2

1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ KAPİLER ELEKTROFOREZİN İLAÇ ANALİZLERİNE UYGULANMASI Hazırlayan Çiğdem TOKAT Danışman Prof. Dr. İbrahim NARİN Analitik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Ödevi MAYIS 2011 KAYSERİ

2

3 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ KAPİLER ELEKTROFOREZİN İLAÇ ANALİZLERİNE UYGULANMASI Hazırlayan Çiğdem TOKAT Danışman Prof. Dr. İbrahim NARİN Analitik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Ödevi MAYIS 2011 KAYSERİ

i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Çiğdem TOKAT

ii Kapiler Elektroforezin İlaç Analizlerine Uygulanması adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Analitik Kimya Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Çiğdem TOKAT Danışman Prof. Dr. İbrahim NARİN Analitik Kimya Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. İbrahim NARİN ONAY : Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın / / tarih ve.. sayılı kararı ile onaylanmıştır. / / Prof. Dr. Müberra KOŞAR Fakülte Dekanı

iii TEŞEKKÜR Bu tezin hazırlanmasında bana destek olan ve hiçbir zaman yardımlarını esirgemeyen danışmanım Prof. Dr. İbrahim NARİN e tezimi hazırlarken bana her zaman destek olan aileme teşekkür ederim. Çiğdem TOKAT

iv KAPİLER ELEKTROFOREZİN İLAÇ ANALİZLERİNE UYGULANMASI ÖZET Çiğdem TOKAT Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Ödevi, Mayıs 2011 Danışman: Prof. Dr. İbrahim NARİN İlk kez Arne Tiselius tarafından geliştirilmiş olan elektroforez, elektriksel bir alanın etkisi altında yüklü taneciklerin tampon çözeltideki bağıl göç hızına dayanan bir ayırma yöntemidir. Bu teknik uzun yıllar makromoleküllerin ayrımı ve tanımlanmasında kullanılmıştır. Fakat bu yöntemin uzun analiz süresi, otomasyon ve dedeksiyon sorunları gibi problemleri bulunmaktadır. Bu nedenle elektroforez in bu dezavantajlarını yok eden bir sisteme ihtiyaç duyulmuştur. Kapiler elektroforezin geliştirilmesiyle bu dezavantajlar ortadan kalkmıştır. Kapiler elektroforez son on yılda genetik, mikrobiyoloji, biyokimya, klinik ve adli tıp gibi birçok alanda protein, ilaç, nükleik asit vb. moleküllerin ayırımında etkin ve ekonomik bir yöntem olarak geniş kullanım alanı bulmuştur. Ayrıca küçük moleküllü iyonların tayinleri de bu metotla yapılabilmektedir. Metot ilaçların kantitatif ve kalitatif analizleri, safsızlıkların saptanması, ilaç moleküllerinin fizikokimyasal ölçümleri gibi alanlarda giderek artan bir kullanıma sahiptir. Bu tez çalışmasında elektroforez ve kapiler elektroforez yöntemleri, kapiler elektroforez tekniklerinin avantajları ve bu tekniklerin ilaç analizlerine uygulanması ile ilgili literatür bilgileri özetlenmiştir. Anahtar kelimeler: Elektroforez, Kapiler Elektroforez, İlaç Analizleri

v APPLICATION OF DRUG ANALYSIS BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS ABSTRACT Cigdem TOKAT Erciyes University, Pharmacy Fakulty Department of Analytical Chemistry Final Project, Mayıs 2011 Supervisor: Prof. Dr. Ibrahim NARIN Electrophoresis, was firstly developed by Arne Tiselius, is a separation method based on the relative migration rate of electrically charged particles under the influence of a field in the buffer solution. This technique is used separation and identification of macromolecules for many years. However, some disadvantages of methods have been such as long analysis time, automation and detection difficulties. Therefore, a system that do not have the disadvantages of electrophoresis become necessary. The development of capillary electrophoresis has been eliminated these disadvantages. Capillary electrophoresis in last ten years, in many areas such as genetics, microbiology, biochemistry, clinical and forensic medicine, is an effective and economical method has found wide usage for separation of proteins, drugs, nucleic acid molecules. This method also can be used in the determination of small-molecule ions. This method has an increasing use in areas such as quantitative and qualitative analysis of drugs, detection of impurities and physicochemical measurements of drug molecules. In this study, methods of electrophoresis and capillary electrophoresis, advantages of capillary electrophoresis techniques and application of these techniques for drug analysis are summarized by literature. Keywords: Electrophoresis, capillary electrophoresis, drug analysis.

vi İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK...i KABUL ONAY...ii TEŞEKKÜR...iii ÖZET...iv ABSTRACT...v İÇİNDEKİLER...vi KISALTMALAR...ix TABLOLAR VE ŞEKİLLER LİSTESİ...x 1. GİRİŞ VE AMAÇ...1 2.GENEL BİLGİLER...3 2.1. ELEKTROFOREZ...3 2.2. ELEKTROFORETİK TEKNİKLERİN UYGULAMA ALANLARI...7 2.3.ELEKTROFOREZ TÜRLERİ...8 2.3.1.Kâğıt elektroforezi...8 2.3.2.Selüloz asetat elektroforezi...8 2.3.3. Jel elektroforezi...8 2.3.3.1. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)...8 2.3.3.2. Agaroz jel elektroforezi...8 2.3.4.Kapiler Elektroforez...9 2.3.5.Kapiler elektroforez çeşitleri...12 2.3.5.1.Kapiler Zon Elektroforez...12 2.3.5.2.Kapiler Jel Elektroforez...13 2.3.5.3.Kapiler İzotakoforez...14 2.3.5.4.Kapiler İzoelektrik Odaklama...14

vii 2.3.5.5.Miseller Elektrokinetik Kromatografi...15 2.4. KAPİLER ELEKTROFOREZ YÖNTEMİNDEKİ AYIRIM PARAMETRELERİ VE ELEKTROFORETİK PARAMETRELERİN AYIRIM PARAMETRELERİ ÜZERİNE ETKİSİ...16 2.4.1.Göç Zamanı...16 2.4.2.Yöntemin Verimi...17 2.4.3.Seçicilik...17 2.4.4.Ayırıcılık...18 2.5. KAPİLER ELEKTOFOREZ CİHAZININ KISIMLARI...19 2.5.1.Örnek Enjeksiyonu...19 2.5.2.Kaynak ve Hedef Vialleri...21 2.5.3.Kapiler Tüp Sistemleri...21 2.5.4.Kapiler Termostat...23 2.5.5.Dedektörler...23 2.5.5.1.Absorbans Dedektörleri...24 2.5.5.2.Floresans Dedektörleri...25 2.5.5.3.Kütle Spektrometrik Dedektörleri...25 2.5.5.4.Elektrokimyasal Tayin (EC)...25 2.5.5.5.Potansiyometri...26 2.5.6.Güç Kaynağı...27 2.6. KAPİLER ELEKTROFOREZDE AYIRIM İLKELERİ...27 2.6.1. Elektroforetik mobilite...27 2.6.2.Elektroosmotik Akış...28 2.7.ELEKTROOSMOTİK AKIŞI ETKİLEYEN FAKTÖRLER...29 2.7.1.Uygulanan Potansiyel...29 2.7.2. Tampon Sisteminin ph sı...32

viii 2.7.3.Tampon Konsantrasyonu ve İyonik Şiddeti...33 2.7.4.Çalışma Sıcaklığı...34 2.7.5.Organik Çözücüler...34 2.7.6.Kapiler Duvarda Yapılan Kimyasal Modifikasyonlar...34 3. UYGULAMA ALANLARI...35 3.1. KAPİLER ELEKTROFOREZ İN GENEL UYGULAMA ALANLARI...35 3.2. FARMASÖTİK ÖRNNEKLERİN KAPİLER ELEKTROFOREZ İLE ANALİZİ...36 4.TARTIŞMA VE SONUÇ...38 5. KAYNAKLAR...40

