KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER; Çözeltiler ve Tamponlar

KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER; Çözeltiler ve Tamponlar AMAÇ: - Moleküler Biyoloji laboratuvarında kullanılan çözeltileri ve hazırlanışlarını öğrenmek. - Biyolojik tamponların kullanım amaçlarını, özelliklerini ve önemini anlamak. KAZANIMLAR: - Yapacağı deneye uygun çözelti hazırlar. - Hangi deney için nasıl bir tampon kullanılması gerektiğine karar verir. - Laboratuvarda kullanılan tampon çözeltilerini hazırlar. - Çeşitli tampon ve sıvıların ph sını ölçer ve titre eder. GENEL BİLGİ: Çözeltiler, çözücü içinde bir miktar maddenin çözünmesiyle oluşan karışımlardır (Çözelti = çözücü + çözünen madde). Çözünen madde katı, sıvı ve gaz olabilir. Maddelerin çözünme dereceleri birbirinden farklıdır. Su iyi bir çözücüdür, ancak bazı maddeler suda çözünmezler ve o zaman başka çözücüler (alkol, asit, baz vs.) kullanılır. Çözeltiler, molar, molal ve normal çözelti olmak üzere değişik şekillerde ifade edilebilir. Molar çözelti (M): 1 litre (l) çözeltide 1 mol gram (g) madde çözünmüşse bu çözelti 1 molar (M) çözeltidir. Bu tanım esas alınarak orantı yoluyla değişik molar konsantrasyonlarda çözeltiler hazırlanabilir. Örnek 1. 0,2 M ve 1 lt NACl çözeltisi hazırlayalım: NaCl ün moleküler ağırlığı (M.A.) = Na: 23 + Cl: 35,5 = 58,5 g/mol 58,5g NaCl 1 M için ise 0,2 M için ise 0,2 M için 0,2 x 58,5 = 11,7 g NaCl gerekir. Elde edilen NaCl miktarı tartılıp bir miktar saf suda çözülür ve mezura konur. Üzeri saf suyla 1 l ye tamamlanır. Örnek 2. 2 M ve 50 ml şeker (sakkaroz) çözeltisi hazırlayalım: Sakkarozun moleküler ağırlığı 342 g/mol dür. 1 M için 342 g gerekirse 2 M için 2 x 342 = 684 g sakkaroz gerekir. Ancak; bu miktar 1 l içindir. 50 ml için (50 x 684) / 1000= 34,2 g sakkaroz saf suda çözülüp 50 ml ye tamamlanır. Normal çözelti (N): 1 lt çözelti içinde 1 eşdeğer gram çözünmüş madde varsa bu çözelti, 1 normal (N) çözeltidir. Kimyasal etkileşmelerde mol sayısından ziyade eşdeğer ağırlık sayısı önemli olduğundan, asit ve baz çözeltilerinin normal olarak hazırlanması uygundur. Eşdeğer ağırlık = Moleküler Ağırlığı (M.A.) / Etki değerliği olarak ifade edilir. Burada, etki değerliği; Çözünen madde asitse, verdiği H +, bazsa OH - iyonu sayısına, tuzsa anyon ve katyon değerlerinin çarpımına eşittir. 1

Örnek 1. 0,5 N ve 100 ml NaOH çözeltisi hazırlayalım: NaOH in M.A. = 23 + 16 + 1 = 40 g/mol dür. Bu miktar 1 N içindir. 0,5 N için 0,5 x 40 = 20 g madde gerekir. NaOH in etki değerliği 1 olduğundan; N=M dir, yani Molar çözelti gibi hazırlanır. İstenen hacim 100 ml olduğu için (20 x 100) / 1000 = 2 g NaOH saf suda çözülüp hacmi 100 ml ye tamamlanır. Örnek 2. 