Beşinci Baskıya Önsöz, xv Dördüncü Baskıya Önsöz, xvi Üçüncü Baskıya Önsöz, xvii İkinci Baskıya Önsöz, xviii Birinci Baskıya Önsöz, xx Kısım 1: Gen Klonlama ve DNA Analizinin Temel İlkeleri, 1 1 Gen Klonlama ve DNA Analizi Neden Önemlidir, 3 1.1 Genetiğin ilk gelişimi, 3 1.2 Gen klonlama ve polimeraz zincir reaksiyonunun keşfi, 4 1.3 Gen klonlama nedir? 5 1.4. PCR nedir? 6 1.5. Gen klonlama ve PCR neden çok önemlidir, 8 1.5.1. Klonlamayla gen izolasyonu, 8 1.5.2. PCR la gen izolasyonu, 9 1.6. Bu kitap boyunca yolunuzu nasıl bulursunuz, 12 2 Gen Klonlama İçin Vektörler: Plazmitler ve Bakteriyofajlar, 14 2.1 Plazmitler, 14 2.1.1 Plazmitlerin temel özellikleri, 14 2.1.2 Büyüklük ve kopya sayısı, 16 2.1.3 Konjugasyon ve uyumluluk, 17 2.1.4 Plazmitlerin sınıflandırılması, 18 2.1.5 Bakteriler dışındaki organizmalarda plazmitler, 19 2.2 Bakteriyofajlar, 19 2.2.1 Bakteriyofajların temel özellikleri, 19 2.2.2. Lizojenik fajlar, 20 v
λ DNA molekülünün gen düzenlenmesi, 22 λ DNA sının doğrusal ve halkasal formları, 23 M13 İpliksi bir faj, 25 Klonlama vektörü olarak M13 ün cazibesi, 25 2.2.3 Diğer organizmalar için klonlama vektörleri olarak virüsler, 27 3 Canlı Hücrelerden DNA nın Saflaştırılması, 28 3.1. Total hücre DNA sının hazırlanması, 28 3.1.1 Bir bakteri kültürünü büyütme ve harmanlama, 29 3.1.2 Bir hücre özütünün hazırlanması, 30 3.1.3 Bir hücre özütünden DNA nın saflaştırılması, 33 Organik özütleme ve enzim sindirimiyle bulaşkanların uzaklaştırılması, 34 Bir hücre özütünden DNA'yı saflaştırmak için iyon-değiştirme kromatografisinin kullanımı, 35 3.1.4 DNA numunelerinin derişimi, 35 3.1.5. DNA derişiminin ölçülmesi, 37 3.1.6. Total hücre DNA sının hazırlanması için diğer metotlar, 37 3.2. Plazmit DNA sının hazırlanması, 39 3.2.1. Büyüklük esasına dayalı ayırma, 41 3.2.2 Konformasyona dayalı ayırma, 42 Alkalin denatürasyon, 43 Etidyum bromür- sezyum klorür yoğunluk kademeli santrifüjleme, 43 3.2.3 Plazmit çoğaltılması, 46 3.3 Bakteriyofaj DNA sı hazırlama, 47 3.3.1 Yüksek λ titresi elde etmek için kültürlerin büyütülmesi, 47 3.3.2 Lizojenik olmayan λ fajını hazırlama, 48 3.3.3 Enfekte bir kültürden fajın toplanması, 50 3.3.4 λ faj partiküllerinden DNA nın izolasyonu, 51 3.3.5 M13 DNA sının saflaştırılması birkaç probleme yol açar, 52 4 Saflaştırılmış DNA nın Manipülasyonu, 54 4.1 DNA manipülatif enzimler serisi, 55 4.1.1 Nükleazlar, 55 4.1.2 Ligazlar, 57 4.1.3 Polimerazlar, 58 4.1.4 DNA yı modifiye eden enzimler, 60 4.1.5 Topoizomerler, 61 4.2 DNA yı kesmek için enzimler restriksiyon endonükleazlar, 61 4.2.1 Restriksiyon enzimlerinin keşfi ve işlevi, 63 vi
