attomol VZV-DNA-LINA Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir! 1.Giriş

Transkript

1 attomol VZV-DNA-LINA Beyin omurilik sıvısı ve swab numunelerinde VZV-DNA tespitine yönelik test Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir! 20 tespit sipariş numarası: Giriş Varicella zoster (VZV) virüs enfeksiyonları iki sendroma neden olur. Bunlardan ilki daha çok çocukları etkileyen suçiçeğidir(chickenpox). Birincil enfeksiyon için enfeksiyon oranı % 90 dır. Vücudun üzerinde geniş ölçüde dağılan epidermis ve koriumun yayılmış lezyonları vardır. Suçiçeği olan çocuklarda bir ekstrakutanoz enfeksiyon % inde ensefalite sebep olur ve merkezi sinir sistemine saldırır. Suçiçeği zatürreeleri, yetişkinlere göre çocuklarda daha sık görülen bir komplikasyon olarak bilinir(weller, 1996, J Infect Dis, 174: ). Torakal ağrı, siyanoz, ateş, öksürükle enfeksiyon 3-5 gün sonra başlar. X-ışını çalışmaları deri lezyonları ve pnömoni nodüler infiltrasyonunun iyileşmesine rağmen, ateş ve etkilenen akciğer fonksiyonu bozukluğunun haftalar boyunca devam edebildiğini göstermiştir. Suçiçeğine neden olan diğer komplikasyonlar, myokarditis, romatizma, kornea dejenerasyonu, nefrit, ve hepatittir. Anneden gelen suçiçeği doğumdan sonra 2 gün ve 5 günün içinde gözükürse perinatal suçiçeği yüksek bir ölüm oranıyla (30%) sonuçlanır (Arvin, 1996, Semin Dermatol, 15:4-7; Peterslund, 1991, Scand J Infec Dis Suppl, 80:15-20). İkincil sendrom, zoster veya zona hastalığı, spinal gangliyonlarda gizli suçiçeği virüslerinin tekrar harekete geçirmesiyle oluşan tek tük bir hastalıktır. Virüsün tekrar harekete geçirmesine neden olan faktörler bilinmemektedir ve en yüksek yaşları arasında görülür (Arvin, 1996, Semin Dermatol, 15:4-7). Zoster, şiddetli ağrı ile birlikte bir dermatomun içinde tek taraflı kabarcık oluşumu ile tanımlanır. Bir dermatomda ağrı, deri lekelerinin görülmesinden saat önce ortaya çıkar. Hastalık, 7-10 günden sonra azalır ama derinin yenilenmesi 2 ila 4 haftayı alır. Bir zonanın komplikasyonları, postherpetik nevralji ve akut sinir iltihabıdır. Merkezi sinir sistemi de dâhil olabilir. Merkezi sinir sisteminde enfeksiyondan şüphelenilirse, nükleik asit amplifikasyonu olmadan bir viral etiyolojinın kanıtı nadiren de sağlanabilir(dörries et al., 1991, Lab Med, 15:99). Moleküler biyolojik tekniklerin kullanımı, beyin omurilik sıvısında virüs teşhisin özgüllüğünü ve hassasiyetini arttırabilir. Bu test aşağıdaki durumlarda önerilir: Gebelik sırasında alışılmamış klinikte (without skin rash) VZV enfeksiyonları teşhis etmek için

