SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER Biyofizik 2015
Pratiğin Amacı Temel ölçüm yöntemlerinden biri olan spektrofotometrik yöntemler ve kullanım alanları hakkında bilgi sahibi olmaktır
Pratiğin Hedefi Bu pratiğin sonunda öğrenciler, spektrofotometrik cihazları tanıyabilmeli ve kullanım alanları hakkında bilgi sahibi olabilmeli
Ölçüm yapmanın temeli Varlığı ya da miktarı araştırılan molekül ile OLABİLDİĞİNCE ÖZGÜN ETKİLEŞİME giren bir araç gereklidir!
Spektrofotometrik yöntemlerde bu araç kimyasal ayraçlar ve özgünlüğü arttırmak için yöntemlere eklenen immunolojik veya enzimatik tepkimelerdir
Spektrofotometrik aletler özelliklerine göre; 1. Emisyon spektrofotometreleri a-emisyonspektrografi b-alev fotometresi 2. Absorbsiyon spektrofotometresi 3. Diğerleri a-kolorimetre b-görünür bölge ve UV (mor ötesi) spektrofotometreleri c-ir (kırmızı ötesi) spektrofotometreleri d-atomik Absorbsiyon spektrofotometreleri a-nmr spektrofotometresi b-kütle spektrofotometresi c-x ışını spektrofotometresi
Elektromanyetik ışıma, uzayda çok büyük hızla hareket eden bir enerji türüdür
Elektromanyetik ışımanın en çok karşılaşılan türleri, gözle algıladığımız görünür ışık ve ısı şeklinde algıladığımız infrared ışınlarıdır
Elektromanyetik ışıma - Madde etkileşmeleri: Kırılması ve yansıması (difraksiyon ve refleksiyon) Yayılım (emisyon) Geçiş (transmittans) Tutulum (absorbans) Başka dalga boyunda ışına çevrilebilir (floresans)
Lambert-Beer kanunu: Bir çözeltiden geçen ışık miktarı, ışığın çözelti içinde kat ettiği yol ve çözelti konsantrasyonu ile logaritmik olarak ters orantılı, emilen ışık miktarı ise doğru orantılıdır
İçerisinde organik moleküller bulunan bir çözeltiden UVgörünür bölge ışınları geçerse, çözelti bu ışınların bir kısmını seçimli olarak soğurur (absorpsiyon), diğerlerini ise çok az soğurur veya olduğu gibi geçirir (transmisyon).
Bir küvet içine konmuş renkli bir çözeltiden çıkan ışık şiddeti (I), çözeltiye giren ışık şiddetinden (Io) daha küçüktür.
Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye giren ışık şiddetine oranı (I/Io), transmittans (T) olarak tanımlanır. Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir.
Bir maddenin rengi, o maddeden gözümüze ulaşan görünür bölgedeki elektromanyetik ışınlardır. Bu ışınlar, saydam maddeler için maddenin içinden geçip gelen, saydam olmayanlar için ise yansıyan ışınlardır
Görünen renk Absorbe edilen renk Işık (nm) - - 220-380 Sarı-yeşil Menekşe 380-440 Sarı Mavi 440-475 Portakal Yeşil-mavi 475-495 Kırmızı Mavi-yeşil 495-505 Mor Yeşil 505-555 Menekşe Sarı-yeşil 555-575 Mavi Sarı 575-600 Yeşil-mavi Portakal 600-620 Mavi-yeşil Kırmızı 620-700
Spektrofotometrenin bölümleri
Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme işlemine fotometri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da fotometre denir. Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin konsantrasyonu da ölçülebilir.
Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar.
Atomik Absorpsiyon Spektrofotometresi
AAS eser miktardaki metallerin (ppm ve ppb düzeyde) kantitatif analiz için kullanılmaktadır. Öncelikle analizi yapılacak örneğin çözeltisi hazırlanır. Hangi metalin analizi yapılacak ise cihaza o metalin oyuk katot lambası takılır. Standartlar hazırlanarak metalin absorbans yaptığı dalgaboyunda okuma yapılarak standart eğrisi hazırlanır.
Çalışma İlkesi: Atomik absorpsiyon spektroskopisinde metallerin çoğu ile az sayıda ametal analiz edilir. Atomik absorpsiyon spektroskopisinde element elementel hale dönüştürüldükten sonra buharlaştırılır ve kaynaktan gelen ışın demetine maruz bırakılır, ışın kaynağından gelen ışınları absorplar.
Çalışma İlkesi: Gaz haline getirilmiş atomların elektromanyetik ışımayı absorblaması sonucunda sadece elektronik enerji düzeyleri arasında bir geçiş söz konusudur. Bu neden ile atomların absorpsiyon ve de emisyon spektrumları dar hatlardan oluşmuştur. AAS her elementin bir çok absorbiyon hattı vardır. Bunların içinden rezonans hat olarak isimlendirilen ve ışımanın dalga boyunun, temel enerji düzeyine geçerken yaydığı ışımanın dalga boyuna eşit olduğu hat seçilir.
Çalışma İlkesi: Sulu numune bir alev içine yükseltgen gaz karışımı ile püskürtülür. Bu şekilde 70 kadar element (metal/yarı metal) analiz edilir. Ametallerin absorpsiyon hattı vakum UV bölgeye düştüğünden bu elementler bu metotla analiz edilemez. Metodun hassasiyeti yüksektir. Eser miktarda madde analizi yapılabilir.
Cihazın Bölümleri: Atomik absorpsiyon spektrofotometresinin bileşenleri, analiz edilecek elementin absorplayacağı ışığı yayan ışık kaynağı, örnek çözeltisinin atomik buhar haline getirildiği atomlaştırıcı, çalışılan dalga boyunu diğer dalga boylarından ayrıştırılmasına yarayan monokromatör ve ışık şiddetinin ölçüldüğü dedektördür.
Yanıcı Gaz - Yakıcı Gaz - Sıcaklık C Doğal gaz Hava 1800 Propan Hava 1900 Hidrojen Hava 2000 Asetilen Hava 2300 Asetilen Nitrozoksit (N2O) 2800 Asetilen Oksijen 3100
Alevin Yapısı
Elektrotermal Atomlaştırıcı Diğer bir atomlaştırıcı olan elektrotermal atomlaştırıcı grafit fırındır. Fırın elektriksel dirençle 3000 C ye kadar istenirse kademeli olarak ısıtılabilmektedir. Alevli sistemlere göre daha pahalı fakat daha avantajlıdır. Özellikle ağır metal elementlerinin analizinde ppb düzeyine kadar inebildikleri için daha fazla tercih edilmektedir.
AAS ile tayin edilen elementlerin absorpsiyon yaptıkları dalga boyları Li - 670.8 Co - 240.7 Na - 589 Rh - 343.5 K - 766.5 Ir - 264.0 Rb - 780.0 Ni - 232.0 Cs - 852.1 Pd - 244.8 Be - 234.9 Pt - 265.9 Mg - 285.2 Cu - 324.8 Ca - 422.7 Ag - 328.1 Sr - 460.7 Au - 242.8 Ba - 553.6 Zn - 213.9 Sc - 391.2 Cd - 228.8