DNA Mısırdan İzolasyon Kiti Öğretmen Kılavuzu a. Konu b. Kullanıcı Kitlesi c. Deney Süresi d. Materyaller e. Güvenlik f. Genel Bilgi g. Deney Öncesi Hazırlık h. Ön Bilgi i. Deneyin Yapılışı j. Deney Sonuçları k. Öğrenci Kılavuzundaki Soruların Cevapları l. Kaynaklar Öğrenci Kılavuzu a. Genel Bilgi b. Deney Süresince Uyulması Gereken Kurallar c. Deneyin Yapılış d. Sorular 1
Öğretmen Kılavuzu DNA, bazı virüsler hariç canlılarda kalıtsal bilgiyi taşıyan ve gelecek nesillere aktaran moleküldür. Tek hücreli ve çok hücreli organizmalarda yer alan DNA molekülü canlının hücresel faaliyetlerini sürdürmesi için gereken tüm bilgiyi içerir. Kit kullanılarak, kitin içinde hazır olarak verilen mısır bitkisinin DNA sı elde edilecektir. Kit 10 öğrencinin deney yapabileceği şekilde dizayn edilmiştir. a) Konu Öğrenciler; Deneyde bitki hücresinden (mısır) DNA izolasyonunu gerçekleştirecektir. b) Kullanıcı Kitlesi DNA izolasyon kiti, 9 yaş ve üstü çocukların kullanımına uygundur. c) Deney Süresi Deney: 45 dakika d) Materyaller Falkon tüpü içerisine konulmuş 5 gr mısır örneği: 10 tane Liziz 1 çözeltisi: 50 ml Liziz 2 çözeltisi: 50 ml Etanol: 70 ml Sargı bezi Deney tüpü: 20 tane Eppendorf;:15 tane Pastör pipeti: 50 tane Küçük plastik kap: 10 tane Eldiven: 20 tane Distile su e) Güvenlik Laboratuvarda uyulması gereken genel kurallara dikkat edilmelidir. Deney süresince öğrenciler eldiven kullanmalıdır. Deney süresince kullanılan kimyasallar ile istenmeyen bir temas olması durumunda bulaşan bölge bol sabun ve su ile yıkanmalıdır. Kullanılan kimyasalların solunmamasına özen gösterilmeli, deneyin yapıldığı laboratuvar havalandırılmalıdır. Laboratuvar sorumlusu olmadan kit kullanılmamalıdır. 2
f) Genel Bilgi 1. DNA nın Yapısı Genetik bilginin nesiller boyunca aktarılmasını sağlayan kalıtsal molekül olan DNA (deoksiribonükleasit) -bazı virüsler hariç-; prokaryotlarda hücre içinde dağınık olarak, ökaryotlarda ise çekirdek içerisinde paketlenmiş olarak (kromotin iplik; bölünme sırasında kısalıp kalınlaşarak kromozom adını alır) bulunmaktadır. 1953 te James Watson ve Francis Crick in önermiş olduğu, günümüzde de hala kabul gören DNA nın 3 boyutlu modeline göre, DNA çift sarmal yapıdadır ve her bir zincir nükleotitlerden meydana gelen uzun polinükleotit zinciri şeklindedir (Şekil 1). Bir nükleik asit olan DNA; azotlu baz, pentoz şeker (5 karbonlu şeker) ve fosfat grubundan oluşmuştur. Azotlu bazlar 2 çeşittir: dokuz atomlu, 2 halkalı pürinler ve 6 atomlu tek halka içeren pirimidinler. Nükleik asitlerde yaygın olarak iki tip pürin ve üç tip pirimidin bulunur. Pürinler adenin (A) ve guanin (G); pirimidinler ise sitozin (C),timin (T) ve urasil (U) olarak adlandırılmaktadırlar. DNA ve RNA da (bir diğer nükleik asit) ortak olarak A, C, G bulunur; T bazı sadece DNA da U bazı ise sadece RNA da vardır. Nükleik asite adını veren taşıdığı pentoz (5 karbonlu) şekerdir. Ribonükleik asitlerde (RNA) riboz, deoksiribonükleikasitlerde (DNA) deoksiriboz bulunur. Riboz ve deoksiriboz arasındaki fark; deoksiribozun (şekerin) 2. karbonunda ribozda olduğu gibi hidroksil grubu (OH) yerine hidrojen (H) atomunun bulunmasıdır. Nükleotit yapısınıdaki fosfat grupları ise; polinükleotit yapısının oluşumu sırasında yapıya katılmaktadır. Baz ve şekerin bir araya gelmesiyle nükleozit; baz, şeker ve fosfat grubundan oluşan yapıya ise nükleotit adı verilmektedir (Şekil 2). İki mononükleotit arasında kurulan bağ yapısında iki şekere bağlı fosfat grubu yer alır ve oluşan bağ fosfodiester bağıdır. İki nükleotit birleştiğinde 3
