KULLANIM KILAVUZU. LCD Array Kit. Süt ID 2.0. Customized LCD-Array Kit. Kod: A

Transkript

1 KULLANIM KILAVUZU LCD Array Kit Süt ID 2.0 Customized LCD-Array Kit Kod: A

2 1) Giriş: Bu dizi süt ve süt ürünlerinde hayvan DNA'sının hızlı, kolay ve güvenilir tanımlaması için geliştirilmiştir. İnek, koyun, keçi, manda, at ve deve gibi süt üretiminde sık kullanılan türlerin hayvan DNA'sı paralel olarak tespit edilecektir. Bu test süt analizi ve birden fazla hayvan türünden süt içeren süt ürünü hazırlıkları için uygundur. 1.1) Metod: Başlangıç materyali olarak süt veya süt ürünlerinden ekstrakte edilen ekstrakte edilmiş DNA kullanılarak (1), mitokondriyal 16S rrna genlerinin küçük parçaları ilk PCR ile amplifiye edilecektir. Bu amplifikasyon esnasında üretilen PCR parçaları Biotin ile etiketlenir (2). PCR amplikonları dizinin yüzeyi üzerinde türlerin spesifik yakalama probları ile hibridize edilir (3). Spesifik olmayan şekilde bağlı PCR amplikonları yüksek sıkılık altında kısa yıkama ile kaldırılacaktır. Kalan özellikle bağlanmış amplikonlar Streptavidin-Peroksidaz konjugat ile inkübasyon ile görüntülenebilir ve peroksidaz substrat ile (TMB) inkübasyondan sonra karanlık bir çökeltinin sonraki oluşumu boyama solüsyonu olarak sağlanabilir (4). ekstrakte edilen DNA Biotin katma ile PCR Dizi hibridizasyon TMB çökelmesi ile algılama Figür 1: Test prensibi

3 1.2) Test Performansı: Bu amplikonlar mitokondriyal genomların (mt-dna) 16S rrna bölgesinde sağlanan primer karışım kaynağı ile üretildi. Çoğu dokuda ve kısa amplikon uzunluğunda (~125 bp) mt-dna nın yüksek kopya sayısı nedeniyle bu test çok hassas olarak kabul edilmelidir. Standart koşullar altında (ör. PCR amplifikasyonu için 35 PCR döngüsü) bir süt türünün diğerine %1 gibi küçük eklemeleri tespit edilebilir. (ör.99% keçi sütünde 1% inek sütü). Bu test taze süt ve ürünlerin analizi için geliştirildiği için bu nedenle, PCR döngü sayısının artması gerekli olabilir eğer yüksek derecede işlenmiş süt ürünlerinin analizi öngörülür ise. Verilen PCR primer karışımları ile amplifiye hedefler yüksek derecede korunmuş dizilerdir ve dizi üstünde lekeli problar türlerin özgünlüğü için iyice değerlendirilmiştir (yakalama probu özelliklerinde ayrıntılar için Figür 2 bakın). Prob dizaynı mevcut veri tabanı girişleri ve Chipron GmbH referans materyalin dizi analizine dayanır. Modern ırklar ve cinslerin karmaşıklığı sebebiyle bu göz ardı edilemez, nadir genotipler analizden kaçar. 1.3) Dizi Modeli: Her LCD-Chip dikdörtgen biçimindeki reaksiyon bölmelerinde sekiz aynı dizi içerir, ayrı ayrı ele alınabilir. Tüm türe özel yakalama probları dikey çiftler olarak konumlandırılır. Her türün pozitif algılaması iki dairesel hibridizasyon sinyalleri ile belirtilir. Hibridizasyon, ikincil etiketleme ve boyama izlemek için fonksiyonel kontroller üç köşede bulunur. Süt ID 2.0 kit dizileri 7 x 7 modellerdir 350 μm ortalama spot çapları ile. * = Yakalama probu Cins Camelus her iki türünüde algılar ( C. bactrianus & C. dromedarius). ** = Yakalama probunun çapraz reaktivitesi Eşek için 100% ile. At belki oluşur. Figür 2: Dizi Modeli ve prob özellikleri