0,5 N ve 100 ml sülfürik asit (H 2 SO 4 ) çözeltisi hazırlayalım: H 2 SO 4 in M.A. = (1x2) + 32 + (16 x 4) = 98 g olarak bulunur. Etki değerliği = 98 / 2 = 49 dur. 0,5 N için 0,5 x 49 = 24,5 g olarak bulunur. Fakat hacim 100 ml olacağından (24,5 x 100) / 1000 = 2,45 g H 2 SO 4 gerekir. Ancak bu asit, sıvı olup yoğunluğu d = 1,83 ve saflığı % 96 dır. Eğer bu göz önüne alınmadan 2,45 g alınıp 100 ml e tamamlanırsa hesap yanlış olur. Çünkü, bu asidin %96 sı asit, %4 ü sudur. Bundan dolayı bu asidin 1 ml sinde 1,83 x 0,96 = 1,76 g H 2 SO 4 vardır. Yukarıda gerekli miktar 2,45 g olarak bulunmuştur. Bu miktardaki sülfirik asitten 2,45 / 1,76 = 1,39 ml alınması gerekir. O halde 0,5 N ve 100 ml olacak şekilde saf su ile karıştırılır. Sülfürik asit gibi kuvvetli asit çözeltisi hazırlanırken, her zaman asitlerin su üzerine ilave edilerek karıştırılması gerektiği unutulmamalıdır. Molal Çözelti (m): 1000g çözücüde 1 mol g madde çözünmüşse bu çözelti, 1 molal çözeltidir. Molar ve normal çözeltilerin toplam hacmi esas iken molal çözeltide çözücünün ağırlığı esastır. Önce gereken miktar çözücü mezura konur, sonra üzerine madde ilave edilerek karıştırılır. Örnek: 0,3 m ve 150 ml glukoz çözeltisi hazırlayalım: (Glukoz M.A. = 180 g/mol) 1 mol / 1000 g için 180 g glukoz gerekli ise 0,3 mol/1000 g için (0,3 x 180) = 54 g gerekir. Ancak 150 ml için (54 x 150) / 1000 = 8,1 g glukoz tartılıp 150 ml saf suda çözülür. Yüzde (%) Konsantrasyon: 100 g veya 100 ml çözeltideki çözünen madde miktarını gösteren bir konsantrasyon çeşididir. Maddenin M.A. değeri hesaba katılmadan hesaplanır. Örnek: %5 lik 80 ml KCl çözeltisi hazırlayalım: 100 ml için 5 g, fakat 80 ml için 5 x 80 / 100 = 4 g KCl gerekir. Belirtilen miktardaki madde tartılıp saf suda çözüldükten sonra hacmi 80 ml e tamamlanır. Ppm Çözelti: Toplam çözeltideki milyonda bir oranında çözünen madde miktarını ifade eder. M.A. hesaba katılmaz, 1 l çözeltide 1 mg çözünmüş madde varsa bu çözelti 1 ppm dir. Örnek: 25 ppm lik 150 ml GA hormon çözeltisi hazırlayalım: 25 x 150 / 1000 = 3,75 mg GA tartılıp birkaç ml etil alkolde çözüldükten sonra (GA suda çözünmez) hacmi saf suyla 150 ml yapılır. 2

Seyrelterek Çözelti hazırlama: Bir stok çözeltiden seyreltmeyle başka çözeltiler hazırlamak mümkündür. Bunun için şu formül kullanılır: C 1 x V 1 = C 2 x V 2 C 1 = Stok çözeltinin konsantrasyonu; V 1 = Stok çözeltiden alınması gereken miktar (ml); C 2 = Hazırlanması istenen çözeltinin konsantrasyonu; V 2 = Hazırlanması istenen çözeltinin hacmi (ml) Örnek 1. 2 M lık bir çözeltiden 0,05 M lık 400 ml çözelti hazırlayalım: V1 = (0,05 x 400) / 2 = 10 ml stok çözeltiden pipetle alınıp mezüre aktarılır ve hacmi saf suyla 400 ml ye tamamlanır. Örnek 2. 