FARELERDE KOKU UYARANININ ÖĞRENME BELLEK SÜRECĠ ÜZERĠNE ETKĠSĠ VE BU SÜREÇTE SEROTONĠN 5-HT 3 RESEPTÖRLERĠNĠN OLASI KATKISI Aslı Irmak BİRANCI, Ayşe GÜZEL, Seda KOZAN, Tuğba KOCABAŞ Danışman: Remzi Erdem ÖZET Evrimsel olarak en eski nöral işlevlerden olmakla birlikte, en az anlaşılmış duyu olan kokunun öğrenme-bellek (Ö-B) süreci üzerine etkileri tam olarak bilinmemektedir. Literatürde Ö-B sürecinde postsinaptik membran potansiyellerinin uzun erimli potansiyalizasyon (LTP) ile modifiye edilmesinin rol oynadığı öne sürülmüştür. Bu çalışmada, koku uyaranının LTP benzeri bir süreç yaratacağı ve sonuçta Ö-B işlevini etkileyeceği varsayımları kuruldu. Bu amaçla, farelerde uzun süreli kokusal uyaran uygulamasının uzaysal Ö-B sürecine etkisi araştırıldı. Ayrıca, serotonin 5-HT 3 reseptörlerinin bu süreçteki rolü araştırıldı. Araştırmamızda 25 adet erkek Swiss albino fare (yetişkin, 38.5±3.80g) kullanıldı. Öncelikle, oluşturulacak gruplar arasında uzaysal Ö-B yeteneği açısından homojen dağılımı sağlamak amacıyla kullanılan Barnes Labirenti (BL) düzeneği ile uzaysal Ö-B süreci değerlendirildi. Beş ardışık gün boyunca yapılan BL uygulamasının ardından, fareler, elde edilen öğrenme eğrilerine göre tabakalı rasgele örnekleme yöntemi ile 4 gruba ayrıldı. Gruplar, Koku (n=7; 12 adet doğal koku, 10 dakika/koku, 2 saat/gün, 14 gün), Kontrol (n=6) ve bunların Tropisetron (30 µg/kg/gün, s.c., 14 gün) uygulanan eşlenikleri (herbiri için, n=6) şeklinde oluşturuldu. İlaç uygulanmayan gruplara aynı yolla, eş hacimde serum fizyolojik (300 µl/gün, 14 gün) uygulandı. BL verileri tüm gruplarda öğrenme sürecinin geliştiğini gösterdi. Ardından, koku uyaranı ve/veya tropisetron uygulamalarının uzaysal Ö-B sürecine etkisi Morris Su Labirenti (MSL) düzeneği ile değerlendirildi. Ortalama OSH olarak ifade edilen öğrenme-bellek verileri, latans (sn), motor aktivite (yüzme hızı; cm/sn), kümülatif yüzme mesafesi (cm), hedefe anlık uzaklık (cm) gibi ölçütlerin saptanmasına olanak veren ve Üniversitemiz Mühendislik Fakültesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü ile ortaklaşa geliştirilen MatLab tabanlı bir görüntü alma, işleme ve değerlendirme yazılımı ile incelendi. GĠRĠġ VE GENEL BĠLGĠLER Koku, duyular arasında en az anlaşılmış olanıdır ve bu konudaki bilgiler sınırlıdır. Son araştırmalara göre, her koku için özgül bir reseptör kullanıldığı ve aynı zamanda farklı reseptörlerin eşzamanlı aktivasyonu ile de değişik koku kombinasyonlarının algılandığı düşünülmektedir. Bu da milyonlarca kokuyu nasıl ayırt edebildiğimizi açıklamaktadır (3). Filogenetik olarak aşağı sınıf hayvanlarda beynin koku ile ilgili bölümleri, gelişmiş olan ilk beyin yapıları arasında yer alır ve beynin geri kalan kısmının büyük bölümü kokuyla ilgili olan bu başlangıç bölümünün çevresinde toplanır (9). Uzaysal öğrenme ve belleğin merkezi olarak bilinen hipokampus de olfaktör korteksin bir bölümü olarak gelişmiştir. Bu da kokunun öğrenme ve bellek süreci ile ilişkili bir rolü olabileceğini düşündürmektedir. Hayatta kalmak için büyük ölçüde koku duyusuna itimat eden farelerde olfaktör korteks homunculusun büyük bölümünü oluşturur. Bu nedenle, fareleri çeşitli kokulara maruz bırakarak sinaptik ağın yeniden yapılanmasının geliştirilmesi ve hipokampusla bağlantısının artırılarak öğrenmebellek oluşumunu olumlu yönde etkilemesi olasıdır (9).