4 2 Saklama koşulları & kit içeriği Belirtilen sıcaklıkta saklandığında ve özellikle tanımlananın dışında kullanılmadığında, tüm bileşenler son kullanma tarihlerine kadar stabildir. Son kullanma tarihleri bileşenlerin etiketinde veya beraberindeki ambalajların etiketlerinde basılıdır. Altıdan fazla dondurma ve çözdürme döngülerinden bileşenler için kaçınılmalıdır, donmuş saklama gerektirir. Gerekirse, alikotlar hazırlayın. Bileşen A (32 test) A (96 test) Saklama LCD-Dizileri 1 kutu, 04 chips 3 kutu, 12 chips +4 C Yıkama Tozu 1 şişe 2 şişe +4 C Primer Karışım ET 1 x 75 µl 2 x 75 µl -10 C to 25 C Alıgılama Kiti I Modulator 1 x 300 µl 2 x 300 µl +4 C Dillüsyon Tampon 1 x 2000 µl 2 x 2000 µl +4 C Boyama 1 x 2000 µl 2 x 2000 µl (*) +4 C Algılama Kiti II Hibridizasyon Tamponu B 1 x 1750 µl 2 x 1750 µl -10 C -25 C Etiket 1 x 25 µl 2 x 25 µl -10 C -25 C Ek malzemeler Manuel, Pattern File, MSDS 1 CD 1 CD --- Chip-Box Konnektörler 2 konnektör 6 konnektör --- (*) = Boyama solüsyonunu daima karanlıkta tutun, direkt Işıktan koruyun.

5 3 Ekipman ve reaktifler - kit ile birlikte verilmez Aletler - Termal döngü - Su banyosu ( 35 C ye ayarlanabilir) - LCD-Arrays için santrifüj (kat. no HS , Chipron GmbH) - Mikro pipetler (2 µl den 1000 µl ye aralık) opsiyonlu: - SlideScanner PF3650u (kat. no HS , Chipron GmbH) - SlideReader Analysis Software (kat. no HS , Chipron GmbH) Reaktifler& Materyaller - DNA ekstraksiyonu için reaktifler - PCR kimyasalları ( Taq Polimeraz, Tampon, dntps) - PCR grade su - Deiyonize su - Tek kullanımlık eldivenler - Steril filtreli uçlar - PCR reaksiyon kanalları - 3 yıkama konteynırı ( ml her biri) - 1l-şişeler 4 Reaktiflerin hazırlanması YıkamaTamponu 20 x yıkama tampon konsantre hazırlamak için bir tane yıkama tozu şişesi içeriğini 1litre deiyonize su içinde çözün. 1 x yıkama tamponu hazırlamak için 950 ml deiyonize suya 20 x yıkama tamponu konsantreden 50 ml ekleyin. 1 x yıkama tamponunu daima taze hazırlayın. Yıkama-Tamponu solüsyonlarının stabilitesi: 20 x Konsantre oda sıcaklığında 2 ay, +4 C de 12 ay Eğer çökelti oluşursa, çözeltiyi 42 C ye ısıtın ve kullanmadan önce oda sıcaklığına denge sağlamasına izin verin 1 x Çalışma solüsyonu oda sıcaklığında min. 10 gün