dinükleotit, üç nükleotit birleştiğinde trinükleotit, yaklaşık yirmi nükleotit birleştiğinde oligonükleotit ve çok sayıda nükleotitin birleşmesiyle de polinükleotit adı verilen yapılar oluşur. Çift sarmal yapının oluşmasında ise bazlar arasındaki hidrojen (H) bağları görev almaktadır. Bir DNA zincirindeki adenin (A) nükleotiti (bazı) diğer zincirdeki timin (T) bazı ile, guanin (G) bazı ise, diğer zincirdeki sitozin (C) bazı ile baz çifti oluşturur. A ile T bazları arasında iki H bağı oluşurken G ile C arasında üç H bağı oluşmaktadır. 2. DNA nın Görevleri DNA nın iki temel görevi bulunmaktadır. a) DNA, hücre bölünmesi sırasında kendini eşleyerek (replikasyon), atasal özelliklerin yeni nesle aktarımını (kalıtımı) sağlar. b) DNA molekülü hücrede protein sentezini (transkripsiyon ve translasyon) kontrol ederek hücredeki metabolik olayları yönetir. 3. DNA Replikasyonu (Eşleme) Hücre bölündüğü zaman kalıtsal özelliklerin hiç bir değişikliğe uğramadan yavru hücrelere aktarılması gerekmektedir. Nesiller boyunca kalıtım materyalinin bu şekilde korunması replikasyon (eşleme) ile sağlanmaktadır. Replikasyon sırasında : DNA nın çift zincirli sarmal yapısının oluşumunu sağlayan bazlar arasındaki hidrojen bağları, enzimler vasıtasıyla koparılmaktadır. Kopan hidrojen bağlarıyla birlikte iki zincir açılmaya başlamakta ve karşılıklı konumlanmış olan nükleotit dizileri birbirinden ayrılmaktadır. Ayrılan zincirlerde iki yönde DNA polimeraz enzimleri yardımıyla yeni DNA zincirleri sentezlenmektedir. Yeni oluşturulan DNA moleküllerine ait zincirlerden biri atasal zincirden gelirken diğeri ortamdaki nükleotitlerden sentezlenmektedir. Açılmış zincirlerdeki tüm nükleotitlerin eşleşmesinin tamamlanmasıyla hücre içerisindeki DNA sayısı ikiye çıkmaktadır. Bu işlemde atasal DNA nın açılmış olan her iki kolu da kalıp işlevi görmektedir. DNA nın bu şekilde eşlenmesine yarı korunumlu (semikonsevatif) replikasyon denir. 4
4. DNA nın Denatürasyonu ve Renatürasyonu DNA nın çift sarmal yapısındaki hidrojen bağlarının ısı ve çeşitli kimyasallarla karşılaşma sonunda açılması sonucunda ipliklerin ayrılmasına denatürasyon denir. İki tamamlayıcı DNA ipliğinin tekrar çift zincir haline dönüşmesine renatürasyon denir. Renatürasyon tamamlayıcı iplikler arasındaki kendine özgü baz eşleşmesine dayanmaktadır. Isı ile gerçekleştirilen denatürasyon, soğutma işlemi ile geri döndürülebilmektedir. Hızlı bir şekilde soğutma tüm bölgelerin renatürasyonuna olanak sağlamazken, yavaş yavaş soğutma ile komplementer (tamamlayıcı) zincirlerin tamamıyla hibridizasyonu gerçekleşebilmektedir. Zincirlerin kimyasal ve ultraviyole ile