0,5 M ve 100 ml lik bir çözeltiden 0,2 M lık bir çözelti hazırlamak için stok çözeltiye kaç ml saf su ilave edilmelidir? C 1 x V 1 = C 2 x V 2 0,5 x100 = 0,2 x V 2 V 2 = (0,5 x 100) / 0,2 = 250 ml hazırlamak istediğimiz çözeltinin hacmi O halde bu stok çözeltiye 150 ml saf su ilave edilirse 0,2 M lık bir çözelti hazırlanmış olur. olur? Örnek 3: 1 M ve 50 ml bir çözeltiye 150 ml saf su eklenirse bu çözelti kaç M lık 1 x 50 = C 2 x 200 C 2 = 50 / 200 = 0,25 M olur. Örnek 4: 2 N lik bir çözeltiden 10 ml alınıp saf su ile hacmi 50 ml yapılırsa hazırlanan çözelti kaç N lik olur? 2 x 10 = C 2 x 50 C 2 = 20 / 50 = 0,4 N olur. Örnek 5: %95 lik alkolden % 70 lik 300 ml alkol çözeltisi hazırlayalım: 95 x V 1 = 70 x 300 V 1 = 70 x 300 / 95 = 221 ml % 95 alkolden alınıp saf suyla hacmi 300 ml yapılır. Seri çözelti: Sabit konsantrasyondan düşük konsantrasyona ulaşmak için seri seyreltmeler yapılır (Şekil 1). Şekil 1. 1/2 (solda) ve 1/10 (sağda) oranlarında hazırlanan seri çözelti. Örnek 1: Bu çalışmada derişimi bilinen renkli bir stok çözeltiden seri sulandırma yaparak, bir seri çözelti hazırlayacaksınız. Bunun için 1/2, 1/3, 1/5, 1/10, oranlarında seri 3

sulandırma tüpleri hazırlayınız ve her bir tüp için Şekil 1 de görüldüğü gibi sulandırma oranlarını ve elde etiğiniz çözelti konsantrasyonlarını yazınız. *Çözeltinin içindeki çözünen madde miktarının azlığı çokluğu çözeltinin renk koyuluğundan anlaşılabilecektir. Tampon Çözelti: Belirli ph ya ayarlanan ve bu ph değeri kolay kolay değişmeyen ve dolayısıyla bulunduğu ortamın ph değerini sabit tutan (tamponlayan) çözeltilerdir. ph: Bir çözeltinin (solüsyonun) hidrojen iyon konsantrasyonu ph olarak ifade edilir. Suyun parçalanması neticesinde H + ve OH - iyonları oluşur. 25ºC de saf sudaki hidrojen iyonlarının konsantrasyonu 10 7 M dır. Böylece, 25ºC de saf suyun ph= log(1/10-7 )= 7,0 dır. Saf suyun ph sı (7,0) nötral ph olarak bilinr. Eğer ortamın ph sı 7,0 nin üzerinde ise bazik, altında ise asidik olarak ifade edilir. H + iyonlarının konsantrasyonu ortama HCl (H + + Cl - ) ilave edilerek artırılabilir. Ortamdaki OH - iyonlarının konsantrasyonunun artırılması ise ortama NaOH ilavesi ile mümkündür ve bu ph nın artmasına sebep olur. Çoğu ökaryotik hücrelerin içerisindeki solüsyonlar pekçok mevcut organik ve inorganik iyonlardan etkilenir ve genellikle ph 7,0 in biraz üzerindedir. Organeller içerisindeki ph sitoplazmanınkinden farklıdır. Mitokondride ATP nin oluşumu mitokondri zarının iki tarafındaki ph nın dengelenmesi esnasında olur. Kan plazmasının ph sı 7,4 ve salivanın ph sı 6,5, mide sıvısının ph sı 1,5-3,0 dür. Hücre aktivitesini etkileyen faktörlerden biri de, hücre içi konsantrasyonu ile bu hücrenin inceleneceği ortamın çözünür madde konsantrasyonu arasındaki dengenin sağlanmasıdır. Tampon, solüsyon halinde iken ph daki değişiklikleri engelleyen bir maddedir. Tampon ya asidik ya da zayıf bazik bir bileşik olup, suda kısmen ayrışarak ayrışmış madde ve onun ürünleri olan iyonlar arasında denge oluşturur. Örnek 1: 0,1 M 500 ml (ph=6) sodyum fosfat (NaH 2 PO 4 ) tamponu hazırlayalım: NaH 2 PO 4 M.A = 142 g dır. 0,1 x 142 = 14,2 g, (14,2 g x 500) / 1000 = 7,1 g tartılıp, biraz saf