TrueScience RespiFinder Identification Panels HIZLI REFERANS KARTI Güvenlik ve biyolojik tehlike yönergeleri için TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN 4460429) Safety kısmına bakın. Uyarılar ve önlemler için, TrueScience RespiFinder Identification Panels Product Insert'e (PN 4460486) başvurun. Tüm kimyasallarda, SDS'yi (Güvenlik Bilgi Formu) okuyun ve kullanma talimatlarını takip edin. Uygun bir koruyucu gözlük takın, koruyucu kıyafet giyin ve eldiven takın. TrueScience RespiFinder Identification Panels hakkında ilave bilgi için, www.appliedbiosystems.com/ respifinderlit adresine gidin. TrueScience RespiFinder Identification Panels kullanım kılavuzlarını indirmek için, www.appliedbiosystems.com/respifinderlit adresine gidin ve ardından Literature/Support sekmesini seçin. Bu hızlı referans kartı aşağıdakileri kapsar: Paneller............................................................................................................. 1 Ürün açıklaması ve prensipler......................................................................................... 1 Kullanım amacı...................................................................................................... 1 Destek alın.......................................................................................................... 2 Başlamadan önce: bir kereye mahsus işlemler.......................................................................... 2 Prosedür............................................................................................................ 3 Paneller Bu hızlı referans kartı aşağıdaki TrueScience RespiFinder Identification Panels'i kapsar: Panel Saklama 4460381 TrueScience RespiFinder 15 Viral Identification Panel 50 test 4460382 TrueScience RespiFinder 19 Pathogen Identification Panel 50 test Ürün açıklaması ve prensipler TrueScience RespiFinder Identification Panels, solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan patojenleri belirlemek ve birbirinden ayırt etmek için multipleks PCR testini kullanır. TrueScience RespiFinder Identification Panels testi bir birleştirilmiş ters transkripsiyon/pcr adımı (virus RNA'sını cdna'ya dönüştürmek ve hedef DNA/cDNA'yı güçlendirmek için), bir prob hibridizasyon adımı ve bir prob ligasyon/ amplifikasyon adımını içerir. Gerçek negatif örnekler ile nükleik asit yıkılımı, PCR inhibisyonu veya kullanma hatalarının neden olduğu yalancı negatifleri ayırt etmek için teste bir Internal Amplification Control (IAC) dahil edilmiştir. Hedefler, kapiller elektroforezin kullanıldığı DNA boyutlandırma fragmanı analizi yoluyla tespit edilebilir. İlave bilgi için, TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol'e (PN 4460429) başvurun. Panel Tespit edilen patojenler Hedef prob setlerinin sayısı Prob boyu aralığı TrueScience RespiFinder 15 Viral Identification Panel TrueScience RespiFinder 19 Pathogen Identification Panel 14 RNA virüsü ve 1 DNA virüsü 15 artı IAC 163 ila 498 nükleotid 14 RNA virüsü, 1 DNA virüsü ve 4 bakteri 19 artı IAC Kullanım amacı TrueScience RespiFinder Identification Panels, saflaştırılmış nükleik asitlerden sık görülen solunum yolu patojenlerini aynı anda belirlemeyi ve tanımlamayı amaçlayan kalitatif çok parametreli testlerdir. Girilen örnek, solunum yolu enfeksiyonları şüphesi bulunan hastalardan alınan nazofarengeal sürüntüler, burun aspiratları, balgam ve bronko-alveoler lavajlardan (BAL) elde edilen ve saflaştırılan total nükleik asitlerdir. Klinik örneklerin hazırlanması panellerin kapsamından ayrı bir süreçtir; örnekleri hazırlamak ve nükleik asitleri elde etmek ve saflaştırmak için uygun yöntemleri veya ürünleri kullanın.