Özellikle öğrenme sürecinin oluşumunun sinaptik güç ve plastisitedeki, yani postsinaptik membran potansiyelindeki, uzun erimli değişimlerle modifiye edildiği düşünülmektedir (2,6). Bu alanda temel hücresel mekanizmalardan olan LTP nin (Long Term Potentiation), postsinaptik nöronu presinaptik nörondan salıverilen nörotransmitterlere karşı duyarlılaştırarak iki nöron arasında ileri iletişimi gerçekleştirdiği ve özellikle uzun dönem hafızada rolü olduğu düşünülmektedir. Burada, son yıllarda bellek süreci ile ilgili yeni bir yaklaşımdan söz etmek gerekir. Bu görüşe göre, sinaptik yeni yapılanma bellek sürecini açıklamak için yeterli bir model değildir, çünkü bellek bir nöral devre özelliğidir (5). Hem koku yolaklarının hem de hipokampusun nörotransmitter olarak yaygın biçimde asetilkolini kullanması nedeniyle koku yolağındaki nörotransmisyon ile hipokampustaki nörotranmisyon işlevini ayırt etmek için kolinerjik ligandlar dışında bir ajan kullanılması düşünüldü. Öğrenme bellek sürecine katkıda bulunan birçok mekanizmanın içinde serotonerjik sistem de yer almaktadır. Serotonin (5-HT) in hücre membranında yer alan bir katyon kanalı olan 5HT 3 reseptörlerinin presinaptik kolinerjik etkisi bilinmektedir. Klinikte kanser tedavisine bağlı kusmaların önlenmesinde antiemetik (bulantı kesici) olarak kullanılan tropisetron, etkisini presinaptik kolinerjik inhibisyon yaparak gösterir. Tropisetronun 5HT 3 reseptörlerini bloke ederek öğrenme belleği olumsuz yönde etkilediği gösterilmiştir (1). Rasyonel: Kokunun, sinaptik yeniden yapılanmayı geliştirdiği ve hipokampusla kurulan bağlantıların öğrenme bellek sürecini etkilediği düşünülmektedir. Ancak kokunun öğrenme bellek üzerine etkileri hakkındaki kanıtlar kısıtlıdır. Ayrıca, klinikte antiemetik olarak kullanılan, kan beyin engelini kolaylıkla geçen ve özellikle farelerde etkin olan tropisetronun, koku ile oluşması muhtemel öğrenme bellek değişikliklerine etkisini araştırmak bu sürece aracılık eden mekanizmaya yönelik bilgi sağlayabilir. Amaç: Farelerde koku uyaranı ve/veya tropisetron uygulamasının öğrenme bellek süreci üzerindeki etkisini Barnes Labirenti ve Morris Su Labirenti düzeneklerinde araştırmak Hipotez: - Tekrarlı ve uzun süreli koku uyaranı uygulaması farelerde öğrenme-bellek işlevini artırır. -Koku bir çevresel zenginleştirmedir. -Tropisetron kullanımı öğrenme-bellek işlevini bozar. YÖNTEM VE GEREÇLER Deney Hayvanları ve Barındırma KoĢulları: Proje kapsamındaki deneysel çalışmalara Başkent Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulundan onay alındıktan sonra başlandı (DA10/04). Deney hayvanı olarak Başkent Üniversitesi Hayvan Üretim Merkezinden sağlanan 25 adet erişkin, erkek, Swiss Albino (38,5 0,76 g) fareler kullanıldı. Deney hayvanları, standart barınma koşullarında (12 saat aydınlık/ 12 saat karanlık, %50 bağıl nem, 24 2 C oda sıcaklığı) standart fare yemi ve su ile beslenerek barındırıldı. Deneyin amacına uygun olarak hayvanlara tekrarlayan koku uygulaması yapıldı; ancak bunun dışında deneysel işlemlerin öncesinde, sırasında ve sonrasında hayvanlarda ağrı, acı, huzursuzluk yaratabilecek her türlü uygulamadan kaçınıldı.