muamele sonucu ayrılması yani denatürasyonu, DNA zincirlerinde oluşan hasarlar ve konfigürasyon değişimleri sebebiyle geri dönüşümsüzdür. g) Deney Öncesi Hazırlık 1. Kit kitapçığı öğretmen ve öğrenci kılavuzu olmak üzere 2 kısımdan oluşmaktadır. Uygulama öncesi öğrenci kılavuz bölümü öğrencilere çoğaltılıp verilecektir 2. Deneyde kullanılan ayırma yöntemlerinde gerçekleşen reaksiyonların bilgisi sadece öğretmen kılavuzundadır. Öğrenci kılavuzunda deney sonunda reaksiyonlar ile ilgili sorular verilerek, öğrencilerin akıl yürütmesi ve araştırma yapması hedeflenmiştir. 3. Deneyde kullanılan liziz 1 ve liziz 2 çözeltileri hücrelerin kimyasal parçalanmasına yönelik hazırlanan kimyasallardır. Çözeltileri oluşturabilmek için liziz 1 ve liziz 2 nin bulunduğu şişeler 50 ml ye distile su eklenerek tamamlanmalıdır. Liziz 1 ve liziz 2 çözeltilerinin bu şekilde kullanıma sunulmasının sebebi raf ömrünü uzatmak ve çözeltilerden maksimum verim alabilmektir. 4. Kit içerisinde verilmiş olan etanol -20 C de saklanmalıdır. Deney sırasında kullanılacak olan etanolün soğukluk derecesi, deney sonucunun kalitesini etkilemektedir. h) Ön Bilgi Mısır örneği toz şeklinde kullanıma sunulmuştur. Bu sayede bitki hücrelerinde bulunan hücre duvarının, fiziksel etki ile parçalanarak deneyde kimyasal parçalamada kullanılacak liziz solüsyonlarının daha etkin bir parçalama yapması hedeflenmiştir. 5
i) Deneyin Yapılışı Falkon tüpü içerisine konulmuş toz halindeki 5 g mısır örneği üzerine 3 ml liziz 1 çözeltisi ve 3 ml liziz 2 çözeltilerinden pastör pipeti yardımıyla eklenerek iyice karıştırılır (15 dakika) Bu karışım sargı bezi kullanılarak küçük plastik kap içine süzülür. Süzüntü deney tüpünün içerisine alınır. Üzerine pastör pipeti yardımıyla çok yavaş bir şekilde tüpün iç kenarından 5 ml etanol (-20 C) eklenir ve 10-15 dakika beklenir. (Bu sırada tüp kıpırdatılmamalıdır, bu sayede altta süzüntü üstte etanol olacak şekilde 2 fazın oluşumu sağlanır.) Etanol içinde topak halinde çıkan DNA molekülü, pastör pipeti yardımıyla eppendorf içerisine alınır j) Deney Sonuçları Etanol içerisinde DNA topak halinde görünür hale gelmektedir. k) Öğrenci Kılavuzundaki Soruların Cevapları 1. Genetik bilginin nesiller boyunca aktarılmasını sağlayan kalıtsal moleküldür. 2. DNA prokaryotlarda sitoplazmada dağınık olarak, ökaryotlarda ise çekirdek içerisinde paketlenmiş olarak bulunur. l) Kaynaklar Concepts of Genetics; Eighth edition; William S. Klug, Michael R. Cummings, Charlotte A. Spencer. Harper s Illustrated Biochemistry; Twenty-sixth edition; Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor W. Rodwell. Lehninger Principles of Biochemistry; Fifth edition; David L. Nelson, Michael M. Cox. 6