ix KISALTMALAR nl ZE ITP IEF CE GC HPLC pl CGE CZE CITP CIEF MECC CEC SDS DAD AD PAGE : nanolitre : Zon elektroforez : İzotakoforez : İzoelektrik odaklama : Kapiler elektroforez : Gaz Kromatografisi : Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi : İzoelektrik nokta : Kapiler jel elektroforez : Kapiler zon elektroforez : Kapiler izotakoforez : Kapiler izoelektrik odaklama : Miseller elektrokinetik kapiler kromatografi : Kapiler elektrokromatografi : Soydum dodesil sülfat : Diyot dedektörü : Amperometrik dedektör : Poliakrilamid jel elektroforezi

x TABLOLAR VE ŞEKİLLER LİSTESİ ŞEKİLLER Şekil 2.1. Tiselius hareketli cephe elektroforez aletinin şematik görünümü... 3 Şekil 2.2. Zon Elektroforez... 5 Şekil 2.3. İzotakoforez... 6 Şekil 2.4. İzoelektrik Odaklama... 6 Şekil 2.5. Bir kapiler içerisinde elektroosmotik akış şeması... 10 Şekil 2.6. Elektroferogram... 10 Şekil 2.7. Çözeltinin geçirilişini takiben kapilerin yüklenişi ve oluşan tabakalar... 11 Şekil 2.8. Kapiler Elektroforez Cihazı... 19 Şekil 2.9. Kapiler elektroforezde enjeksiyon sistemleri.... 20 Şekil 2.10. Eritilmiş silika kapilerin boyuna kesiti... 22 Şekil 2.11. Kapiler içinde elektroosmotik akışın gösterimi... 28 Şekil 2.12. Uygulanan potansiyelin artırılması ile göç zamanının azaltılması... 30 Şekil 2.13. Akım-Uygulanan potansiyel grafiği... 31 Şekil 2.14. Tampon ph sının etkisi ile elektroosmotik akışın değişmesi... 32 Şekil 2.15. Tampon konsantrasyonunun elektroosmotik akış üzerine etkisi... 33 TABLOLAR Tablo 2.1. Dedektör Tipleri ve Gözlenebilme Sınırları... 24 Tablo 3.1. Farmasötik örnekler... 36 Tablo 3.2. Biyolojik örnekler... 37

1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Elektroforez, elektriksel bir alanın etkisi altında yüklü taneciklerin tampon çözeltideki bağıl göç hızına dayanan bir ayırma yöntemidir. Bu yöntem, inorganik anyon ve katyonlar, aminoasitler, katekolaminler, ilaçlar, vitaminler, karbonhidratlar, peptitler, proteinler, nükleik asitler gibi birçok türün ayrılmasında kullanılmaktadır. Elektroforezin en önemli özelliği, özellikle biyoteknoloji endüstrisinde biyolojik ve biyokimyasal araştırmalarda yüklü makromolekülleri ayırmasıdır. Elektroforez yıllarca proteinler, enzimler, hormonlar, antikorlar ve nükleik asitler (DNA, RNA) için vazgeçilmez bir ayırma yöntemi olmuştur. Bu türlü bileşiklerin ayrılması için elektroforez yöntemi eşsiz bir yöntemdir. Elektroforez, birçok madde için en çok kullanılan ayırma tekniği olmasına rağmen, analiz süresinin uzunluğu, düşük verimlilik, otomasyon ve dedeksiyon sorunları gibi problemleri bulunmaktadır. Bu yüzden elektroforetik ayırmayı sağlayabilmek için jel tabaka sistemine alternatif olarak dar tüp veya kapilerler kullanılmaya başlanmıştır. Dar kapilerin anti-konvektif yapıda olması analit dispersiyonunun azaltılmasını sağlamakta, kapiler ve akışkan ortam arasında oluşabilecek ısı iletimine engel olmaktadır. Bu da yüklenen örneğin viskozitesi ve elektroozmotik akışın kontrolü açısından önemlidir, jel ortam ise bu fonksiyonu yerine getirememektedir. Kapiler elektroforez; Gaz Kromatografisi, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ve Jel Elektroforez in iyi özelliklerinin birleşiminden geliştirilmiş modern bir yöntemdir. Kapiler elektroforez bu tekniklerin avantajlarını içerdiği gibi; yüksek ayırım gücü (yüzlerce bileşiği aynı anda tayin edebilme yeteneği), kısa analiz zamanı, analiz için az miktarda örnek ihtiyacı, analizin ucuz olması, yüksek kararlılık, düşük hareketli faz tüketimi ve otomasyona imkân tanıması gibi üstünlüklerde sahiptir. Kapiler elekroforez 1990 lı yıllarda gelişen, günümüzde ise birçok alanda uygulanan bir yöntemdir.

2 Aynı anda birçok maddeyle çalışmaya olanak vermesi, küçük hacimde numune kullanılması ve mikromoleküler maddelerle de çalışılabilmesi nedeniyle kapiler elektroforez yöntemi ilaç analizlerinde de oldukça önemli bir yere sahiptir. İlaç etken madde analizleri, toksikoloji çalışmaları, ilaç farmakokinetiği ile ilgili çalışmalarda kullanılan yöntemlerden birisi olmuştur. Bu tez çalışmasında kapiler elektroforez yönteminin ilaç analizlerindeki uygulamalarının araştırılması amaçlanmıştır.

3 2.GENEL BİLGİLER 2.1. ELEKTROFOREZ Temel prensipler Elektroforetik ayırma yönteminde, ince bir tüp içindeki veya düz gözenekli bir destek ortamındaki (örneğin kâğıt veya yarı katı jel) sulu tampon bir çözeltiye numune bant halinde uygulanır. Tampon çözeltiye her iki taraftan elektrotlar aracılığıyla, yüksek bir doğru akım potansiyeli uygulanır. Uygulanan bu potansiyel, numune içindeki iyonların katoda ya da anoda doğru göç etmesine neden olur. Numunedeki taneciklerin göç hızları, tanecik yüküne ve büyüklüklerine bağlıdır (1). Serbest elektroforez tekniği 1930 lu yıllarda Arne Tiselius tarafından geliştirilmiştir. Tiselius bir elektrolit solüsyonunda çözünmüş olan proteinleri, protein-elektrolit solüsyonunun bulunduğu U şeklindeki kuartz bir borunun içinden elektrik akımı geçirerek ayırmıştır. Uygulanan elektrik akım altında moleküller yüklerine bağlı olarak anoda ya da katoda doğru göç etmişlerdir. Şekil 2.1. Tiselius hareketli cephe elektroforez aletinin şematik görünümü (a) İnsan kanındaki plazma proteinlerinin elektroforetik deseni (b) A=serum albumini, α 1, α 2, β ve γ=çeşitli globülinler

4 Tiselius un bu hareketli cephe elektroforezinde U şeklindeki borunun alt kısmı protein karışımını içeren bir tampon çözeltisi ile üst kısmı ise saf tamponla doldurulur. U borusunun ağız kısımlarına bir akım kaynağının pozitif ve negatif kutuplarına bağlanmış elektrotlar yerleştirilir. Elektrotlara gerilim uygulandığında negatif yüklü proteinler anoda, pozitif yüklü proteinler de katoda doğru hareket etmeye başlarlar. Karışımdaki proteinlerin tümünü veya çoğunu ayırabilmek için tampon ph sı genellikle proteinlerin tümünün veya çoğunun aynı işaretten yükler taşıyacağı bir değere ayarlanır. Örneğin, tampon ph sında bütün proteinler negatif yüklü iseler akım uygulandığında bu proteinler proteinsiz tampon içine doğru göç etmeye başlarlar. Bu olay borunun proteinsiz tampon bölgesinde kırılma indeksi değişikliklerine yol açarak Schlieren desenleri adı verilen görüntülerin oluşmasına neden olur. Belli başlı proteinlerin birbirlerine göre hareket hızları ve yönleri de boru boyunca yapılacak optik ölçümlerden saptanabilir. Şekil 2.1 de böyle bir ölçümün sonuçları gösterilmektedir ve buradaki pikler insan kanı plazmasındaki çeşitli protein hatlarının elektroforez borusu üzerinde aldıkları konumları göstermektedir (2). Göç hızının belirlediği elektroforetik hareketlilik, yüklü molekül ve tanecikler için önemli ve karakteristik bir parametredir. Bu hareketlilik yüklü grupların pk değerlerine, molekül veya taneciğin boyutuna bağlıdır. Elektroforetik hareketlilik tamponun ph sı, konsantrasyonu ve türünden etkilenir. Yardımcı maddelerin özellikleri kadar alan kuvveti ve sıcaklık da önemlidir. Elektroforetik ayırma, kapilerdeki serbest çözeltide ve akış sistemlerinde ya da ince tabaka plakaları, film, jel gibi stabil ortamlarda gerçekleşir (3). Doğru akım potansiyelinin uygulandığı bir tampon çözeltide yüklü taneciklerin diferansiyel göç hızlarına dayanan bir ayırma yöntemi olan elektroforez; inorganik anyon ve katyonlar, aminoasitler, ilaçlar, vitaminler, karbonhidratlar, peptitler, proteinlerin ayrılması ve tayini gibi birçok zor analitik ayırma problemine uygulanmaktadır (2). Elektroforetik ayırma teknikleri üç farklı temele ayrılır. a) Elektroforez (Zon Elektroforez) (ZE) Bu tür ayırmada, ayırma işlemi boyunca sabit ph da homojen bir tampon sistemi kullanılır. Şekil 2.2 de görüldüğü gibi elektrik alan uygulandıkça maddelerin