Deney Grupları: Barnes Labirenti (BL) düzeneği kullanılarak 5 ardışık gün boyunca farelerin öğrenme düzeyleri ölçüldü. Bu 5 günün latans ortalaması ve öğrenme eğrileri göz önüne alınarak fareler tabakalı rasgele örnekleme yöntemi kullanılarak bilişsel işlev düzeyleri açısından 4 homojen gruba ayrıldı. Gruplar; 1. Grup: Kontrol grubu (K), 2. Grup: çeşitli kokulara maruz bırakılan grup (O), 3. Grup: Tropisetron uygulanan grup (KT), 4. Grup: kokuyla birlikte tropisetron uygulanan grup (OT) şeklinde oluşturuldu.(tablo 1). Tablo 1. Deney Grupları Tropisetron uygulaması Yok Var Koku uygulaması Yok Grup 1, K (6) Grup 3, KT (6) Var Grup 2, O (7) Grup 4, OT (6) Barnes Labirenti: BL, deney hayvanlarında uzaysal öğrenme ve bellek ölçümünde kullanılan bir yöntemdir. Deneyimizde kullanılan BL, fareler için tanımlanan boyutlara uygun olarak yapılmıştır. BL, 122 cm çapındaki bir tahta plaka üzerine çapları 5 cm olan ve aralarında 9 açı bulunan 40 delik açılması ile oluşturuldu. Bu deliklerin birinin altına bir çekmece yerleştirildi. Fareler 5 ardışık gün boyunca, bırakılma sıraları rasgele olmak üzere, etrafı kapalı bir silindir içinde düzeneğin tam ortasına bırakıldı. Her bir deney hayvanı için 120 saniye değerlendirme süresi tanındı. Deney hayvanının çekmeceyi bulması durumunda, her bir deney hayvanı çekmece içinde 10 saniye bekletildi. 26. gün bellek işlevinin değerlendirmesi BL ile retansiyon deneyi yapıldı.. 40 delik BARNES LABİRENTİ 122 cm 9 Resim 1. Barnes Labirenti ölçütleri ve çekmecenin konumu 5 cm Çekmece 140 cm
Deney Protokolü BL-1 Ġlaç ve/veya koku uyg. MSL-1 Ġlaç ve/veya koku uyg. Uyg. ve MSL-2 0 1 2 3 4 5 6 19. 22..26.30 (günler) ġema 1. Deney protokolü Koku Uygulaması-1 14 gün O ve OT gruplarına 12 çeşit koku kullanılarak uzun süreli, tekrarlayan koku uygulaması yapıldı. Her bir koku kaynağını 10 dakikada bir değiştirmek suretiyle, toplam 2 saat boyunca kokusal uyaran uygulandı. Kullanılan koku kaynakları gülsuyu, sirke, sarımsak, kül, karanfil, portakal, çilek, soğan, kimyon, köri, kahve, nane olarak belirlendi ve flakonlar içine konuldu. Bu kokular sentetik değil, doğal olmaları göz önüne alınarak seçildi. K ve KT gruplarını da aynı işleme tabi tutmak açısından, koku kaynağı içeren flakonlar yerine içi su dolu flakonlar kullanıldı. Morris Su Labirenti-1 Farelerde öğrenme sürecini değerlendirebilmek amacıyla daha önce tanımlanan biçimde Morris Su Labirenti (MSL) düzeneği kullanıldı (4). Deney süresince suyun sıcaklığı 22 ± 2 C de sabit tutuldu. Yerleşimi sabit kalmak üzere havuzun rasgele bir yerine su yüzeyinden 1 cm aşağıda olacak şekilde deney hayvanlarının üzerinde durabileceği bir platform konuldu. Havuzun etrafına 3 yöne, farelerin oryantasyonunu sağlamak için ayırt edici belirteçler (ipuçları) konuldu. Fareler 5 ardışık gün boyunca kuzey, güney, doğu ve batı olmak üzere, dört ayrı yönden, suya bırakılma yönleri ve sıraları farklı olacak şekilde MSL de