4.2.2 Tip II restriksiyon endonükleazları DNA nın spesifik nükleotit dizilerini keser, 64 4.2.3 Küt uçlar ve yapışkan uçlar, 64 4.2.4 Bir DNA molekülündeki tanıma dizilerinin sıklığı, 65 4.2.5 Laboratuvarda bir restriksiyon sindiriminin gerçekleştirilmesi, 68 4.2.6 Restriksiyon endonükleaz kesim sonuçlarını değerlendirme, 70 Jel elektroforezi ile moleküllerin ayırımı, 70 Jel boyamayla DNA moleküllerinin görüntülenmesi, 70 Otoradyografi ile DNA moleküllerini görüntüleme, 72 4.2.7 DNA moleküllerinin büyüklüklerinin hesaplanması, 74 4.2.8 Bir DNA molekülündeki farklı kesim pozisyonlarını haritalama, 76 4.3 Ligasyon - DNA moleküllerini birbirine bağlama, 78 4.3.1 DNA ligazın etki şekli, 78 4.3.2 Bağlamanın etkisini artıran yapışkan uçlar, 78 4.3.3 Küt uçlu bir moleküle yapışkan uçlar koymak, 80 Linkerler, 80 Adaptörler, 80 Homopolimer kuyruk takmayla (Homopolymer Tailing) yapışkan uçlar üretmek, 84 5 Canlı Hücrelere DNA nın Girişi, 87 5.1 Transformasyon - bakteri hücreleri tarafından DNA nın alınması, 90 5.1.1 Tüm bakteri türleri DNA alımında eşit şekilde etkili değildir, 90 5.1.2 Kompetan E. coli hücrelerinin hazırlanması, 90 5.1.3 Transforme olan hücrelerin seçilmesi, 91 5.2 Rekombinantların Saptanması, 93 5.2.1 pbr322 ile rekombinant seçimi bir antibiyotik direnç geninin insersiyonel inaktivasyonu, 93 5.2.2 İnsersiyonel inaktivasyon, daima antibiyotiğe dirençliliği gerektirmez, 95 5.3 Bakteri hücrelerine faj DNA sının sokulması, 97 5.3.1 Transfeksiyon, 98 5.3.2 λ klonlama vektörlerinin in vitro paketlenmesi, 98 5.3.3 Faj enfeksiyonu bir agar ortam üzerinde plakalar şeklinde belirir, 99 5.4 Rekombinant fajların saptanması, 101 5.4.1 Faj vektörü tarafından taşınan lacz geninin insersiyonal inaktivasyonu, 101 5.4.2 λ cl geninin insersiyonel inaktivasyonu, 101 vii
5.4.3 Spi fenotipini kullanarak seçilim, 103 5.4.4 λ genomu büyüklüğüne dayalı seçilim, 103 5.5 Bakteri olmayan hücrelerin transformasyonu, 103 5.5.1 Bireysel hücrelerin transformasyonu, 103 5.5.2 Tüm organizmanın transformasyonu, 106 6 E. coli İçin Klonlama Vektörleri, 104 6.1 E. coli plazmitlerine dayalı klonlama vektörleri, 108 6.1.1 Plazmit klonlama vektörlerinin isimlendirilmesi, 108 6.1.2 pbr322 nin kullanışlı özellikleri, 108 6.1.3 pbr322 nin pedigrisi, 109 6.1.4 Diğer tipik E. coli plazmit klonlama vektörleri, 109 puc8- Lac seçilim plazmiti, 111 pgem3z- klonlanan DNA nın in vitro transkripsiyonu, 113 6.2 M13 bakteriyofajına dayalı klonlama vektörleri, 114 6.2.1 M13mp2 klonlama vektörlerinin geliştirilmesi, 115 M13mp7- simetrik klonlama yerleri, 115 Daha kompleks M13 vektörleri, 118 6.2.2 Hibrit plazmit- M13 vektörleri, 120 6.3 λ bakteriyofajına dayalı klonlama vektörleri, 120 6.3.1 λ genomunun parçaları, canlılığını yok etmeksizin çıkarılabilir, 122 6.3.2 Doğal seçilim, belli restriksiyon yerlerinden yoksun modifiye λ yı izole etmek için kullanılabilir, 123 6.3.3 İnsersiyon ve replasman (replacement) vektörler, 