5 elektroforetik hareketliliklerinden doğan göç hızları ölçülür. Destek ortamı olarak filtre kâğıdı veya selülozasetat gibi protein molekülleri ile etkileşmeyen ve onların hareketlerini kısıtlamayan maddeler kullanılır. Bu yöntem hem asidik hem de bazik özellik taşıyan maddelere uygulanabilir. Şekil 2.2. Zon Elektroforez b) İzotakoforez (ITP) İzotakoforez izo (aynı), tako (hız) ve forez (elektroforez) kelimelerinden meydana gelmektedir. Protein ayrımlarında çokça kullanılan bir yöntemdir. İzotakoforez esnasında anyonlar ya da katyonların ayırımı mümkündür, fakat her ikisi aynı anda yapılamaz. Ayırma işleminde numune iki tampon arasına enjekte edilir. Öndeki tampon, hareketliliği numune içindeki en hızlı iyondan daha hızlı iyonları ve sonraki tampon ise hareketliliği numune iyonlarından daha düşük iyonları içerir. Anyonların ayrılmasında, öndeki elektrolit çözeltisi anoda bağlı sondaki ise katoda bağlıdır (3). Bu yöntemde önde giden ve arkada kalan elektrolitler karakterizedir. Öndeki elektrolit analitten daha yüksek bir hareketlilik gösterirken, arkadaki elektrolit daha düşük bir mobiliteye sahiptir. Karışımdaki maddeler de öndeki ve arkadaki elektrolitleree göre konumlanır ve ayrışır. Şekil 2.3 de iyonize olmuş örneğin mobiliteleri farklı iki elektrolit arasındaki göçü görülmektedir.

6 Ayırım ortamına bir elektrik alan uygulandığında analit iyonları kendine özgü µ e E (elektroforetik hareketlilik uygulanan elektrik alan) çarpımı ile verilen hızla hareket ederler. Numune bileşenleri sabit elektrik akımı ve sıcaklıkta birbirine yakın bantlara ayrılır. Ohm kuralına göre, elektrik alan şiddeti iyon bantlarının hareketliliği azalacağı için artar. Bantlar oluştuktan sonra numune bileşenleri aynı hızda hareket eder (4). Şekil 2.3. İzotakoforez c) İzoelektrik odaklama (IEF) Şekil 2.4. İzoelektrik Odaklama

7 İzoelektrik odaklama sadece amfoterik türlerin ayrımında kullanılır. Bir zayıf karboksilik asit grubu ve bir zayıf baz amino grubu içeren, çözeltilerinde hem proton alabilen hem de proton verebilen; proteinler, peptitler ve aminoasitler gibi maddelerin ayrımı için uygun bir yöntemdir (3). Proteinlerin izoelektrik noktaları arasındaki farklılıklara dayalı tek ayırma mekanizmasıdır (4). Anyonik ve katyonik formunun derişimleri birbirine eşit olduğu ph da bir elektrik alan uygulandığında örnek bileşenlerinin herhangi bir yönde hareket etmezler ve bir ph gradienti oluşur (Şekil 2.4). Net bir hareketin olmadığı bu ph ya izoelektronik nokta (pi) denir. Ayırım işlemi, örnek bileşenlerinin izoelektrik noktalarındaki farklılıklarını esas alır (3). Odaklama işlemi genellikle 15 20 dakika kadar sürer, bu esnada protein, türlerin elektriksel olarak nötral olduğu ph bölgesine göç eder ve çok geçmeden göç sona erer (4). 2.2. ELEKTROFORETİK TEKNİKLERİN UYGULAMA ALANLARI Çeşitli elektroforetik ayırma teknikleri, protein ve nükleik asitler gibi makromoleküler yapıdaki maddelerin kalitatif ve kantitatif analizinde kullanılmaktadır. Kullanım alanları, saflaştırma, saflık kontrolü, molekül ağırlığı saptama, kalıtsal veya kalıtsal olmayan hastalık saptama, enzim izoenzimlerinin saptanması (tanısal amaçlı, popülasyon çalışması için, adli tıpta) ve immünolojik ve moleküler biyoloji olarak sıralanabilir. Elektroforez, patolojik durumların tanımlanması ve takibinde yaygın olarak kullanılır. Serumda, dokuda, hemoglobinde ve idrarda, patolojik durumlar sonucunda ortaya çıkan normal olmayan proteinlerin varlığını, normal proteinlerin yokluğunu veya tedavi sırasında hastalığın seyrini izlemek amacıyla kullanılır. Son yıllarda proteomiks teknolojisinin, en önemli yöntemlerinden biri haline gelmiştir. Bu yöntem ile protein miktarlarındaki çok küçük değişikliklerin dahi analizi yapılabilmektedir. Böylece, patolojik durumlarda ortaya çıkan yeni proteinler kolaylıkla tanımlanabilmektedir. Otomatize edilmiş olması nedeniyle, başta kimya, biyokimya, farmakoloji, toksikoloji, adli tıp bilimlerini kapsayan çeşitli bilimsel alanlarda pratik ve yaygın bir biçimde kullanılmaktadır. Yasadışı ilaç kullanımı analizi için de kullanılmaktadır (5).

8 2.3.ELEKTROFOREZ TÜRLERİ 2.3.1.Kâğıt elektroforezi Kağıt elektroforezinin düşük ve yüksek voltajlı olmak üzere iki türü bulunmaktadır. Düşük voltajlı kâğıt elektroforezi, proteinlerin ve enzimlerin ayırt edilmelerinde kullanılır. Kâğıt, oldukça düşük molekül ağırlıklı bileşiklerin ayırt edilmeleri için en iyi ortamdır. Yüksek voltajlı kâğıt elektroforezinde genellikle her cm için 20 Volt dan fazla gerilim kullanılır. Bu yöntem en çok peptitler ve aminoasitlerin ayırt edilmelerinde kullanılmaktadır (6). 2.3.2.Selüloz asetat elektroforezi Selüloz asetat elektroforezi ise öncelikle serum proteinlerinin elektroforezinde önemlidir. Ayrıca kâğıt elektroforezi ile çok iyi ayırma yapılamayan bazı serum örneklerinde selüloz asetat ile başarılı sonuç alınabilir. 2.3.3. Jel elektroforezi 2.3.3.1. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) Bu yöntemde yardımcı ortam olarak poliakrilamid jel kullanılır. Yardımcı ortamın amacı konveksiyonu ve difüzyonu engellemektir. Böylece ayrılan bileşikler keskin zonlar halinde maksimum kararlılıkta kalırlar. Çoğu zaman istenilen yardımcı ortamın ayırma işlemi sırasında kimyasal olarak inert olmasıdır. Stabil bir yapıda olmalı ve kolayca ve tekrar hazırlanabilmelidir. Poliakrilamid jel genellikle bu özelliklerinden dolayı benimsenmiştir. Bu yöntem de protein türlerinin ayrımında kullanılır. 2.3.3.2. Agaroz jel elektroforezi Çoğu protein ve glikoproteinlerin ayrımında poliakrilamidin kullanımıyla gölgede kalmış bir yöntemdir fakat geniş porlara sahip yapılarda çok değerlidir. İmmunoelektroforetik çalışmalarda ve ortalama hidrodinamik yarıçapı 5 ile 10 nm