yüzdürüldü. Her bir deney hayvanı için 120 saniyelik değerlendirme süresi tanındı. Deney hayvanının kaçış platformunu bulması durumunda, oryantasyon gelişimini sağlamak için her bir deney hayvanı kaçış platformu üzerinde 10 saniye bekletildi. Bu uygulamalarla latans, motor aktivite (yüzme hızı, cm/sn), kümülatif yüzme mesafesi (cm), hedefe anlık uzaklık (cm) gibi ölçütlerle uzaysal öğrenme-bellek işlevinin değerlendirilmesi amaçlandı. MSL - 1 MSL - 2 K 24 cm B D 46 cm 33 cm 75 cm G Resim 2. MSL deki kaçış platformunun yerleşimi ve yönler (K: kuzey, G: güney, B: batı, D: doğu)
KUZEY Resim 3. MSL 1 uygulamasında kullanılan belirteçler (ipuçları) BATI DOĞU GÜNEY Koku uygulaması-2 Aynı kokular 10 gün boyunca her biri 10 dakika ara ile değiştirilecek şekilde günde 2 saat uygulandı. Morris Su Labirenti-2 Deneyin bir önceki deneyden etkilenmemesi için platformun yeri ve belirteçler değiştirildi. Her bir deney hayvanına değerlendirme süresi olarak 90 saniye, platform üzerinde bekletilme süresi olarak da 30 saniye tanındı. Fareler için itici güç oluşturması amacı ile suyun sıcaklığı (20 ± 1 C) azaltıldı. KUZEY BATI Resim 4. MSL 2 uygulamasında kullanılan belirteçler (ipuçları) DOĞU GÜNEY
Ġlaç Uygulaması-1 İlaç gruplarına 14 boyunca 30 µg/kg/gün/300 µl, s.c tropisetron uygulanırken diğer gruplara da enjeksiyon stresini ekarte edebilmek için aynı protokolle 300 µl/gün, s.c, serum fizyolojik uygulandı. Ġlaç Uygulaması-2 Bütün gruplara 10 gün boyunca injeksiyon aynı protokolle, aynı yolla, aynı hacimde yapıldı. Veri Toplanması ve Ġstatiksel Analiz: Tüm veriler, ortalama ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ifade edildi. Günlük latans ortalaması, 4 yönden elde edilen latansların ortalaması şeklinde değerlendirildi. Elde edilen öğrenme ve bellek eğrileri nonparametrik Kruskal-Wallis varyans analizi ile değerlendirildi. P değeri < 0,05 olan karşılaştırmalar istatistiksel olarak önemli kabul edildi. BULGULAR Barnes Labirenti Tabakalı rasgele örnekleme yapıldı: İlk 5 gün değerlendirildiğinde tüm grupların öğrenme gelişim eğrilerinin paralel seyrettiği ve gruplarda tabakalı rasgele örneklemenin başarılı bir şekilde gerçekleştiği saptandı (Şekil 2). Tüm gruplarda öğrenme gerçekleģti: İlk 5 gündeki öğrenme eğrileri incelendiğinde tüm gruplarda öğrenme artışındaki değişmenin zamana karşı önemli olduğu saptandı (P<0,005). Koku bellek geliģmesini bozdu: 14 günlük koku uygulamasının ardından kokunun öğrenmeyi anlamlı bir şekilde bozduğu görüldü (P<0,05). Tropisetron bellek geliģmesini bozdu: 14 günlük ilaç uygulamasının ardından tropisetronun öğrenme sürecini anlamlı bir şekilde bozduğu saptandı.(p<0,05) * * * * ġekil 2. Öğrenme-bellek eğrileri: Latans ortalamalarının zamana göre değişmesi. * P<0,005