6 5 Uyarılar ve önlemler - Tüm protokol adımları sadece iyi eğitimli laboratuar personeli tarafından yapılmalıdır. - Kılavuzu başlamadan önce dikkatle ve tamamen okuyun. - Boyama solüsyonunun ışığa herhangi bir maruziyetinden kaçının. Daima karanlıkta tutun. - Kitteki tüm reaktifler bu özel test için optimize edilmiştir. Kit reaktiflerin değişikliği performansı etkileyebilir. - Örnek materyaline uygulanan aynı genel güvenlik kuralları bütün protokol boyunca takip edilmelidir. - İlk protokol aşamasında üretilen PCR ürünlerinin ilerki PCR için kontaminasyon kaynağı gibi dikkate alınması gerekir. Bu nedenle, tüm hibridizasyon, yıkama, boyama, kurutma ve analiz aşamaları post-pcr alanında yapılmalıdır. Kontaminasyonlardan korumak için PCR moleküler diagnostik laboratuarında çalışma için standart kurallara uyun. 6 Genel güvenlik bilgisi Kimyasallarla çalışırken, her zaman uygun bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlük kullandığınızdan emin olun Ürünlerimizle ilgili daha fazla bilgi için, lütfen uygun materyal güvenlik veri sayfalarına bakın (MSDS), kit ile birlikte verilen CD'de bulunabilir. Hibridizasyon Tamponu formamid ( >50%) ve N-Dodekanoil-N-methylglycin-Sodyum tuzu içerir. Hibridizasyon tamponu bu nedenle formamid olarak ele alınmalıdır. Toksik, zararlı, tahriş edici Riskvegüvenlik ifadeleri: R61, R36, R38, S24, S26 Yıkama Tozu N-Dodekanoil-N-methylglycin-Sodyum tuzu içerir. Zararlı, tahriş edici Riskvegüvenlik ifadeleri: R36, S24, S26 Boyama 3,3,5,5 - Tetramethylbenzidin (> 0.5 %) içerir. Zararlı, tahriş edici Riskvegüvenlik ifadeleri: R20/21/22, R36/37/38, R40 (Öz Değerlendirme) Modulator Zararlı, tahriş edici Riskvegüvenlik ifadeleri: R36/37/38 S26/36 (Öz Değerlendirme)

7 7 Protokol 7.1 PCR amplifikasyon PCR yapısı 2 x PCR Master Karışım Kullanılarak (Taq-Polimeraz, dntps, Tampon ve MgCl2 içerir) Reaksiyon sayısı (25 μl her biri) 1 4 (set up 5) 8 (set up 9) 2x Master Karışım ( MgCl2 final mm içerir) 12.5 μl 62.5 μl μl Primer Karışım Et 1.5 μl 7.5 μl 13.5 μl PCR grade su 6.0 μl 30.0 μl 54.0 μl Toplam hacim 20.0 μl μl μl Alikot into 4 x 20.0 μl 8 x 20.0 μl Kalıp Kalıp olarak ekstrakte edilen DNA dan 5.0 μl her reaksiyon tüpüne ekleyin. Not: Eğer kalıbın daha büyük veya daha küçük hacimlerinin eklenmesi gerekirse, buna göre ilave edilen su miktarını azaltın

8 7.1.3 Cycler ayarları Aşağıda verilen döngü düzeni şunların kullanımı için optimize edilmiştir - HotStar Taq Plus Master Mix Qiagen GmbH [Kod ] - TProfessional Standard Cycler, Analytik Jena AG [Kod ] PCR döngüsünün diğer kombinayonları ve enzim kullanılacaksa, verilen protokolde küçük değişiklikler gerekli hale gelebilir. Test optimizasyonunun herhangi bir türü için yardım isterseniz, lütfen yerel distribütörünüz veya Chipron destek ekibine ulaşın. Aşama Süre Sıcaklık Ramp Not 1) Initial Denaturasyon 5:00 dk 95 C bazısı ile uzun 2) 35* repetitions of: Hot-Start enzimler Denaturasyon 0:30 dk 94 C 3 C / sn Annealing 0:45 dk 57 C 3 C / sn Elongation 0:45 dk 72 C 3 C / sn 3) Strand tamamlama 2:00 dk 72 C * Yüksek duyarlılık için PCR döngülerinin artan sayısı Agaroz jel inceleme Diziler ilk kez kullanılacaksa veya optimizasyon gerekliyse, agaroz jel elektroforez ile PCR amplifikasyonunu analiz etmek için önerilir. ( 2.0 % agaroz jel ). Beklenen parça boyutu: bp (bağlı türler). 7.2 LCD Dizi hibridizasyon ve tespit Ilk kez kullanacak kullanıcı için ayrıntılı protokol ileri düzey kullanıcılar kısa protokol bakınız (chapter 7.3.) Genel Açıklamalar LCD-Arrays çalışma prensibi DNA/DNA hibridizasyon olduğu için, testlerin özgüllüğü ve duyarlılığı esas olarak 30 dakikalık hibridizasyon adımı süresince hibridizasyon şiddeti ile kontrol edilir. Etkileşen moleküllerin konsantrasyonundan ayrı, hibridizasyon şiddetinde en büyük etkisi olan iki faktör sıcaklık ve tampon bileşimidir (ör. tuz konsantrasyonu, formamid, üre v.s.). Hibridizasyon boyunca sıcaklığın ve pipetleme hacimlerinin tam olarak kontrol edilmesi önemlidir. Kalibre termometreler ve mikro pipetlerin kullanılması önemle tavsiye edilir. 1 C veya 1µl den fazla sapmaların ciddi etkileri olabilir.