2 Birincil VZV enfeksiyonu veya zoster bir sonucu olarak VZV ensefaliti teşhis etmek için Diğer patojenlerin ayrımı için (Mesela HSV) Belirsiz serolojik teşhisin doğrulaması için (IgG antikorları, IgM antikorlarından önce gelir) 2. Genel Açıklamalar Belirtilen saklama sıcaklığında her kit bileşenini tutun Parmaklarla test şeritlerine dokunmayın, bir pens kullanın Bir bıçak veya neşter kullanarak bloktan şeritleri kesin Bu kit sadece in vitro diagnostik uygulamalar için kullanılmalıdır. Bu kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayın Kullanmadan önce sıvıların küçük miktarlarını içeren tüm tüpleri santrifüjleyin Hafif ısıtma ile 5 kez yıkanan solüsyon da çökeltileri çözün Test çalışması için iyi eğitimli personel ve uygun laboratuar ekipman hususuna dikkat edin Hasta numuneleri, potansiyel enfeksiyonlu madde olarak dikkate alınmalı ve mevcut yasalara göre hareket edilmelidir. PCR* a yönelik reaktifleri, DNA numuneleri ile amplifikasyon ürünlerinden ayrı saklayın. PCR reaksiyonları ile amplife edilmiş numuneleri pipetlerken filtre uçlu farklı pipet setleri kullanın. Hibridizasyon solüsyon(# 127) kullanırken dikkatli olun. Bu solüsyon aşağıdaki R ve S- sınıflandırmaya bağlı olan formamide içerir: R61, S53-24/ Dahil olan malzemeler Sipariş numarası Reaktif Hacim/ Kantite Saklama Isısı 38 deiyonize PCR-H 2 O 0.2 ml -20 C 118 PCR buffer E 0.7 ml -20 C 119 VZV Primer 2 tüplü bir 8.5 μl primer solusyon, primer karışımı hazırlamak için 300 μl PCR buffer E (#118) ile her birini doldurun -20 C 121 Iç standart VZV (yeşil renkli tüpler) 2 tüplü bir 8.5 μl iç standart solusyon, 300 μl primer karışımı ile her birini doldurun. -20 C

3 125 Denatürasyon solüsyonu 0.75 ml 4 C 126 VZV test strips 20 strips 4 C 127 Hibridizasyon solüsyonu (2 x konsantre) 211 Yıkama solüsyonu D* (5 x konsantre) 212 Konjugat buffer (kullanıma hazır) 214 Konjugat C* (500 x konsantre) 14 ml 4 C 24 ml (2 x 12 ml) 4 C 14 ml 4 C 40 μl 4 C 75 Substrate 12 ml 4 C *Terim yıkama solusyonu ve konjugat için yukarıdaki tabloda açıklanan ürüne bu manuelden bakınız. a dahil olan üreticiden sipariş edilebilir yada defalarca kullanılabilir(# 124). Kitteki tüm reaktiflerin miyadı, kutunun dış yüzeyinde bulunan esas etikette bulunmaktadır 4. İlave Reaktifler ve Dahil olmayan malzemeler Hastaların DNA numuneleri Liquor cerebrospinalis ya da swab numunelerden hazırlanır (Qiagen dan spin kolonlar kullanılarak hazırlanır) Qiagen tarafından sağlanan HotStarTaq DNA Polimeraz Kontrol template (VZV pozitif DNA hazırlama) Eppendorf-tüpler (0.2 ml; 1.5 ml) Mikropipetler (hacim aralığı μl) ve steril filtre uçları Thermocycler Thermoshaker Pens, beher, Falcon tüpler, distile su 5. Test Prensibi, Test sonuçlarının yorumlanması DNA LINA, saflaştırılan DNA numunesinin ve DNA iç standardının aynı reaksiyon karışımı içindeki PCR amplifikasyonuyla başlar. Amplifiye olan DNA nın tespiti strip yüzeyinde sabitlenmiş yakalama problarının yönlendirdiği ters hibridizasyon ve sonraki aşamadaki işaretleme reaksiyonu ile gerçekleşir.