Uygulamalar sonrasında bellek gelişimini değerlendirmek amacıyla 20. günde yapılan retansiyon incelendiğinde koku ile kontrol grupları arasında ve tropisetron ile kontrol grupları arasında önemli fark saptandı (P<0,05). Morris Su Labirenti 1 Kontrol grubunda platformu bulma sürelerinin zamanla artmasından ötürü öğrenmenin gerçekleşmediği görüldü (Şekil 3). Koku grubunda ise ilginç olarak, ilk 3 günde öğrenmenin gerçekleştiği gözlendi. ġekil 3. Öğrenme eğrileri: Latans ortalamalarının zamana göre değişmesi. Morris Su Labirenti 2 Deney protokolünün ikinci MSL kısmında, yine, kontrol grubunda beklenen öğrenmenin gerçekleşmediği görüldü (Şekil 4). Ancak, çarpıcı olarak yine koku grubunda ortalama latans değerlerinin kontrol grubundan belirgin biçimde düşük seyrettiği saptandı (Şekil 4). ġekil 4. Öğrenme eğrileri: Latans ortalamalarının zamana göre değişmesi.
Ortalama Vücut Ağırlıkları ġekil 5. Koku ve/veya ilaç uygulamasının vücut ağırlığı değişimlerine etkisi. Deney protokolü süresince yapılan tartımlar sonucunda vücut ağırlığı değişimleri saptandı. Tropisetron uygulanan grupların (KT ve OT) eğrilerinin paralel seyretmesi dikkat çekici bulundu. TARTIġMA Projemizde, çok sayıda kokusal uyaran uygulanmasıyla LTP benzeri bir etki yaratarak öğrenme ve belleğin geliştirilmesi amaçlandı (2, 6). Uzaysal öğrenme-bellek işlevinin ana merkezi olarak kabul edilen hipokampusta asetilkolinin yanı sıra glutamat ve serotonin reseptörlerinin de gösterilmesi, öğrenme-bellek sürecini bozmak için serotonerjik yolu seçmemizde etkili oldu; çünkü kolinerjik yolak inhibe edilseydi kokunun algılanmasını da etkileyebilirdi (2, 6). Bunun için, kan-beyin bariyerini geçebilen ve farelerde etkinliği bilinen 5-HT 3 antagonisti tropisetron kullanıldı (7, 8). Ancak, tropisetronun nikotinik kolinerjik reseptörler için parsiyel agonist olduğu da burada vurgulanmalıdır (9). Tropisetronun öğrenme belleği bozduğu daha önceki bir çalışma grubu projesi ile de gösterilmiştir (1). Deney hayvanı olarak farelerin kullanılmasının nedeni, bu deney hayvanı türünün koku yolakları bakımından insanlarla benzeşim göstermesidir (9). Koku bir çevresel zenginleştirme bileşeni ise tropisetron uygulamasıyla beraber koku uygulamasının tropisetronun öğrenme bellek üzerindeki bu olumsuz etkisini en azından azaltması beklendi (1). Ancak Barnes Labirenti bulgularına göre koku veya tropisetron uygulanan farelerde bellek gelişmediği görüldü. Morris Su Labirenti-1 bulgularında ise koku grubunda öğrenmenin geliştiği görülse de kontrol grubunun öğrenmemesinden ötürü bu sonuç anlamlı bulunmadı. Bu yüzden 5 ardışık gün boyunca uygulanması gereken MSL 4 günde sonlandırılarak ek deney protokolü oluşturuldu; olası hatalar düzeltilerek tekrar tropisetron ve/veya koku uygulamasına karar verildi. MSL-2 de de farklı bir sonuç elde edilemedi, yine, kontrol grubunda öğrenme gelişmedi. Bu yüzden farelerin stereotipik yüzme davranışları göz önüne alınarak depresyona girdiği düşünüldü (10). Vücut ağırlıkları grafiği incelendiğinde ilaç gruplarının kokudan bağımsız olarak eğrilerinin paralel seyretmesi dikkat çekti.