TrueScience RespiFinder Identification Panels, diğer klinik ve laboratuar bulgularıyla birlikte kullanıldığında, solunum yolu enfeksiyonu tanısında yardımcı olur. Negatif sonuçlar viral veya bakteriyel solunum yolu enfeksiyonunun yokluğunu kesin olarak göstermez; negatif sonuçlar tanı, tedavi veya diğer tedavi kararlarının tek dayanağı olarak kullanılmamalıdır. Pozitif sonuçlar, diğer patojenlerle eş zamanlı enfeksiyon olasılığını ortadan kaldırmaz. Tespit edilen patojen(ler) hastalığın kesin nedeni olmayabilir. Kesin tanıya klinik durumla ilgili diğer laboratuar testleri ve değerlendirme dahil edilmelidir. Performans özellikleri www.qcmd.org'den alınan onaylanmış EQA panelleriyle belirlenmiştir. Bu ürün laboratuar çalışanları tarafından kullanılmalıdır ve Life Technologies firmasından sağlanabilen belirli cihazlar ve veri analiz yazılımıyla kullanımı amaçlanmaktadır. Destek alın Tüm bölgelere ait en son hizmetler ve destek bilgileri için, www.appliedbiosystems.com adresine gidin ve ardından Support için linki tıklayın veya yerel Life Technologies temsilcinizle irtibat kurun. Başlamadan önce: bir kereye mahsus işlemler Çalışma alanlarını hazırlama Kontaminasyonu önlemek için, deneme niteliğindeki faaliyetleri ayrı alanlarda yapmanız kesinlikle önerilir. Ayrıntılar için TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol'e (PN 4460429) başvurun. Termal işlem cihazını programlama Termal işlem cihazını aşağıdaki üç programla programlayın: 1. Ters transkripsiyon ve PCR programı 2. Prob hibridizasyon programı 3. Ligasyon ve PCR programı Aşama Sıcaklık Süre (dd:ss) Aşama Sıcaklık Süre (dd:ss) Aşama Sıcaklık Süre (dd:ss) Ters transkripsiyon Aktif hot-start Taq Döngü: 30 döngü Veri toplama yazılımını kurma 50 C 30:00 DNA denatürasyonu 95 C 15:00 Prob hibridizasyonu 98 C 10:00 Prob ligasyonu 54 C 15:00 60 C 60:00 İlk denatürasyon 95 C 2:00 94 C 00:30 Bekleme 60 C Doğrudan Döngü: 94 C 0:30 55 C 00:30 bir sonraki 33 döngü adımla 60 C 0:30 72 C 01:00 devam edin 72 C 1:00 Bekleme 20 C Doğrudan bir sonraki adımla devam edin veya saklayın 1 haftaya kadar 4 C veya daha uzun sürelerde 20 C sıcaklıkta saklayın. Bekleme 20 C Doğrudan kapiller elektroforezle devam edin veya saklayın TrueScience RespiFinder Identification Panels'leri ilk kez kullanmadan önce, 3130/3130xl Data Collection Software v3.0 veya v3.1'i veya 3500 Data Collection Software v1.0'ı kurun. Talimatlar için TrueScience RespiFinder Identification Panels Software Setup and Data Analysis User Guide'a (PN 4460428) başvurun. Kullanım kılavuzunu indirmek için, www.appliedbiosystems.com/respifinderlit adresine gidin ve ardından Literature/Support sekmesini seçin. 2
Prosedür 1 Total nükleik asitleri elde edin ve lizise uğratılmış örneklere Internal Amplification Control'ü (IAC) ilave edin a. Klinik örnekleri toplayın. Kılavuz bilgiler için TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol'e (PN 4460429) başvurun. b. (Önerilen) Örnekler visközse ve/veya katı hücre bileşenleri içeriyorsa, örnekleri ön-işleme tabi tutun. Ayrıntılar için TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol'e (PN 4460429) başvurun. c. Uygun bir ekstraksiyon yöntemini kullanarak ve üretici talimatlarını takip ederek total nükleik asitleri (RNA ve DNA) elde edin. Onaylanmış ekstraksiyon yöntemleri için TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol'e (PN 4460429) başvurun. Ekstraksiyon yöntemlerinin çoğunda, 200 µl örnek materyali kullanılması ve 100 µl elüsyon tamponunda ayrıştırılması önerilir. d. Örneğin lizis tamponuyla inkübasyonundan sonra, Internal Amplification Control'ü (IAC) ilave edin ve ardından iyice karıştırın. Her 100 µl elüsyon tamponu için 5 µl IAC ekleyin. ÖNEMLİ! Tüm ekstraksiyon protokolleri için, örneğin lizis tamponuyla inkübasyonunu tamamladıktan sonra IAC ilave edin. Örnek/lizis tamponu karışımına IAC'yi inkübasyon tamamlanmadan önce ilave ederseniz, örnekteki RNazlar ve DNazlar IAC'yi yıkarak yalancı negatiflerin elde edilmesine neden olacaktır. Lizis tamponu RNazları ve DNazları inhibe eder ve IAC'nin yıkılmasını önler. 