9 üzerindeki büyük moleküllerin ayrımında çokça kullanılır. Bu maddelere virüsler, nükleik asitler, lipoproteinler,ve bazı membran proteinleri örnek verilebilir (5). 2.3.4.Kapiler Elektroforez Kapiler elektroforez (CE), elektroforetik hareket kabiliyeti, faz ayırımı ve moleküler boyuttaki farklılıklara ya da bunların bir kaçına bağlı olarak elektrokinetik ayırım yapan bir tekniktir. Bu elektrokinetik ayırım iki ucu açık, dış yüzeyi silika ile kaplanmış, yaklaşık 25-75 µm iç çaplı ve 15-100 cm uzunluğunda, silindirik kapilerlerde yapılır. Kapiler, elektrotları ve tamponu içeren iki cam hazne arasına yerleştirilmiş olup, kapilerler jel ile dolduktan sonra çok az miktardaki örnek, kapilerin bir ucuna elektrokinetik ve hidrodinamik teknikle yüklenir. Ayırım 5-30 kv gibi yüksek voltaj uygulayarak yaklaşık 200-500 V/cm doğru akım altında sağlanır (7). Elektrik akımı altında oluşan elektroosmotik akış elektrolitlerin kapiler tüp içinde ilerlemesini sağlar. Yüklü maddeler tüp içinde göç ederlerken, yüksek yüklü iyonlar en hızlı, düşük yüklü iyonlar ise en yavaş göç hızına sahiptirler. Tamponun elektroosmotik akışı negatif yüklü çözünen maddenin elektroforetik hareketliliğinden daha büyüktür. Dolayısıyla, bunlar tampon ile dedektöre taşınırlar. Hatta elektroosmotik akış, küçük ve yüklü anyonları bile negatif elektroda taşıyacak güçtedir. Anyonik çözünen maddeler kaynak vialinden pozitif yüklü anoda doğru çekildikleri için, elektroosmotik akıştan daha düşük bir oranda hareket ederler. Nötral çözünen maddeler elektroforetik hareketlilikten etkilenmezler ve buna bağlı olarak elektroosmotik akışla aynı oranda olarak kapilere doğru hareket ederler. Yine de nötral moleküller miseller elektrokinetik kapiler kromatografi ile birbirlerinden ayrılabilirler. Pozitif yüklü çözünen maddeler hem elektroosmotik akış hem de elektroforetik hareketliliğin etkisi altında negatif elektroda doğru hareket ederler ve hareketleri elektroosmotik akıştan daha hızlıdır. Yüklü moleküller iletken ortamda moleküler difüzyon olmadan zonlar halinde hareket ederler (8). Şekil 2.5 de katyonik, anyonik ve nötral çözünen maddelerin kapilerden geçişi görülmektedir. Yüklü çözünen maddeler, farklı elektroforetik mobilitelere sahip oldukları için birbirlerinden ayrılırlar. Nötral çözünen maddeler, birbirlerinden değil, yüklü çözünen maddelerden ayrılırlar. Yüksek hareketliliğe sahip, daha fazla yüklü ve

10 boyut olarak daha küçük katyonlar kapilerden ilk olarak geçerler. Kapilerden en son, fazla yüklü küçük anyonlar geçerler. Şekil 2.5. Bir kapiler içerisinde elektroozmotik akış şeması Şekil 2.6 da bir elektroferogram görülmektedir. Nötral çözünen maddeler birbirlerinden farklı tip kapiler eletroforez veya miseller elektrokinetik kapiler kromatografi kullanılarak ayrılırlar. Bir tampon kapiler içerisine yerleştirildiği zaman, kapilerin iç yüzü yüklenir. Bu, kapilerin yüzeyinin iyonizasyonuna veya iyonların tampondan kapilere doğru adsorbsiyonuna bağlı olabilir. Burada, elektrik yüklü iyonların tampondan kapiler duvarına adsorbsiyonuna bağlı olarak teflon kapilerler bile elektroosmotik akışı sağlayabilir. Şekil 2.6. Elektroferogram Erimiş silikada ise, yüzey silanol grupları (Si-OH), yaklaşık ph 3 ün üzerinde negatif yüklü silanoat (Si-O-) gruplarına iyonize olurlar. Bu iyonizasyon, tamponu takiben kapilerden basit bir çözeltinin ilk olarak geçirilmesiyle artırılabilir. Sıklıkla, yeni bir kapiler öncelikle KOH veya NaOH çözeltileri ile muamele edilir. Negatif yüklü silanoat

11 grupları, kapiler duvarındaki katyonların iç tabakasındaki formu olan tampondaki pozitif yüklü katyonları çeker. Bu katyonlar bütün negatif yükleri nötralize edebilecek yoğunlukta değildir. Dolayısıyla daha dış tabakadaki katyonlarda işin içine girer. (Si-O) grupları tarafından sıkı bir biçimde nüfuz edilmiş olan iç tabaka sabit tabaka olarak da adlandırılır. Silanoat gruplarından daha uzakta olduğu için, dış tabaka bu kadar sıkı biçimde kaplanmamıştır ve hareketli tabaka olarak adlandırılır. Bu iki tabaka katyonların difüze çift tabakasını meydana getirir. Şekil 2.7 de silanoat grupları ve kapiler içindeki difüze çift tabaka görülmektedir. Şekil 2.7. Çözeltinin geçirilişini takiben kapilerin yüklenişi ve oluşan tabakalar Bir elektrik alanı uygulandığı zaman, hareketli tabaka negatif yüklü katoda doğru çekilir. Bu katyonlar çözündüğü için, bunlar, bu katyonlarla birlikte ham tampon çözeltisine karşı direnç gösterir; bu da elektroosmotik akışın sebebidir. İki tabakanın arası kesici düzlem olarak adlandırılır ve elektriksel dengesizlik bu düzlemde meydana gelir ve tabakalar arasındaki bu potansiyel farklılığı zeta potansiyeli (ζ) olarak adlandırılır. Elektroosmotik akış zeta potansiyeli ve çift tabakanın kalınlığı ile doğru orantılıdır. Zeta potansiyeli aşağıdaki denklemle ile verilebilir. ζ = 4.π.d.e /e (2.1)

12 Burada d difüz çift tabakanın kalınlığı, e birim yüzey başına yük ve e tamponun dielektrik sabitidir. Difüz çift tabakanın kalınlığı tamponun konsantrasyonuyla ters orantılıdır. 10 mm konsantrasyon ile yaklaşık 1 nm kalınlığında tabaka elde edilir (8). Basınçlı akımlarda gözlediğimiz parabol şeklindeki akım eğrisinin yerine elektroosmozda düz akım eğrisi oluşur. Kapilerdeki çözünür maddenin dağılımı temel olarak difüzyon ile kapiler duvarı-örnek etkileşimi, ısı ve iletkenlikteki değişkenliğe bağlı olarak elektroforetik dağılıma dayanır. Kapiler duvarı-örnek etkileşimi, duvar iç yüzeyinin tampona eklenen dinamik maddeler ile kaplanması ile en aza indirilir. Örnekler kapilerin anot ucuna yakın yerleştirilen sensörler ile kapiler üzerinden saptanırlar.(7) Kapiler elektroforez yüksek hızda ve duyarlılıkta, az numune kullanımıyla, ucuza mal edilebilmesiyle analitik alanda yaygın kullanımı olan çok yönlü bir tekniktir. CE, ayırma prensipleri farklı olduğu için sıvı kromatografiyle ayrılması zor olan örnekler için uygundur. Ayrıca yüzey adsorpsiyonu olmayan homojen bir ayırım metodudur. CE nin düşük tayin limiti küçük miktarlardaki maddelerin ayrılması ve tanımlanmasına olanak sağlar (8). 2.3.5.Kapiler elektroforez çeşitleri Kapiler elektroforetik ayırma birkaç değişik şekilde sınıflandırılmaktadır. Kapiler elektroforez prensibi ile çalışan bu teknikler, kapiler zon elektroforez (CZE), kapiler jel elektroforez (CGE), kapiler izotakoforez (CITP), kapiler izoelektrik odaklama (CIEF), miseller elektrokinetik kromatografi (MECC) ve kapiler elektrokromatografi (CEC) dir (4). 2.3.5.1.Kapiler Zon Elektroforez Kapiler bölge elektroforez basitliği ve uygunluğundan dolayı CE in en yaygın kullanılan tipidir. Uygulanan potansiyel ile karışımı oluşturan parçacıklar kendi yük yarıçap oranına göre sahip oldukları iyonik hareketliliklerine göre bölgelere ayrılırlar. Bununla birilikte, nötral türler elektroosmotik akış hızı ile hareket ettiklerinden dolayı ayrılamazlar. CZE, kapiler elektroforezin ilk uygulanmış olan temel türüdür. CZE de, kapiler içindeki iyonlara iki kuvvet etki eder. Birincisi, uygulanan voltajdan kaynaklanan elektrik alanın