Sonuçlar ve Çıkarımlar 1. Öğrenme bellek sürecinde 5-HT 3 reseptörlerinin rolü vardır. 2. Koku, bellek gelişmesini olumsuz etkilemiştir. 3. Tropisetron, bellek gelişmesini olumsuz etkilemiştir. 4. Barnes Labirenti uzaysal öğrenme-bellek işlevinin ölçümü için geçerli ve güvenilir bir değerlendirme yöntemidir. 5. Projede kullanılan deney hayvanlarının sayısının bir davranış çalışması için yetersiz olmasından dolayı varılan sonuçların daha ileri çalışmalarla desteklenmesi gerekir. KAYNAKLAR: 1. Akyüz İ, Durgut S, Hocaoğlu E ve diğerleri. Farelerde Stres ve Çevresel Zenginleştirmenin Öğrenme-Bellek ve Anksiyete Üzerinde Etkilerinde Serotonin 5-HT 3 Reseptörlerinin Rolü. Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi VIII. Öğrenci Sempozyumu Çalışma Grubu Raporları kitabı, 2006; 233-245. 2. Bliss TV, Collingridge GL. A Synaptic Model of Memory: Long- Term Potentiation in The Hippocampus. Nature. 1993 Jan;361(6407): 31 9. 3. Buck L, Axel R. A Novel Multigene Family May Encode Odorant Receptors: A Molecular Basis for Odor Recognation. Cell. 2004 Jan 23;116(2 Suppl):S117-9, 1p Following S119. 4. Çelik BC, Kocaman E., Şimşek EK ve diğerleri. Farelerde Siklooksijenaz-2 İnhibisyonunun Strese Bağlı Öğrenme-Bellek Bozulması Üzerinde Etkisinin Araştırılması. Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi XI. Öğrenci Sempozyumu Çalışma Grubu Raporu, 2009; (basılmadı). 5. Çevik MÖ. Türk Nöroloji Dergisi 2009;15(EK1):95. 6. Cooke SF, Bliss TV. Plasticity in the Human Central Nervous System. Brain 129 (Pt 7): 1659 73. 7. Cui R, Suemaru K, Li B ve diğerleri. Tropisetron Attenuates Naloxone-Induced Place Aversion in Single-Dose Morphine-Treated Rats: Role of Alpha7 Nicotinic Receptors. European Journal Of Pharmacology. 2009 May;609 (1-3): 74 7. 8. Macor JE, Gurley D, Lanthorn T ve diğerleri. The 5-HT 3 Antagonist Tropisetron is a Potent and Selective Alpha7 Nicotinic Resetor Partial Antogonist. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2001 Feb; 11 (3): 319 21. 9. Mandorion N, Poncelet J, Bensafi M ve diğerleri. Humans and Mice Express Similar Olfactory Preferences. Plos One. 2009;4(1):E4209. Epub 2009 Jan 16. 10. Uzbay T.: Psikofarmakolojinin Temelleri ve Deneysel Araştırma Teknikleri, Çizgi Tıp Yayınevi, Ankara, 2004, 134-138.