2 RT/PCR Mix'i hazırlayın ve pipetleyin a. Aşağıdaki maddeleri çözün ve bunları buz üzerinde bekletin. Total nükleik asit (RNA ve DNA) şablonu Dilution Buffer 5 RT-PCR Buffer Pre-Amplification Primer Mix dntp Mix b. İşlediğiniz örneklerin sayısına ilaveten pipetleme esnasında meydana gelen kayıplara ait ilave hacim için yeterli RT/PCR Mix hazırlayın. Karışımı hazırlarken aşağıdaki reaktif kullanma kılavuzunu takip edin: RT-PCR Enzyme Mix için: Karışımı, saklama yerinden pipetleme işleminden hemen önce çıkarın. Karışımı 5 saniye süreyle santrifüjleyin, ardından pipete çekip boşaltarak nazikçe karıştırın. Karışımı kullanırken, düşük tutma hacmine sahip pipet uçları kullanın. Kullandıktan hemen sonra karışımı derhal saklama yerine götürün. Diğer tüm reaktifler ve total nükleik asit şablonu için: Kullanmadan hemen önce tüpleri vorteksleyin ve kısa süreyle santrifüjleyin. RT/PCR Mix bileşeni Reaksiyon başına hacim Dilution Buffer 5,5 µl 5 RT-PCR Buffer 5,0 µl Pre-Amplification Primer Mix 2,5 µl dntp Mix 1,0 µl RT-PCR Enzyme Mix 1,0 μl Reaksiyon başına RT/PCR Mix toplam 15 µl hacmi c. RT/PCR Mix'i kısa süreyle vorteksleyin, 0,2-mL PCR tüplerine 15 µl dağıtın ve ardından tüpleri kapatın. PCR Tüplerini buz üzerinde tutun. 3
3 Probe Hybridization Mix'i hazırlayın ve pipetleyin a. Dilution Buffer, Hybridization Buffer ve Probe Mix'i çözün, ardından tüm malzemeleri buz üzerinde bekletin. b. İşlediğiniz örneklerin sayısına ilaveten pipetleme esnasında meydana gelen kayıplara ait ilave hacim için yeterli Probe Hybridization Mix hazırlayın. Not: Kullanmadan hemen önce her reaktifi vorteksleyin ve kısa süreyle santrifüjleyin. Probe Hybridization Mix bileşeni Reaksiyon başına hacim Dilution Buffer 3,0 µl Hybridization Buffer 1,5 µl Probe Mix 1,5 µl Reaksiyon başına Probe Hybridization Mix toplam hacmi 6,0 µl c. Yeni 0,2-mL PCR tüplerine 6 µl Probe Hybridization Mix pipetleyin, tüpleri kapatın, ardından PCR tüplerini kullanılana kadar 4 C sıcaklıkta tutun. 4 5 Ters transkripsiyon ve PCR'ı kurun ve çalıştırın Prob hibridizasyonu kurun ve çalıştırın a. 15 µl RT/PCR Mix içeren her PCR tüpüne 10 µl total nükleik asit şablonu ilave edin. Nazikçe pipete çekip boşaltarak içeriği iyice karıştırın, ardından kısa süreyle santrifüjleyin. Termal işlem cihazının ön ısıtması tamamlanana dek PCR tüplerini buz üzerinde tutun. Not: Dahili laboratuar prosedürleriniz bir negatif kontrol çalışmanızı gerektiriyorsa, 10 µl DNaz/ RNaz-içermeyen suya 0,25 µl Internal Amplification Control ilave edin, ardından bu karışımı 15 µl RT/PCR Mix içeren bir PCR Tüpüne ilave edin. b. Ters Transkripsiyon/PCR Termal işlem cihazı programını başlatın. Sıcaklık 50 C'ye ulaştığında, PCR tüplerini termal işlem cihazına yerleştirin. a. Her ters transkripsiyon/pcr reaksiyonuna 100 µl steril su (sağlanmamıştır) ilave edin, ardından nazikçe pipete çekip boşaltarak iyice karıştırın. b. 6 µl Probe Hybridization Mix içeren her tüpe 2 µl seyreltilmiş ters transkripsiyon/pcr reaksiyonu ilave edin, ardından kısa süreyle santrifüjleyin. c. PCR tüplerini termal işlem cihazına yerleştirin, ardından Prob Hibridizasyon programını çalıştırın. ÖNEMLİ! Prob hibridizasyonunun son 60 dakikasında, TwoStep Mix'i hazırlayın. Prob hibridizasyonundan sonra, beklemeden ligasyon aşamasına ilerleyin ve PCR çalışmasını başlatın. Ligasyon ve PCR çalışmasına ilerlemeye hazır olana dek termal işlem cihazındaki PCR tüplerini 60 C'de tutun. 