9 7.2.1 Hibridizasyon 1) Su banyosu sıcaklığını 35 C ye ayarlayın ve nem bölmesinin her köşesine bir damlacık su ekleyin. LCD-Chip ön ısıtma YAPMAYIN. Bu chip oda sıcaklığına gelmesi gerekir. 2) Hybridizasyon Karışımı Hazırlama Tüm bileşenlerin oda sıcaklığına geldiğinden emin olun. Reaksiyonların numarası 1 4 (set up 5) 8 (set up 9) Hibridizasyon tampon B 22 µl 110 µl 198 µl Modülatör 2 µl 10 µl 18 µl Aliquot per* - 24 µl 24 µl * 0.2 ml reaksiyon şişeleri veya 8-well PCR stripleri reaksiyonları ayarlamak için uygundur 3) Hibridizasyon Karışımıyla PCR ürünlerini Birleştirme 10 µl PCR ürününü Hibridizasyon Karışımının ilgili kısmına ekleyin. Birkaç kez aşağıya ve yukarıya doğru pipetleme ile iyice karıştırın vortex yapmayın! 4) Hibridizasyonu başlatma Nem bölmesine slaytı yerleştirin ve ilgili alanlara 28 μl PCR-Hibridizasyon karışımlarını pipetleyin. PCR-Hibridizasyon karışımlarının ilgili array alanının tüm reaksiyon bölgesiyle temasta olduğundan emin olun chip yüzeyiyle pipetleme ucunun herhangi bir temasından kaçının. Önceden ayarlanmış su banyosuna mümkün olduğunca çabuk kapalı nem bölmesi transfer edin (bu bölme yüzey üzerinde yüzecektir). 5) Slaytı 30 dakika 35 C de inkübe edin. 6) 1 x yıkama tamponuyla üç yıkama kabı hazırlayın (~ 150 ml her biri). 20 x yıkama tampon konsantreden 1 x yıkama tamponu hazırlayın, 950 ml deiyonize suya 50 ml konsantre ekleyerek. İyice karıştırın. 7) Yıkama tamponu ile ilk kapta slaytı tamamen batırın ve 3 kez yavaşça ileri ve geri hareket ettirin. Slaytı hızlı şekilde daldırın, field cross talk alanından kaçının. Yıkama kabi ikide prosedürü tekrarlayın. Daha sonra, slaytı kap üçe aktarın ve 1 dakika inkübe edin. 8) CHIP Spin FVL2400N de 15 saniye döndürme ile slaytı kurutun (Kat.No. HS ).