123 İnsersiyon vektörleri, 123 Replasman vektörleri, 124 6.3.4 λ insersiyon ya da replasman vektörleriyle klonlama deneyleri, 126 6.3.5 Uzun DNA fragmanları bir kozmit kullanarak klonlanabilir, 127 6.4 λ ve diğer yüksek kapasiteli vektörler gen kütüphanelerinin yapılmasına izin verirler, 129 6.5 Diğer bakteriler için vektörler, 130 viii 7 Ökaryotlar İçin Klonlama Vektörleri, 132 7.1 Maya ve diğer mantarlar için klonlama vektörleri, 132 7.1.1 2 μm plazmit için seçici belirteçler, 132 7.1.2 2μm plazmit e dayalı vektörler-maya epizomal plazmitleri, 133 7.1.3 YEp maya kromozomal DNA sına sokulabilir, 135 7.1.4 Maya klonlama vektörlerinin diğer tipleri, 135 7.1.5 Yapay kromozomlar mayada uzun DNA parçalarını klonlamak için kullanılabilirler, 138
YAC vektörünün yapısı ve kullanımı, 138 YAC vektörleri için uygulamalar, 140 7.1.6 Diğer mayalar ve mantarlar için vektörler, 140 7.2. Yüksek bitkiler için klonlama vektörleri, 141 7.2.1 Agrobacterium tumefaciens-doğanın en ufak genetik mühendisi, 141 Bitki hücrelerine yeni genlerin sokulması için Ti plazmitinin kullanılması, 142 Ti plazmitle transforme olan bitkilerin üretimi, 145 Ri plazmit, 145 Agrobacterium plazmitleriyle klonlamanın sınırlamaları, 146 7.2.2 Bitkilerde doğrudan gen transferi ile klonlama, 147 Çekirdeğe doğrudan gen transferi, 147 Genlerin kloroplast genomuna transferi, 149 7.2.3 Bitki virüslerini klonlama vektörleri olarak kullanmak için girişimler, 150 Kaulimovirüs vektörleri, 150 Geminivirüs vektörler, 150 7.3 Hayvanlar için klonlama vektörleri, 151 7.3.1 Böcekler için klonlama vektörleri, 151 Drosophila için klonlama vektörleri olarak P elementleri, 151 Böcek virüslerine dayalı klonlama vektörleri, 153 7.3.2 Memelilerde klonlama, 153 Memeliler için klonlama vektörleri, 153 Vektörsüz gen klonlama, 155 8 Belli Bir Geni İçeren Klon Nasıl Elde Edilir, 158 8.1 Seçilim problemi, 158 8.1.1 İstenilen klonu elde etmek için iki temel strateji vardır, 158 8.2. Doğrudan Seçilim, 159 8.2.1 Belirteç kurtarma (marker rescue) doğrudan seçilimin kapsamını genişletir, 161 8.2.2 Belirteç kurtarmanın (marker rescue) kapsamı ve sınırlamaları, 163 8.3 Bir gen kütüphanesinden bir klonun saptanması, 163 8.3.1 Gen Kütüphaneleri, 163 8.3.2 Tüm genler aynı anda ifade olunmaz, 164 8.3.3 mrna komplementer DNA olarak klonlanabilir, 166 8.4 Klon saptamak için metotlar, 166 8.4.1 Komplementer nükleik asit iplikleri birbirleriyle hibritlenir, 166 8.4.2 Koloni ya da plaka ile probu hibritleme, 168 8.4.3 Hibritleme probunun pratik kullanımına örnekler, 172 ix