13 iyon üzerinde oluşturduğu kuvvet (elektroforetik kuvvet), ikicisi de iyonun bulunduğu tamponun akışıdır (elektroosmotik akış). Elektrik alan, pozitif yüklü iyonlar (katyonlar) üzerinde negatif yüklü elektrot (katot) yönüne doğru bir kuvvet oluştururken, negatif yüklü iyonlar (anyonlar) üzerinde de pozitif yüklü elektrot (anot) yönünde bir kuvvet oluşturur. Çözeltideki nötr moleküller elektrik alandan etkilenmez. Elektrik alanın oluşturduğu kuvvet, iyonlarda elektroforetik göç denen harekete neden olur. İyonların elektroforetik göç hızları, yük/çap oranlarına bağlıdır. Yük/çap oranı büyük olan iyonlar daha hızlı göç ederken, bu oranı küçük olan iyonlar daha yavaş göç eder. İyonların göçünü etkileyen diğer kuvvet elektroosmotik akıştır. Bu akışın nedeni, kapilerin iç çeperinde çalışma elektroliti ile SiO grupları arasında çift tabaka oluşmasıdır. Kapiler iç çeperinde ph 3.0 ın üzerinde silanol gruplarının ayrışması ile negatif yüklü SiO grupları oluşur. Çalışma elektrolitindeki pozitif yüklü iyonlar, kapiler çeperine yaklaşırlar. Çepere çok yakın olan pozitif yüklü iyonlar hareketsizdir. Ancak çeperden uzaklaştıkça, çeperle pozitif yüklü iyonlar arasındaki elektrostatik çekim zayıflar, kapilere uygulanan elektriksel alanın iyonlar üzerindeki kuvveti baskın gelir ve bu pozitif yüklü iyonlar topluca negatif yüklü elektroda (katot) doğru göç ederler. Bu toplu göç, kapiler içindeki tamponun katoda doğru akmasına neden olur. Bu akışa elektroosmotik akış (EOF) denir (1, 9, 10). 2.3.5.2.Kapiler Jel Elektroforez Kapiler jel elektroforez, genellikle gözenekli polimer matriks içinde yapılır. Gözenekler içinde ayrılmanın meydana geldiği bir tampon karışımı bulunur. İlk tabaka elektroforez çalışmalarında, polimerik maddenin asıl amacı, konveksiyon ve difüzyonla analitin dispersiyonun azaltılarak görüntülenmesi ve tayin için uygun bir ortam sağlanmasıydı. Sonraları görüldü ki, bu tip bir ortam moleküler elek etkisi yapmakta ve buna bağlı olarak polimerin gözenek büyüklüğü ve analitin iyon büyüklüğüne bağlı olarak numunenin göçünü geciktirmektedir. Bu tip bir eleme etkisi, yaklaşık olarak aynı yüke sahip olan fakat büyüklükleri(hacimce) farklı olan proteinler, DNA parçaları ve oligomerler gibi makromoleküllerin ayrılmasında önemli ölçüde faydalı olmuştur. Günümüzde makromoleküllerin elektroforetik ayrılması genellikle jel tabaka yöntemiyle yapılmaktadır. Boyut bakımından farklı olan türlerin bazı kapiler

14 elektroforetik ayrılmasında da kapiler içinde jel bulunan kapilerlerden faydalanılmaktadır. Kapiler elektroforezde yaygın olarak kullanılan jel tipi olarak, çapraz bağlayıcı reaktiflerin bulunduğu ortamda akrilamidin polimerleşmesiyle meydana gelmiş poliakrilamit polimeri kullanılmaktadır. Bunun yanı sıra kapiler elektroforezde kullanılan diğer jel türleri, agaroz, metil selüloz ve polietilen glikoldür (1). 2.3.5.3.Kapiler İzotakoforez Kapiler izotakoforez, iki tampon sisteminin kombinasyonuyla meydana gelen kapiler bir elektroforetik yöntemdir. Böylece tüm türlerin ayrılan zonlarının aynı hızda hareket etmesi amaçlanır. Zonlar öndeki ve sondaki elektrolitler arasında sıkışır. CITP de kararlı durum hızı her zondaki elektrik alan değiştiği zaman meydana gelir. Böylece zonlarda çok keskin sınırlar görünür (11). CITP de tüm analitin bantları aynı hızda göç eder. Bu tekniğin kullanıldığı herhangi özel bir uygulamada ya anyonlar ya da katyonlar ayrılabilir, fakat her ikisi aynı anda yapılamaz. Bir ayırma işleminde, numune iki tampon arasına enjekte edilir, öndeki tampon hareketliliği numune içindeki en hızlı iyondan daha hızlı iyonlar ve sonraki tampon ise hareketliliği numune iyonlarından daha düşük olan iyonlar içerir (1). 2.3.5.4.Kapiler İzoelektrik Odaklama Kapiler izoelektrik odaklamada, kapilerde hem asidik hem bazik gruplar içeren bileşiklerin kullanılmasıyla ph gradienti oluşur. Odaklama olarak adlandırılan işlemde bazik ve asidik solüsyonlar sırasıyla katot ve anotta birikir ve uygulanan elektrik akım sonucunda ayrıma işlemi gerçekleştirilir. Kapiler elektroforezin bu modu immünoglobülinler ve hemoglobülinlerin ayrımı ve proteinlerin izoelektrik noktalarının tayinlerinde kullanılır (11).

15 2.3.5.5.Miseller Elektrokinetik Kromatografi Miseller Elektrokinetik Kromatografi elektroforez ve kromatografi tekniklerinin birleşiminden oluşmaktadır. CE tekniğinin en yaygın kullanılan bir çeşididir. Elektroforetik tekniklerde sadece yüklü moleküllerin analizi gerçekleşirken, MECC yöntemi ile yüksüz çözünen maddelerin ayrılması mümkündür. Bu hareket eden tampon içerisine yüzey aktif maddelerin eklenmesi ile gerçekleşmektedir. Kapiler içerisine kritik misel derişimini aşacak şekilde yüzey aktif madde ilave edilir. Miseller genellikle hidrofobik kısmı iç tarafta ve iyonik kısımları su moleküllerine dönük olmak üzere küre şeklinde bir araya gelirler. Miseller polar olmayan tanecikleri hidrokarbon kısmının içinde absorbe ederek ikinci bir faz meydana getirir, böylece apolar türler çözelti içerisinde çözünürleştirilmiş olur. Soydum dodesil sülfat (SDS) gibi anyonik yüzey aktif maddeler anoda doğru göç ederler. MECC daha çok katoda doğru elektroosmotik akışla uygulanır. Genel olarak, SDS misellerin elektroforetik mobilitesi, elektroosmotik mobiliteden daha düşüktür ve yavaşça katoda doğru hareket ederler. Böylece bir tamponda hızlı hareket eden su faz ile yavaş hareket eden misel fazlarından meydana gelir. Böyle bir sisteme numune ilave edildiğinde, numune bileşenleri sulu faz ve miselin iç kısmı olan hidrokarbon fazı arasında dağılırlar. Buradaki dağılma dengesi çözünen maddenin polaritesine bağlıdır (11). 2.3.5.6.Kapiler Elektrokromatografi Kapiler elektrokromatografi (CEC), kapiler elektroforez (CE) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) nin iyi özelliklerini birleştiren melez bir yöntemdir. Kapiler elektrokromatografi (CEC), bu iki tekniğinden bileşiminden oluştuğu için ayırma gücü daha fazladır ve kendini meydana getiren her iki tekniğe göre bazı avantajlara sahiptir. Birincisi, HPLC de olduğu gibi yüksüz taneciklerin ayrılmasında uygulanabilir olmasıdır. İkincisi, kapiler elektroforezdeki gibi, çok küçük miktardaki numune çözeltilerinin en iyi şekilde ayrılması için yüksek basınçlı pompa sistemine ihtiyaç duymamasıdır. Elektrokromatografide hareketli faz elektroosmotik akışın pompalaması ile durgun faz üzerinden hareket ettirilir. Mekanik pompa kullanılmadığı için sistem önemli ölçüde basite indirgenmiştir. Ayrıca elektroosmotik pompalama hidrodinamik