10 7.2.2 Etiketleme 9) Etiketleme karışımı hazırlayın Reaksiyonların numarası 1 4 (setup 5) 8 (setup 10) Dilüsyon Tampon 27.0 µl 135 µl 270 µl Modülatör 3.0 µl 15 µl 30 µl Etiket 0.2 µl 1 µl 2 µl Toplam 30.2 µl 151 µl 302 µl Vortex veya yoğun pipetleme ile iyice karıştırın 10) Slaytın her alanına 28 μl etiket karışımı uygulayın Etiket karışımının ilgili array alanının tüm reaksiyon bölgesiyle temasta olduğundan emin olun chip yüzeyiyle pipetleme ucunun herhangi bir temasından kaçının. 11) Oda sıcaklığında 5 dk slaytı inkübe edin. 12) Üç kabın hepsinde yıkama tamponunu değiştirin ve adım 7den yıkama prosedürünü tekrarlayın). 13) Adım 8deki gibi slaytı kurutun) Boyanma 14) 28 Boyama solüsyonunu her alana uygulayın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Alanların yıkama solüsyonundan herhangi bir iz içermediğinden emin olun alanlar tamamen kuruyana kadar bekleyin. hazırlayın. Boyama stok solüsyonunun herhangi kontaminasyonundan kaçının! Gerekirse aliquots 15) Adım 12den son yıkama kabında slaytı durulayarak boyama işlemini durdurun) 15 saniye için. 16) Adım 8deki gibi slaytı kurulayın). Slaytlar okuma için şimdi hazırdır ve önemli bir sinyal yoğunluğu kaybı olmadan birkaç yıl karanlıkta tutulabilir

11 7.3 Kısa protokol 1) Su banyosu sıcaklığını 35 C ye ayarlayın. 2) Her reaksiyon için 22 μl Hibridizasyon tampon B, 2 μl Modulator ve 10 μl PCR ürünü karıştırın. İlgili array alanına 28 µl bu solüsyondan uygulayın. 3) 30 dakika 35 C de slaytı inkübe edin (nem bölmesinde) 4) şununla 3 yıkama kabı hazırlayın ~ 150 ml her bir 1x yıkama solüsyonu. ( 20x konsantreden taze hazırlanan 1 x yıkama tamponu ) 5) Slaytı 10 saniye yıkama kabı 1 ve 2de durulayın her birini ve 1 dakika yıkama kabı üçte inkübe edin. 6) CHIP-Spin Santrifüjde 15 saniye döndürerek slaytı kurulayın 7) Her array alanı başına 27 μl Dilüsyon tamponu, 3 μl Modulator ve 0.2 μl Etiketle birleştirerek etiketleme karışımını hazırlayın. 8) Slaytın her alanına 28 μl etiket karışımı uygulayın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 9) Tüm kaplardaki yıkama solüsyonunu değiştirin ve 5den yıkama prosedürünü tekrarlayın). 10) Adım 6daki gibi slaytı kurulayın). 11) Slaytın her alanına 28 μl Boyama solüsyonu uygulayın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. BOYAMA solüsyonunun Etiket solüsyonunun artıklarıyla kontaminasyonundan kaçının. 12) Adım 9dan son yıkama kabında slaytı durulayarak 5 dakika sonra boyamayı durdurun ) 10 saniye için. 13) Adım 6daki gibi slaytı kurulayın) slayt şimdi analiz için hazırdır.

12 8 Sipariş bilgisi Ürün: Miktar Sipariş No. Süt ID Test / 04 Chips A Süt ID Test / 12 Chips A İlgili Ürünler: Ürün Tanım Sipariş No. Slide Reader Software 1 License HS Scanner PF 7250u Slide Scanner w. 10µm resolution HS CHIP Spin FVL 2400N LCD-Arrays için Mini-Santrifüj HS Üretici teması Chipron GmbH Tel.: + 49 (0) Eresburgstrasse Fax: + 49 (0) D Berlin info@chipron.com Almanya Support: support@chipron.com 10 Sembol anahtarı Aşağıdaki semboller kit kutusunun etiketlerinde ve içindeki bileşenlerde kullanılır Üretici Test sayısı Lot numarası Son kullanma tarihi [ ay yıl ] Sıra numarası Saklama sıcaklığı [ aralık C ]