Bir cdna kütüphanesini analiz etmek için bolluk problama, 172 Translasyon ürünü tanımlanan genler için oligonükleotit problar, 172 Heterolog problama ilişkili genlerin saptanmasına izin verir, 176 8.4.4 Klonlanan genin translasyon ürününün saptanmasına dayalı teşhis metotları, 177 İmmünolojik saptama metotları için antikorlar gereklidir, 177 Rekombinant kolonilerde protein saptamak için saflaştırılmış bir antikorun kullanılması, 178 Gen ifadesinin problemi, 178 9 Polimeraz Zincir Reaksiyonu, 181 9.1 Ana hatlarla polimeraz zincir reaksiyonu, 181 9.2 Daha detaylarla PCR, 184 9.2.1 Bir PCR için oligonükleotit primerleri tasarlama, 184 9.2.2 Kullanılacak doğru sıcaklığı belirleme, 186 9.2.3 PCR sonrası: PCR ürünlerini çalışma, 189 PCR ürünlerinin jel elektroforezi, 189 PCR ürünlerini klonlama, 190 9.3 Taq polimerazın hata oranına ilişkin problemler, 193 Kısım 2: Araştırmalarda Gen Klonlama ve DNA Analizi Uygulamaları, 197 x 10 Genin Yerini ve Yapısını İncelemek, 199 10.1 Klonlanan bir genin yeri nasıl çalışılır, 199 10.1.1. Küçük bir DNA molekülündeki bir genin pozisyonunun belirlenmesi, 199 10.1.2 Büyük bir DNA molekülündeki bir genin pozisyonunu belirlemek, 202 Jel elektroforezi ile kromozomların ayrılması, 203 Ökaryotik kromozoma klonlanan bir genin pozisyonunu in situ hibritleme ile görüntüleme, 205 10.2 DNA baz dizisi çıkarma- bir genin yapısını çözme, 207 10.2.1 Sanger-coulson metodu; zincir sonlandıran nükleotidler, 207 Primer, 207 Komplementer ipliğin sentezi, 207 Dört ayrı reaksiyon sonlanan ipliklerin dört ailesiyle sonuçlanır, 209 Otoradyografiden DNA dizisinin okunması, 209
Baz dizisi çıkarmak için tüm DNA polimerazlar kullanılamaz, 210 10.2.2 Otomatik DNA dizileme, 211 10.2.3 PCR ürünlerini dizileme, 211 10.2.4 Maxam- Gilbert metodu-dna nın kimyasal sindirimi, 214 10.2.5 Uzun bir DNA dizisi oluşturmak, 216 10.2.6 DNA dizilemenin başarılması, 218 11 Gen İfadesi (ekspresyonunun) ve İşlevini İnceleme, 220 11.1 Klonlanan bir genin transkripsiyonunu inceleme, 221 11.1.1 Nükleik asit moleküllerinin elektron mikroskobisi, 222 11.1.2 Nükleaz muamelesi ile DNA-RNA hibritlerinin analizi, 223 11.1.3 Primer uzatmayla transkript analizleri, 224 11.1.4 RNA transkriptlerini incelemek için diğer teknikler, 225 Northern hibritleme, 225 Revers transkripsiyon-pcr (Rt-PCR), 226 cdna uçlarının hızlı çoğaltımı (RACE), 227 RNA dizileme, 228 11.2 Gen ifadesinin düzenlenmesini inceleme, 230 11.2.1 Bir DNA molekülü üzerinde protein bağlanma yerlerinin saptanması, 231 DNA-protein komplekslerinin jel gecikmesi (retardasyonu), 231 DNaz I ile ayakizleme (footprinting), 232 Modifikasyon interferans analizleri, 233 11.2.2 Delesyon analiziyle kontrol dizilerininin saptanması, 236 Raportör genler, 236 Delesyon analizini gerçekleştirmek, 237 11.3 Klonlanan bir genin translasyon ürününü saptama ve inceleme, 239 11.3.1. HRT ve HART klonlanan genin translasyon ürününü saptayabilir, 239 11.3.2 İn vitro mutagenez ile proteinlerin analizi, 240 In vitro mutagenez tekniklerinin farklı tipleri, 241 Klonlanan bir gende nokta mutasyonu oluşturmak için bir oligonükleotit kullanımı, 243 Klonlanan bir gende bir nokta mutasyonu oluşturmak için diğer metotlar, 245 İn vitro mutagenezin potansiyeli, 247 11.3.3 Protein-protein etkileşimlerinin çalışılması, 247 Faj görüntüleme, 247 Maya iki hibrit sistemi, 250 xi