4 Hasta numunesi VZV DNA içerirse, patojen-spesifik bant test şeridinde görünür(fig. 1). Bütün numuneler ve kontrollerde iç standart bandı renklenmek zorundadır. Ancak hasta numunesi çok yüksek pozitifliğe sahipse iç kontrol DNA sı ile yarışır ve onu tamamıyla veya kısmen inhibe eder bu durumda iç konrol bandında ya hiç renklenme olmaz ya da çok az renklenme olur(fig.1 bakin, strip 14). Bu durumda sadece kuvvetlice koyulaşan patojen-özel bant görünür. 6. Manuel Test protokolü için gerekli iki adım: (6,1) patojen DNA amplifikasyonu ve (6.2) test şeritler için amplifiye olan DNA nın ters hibridizasyonudur. Hastaların numunelerine ek olarak PCR reaksiyonlarını kontrol etmek için aşağıdaki kontrolleri eklemeniz önerilir: 1. Negatif kontrol (PCR-blank) 2. Pozitif kontrol (VZV-pozitif kontrol template) Kontrol template ayrı olarak üreticisinden de sipariş edilebilir(sipariş numaranızı 123). VZV- DNA için pozitif test edilmiş olan hastaların numuneleri kullanıcı tarafından pozitif kontrol template olarak da kullanılabilir. 6.1 Amplifikasyon Hastaların beyin omurilik sıvısında ya da swab numunelerinden DNA hazırlama Kısaca kapsül solüsyonu içeren renksiz reaksiyon tüpleri santrifüjleyin (#119) ve 300 μl PCR buffer E ile her bir tüpü doldurun(#118). Primer mix. hazırlamak için pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın Kısaca iç standart solüsyonu içeren yeşil reaksiyon tüpleri santrifüjleyin (#121) ve 300 μl primer karışımıyla her tüpü doldurun. Primer mix. hazırlamak için pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın Dikkat: 300 μl den daha az PCR premixe ihtiyacınız varsa geri kalanı -20 C de saklayabilirsiniz.

5 PCR premix e hot start Taq DNA polimeraz ilavesiyle PCR mix hazırlama Bir reaksiyon için kullanılacak toplam PCR premixin miktarını hesaplamak için her bir numune ve kontrol sayıları ile premix miktarı (25 μl) çarpılmalıdır ve bir miktar fazla hacim eklenmelidir (5 reaksiyon için örnek: 5 x 25 μl + 15 μl fazladan hacim = 140 μl PCR premix). Daha sonra, hot start Taq DNA polimeraz (5 U / μl) premix içine son dilüsyon 1:100 olacak şekilde ilave edilmelidir. (örneğin: 140 μl PCR premix + 1,4 μl 5 U / μl polimeraz). Şimdi, PCR mix iyice karıştırılmalıdır. PCR mixi 0.2 ml lik tüplerde eşit hacimlere ayırma: Negatif kontrol: Pozitif Kontrol: Hasta numuneleri: 25 μl PCR mix 25 μl PCR mix 25 μl PCR mix + 10 μl PCR-H2O + 10 μl kontrol template (ca. 20 ng/μl) + 10 μl DNA (ca. 20 ng/μl) PCR thermocyclerde aşağıda listelenen sıcaklık rejimi kullanılarak yapılmaktadır: 40 döngü: 40 s 95 C 35 s 58 C 1 dk 72 C Durdurma: 4 C zaman sınırı yok Dikkat: a) Qiagendan hot start Taq DNA polimeraz kullanılırsa aktivasyon adımları firmanın protokolünde detaylı olarak tanıtılmalıdır(15 min at 95 C). b)bu testin PCR premixi dutpi içerir, bundan dolayı uracil-dna glycosylase (UDG)- dekontaminasyonu,8 mu/μl reaksiyonu karışımının tavsiye edilen UDG enzim konsantrasyonu kullanılarak yapılabilir. Bu durumda iki başlangıç inkübasyon adımı 10 min için 37 C'de, (UDG-reaksiyon) ve ondan sonra 10 min için 95 C'de (UDG de inactivati), PCR-sıcaklık profiline eklenmelidir. Beyin omurilik sıvısından hazırlanan numunelerde VZV in tespiti için bir UDGdekontaminasyonu öneririz. 6.2 Test şeritleri için ters hybridisation tarafından amplifikasyon ürünleri tespit etme Aşağıda listelenen indüksiyon adımları için reaktiflerin miktarları, başlayıcı kit ile sağlanan indüksiyon larının türü için geçerlidir. Diğer indüksiyon ları kullanılırsa, reaktif miktarı ona göre adapte edilmelidir. Bu durumda üretici firmadan toptan eşya gibi ek reaktifler sipariş etmek mümkündür.