suda çözülür ve ph metrede ph sı 6 ya ayarlanır. ph ayarlaması için; HCl (ph>6 ise) veya NaOH (ph<6 ise) kullanılır. ph ayarlandıktan sonra hacmi saf suyla 500 ml yapılır. Çözelti Hazırlamada Dikkat Edilmesi Gereken Hususlar: Çözelti hazırlamadan önce dikkat edilmesi gereken bir husus da, kimyasal maddelerin moleküler ağırlığını hesaplarken sulu veya susuz (anhydrous) olduklarına bakmaktır. Eğer sulu ise yapısındaki H 2 O yu da hesaba katmak gerekir. Bu durum maddeyi aldığımız kutu veya şişenin üzerinde yazılıdır. Bununla birlikte sıvı maddelerin yoğunluk ve saflık durumlarına bakmak gerekir. Birimler ve Birbirine Çevrilmeleri: 1 molar (M) = 10 3 milimolar (mm) = 10 6 mikromolar (µm) 1 metre (m) = 10 3 milimetre (mm) = 10 6 mikrometre (µm) 1 mikron (µ) = 10 9 milimikron (mµ) veya nanometre (nm) = 10 10 Angstrom (A ) 4

UYGULAMA 1: 250 ml 1 M lık Tris asetat, Sodyum asetat ve EDTA çözeltileri hazırlamak - Tris asetat (MA= 181,2 g) - Sodyum asetat (MA= 82 g) - EDTA MA= 372 g - Cam şişe - Karıştırıcı, magnet - Tartı - Spatula - Saf su - 250 ml 1M Tris asetat çözeltisi için; 45,3 g Tris asetat tartılır, bir miktar suda çözüldükten sonra hacmi 250 ml e tamamlanır. - 250 ml 1M Sodyum asetat çözeltisi için; 20,5 g Sodyum asetat tartılır, bir miktar suda çözüldükten sonra hacmi 250 ml e tamamlanır. - 250 ml 1M EDTA çözeltisi için; 93 g EDTA tartılır, bir miktar suda çözüldükten sonra hacmi 250 ml e tamamlanır. UYGULAMA 2: Seyreltik ve seri çözelti hazırlama - Meyve suyu (vişne, elma vd.) - Cam tüp ve tüplük - Otamatik pipet - 1 M Tris asetat çözeltisi - Meyve suyunun 1/10 seri seyreltme (sulandırma) çözeltisinin hazırlanışı: Sulandırma tüpleri hazırlayınız ve her bir tüp için Şekil 1 de görüldüğü gibi sulandırma oranlarını ve elde etiğiniz çözelti konsantrasyonlarını yazınız. - İlk sulandırma tüpüne 1 ml vişne suyu ve 9 ml saf su; ikinci sulandırma tüpüne birinci tüpden 1 ml vişne suyu ve 9 ml saf su; üçüncü sulandırma tüpüne ikinci tüpden 1 ml vişne suyu ve 9 ml saf su; dördüncü sulandırma tüpüne üçüncü tüpden 1 ml vişne suyu ve 9 ml saf su; beşinci sulandırma tüpüne dördüncü tüpden 1 ml vişne suyu ve 9 ml saf su konulur. Sonuç konsantrasyon ne oldu? - 1 M lık Tris asetat çözeltisinden 0,05 M lık 400 ml çözelti hazırlanışı: C1xV1=C2xV2; 1M x V1=0,05 M x 400ml; 20 ml stok çözeltiden alınıp üzeri 400 ml e tamamlanır. 5

UYGULAMA 3: ph Metenin Kalibrasyonu ve Bilinen Çözeltilerin ph sı ph metre kalibrasyonu: ph metreyi kullanmadan önce iki şekilde kalibre edilir; - ph metreyi ph sı 7 olan standart solüsyonu, 7 okuyacak şekilde ayarlayınız. - mv ile ph arasındaki doğru ilişkiyi sağlamayı diğer standardı (ph 4 veya 10) kullanarak sağlayınız. ph metreyi gerçek değere ayarlayınız. Not: ph elektrodu hafif asidik bir solüsyonda muhafaza edilmeli, Her okuma arasında elektrodu distile su ile yıkayınız. - ph metre - ph sı 7, 