6 (Prob hibridizasyonu sırasında) TwoStep Mix'i hazırlayın Prob hibridizasyonu çalışmasının son 60 dakikasında, TwoStep Mix'i hazırlayın: a. TwoStep Buffer'ı çözün, ardından buz üzerinde bekletin. b. İşlediğiniz örneklerin sayısına ilaveten pipetleme esnasında meydana gelen kayıplara ait ilave hacim için yeterli TwoStep Mix hazırlayın. Kullanana dek karışımı buz üzerinde tutun. Karışımı hazırlarken aşağıdaki reaktif kullanma kılavuzunu takip edin: Ligase Enzyme ve Taq Polymerase için: Her bir reaktifi, saklama yerinden pipetleme işleminden hemen önce çıkarın. Her reaktifi 5 saniye süreyle santrifüjleyin, ardından nazikçe pipete çekip boşaltarak her reaktifi karıştırın. Bu reaktifleri kullanırken, düşük tutma hacmine sahip uçları kullanın. Kullandıktan hemen sonra reaktifleri derhal saklama yerine götürün. 4
TwoStep Buffer'ı pipetlemeden önce vorteksleyin ve kısa süreyle santrifüjleyin. TwoStep Mix bileşeni Reaksiyon başına hacim TwoStep Buffer 30,6 µl Ligase Enzyme 1,0 µl Taq Polymerase 0,4 µl Reaksiyon başına TwoStep Mix toplam hacmi 32,0 µl 7 (Prob hibridizasyonundan hemen sonra) Ligasyon ve PCR'ı ayarlayın ve çalıştırın Prob hibridizasyonu çalışmasından hemen sonra: a. Prob hibridizasyonu programını durdurun ve Ligasyon ve PCR programını bekletmeden çalıştırın. b. Termal işlem cihazının sıcaklığı 54 C'ye ulaştığında, termal işlem cihazı bloğunun sıcaklığını 54 C'de tutumak için Pause öğesine basın. c. Ligasyon ve PCR için prob hibnridizasyon reaksiyonlarını hazırlayın: 1. Prob hibridizasyon reaksiyonlarını termal işlem cihazından çıkarın. 2. Her 8 µl prob hibridizasyon reaksiyonuna 32 µl TwoStep Mix ilave edin. 3. Tüpleri tekrar termal işlem cihazına yerleştirin. Not: Çok sayıda reaksiyonu çalışıyorsanız, 7c adımını gruplar halinde gerçekleştirin. Örneğin, 8-şeritli tüpleri kullanıyorsanız, 8 reaksiyonu çıkarın, TwoStep Mix ilave edin, ardından sonraki 8 reaksiyonu çıkarmadan önce termal işlem cihazındaki tüpleri değiştirin. d. Durdurulmuş Ligasyon ve PCR programını beklemeden yeniden başlatın. 8 Kapiller elektroforezi gerçekleştirin a. Boy standardı, formamid ve PCR ürününü birleştirin: 1. Aşağıdakileri birleştirin ve iyice karıştırın. İşlediğiniz örneklerin sayısına ilaveten pipetleme esnasında meydana gelen kayıplara ait ilave hacim için yeterli hacim hazırlayın. Size Standard Mix bileşeni Reaksiyon başına hacim (PCR ürünü veya reference marker) GeneScan 600 LIZ Size Standard (PN 4366589) 0,5 µl Hi-Di Formamide (PN 4311320) 10,0 µl Reaksiyon başına Size Standard Mix toplam hacmi 10,5 µl 2. 96 kuyucuklu optik plakta, gerekli sayıda kuyucuğun her birine 10,5 µl Size Standard Mix pipetleyin. 3. (Önerilen) Size Standard Mix içeren kuyucuklardan birine 1 µl Reference Marker (FAM ) pipetleyin. Karıştırmak için pipeti kullanın. 4. Her örnek PCR ürünü için: 45 µl deiyonize suda 5 µl örnek PCR ürünü seyreltin. Size Standard Mix içeren bir kuyucuğa 1 µl seyreltilmiş örnek PCR ürününü pipetleyin, ardından karıştırmak için pipeti kullanın. Not: Bazı durumlarda (örneğin, yüksek virüs yükü), ölçek dışı tepe değerlerini önlemek için PCR ürünü ilaveten seyreltmek gerekebilir. İlave bilgi için TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol'e başvurun. 5. Plağı uygun bir kapla kapatın. 5