12 Genomları Çalışma, 252 12.1 Genomiks bir genom nasıl dizilenir, 253 12.1.1 Genom dizilemede rastgele yaklaşım, 254 H.influenza genomunu dizileme projesi, 255 Rastgele klonlama ile ilgili problemler, 257 12.1.2 Klon kontig yaklaşımı, 257 Kromozom yürüme ile klon kontig birleştirme, 258 Klon kontig birleştirme için hızlı yöntemler, 259 Başlandırılmış dizi bölgesi içeriği analizi ile klon kontig birleştirme, 260 12.1.3 Dizi birleştirmeye yardımcı olacak bir harita yapma, 261 Genetik haritalar, 261 Fiziksel haritalar, 262 Bir haritanın dizi birleştirmede önemi, 264 12.2 Post-genomiks bir genom dizisini anlamaya çalışma, 264 12.2.1 Bir genom dizisindeki genleri saptama, 265 Açık okuma çerçevelerini araştırma, 265 Olası ORF lerde gerçek genleri ayırt etme, 266 12.2.2 Bilinmeyen bir genin işlevini belirleme, 268 12.3 Transkriptom ve proteom çalışmaları, 269 12.3.1 Transkriptomu çalışma, 269 12.3.2 Proteomu çalışma, 271 Kısım 3: Gen Klonlama ve DNA Analizinin Biyoteknolojide Uygulamaları, 275 13 Klonlanan Genlerden Protein Üretimi, 277 13.1 Yabancı genlerin E. coli de ifade edilmesi için özel vektörler, 279 13.1.1 Promotor bir ifade vektörünün kritik bileşenidir, 282 Promotor dikkatli seçilmelidir, 282 İfade vektöründe kullanılan promotor örnekleri, 284 13.1.2 Kasetler ve gen birleşmeleri, 285 13.2 E. coli de rekombinant protein üretimi ile ilgili genel problemler, 287 13.2.1 Yabancı gen dizisinden kaynaklanan problemler, 288 13.2.2 E. coli nin neden olduğu sorunlar, 291 13.3 Ökaryotik hücreler tarafından rekombinant protein üretimi, 292 13.3.1 Maya ve ipliksi mantarlardan rekombinant proteinler, 292 Rekombinant protein sentezinde konak olarak Saccharomyces cerevisiae, 292 xii
Diğer maya ve mantarlar, 293 13.3.2 Rekombinant protein üretimi için hayvan hücrelerini kullanma, 295 Memeli hücrelerinde protein üretimi, 295 Böcek hücrelerinde protein üretimi, 295 13.3.3 Canlı hayvanlar ve bitkilerden rekombinant protein üretimi (pharming-farmasötiktarım) Hayvanlarda farmasötiktarım, 297 Bitkilerden rekombinant proteinler, 298 Farmasötik tarım ile artan etik sorunlar, 299 14 Tıpta Gen Klonlama ve DNA Analizi, 302 14.1 Rekombinant farmasötiklerin üretimi, 302 14.1.1 Rekombinant insülin, 302 Yapay insülin genlerinin sentezi ve ifadesi, 303 14.1.2 İnsan büyüme hormonlarının E. coli de sentezi, 305 14.1.3 Rekombinant faktör VIII, 306 14.1.4 Diğer rekombinant insan proteinlerinin sentezi, 309 14.1.5 