6 Protokol adımları 1.2xhibridizasyon solüsyonun 1:2 seyreltilmesi 2. 5xyıkama solüsyonun 1:2 seyreltilmesi İhtiyaç duyulan solüsyonlar ve bileşenler Reaksiyon ampül Sıcaklık Zaman Aletler 14ml 2xhibridizasyon solüsyonu + 14ml distile su=28 ml kullanıma hazır 1xhibridizasyon solüsyonu (4 C de saklayın,4 ay sonra kullanım süresi dolar) Her test şeriti 1 ml 1xhibridizasyon solüsyonuyla inkübe edilmelidir. 12 ml 5xyıkama solüsyonu + 48ml distile su=60 ml kullanıma hazır 1xyıkama solüsyonu (4 C de saklayın,4 ay sonra kullanım süresi dolar) Her test şeriti için 4.5 ml 1xyıkama solüsyonunun toplam miktarına ihtiyaç vardır. 3. Solüsyonun RT dengesi 1xhibridizasyon solüsyonu 1 kullanıma hazır (line 1 bak ) 1xyıkama solüsyonu kullanıma hazır (line 2 bak ) konjugat buffer kullanıma hazır Falcon tüpü gibi RT 4.Amplifikasyon ürününün denatürasyonu 5.hibridizasyon 30 μl amplifikasyon ürünü + 30 μl denatürasyon solüsyonu 6. Hibridizasyon solüsyonu başka bir yere boşaltın 7.Yıkama adımaları (iki Her şerit için 1 ml 1xyıkama kez) solüsyonu(rt)ekleyin, inkübe edin ve sonra tekrar yıkama döngüsünden önce yıkama solüsyonu başka yere boşaltın 8.Konjugat dilusyonu Konjugat buffer da 1:500 (RT) (5 şerit için örnek: 5.4 μl konjugat ml konjugat buffer [RT]) 9. Konjugat Her şerit için 500 μl inkübasyonu konjugat dilusyonu ekleyin 10. Konjugat dilusyonunu başka bir yere boşaltın 11. Yıkama Her şerit için 1 ml adımaları (iki 1xyıkama kez) solüsyonu(rt)ekleyin, Falcon tüp yada küçük beher 42 C 5 dak. Termo Çalkalayıcı (0 rpm) 42 C 60 dak. Termo Çalkalayıcı 42 C 2x6 dak. Termo Çalkalayıcı RT RT 20 dak. Çalkalayıcı RT 2 x 1 dak. Çalkalayıcı

7 inkübe edin ve sonra tekrar yıkama döngüsünden önce yıkama solüsyonu başka yere boşaltın 12. Substrat reaksiyonu Her şerit için 500 μl substrat ekleyin 13. Substrat başka bir yere boşaltın 14. Stop substrat Şeritler için 1 ml reaksiyonu distile su ekleyin 15. Test şeritlerini kurutun(ışıktan koruyun) ve test sonuçlarını yorumlayın RT 20 dak. Çalkalayıcı RT 5 dak. Çalkalayıcı İlk kez her test kiti kullanmadan önce, sadece bir kez gerçekleşmesi için istenen protokol adımları gri ile vurgulanmıştır. RT = oda sıcaklığı *) Eğer 3x konsantre yıkama solüsyonunda çökelti oluşmuşsa hafif ısıtma ile seyreltmeden önce çözün. (30-50 C, su banyosu için). Test uygulaması sırasında sorunlar ile ilgili olarak üretici veya distribütör firmayla bağlantı kurmakta tereddüt etmeyin.