16 profilden ziyade düz bir akış profiline sahiptir. Düz akışının düzgün yüzü hidrodinamik profilden daha az bant genişlemesine sebep olur. Bunun sonucunda ayırma verimi daha yüksek olmaktadır (1). 2.4. KAPİLER ELEKTROFOREZ YÖNTEMİNDEKİ AYIRIM PARAMETRELERİ VE ELEKTROFORETİK PARAMETRELERİN AYIRIM PARAMETRELERİ ÜZERİNE ETKİSİ 2.4.1.Göç Zamanı Kapiler elektroforezde ayırma ve miktar tayininde geliştirilen yöntemin başarılı sayılması için analiz süresinin kısa, etkinliğin, seçiciliğin ve ayırıcılığın yüksek olması gerekmektedir. Analiz süresinin kısa olması için yapılması gereken ön işlemlerin ve kapiler şartlandırılmasının az zaman alması, ayrıca cihazdan elde edilen verilerle sonuca kısa zamanda ulaşılabilmesi gerekir. Kapiler elektroforezde ön işlemlerin basit olması ve kısa zaman alması, cihazdan elde edilen verinin yazılım yardımıyla anında sonuca dönüştürülmesi, analiz süresini kısaltmaktadır. Analizin tamamlanması için tüm numune bileşenlerinin dedektöre ulaşması gerektiğinden, bileşenlerin göç zamanlarının kısa olması önemlidir. Bir çözünen maddenin göç zamanı (t g ), o maddenin giriş kısmından dedektöre olan kapiler uzunluğunu göç etmesi için gereken süredir. t g = l etkin. L toplam / µ g. V (2.2) t g : Göç zamanı V: Uygulanan voltaj l etkin : Kapilerin etkin uzunluğu L toplam : Kapilerin toplam uzunluğu µ g : Gözlenen elektroforetik hız Eşitliğe göre, yüksek gerilim uygulanması, kapiler boyunun kısa olması ve yüksek elektroosmotik akışa bağlı olarak maddenin alıkonma zamanı azalır ve böylece hızlı bir analiz gerçekleşir (14).

17 2.4.2.Yöntemin Verimi Kapiler elektroforezde verim, teorik tabaka sayısı (N) ile belirlenir. Teorik tabaka sayısı göç zamanı ve pik genişliğine bağlıdır.(1) Göç zamanı ve pikin tabanından itibaren pik genişliğinin ölçülmesi ile hesaplanabilir. N = 16 (t g /w) 2 (2.3) N: Teorik tabaka sayısı t g : Göç zamanı w: Pik genişliği Eşitlikten hareketle, daha uzun bir göç zamanı ve daha kısa bir pik verimin yükselmesine neden olur. Elektroforetik hareketlilik, difüzyon katsayısı ve uygulanan potansiyel göz önüne alındığında verim aşağıdaki şekilde de hesaplanabilir. N = (µ EP + µ EOF ) V / 2D (2.4) N: Teorik tabaka sayısı µ e : Maddenin elektroforetik hareketliliği V: Uygulanan voltaj D: Maddenin difüzyon katsayısı Denklemden de görüleceği üzere, uygulanan potansiyelde (V) bir artış ile verim artırılabilirken, bu terim ile difüzyon katsayısı (D) arasında ters bir orantı vardır (1,14). 2.4.3.Seçicilik Seçicilik elektroferogramdaki komşu piklerin uçları arasındaki mesafeye eşittir ve çözünen maddelerin dedektör içinden geçerken birbirlerinden ne kadar ayrı durduklarıyla alakalıdır. α = (t 2 t nm ) / (t 1 t nm ) (2.5) α: Seçicilik katsayısı t 1 : Göç zamanı kısa olan maddenin göç zamanı t 2 : Göç zamanı uzun olan maddenin göç zamanı t nm : Sadece EOF ile sürüklenen maddenin göç zamanı

18 Çözünen maddelerin elektroforetik hareketlilikleri göz önüne alındığında denklem aşağıdaki hali alır. α = µ 1 / µ 2. c (2.6) Burada µ 1 ve µ 2, çözünen maddelerin elektroforetik hareketlilikleridir. Denkleme bakıldığında seçiciliğin elektroforetik hareketlilikler arasındaki farka bağlı olabileceği görülmektedir. Tamponun ph ını değiştirmek seçicilikte bir değişikliğe sebep olacak en etkili yoldur. 2.4.4.Ayırıcılık Bir karışımdaki bileşenlerin ne kadar iyi ayrıldığının bir göstergesi olan rezolüsyon ( R ) en önemli ayırım parametresidir. Komşu iki pikin birbirine olan uzaklığı ile ilgilidir. R = t / w AVE (2.7) R = 2 (t 2 t 1 ) / (w 1 + w 2 ) (2.8) R: Ayırıcılık (Rezolüsyon) t 1 : Göç zamanı kısa olan maddeniz göç zamanı t 2 : Göç zamanı uzun olan maddenin göç zamanı w 1, w 2 : Komşu piklerin pik genişliği Rezolüsyon elektroforetik hareketlilik, uygulanan potansiyel ve difüzyon katsayısı göz önüne alınarak şu şekilde de hesaplanabilir. R = 0.177 (µ 2 - µ 1 ) [V/ (µ AVE + µ EOF ) D] 1/2 (2.9) Elektroforetik hareketlilikler arasındaki fark ne kadar büyük olursa rezolüsyon da o kadar iyi olacaktır. Bu fark tampon ph ının en iyi biçimde optimize edilmesiyle artırılabilir. Bazen tampona bir organik çözücünün eklenmesi de bu farlılığa etki eder ve rezolüsyonu artırır. Kapiler uzunluğunun artması ise analiz süresini uzatır (14).

19 2.5. KAPİLER ELEKTOFOREZ CİHAZININ KISIMLARI Bir CE sistemi; bir örnek viali, kaynak ve hedef vialleri, kapiler, dedektör, yüksek gerilim destekleyicisi ve bilgisayardan oluşmaktadır. Şekil 2.8 de bir kapiler elektroforez sistemi görülmektedir. Birçok sistemde kapilerdeki ısınmayı soğutmak ve kapiler sıcaklığını kontrol etmek için termostat bulunmaktadır. Bir CE analizinin temel adımları; kapilerin ön yıkaması, kapiler ile giriş ve çıkış viallerinin çalışma tamponu ile doldurulması, kapilerin tampon ile şartlandırılması, örneğin kapilere enjeksiyonu ve elektriksel alan uygulanmasını içerir. Örnekler kapiler içinde göç ederler, dedektörden geçerken gözlemlenirler ve veriler integratör veya bilgisayara gönderilir. Veriler, dedektör cevabının zamana karşı grafiği olan elektroferogramlar şeklinde elde edilir (1, 13). Şekil 2.8. Kapiler Elektroforez Cihazı 2.5.1.Örnek Enjeksiyonu Numune enjeksiyonu numuneyi kapiler içerisine almak amacıyla yapılır. Numuneler genellikle birkaç µl den birkaç ml ye kadar hacme sahip numune viallerine doldurulur. Kapilere yalnızca birkaç nl enjekte edildiği için küçük hacimde bir numune yeterlidir. Kapiler içine numune enjeksiyonu hidrodinamik veya elektrokinetik olarak yapılabilir.