Rekombinant aşılar, 309 Rekombinant proteinler olarak aşı üretimi, 310 Transgenik bitkilerde rekombinant aşılar, 312 Canlı rekombinant aşılar, 312 14.2 İnsan hastalıklarından sorumlu genlerin saptanması, 314 14.2.1 Genetik bir hastalık için bir gen nasıl saptanır, 315 İnsan genomunda genin yaklaşık pozisyonunu belirleme, 315 Hastalık genleri için adayların saptanması, 318 14.3 Gen tedavisi, 319 14.3.1 Kalıtsal hastalıklar için gen tedavisi, 319 14.3.2 Gen tedavisi ve kanser, 321 14.3.3 Gen tedavisi ile ortaya çıkan etik konular, 321 15 Tarımda Gen Klonlama ve DNA Analizi, 323 15.1 Bitki genetik mühendisliğinde gen ekleme yaklaşımı, 324 15.1.1 Kendi böcek öldürücülerini yapan bitkiler, 324 Bacillus thuringiensis δ-endotoksinleri, 324 Mısıra bir δ -endotoksin genini klonlama, 325 Kloroplastlarda δ-endotoksin genlerinin klonlanması, 328 δ-endotoksin kültür bitkileri için böcek direncini sürdürme, 329 15.1.2 Herbisite dirençli kültür bitkileri, 331 Roundup ready kültür bitkileri, 331 Glifosat dirençli kültür bitkilerinin yeni bir nesli, 332 15.1.3 Diğer gen ekleme projeleri, 334 xiii
15.2 Gen çıkarma, 334 15.2.1 Antisens teknolojinin arkasındaki prensip, 335 15.2.2 Antisens RNA ve domateste meyve olgunlaşmasının mühendisliği, 336 Poligalakturonaz genini inaktif hale getirmek için antisens RNA nın kullanımı, 337 Etilen sentezini inaktive etmek için antisens RNA nın kullanımı, 339 15.2.3 Bitki genetik mühendisliğinde antisens RNA kullanımının diğer örnekleri, 340 15.3 Genetik olarak değiştirilmiş bitkilerle problemler, 341 15.3.1 Seçilebilir belirteçlerle güvenlik endişeleri, 341 15.3.2 Terminatör teknolojisi, 342 15.3.3 Çevre üzerinde zararlı etkilerin olasılığı, 344 16 Adli Tıp Biliminde ve Arkeolojide Gen Klonlama ve DNA Analizi, 346 16.1 Suç şüphelilerinin teşhisinde DNA analizi, 346 16.1.1 Hibritleme problama ile genetik parmakizleme, 347 16.1.2 Kısa ardışık tekrarların PCR ı ile DNA profilleme, 347 16.2 DNA profilleme ile akrabalık çalışma, 350 16.2.1 Akraba bireyler benzer DNA profillerine sahiptir, 350 16.2.2 DNA profilleme ve Romanovların kalıntıları, 350 Romanov kemiklerinin STR analizi, 351 Kayıp çocuklar, 352 16.3 DNA analizi ile cinsiyet saptama, 353 16.3.1 Y kromozomuna-özgül dizilere yönlendirilen PCR lar, 353 16.3.2 Amelojenin geninin PCR ı, 354 16.4 Arkeogenetik-İnsan evrimi çalışmak için DNA yı kullanma, 356 16.4.1 Modern insanların kökeni, 356 DNA analizleri çoklubölgesel hipotezine ters düştü, 357 DNA analizleri Neanderthal lerin modern Avrupa lıların atası olmadığını gösterir, 358 16.4.2 DNA tarih öncesi insan göçlerini araştırmak için de kullanılabilir, 359 Tarımın Avrupa ya yayılması, 359 Geçmişte Avrupa ya insan göçlerini incelemek için mitokondri DNA sının kullanılması, 360 Sözlük, 363 Dizin, 379 xiv