4 ve 10 olan standart solüsyonlar - Uygulama 1 ve 2 de hazırlanan çözeltiler - Karıştıcı Bilinen Çözeltilerin ph sı: - Uygulama 1 ve 2 de hazırlanan çözeltilerden 50 veya 100 ml alarak ph larını ölçerek kaydediniz. UYGULAMA 4: Biyolojik Sıvıların Titrasyonu Asit Baz Titrasyonu: Asidik olduğunu bildiğimiz bir çözeltiye baz damlatmak veya bazik olduğunu bildiğimiz bir çözeltiye asit damlatmaktır. - ph metre - 0,1 M HCl ve 0,1 M NaOH standart solüsyonları - Karıştırıcı - Meyve suyu - Tris-asetat ve ya diğer tamponlar - 100 er ml meyve suyu alıp ph larını ölçerek kaydediniz. - Daha sonra bu sıvılara 1 er ml asit (0,1 M HCl) veya baz (0,1 M NaOH) ilave ederek, iyice karıştırın ve tekrar ph larını ölçün. - Herhangi bir renk değişikliği olup olmadığına bakın ve varsa bu değişimleri not alın. - Çözetinin ph sını y eksenine, ml HCL veya NaOH ise x eksenine yerleştiriniz. - Sonuçlarınızı karşılaştırınız. Bir tamponun titrasyonu: - 250 ml lik bir behere 50 ml Tris asetat tamponu koyarak ph sını kaydediniz ve 1 er ml artan oranlarda NaOH ile titre ediniz. - Her eklentiden sonra çözeltiyi karıştırınız. 6

- Ortamın ph sını ölçünüz ve titrantı kaydediniz. Çözeltinin ph sını y eksenine, NaOH ın konsantrasyonunu ise x eksenine yerleştiriniz. Titrasyon sonuçlarınızı yukarıdaki sonuçlarla birleştirerek tartışınız. UYGULAMA 5: 1 litre ph = 7,4 10X TAE tamponu hazırlanışı Çözeltiler yalnızca bir çözücü ve çözünen olarak hazırlanmazlar. Bazı çözeltiler farklı konsantrasyonlarda birden fazla çözünen içerebilirler. Tampon çözeltiler bu tip çözeltilere örnektir. Tampon çözeltiler laboratuvarda yüksek miktarlarda tüketildiği zaman, bu çözeltileri büyük hacimli şişelerde saklamak yer sıkıntısına neden olur. Bu nedenle bu tip çözeltiler derişik olacak şekilde örneğin 5kat (5X), 10 kat (10X) daha konsantre hazırlanır. Yani içerisindeki madde miktarları bu kadar kat daha fazla konur. Bunlara stok çözelti adı verilir. Daha sonra bu çözeltiler istenilen oranda sulandırılarak kullanılır (1X gibi). 10x TAE tamponu, 1xTAE için gerekli miktarların 10 katı kullanılarak hazırlanır 1xTAE tamponu= 40 mm Tris asetat (MA: 181,2g), 5 mm Sodyum asetat (MA: 82 g), 1 mm EDTA (MA: 372) - 40 mm Tris asetat (MA: 181,2g) x 10 = 400 mm = 0,4 M için 72,84 gram; - 5 mm Sodyum asetat (MA: 82 g) x 10 = 50 mm= 0,05 M için 4,1 gram ; - 1 mm EDTA (MA: 372) x 10 = 10 mm = 0,01 M için 3,72 gram; - 72,84 gram Tris asetat + 4,1 gram Sodyum asetat + 3,72 gram EDTA, tartılarak hepsi bir kaba konur. Üzerine bir miktar distile su eklenir ph sı ayarlanır ve son hacim 1 litre olacak şekilde su ilave edilir. Ya da; - 1 M lık Tris asetat, Sodyum asetat ve EDTA çözeltileri ayrı ayrı hazırlanır ve seyrelterek kullanılır. 400 ml Tris asetat + 50 ml Sodyum asetat + 10 ml EDTA bir çam şişede birleştirilir, üzerine su ilave edilir, ph sı ayarlandıktan sonra 1 lt ye tamamlanır. 7