20 Hidrodinamik enjeksiyon en çok kullanılan enjeksiyon yöntemidir. Bu işlem üç şekilde yapılabilir (Şekil 2.9-a,b,c). Bunlardan birincisi, kapilerin giriş tarafına konulan numune vialine basınç uygulanmasıdır. Genelde 50 mbar civarında 1-5 saniye arası basınç uygulanır. Ardından numune viali çıkarılıp çalışma tamponu viali takılır ve voltaj uygulanarak analize devam edilir. Hidrodinamik enjeksiyonun ikinci yolu, numune viali kapilerin giriş kısmındayken, çıkış kısmındaki tampon vialine vakum uygulanmasıdır. Uygulanan vakumla istenen miktardaki numune kapilere girince vakum kesilir, numune viali çıkarılıp çalışma tamponu viali takılır ve voltaj uygulanarak analize devam edilir. Üçüncü hidrodinamik enjeksiyon yönteminde, sifon etkisinden yararlanılır. Kapilerin giriş kısmına takılan numune viali, çıkıştaki tampon vialinden daha yükseğe yerleştirilir. Yerçekiminin etkisiyle, numune kapilerin içine girer. Ardından numune viali çıkarılıp çalışma tamponu viali takılır ve voltaj uygulanarak analize devam edilir. Elektrokinetik enjeksiyonda kapilerin giriş kısmına numune viali yerleştirildikten sonra, numune vialiyle çıkış kısmındaki çalışma tamponu viali arasına voltaj uygulanır. Oluşan elektrik alanın etkisiyle numunedeki iyonlar kapiler içine göç etmeye başlar. Bu voltajın uygulanmasından sonra numune viali çıkarılıp tampon viali takılır ve voltaj uygulanarak analize devam edilir (13). Şekil 2.9. Kapiler elektroforezde enjeksiyon sistemleri a, b, c) Hidrodinamik enjeksiyon, d) Elektrokinetik enjeksiyon.

21 2.5.2.Kaynak ve Hedef Vialleri Kaynak viali yerine bazen giriş viali veya giriş rezervuarı; hedef viali için çıkış viali veya çıkış rezervuarı terimleri de kullanılır. Normalde kaynak viali, kapiler ve hedef viali aynı tampon ile doldurulur. Tamponun oluşturulması CE de en önemli değişkenlerden biridir. Tamponun ph sındaki veya konsantrasyonundaki küçük değişiklikler çözünen madde göçü oranları ve göç zamanlarında önemli değişikliklere yol açar. Bu nedenle tampon değiştiğinde kaynak vialini, hedef vialini ve kapileri çok iyi bir biçimde çalkalamak önemlidir. Aynı tampon ile tekrarlayan analizler yapıldığı sürece, anottaki hidrojen iyonları ve katottaki hidroksil iyonlarının elektrolitik oluşumuna bağlı olarak, viallerdeki ve kapilerdeki tampon kompozisyonu değişebilir. Tekrarlayan analizlerden sonra kaynak vialindeki tampon hedef vialindeki daha farklı bir kompozisyonda olabilir. Bu da tekrar üretilemeyen göç zamanlarına yol açar. Ayrıca çözünen maddeler kapiler içerisinde göç ettikten sonra, hedef vialine geçerler ve burada biriktiklerinde kapiler ve kaynak vialindekine oranla hedef vialindeki tamponun bileşiminde değişikliğe yol açarlar. Bu nedenle her analizde aynı tampon kullanılsa dahi enjeksiyon aralarında vialler ve kapilerler periyodik olarak çalkalanmalı ve yeniden doldurulmalıdır. Pek çok aygıt bu çalkalama ve doldurma işlemini otomatik olarak gerçekleştirme özelliğine sahiptir. Böylece her analiz için sabit bir tampon bileşimi sağlarlar. Kaynak ve hedef vialleri göç zamanlarında değişikliğe yol açabilecek bir vialden diğerine tampon sifonlaşmasını önlemek amacıyla aynı seviyede tutulmalıdırlar. Bazı aygıtlarda, oto örnekleme sistemleri içerisindeki belirli örnek vialler kaynak ve hedef vialler olarak tasarlanmıştır. 2.5.3.Kapiler Tüp Sistemleri Kapiler elektroforezde kullanılacak kapilerin türü ve boyutları uygulanacak yöntem, analiz edilecek numune, istenen ayırıcılık ve uygun analiz süresine göre seçilir. Kapilerden beklenen, kısa analiz süresinde yeterli ayırımı sağlayabilmesidir. Kapilerin üretildiği materyalin elektrik iletkenliğinin olmaması, kimyasal olarak inert olması ve dedektörle uyumlu olması (örneğin UV dedektör için kapilerin ışınları absorplamaması)

22 gerekir. Eritilmiş silika günümüzde en sık kullanılan kapiler materyalidir. Şekil 2.10 da görüldüğü gibi kolay kırıldığı için dış kısmı poliimid ile kaplanıp sağlamlaştırılmıştır. UV dedektör kullanılacaksa, ışık yolunu kapatmaması için poliimid kaplama bu bölgeden kaldırılır. Şekil 2.10. Eritilmiş silika kapilerin boyuna kesiti. Pyreks kapiler, eritilmiş silika kapilere göre daha sağlam olması ve dedektör penceresi açmaya gerek göstermemesine rağmen 280 nm nin altında çalışılamama dezavantajına sahiptir. Teflon kapilerde homojen iç çap elde edilemez ve ısı iletkenliği düşük olduğundan yüksek voltaj uygulanamaz. Bu nedenlerden dolayı eritilmiş silika, pyreks ve teflondan daha sık kullanılan bir kapiler materyalidir. Genelde iç çapı 25-100 µm olan eritilmiş silika kapiler kullanılır. Büyük çaplı kapilerde yüksek ısı açığa çıkar ve kapilerin iç duvarıyla merkezi arasındaki ısı farkı çok büyük olur. Küçük çaplı kapiler kullanılması ile UV/VIS absorbans veya floresans gibi dedektörlerde ışık yolunun küçülmesinden dolayı absorbans düşer ve pik yüksekliği azalır. Ayrıca çok küçük çaplı kapilerin partiküllerle tıkanma olasılığı yüksektir. Kapilerin tekrarlanabilir sonuçlar vermesi için ilk kullanımda ve her analizden önce şartlandırma işleminden geçirilmesi gerekir. Silika yüzeyinin durumu, CE de parçacıkların hızlarına etki eden iki kuvvetten biri olan elektroosmotik akış (EOF) üzerinde etkilidir. Şartlandırmayla kapilerin iç çeperindeki silanol gruplarının iyonlaşma oranı, dolayısıyla EOF, her analizde aynı olur. Kapiler yeni ise 1 M NaOH, takiben 0.1 M NaOH, su ve en son olarak da çalışma tamponu geçirilerek şartlandırılır. Ayrıca her