9 Verileri analiz edin ve yorumlayın b. Örnek plağını çalışın 1. Sıvının kuyucukların tabanına gelmesi ve hava kabarcıklarını uzaklaştırmak için plağı 1000 g'de 10 saniye süreyle santrifüjleyin. 2. Plağı genetik analizöre yükleyin, veri toplama yazılımını TrueScience RespiFinder Identification Panels Software Setup and Data Analysis User Guide'da (PN 4460428) açıklanan şekilde kurun, ardından plakla irtibatlayın ve çalışmayı başlatın. Önerilen analiz ayarları, paneller ve binset'leri kullanarak verileri analiz etmek suretiyle patojen aday durumu tanımlaması yapın. Talimatlar için, TrueScience RespiFinder Identification Panels Software Setup and Data Analysis User Guide'a (PN 4460428) başvurun. Life Technologies, her laboratuarın kendi yorumlama ve raporlama prosedürleri ve kriterlerini geliştirmesini önerir. 6
7
Not for sale in U.S.A. Yasal Uyarı Bu veya herhangi diğer tanı panelinden elde edilen sonuçlar sadece genel klinik tablo bağlamında kullanılmalı ve yorumlanmalıdır. Life Technologies verilmiş olan herhangi bir klinik kararın sorumluluğunu kabul etmez. Life Technologies, bu kılavuzun TrueScience RespiFinder Identification Panels kullanılarak elde edilecek tüm olası sonuçların kapsamlı bir özeti olduğunu beyan etmemektedir. Bu kılavuzun kullanım amacı sadece hatırlamaya yardımcı olmaktır. Test sonuçlarının klinik yorumunda kullanılmaz. Laboratuarlar testin sonuçlarının kendi bünyelerinde geliştirdikleri yerel prosedürlere göre yorumlamalı ve raporlamalıdır. Information in this document is subject to change without notice. APPLIED BIOSYSTEMS DISCLAIMS ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE. TO THE FULLEST EXTENT ALLOWED BY LAW, IN NO EVENT SHALL APPLIED BIOSYSTEMS BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF, WHETHER OR NOT FORESEEABLE AND WHETHER OR NOT APPLIED BIOSYSTEMS IS ADVISED OF THE POSSIBILITY OF SUCH DAMAGES. Etiketler ve ambalajda kullanılan semboller: ÜRETİCİ TEST SAYISI KULLANMA TALİMATLARINA BAŞVURUN GÖSTERİLEN SICAKLIKTA SAKLAYIN GÖSTERİLEN TARİHTEN ÖNCE KULLANIN KATALOG KODU LOT VEYA PARTİ NUMARASI Life Technologies Ltd. 7 Kingsland Grange Woolston, Warrington, WA1 4SR, United Kingdom www.appliedbiosystems.com/respifinderlit NOTICE TO PURCHASER: This product is a RespiFinder product manufactured by PathoFinder B.V. in Maastricht, The Netherlands within quality systems accredited to ISO13485:2003. These products are sold for use by the end-user only and may not be re-sold, distributed or re-packaged. LIMITED USE LABEL LICENSE: No right to resell this product or any of its components is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. For information on obtaining additional rights, please contact outlicensing@lifetech.com or Out Licensing, Life Technologies, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008. Trademarks: The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners. RespiFinder is a registered trademark of PathoFinder B.V. TRUESCIENCE RESPIFINDER IDENTIFICATION PANELS PROFESYONEL İN VİTRO TANI TESTİ İÇİN SAĞLANMAKTADIR. BU ÜRÜN, HOFFMANN-LA ROCHE (HOFFMANN-LA ROCHE LTD, DIAGNOSTICS, CH-4070 BASEL, SWITZERLAND) VE ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, INC (ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, INC., 1145 ATLANTIC AVENUE, ALAMEDA, CALIFORNIA 94501) DAHİL HERHANGİ BİR ÜÇÜNCÜ TARAFIN SAHİBİ OLDUĞU PATENT HAKLARI ALTINDAKİ PCR ÇALIŞMASI İÇİN BİR LİSANS SAĞLAMAMAKTADIR. Testlerin onaylanmasından ve RespiFinder ürünlerinin prosedürleri ve kullanımına ilişkin yasal gerekliliklere uygunluktan müşteri sorumludur. 2011 Life Technologies Corporation. All rights reserved. Part Number 4461394 Rev. B 07/2011 Translated from the English PN 4460430 Rev. A Headquarters 5791 Van Allen Way Carlsbad, CA 92008 USA Phone 760.603.7200 www.lifetechnologies.com Technical Resources and Support For the latest technical resources and support information for all locations, please refer to our Web site at www.appliedbiosystems.com