Öğrenci Kılavuzu AD- SOYAD : TARİH : DNA, bazı virüsler hariç genetik bilginin nesiller boyunca aktarılmasını sağlayan kalıtsal moleküldür. Bir hücreyi ya da organizmayı oluşturmak için gerekli tüm bilgileri içermektedir. Yapılacak olan deneyde bitki hücresinden DNA izolasyonu gerçekleştirilecektir. a) Genel Bilgi 1. DNA nın Yapısı Genetik bilginin nesiller boyunca aktarılmasını sağlayan kalıtsal molekül olan DNA (deoksiribonükleasit) -bazı virüsler hariç-; prokaryotlarda hücre içinde dağınık olarak, ökaryotlarda ise çekirdek içerisinde paketlenmiş olarak (kromotin iplik; bölünme sırasında kısalıp kalınlaşarak kromozom adını alır) bulunmaktadır. 1953 te James Watson ve Francis Crick in önermiş olduğu, günümüzde de hala kabul gören DNA nın 3 boyutlu modeline göre, DNA çift sarmal yapıdadır ve her bir zincir nükleotitlerden meydana gelen uzun polinükleotit zinciri şeklindedir (Şekil 1). Bir nükleik asit olan DNA; azotlu baz, pentoz şeker (5 karbonlu şeker) ve fosfat grubundan oluşmuştur. Azotlu bazlar 2 çeşittir: dokuz atomlu, 2 halkalı pürinler ve 6 atomlu tek halka içeren pirimidinler. Nükleik asitlerde yaygın olarak iki tip pürin ve üç tip pirimidin bulunur. Pürinler adenin (A) ve guanin (G); pirimidinler ise sitozin (C),timin (T) ve urasil (U) olarak adlandırılmaktadırlar. DNA ve RNA da (bir diğer nükleik asit) ortak olarak A, C, G bulunur; T bazı sadece DNA da U bazı ise sadece RNA da vardır. Nükleik asite adını veren taşıdığı pentoz (5 karbonlu) şekerdir. Ribonükleik asitlerde (RNA) riboz, deoksiribonükleikasitlerde (DNA) deoksiriboz bulunur. Riboz ve deoksiriboz arasındaki fark; deoksiribozun (şekerin) 2. karbonunda ribozda olduğu gibi hidroksil grubu (OH) yerine hidrojen (H) atomunun bulunmasıdır. 7
Öğrenci Kılavuzu Nükleotit yapısınıdaki fosfat grupları ise; polinükleotit yapısının oluşumu sırasında yapıya katılmaktadır. Baz ve şekerin bir araya gelmesiyle nükleozit; baz, şeker ve fosfat grubundan oluşan yapıya ise nükleotit adı verilmektedir (Şekil 2). İki mononükleotit arasında kurulan bağ yapısında iki şekere bağlı fosfat grubu yer alır ve oluşan bağ fosfodiester bağıdır. İki nükleotit birleştiğinde dinükleotit, üç nükleotit birleştiğinde trinükleotit, yaklaşık yirmi nükleotit birleştiğinde oligonükleotit ve çok sayıda nükleotitin birleşmesiyle de polinükleotit adı verilen yapılar oluşur. Çift sarmal yapının oluşmasında ise bazlar arasındaki hidrojen (H) bağları görev almaktadır. Bir DNA zincirindeki adenin (A) nükleotiti (bazı) diğer zincirdeki timin (T) bazı ile, guanin (G) bazı ise, diğer zincirdeki sitozin (C) bazı ile baz çifti oluşturur. A ile T bazları arasında iki H bağı oluşurken G ile C arasında üç H bağı oluşmaktadır. 2. DNA nın Görevleri DNA nın iki temel görevi bulunmaktadır. c) DNA, hücre bölünmesi sırasında kendini eşleyerek (replikasyon), atasal özelliklerin yeni nesle aktarımını (kalıtımı) sağlar. d) DNA molekülü hücrede protein sentezini (transkripsiyon ve translasyon) kontrol ederek hücredeki metabolik olayları yönetir. 3. DNA Replikasyonu (Eşleme) Hücre bölündüğü zaman kalıtsal özelliklerin hiç bir değişikliğe uğramadan yavru hücrelere aktarılması gerekmektedir. Nesiller boyunca kalıtım materyalinin bu şekilde korunması replikasyon (eşleme) ile sağlanmaktadır. Replikasyon sırasında : DNA nın çift zincirli sarmal yapısının oluşumunu sağlayan bazlar arasındaki hidrojen bağları, enzimler vasıtasıyla koparılmaktadır. Kopan hidrojen bağlarıyla birlikte iki zincir açılmaya başlamakta ve karşılıklı konumlanmış olan nükleotit dizileri birbirinden ayrılmaktadır. Ayrılan zincirlerde iki yönde DNA polimeraz enzimleri yardımıyla yeni DNA zincirleri sentezlenmektedir. 8