23 analizden önce 0.1 M NaOH, su ve çalışma tamponu geçirilerek kapilerin mümkün olduğunca aynı şartlanması sağlanır. Çalışma bitiminde su geçirilmelidir. Eğer birkaç gün çalışma yapılmayacaksa kapiler içinde mikroorganizma üreyeceği göz önünde bulundurularak hava çekilerek kurutulmuş olarak bırakılması yararlı olur (14). 2.5.4.Kapiler Termostat CE de tekrarlanabilir sonuçlar almak için kapiler sıcaklığının kontrolü önemlidir. Sıcaklığın değişmesiyle etkinlik, göç zamanı, enjeksiyon hacmi ve dedektör cevabı değişir. Ayrıca sıcaklık numunenin bozunmasına da neden olabilir. Kapiler sıcaklığının kontrolü, kapilerin içinde bulunduğu kasetin içine, istenen sıcaklığa termostatlı sistem ile ayarlanmış havanın fan ile üflenmesiyle sağlanır (13). 2.5.5.Dedektörler Konsantrasyon değişiklerini elektriksel olarak görülebilir sinyallere dönüştüren araçlara dedektör denir. Dedektörlerin tipi, gücü ve ayırma etkinliği bakımından önemlidir. Kapiler elektroforezin birçok tipinde ayrılan analitlerin hepsi ortak bir noktadan geçtikleri için dedektörlerin tasarımı ve fonksiyonları HPLC de kullanılanlara benzer. CE de en çok kullanılan dedektörler UV/VIS absorbans, floresans, lazer indüklenmiş floresans, kütle spektrometrisi, iletkenlik, amperometri, radyometrik ve kırılma indisi dedektörleridir. Absorbans dedektörleri CE ye uygulanabilirlikleri nedeniyle yaygın olarak kullanılırlar. Gözlenebilme sınırı genellikle 10-5 -10-7 M aralığındadır (Tablo 2.1). Tek bir dalga boyunda veya dizi diyot dedektör kullanılarak birçok dalga boyunda absorbans alınabilir. Absorbans dedektörlerinde kapilerin kendisi dedektör hücresi olarak görev yapar. Bunun için erimiş silika kapilerin dış kısmındaki poliimid koruyucu kaplamanın bir kısmı yakma, çözme ve kazıma ile uzaklaştırılır. Ancak, bu durumda ışın yolunun uzunluğu kapiler iç çapından (50 ile 100 µm) fazla olamaz ve bu da derişim cinsinden

24 gözlenebilme sınırını kısıtlar. Işın yolunun arttırılması için z veya baloncuk şeklinde dedektör hücresine sahip kapilerler kullanılarak duyarlılık arttırılabilir (1). Dedektör Tipi Tablo 2.1. Dedektör Tipleri ve Gözlenebilme Sınırları Gözlenebilme Sınırı a Spektrofotometri Absorbsiyon b 10-15 -10-16 Floresans Kapilerden önce türevlendirme 10-17 -10-20 Kapilerden türevlendirme 8x10-16 Kapilerden sonra türevlendirme 2x10-17 Dolaylı floresans 5x10-17 Termal mercekler b 4x10-17 Raman b 2x10-17 Kütle spektrometri Elektrokimyasal 10-17 İletkenlik b 10-16 Potansiyometri Belirtilmemiştir. Amperimetri 7x10-17 Radyometri b 10-19 a. Burada verilen gözlenebilme sınırları 18 pl ile 10 nl lik geniş bir enjeksiyon hacmi aralığından hesaplanmıştır. b. Kütle gözlenebilme sınırı 1 nl enjeksiyon hacmi kullanılarak derişim gözlenebilme sınırından çevrilmiştir. 2.5.5.1.Absorbans Dedektörleri Kapiler elektroforezde en yaygın kullanılan dedektör absorbans dedektörleridir. Dedeksiyon hacmini nl veya daha az tutabilmek için dedeksiyon kolon üzerinden

25 yapılmalıdır. Bunun için kapilerin içi kısmındaki polimiid koruyu kaplamanın bir kısmı yakma, çözme veya kazma ile uzaklaştırılır ve bu kısım dedektör hücresi olarak görev yapar. Bu durum ışın yolunun uzunluğunu azaltır ve derişim cinsinden gözlenebilme sınırını azaltır. Absorbans ölçümlerinin duyarlılığını artırmak için kapilerinin ucunun z şeklinde bükülmesi, kapilerin sonuna doğru bir baloncuk oluşturması ile gerçekleştirilebilmektedir. Böylece ışın yolu artmaktadır. Kapiler elektroforez de, ayırımı yapılacak olan analit kromorfik veya floroforik grup içermiyorsa İndirek Spektrometrik dedeksiyon uygulanır. Ayrılacak madde UV/görünür alanda absorpsiyon göstermiyorsa, tampon içine UV/görünür alanda bir kromofor madde madde konulur. Örnek ayrılıp dedektörden geçerken kromofor ile yer değiştirip negatif şeklinde pikler görülür. 2.5.5.2.Floresans Dedektörleri Bu metodun tayin sınırı düşük olup, bütün bileşikler içinde sadece çok azı floresans özelliğe sahiptir. Yoğun ışın kaynağından faydalanarak gözlenebilme sınırlarını düşürmek amacıyla, küçük kapilerde uyarıcı ışını odaklamak için lazerli cihazlar tercih edilmektedir. 2.5.5.3.Kütle Spektrometrik Dedektörleri Kütle spektrometreli kapiler elektroforez protein, DNA parçaları ve peptitler gibi büyük doğal moleküllerin tayininde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu dedektör ile analiz edilecek maddenin kütlesi de tayin edilmiş olmaktadır (1). 2.5.5.4.Elektrokimyasal Tayin (EC) Kapiler elektroforezde üç çeşit elektrokimyasal dedektör kullanılmaktadır. Bunlar; iletkenlik, amperometri ve potansiyometridir. Kapiler elektroforezin diğer konveksiyonel kromatografik metotlarla karşılaştırıldığında en önemli avantajlarından biri elektroforetik ayırım sistemlerinin minyatürizasyonu sınırlandırmamasıdır. 10 fl a kadar düşük örnek hacimlerinin enjeksiyonuna izin verir. Küçük örnek hacmi ve küçük iç çap CE kapilerinin kullanılması dedeksiyon metodunun küçük hacim olmasını

26 sınırlamaktadır. Tam olarak duyarlılık ve minyatürizasyonun yapılabilmesi başarılı bir şekilde elektrokimyasal dedeksiyon ile yapılabilmektedir (15). Kapiler elektroforezde organik asitler ve inorganik iyonların analizi için UV absorpsiyon ya da floresans dedektör uygun değildir. Çünkü bu tür bileşiklerin çoğu UV ışını absorplamazlar ve floresans aktivite göstermezler. Bu yüzden optik dedeksiyonlar dolaylı yapılmaktadır. Bu da duyarlılığın azalmasına neden olmaktadır. Henüz CE de elektrokimyasal dedektörler sık kullanılmamasına rağmen bu tür bileşiklerin analizi için kullanımı uygundur. Amperometri çoğunlukla direkt olarak kullanılmaktadır (elektroaktif türlerde) ve çok düşük dedeksiyon limitleri başarıyla elde edilebilir. Kondüktometrik dedektör elektrokimyasal dedektörlerin içinde daha çok evrenseldir, fakat onun duyarlılığı büyük background sinyaller tarafından sınırlandırılmaktadır. Potansiyometrik dedektörler ise sadece anyon ve katyonlara cevap verdiklerinden dolayı kondüktometrik dedektörden daha seçicidir (16). Kapiler elektroforezde kullanılan UV ve floresans dedektörler taşınabilirlik açısından kullanımı uygun değildir. Potansiyometrik dedektörler ise duyarlılığını kaybetmeksizin kolaylıkla minyatürize olabilirler ve mikro CE hücrelerinde kullanılırlar (17). 2.5.5.5.Potansiyometri Akımın çok az geçtiği (n A, µ A seviyesinde) veya hiç geçmediği sistemlerde, indikatör elektrodun referans elektroda karşı gösterdiği, derişim değişimine bağlı olarak değişen potansiyelin ölçüldüğü elektrokimyasal tayin yöntemidir. Potansiyometride kullanılan cihazlara potansiyometreler denir. Potansiyometrik sistem, bir test hücresi (elektrolitik çözelti), buna bağlantılı olan indikatör elektrot (değişken potansiyel) ve referans elektrot (sabit potansiyel) ile kararlı bir potansiyometreden oluşur. Bunlara potansiyometrik hücre elemanları da denir. Analit çözeltisine daldırılan indikatör elektrotta, mevcut iyon veya iyonların derişimine bağlı olarak bir potansiyel değişimi meydana gelir ve bu potansiyel değişimi ölçülerek iyonların derişimleri tayin edilebilir (18).