Öğrenci Kılavuzu biri atasal zincirden gelirken diğeri ortamdaki nükleotitlerden sentezlenmektedir. Açılmış zincirlerdeki tüm nükleotitlerin eşleşmesinin tamamlanmasıyla hücre içerisindeki DNA sayısı ikiye çıkmaktadır. Bu işlemde atasal DNA nın açılmış olan her iki kolu da kalıp işlevi görmektedir. DNA nın bu şekilde eşlenmesine yarı korunumlu (semikonsevatif) replikasyon denir. 4. DNA nın Denatürasyonu ve Renatürasyonu DNA nın çift sarmal yapısındaki hidrojen bağlarının ısı ve çeşitli kimyasallarla karşılaşma sonunda açılması sonucunda ipliklerin ayrılmasına denatürasyon denir. İki tamamlayıcı DNA ipliğinin tekrar çift zincir haline dönüşmesine renatürasyon denir. Renatürasyon tamamlayıcı iplikler arasındaki kendine özgü baz eşleşmesine dayanmaktadır. Isı ile gerçekleştirilen denatürasyon, soğutma işlemi ile geri döndürülebilmektedir. Hızlı bir şekilde soğutma tüm bölgelerin renatürasyonuna olanak sağlamazken, yavaş yavaş soğutma ile komplementer (tamamlayıcı) zincirlerin tamamıyla hibridizasyonu gerçekleşebilmektedir. Ancak nasıl ki kimyasal ve ultraviyole ile muamele sonucu zincirlerin ayrılması yani denatürasyonu geri dönüşümsüzse (DNA zincirlerinde oluşan hasarlar ve konfigürasyon değişimleri sebebiyle) çok yüksek sıcaklık sonucu oluşmuş olan denatürasyonda geri dönüşümsüz olabilir. b) Deney süresince uyulması gereken kurallar Laboratuvar dersinde uyulması gereken genel kurallar dışında kit içerisinde bulunan kimyasal malzemeler eldiven kullanılmaksızın kullanılmamalıdır. Deney süresince kullanılan kimyasallar ile istenmeyen bir müdahale olması durumunda bulaşan bölge bol sabun ve su ile yıkanmalıdır. Kullanılan kimyasalların solunmamasına özen gösterilmeli, deneyin yapıldığı laboratuvar havalandırılmalıdır. Deneyler tamamlandıktan sonra sonuçlar yazılmalı ve üzerinde tartışılmalıdır. Deney sonu verilen sorular işlenen konuyu ve yapılan deneyi pekiştirici niteliktedir. Deney tamamlandıktan sonra soruların çözülmesi ve cevaplarının tartışılması önerilmektedir. Laboratuvar sorumlusu olmadan kit kullanılmamalıdır. 9
Öğrenci Kılavuzu c) Deneyin Yapılışı Falkon içerisine konulmuş toz halindeki 5 g mısır örneği üzerine 3 ml liziz 1 çözeltisi ve 3 ml liziz 2 çözeltilerinden pastör pipeti yardımıyla eklenerek iyice karıştırılır (15 dakika) Bu karışım sargı bezi kullanılarak küçük plastik kap içine süzülür. Süzüntü deney tüpünün içerisine alınır. Üzerine pastör pipeti yardımıyla çok yavaş bir şekilde tüpün iç kenarından 5 ml etanol (-20 C) eklenir ve 10-15 dakika beklenir. (Bu sırada tüp kıpırdatılmamalıdır, bu sayede altta süzüntü üstte etanol olacak şekilde 2 fazın oluşumu sağlanır.) Etanol içinde topak halinde çıkan DNA molekülü, pastör pipeti yardımıyla ependorf içerisine alınır. d) Sorular 1. DNA nedir? 2. DNA canlılarda nerede bulunur? Ökaryotik ve prokaryotik canlıları düşünerek bu soruyu cevaplandırınız. 10