I. ULUSAL KLİNİK MİKROBİYOLOJİ KONGRESİ HPV MOLEKÜLER TANISINDA GÜNCEL DURUM: mrna BAZLI TESTLER Doç. Dr. Ahmet Pınar Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi
Farklı Dokularda Tümoral Gelişim Tümör HPV (%) Serviks 100 Anüs 88 Vulva 55 Vajina 54 Tonsil 51 Konjunktiva 50 Penis 42 Lariks 25 Oral 22 Nazal 22
Dünyada Servikal Kanser İnsidansı < 91.5 < 33.2 < 25.3 < 15.4 < 9.7 */100.000 women
HPV de Tanı Yaklaşımları Sitolojik Tanı Smear Mikrobiyolojik Tanı
Mikrobiyolojide HPV tanısını nasıl koyarız? HPV nin tanısal kültürü yapılamaz. HPV-tanı testleri enfekte dokuda viral nükleik asitlerin saptanmasına dayanır. DNA mrna
HPV Testlerinin Klinik Kullanımı Primer tarama Toplumda HPV prevalansının saptanması Toplumda tip dağılımının belirlenmesi Servikal kanser için risk altındaki popülasyonun saptanması
HPV Testlerinin Klinik Kullanımı Sitolojik küçük anormallikler saptanan olguların triyajı Sitolojik olarak sınırda atipi saptanan olgularda girişim kararı ya da izleme aralıklarının belirlenmesi
HPV Testlerinin Klinik Kullanımı Tedavi sonrası persistans ya da rekürren hastalığı izleme HPV saptanan ve girişimsel tedavi yapılan olgularda enfeksiyon varlığının saptanması
HPV Tanısında Zorluklar 1- Geçici Enfeksiyonlar
Ölüm 230.000 Kanser 470.000 Yüksek Dereceli Displazi 10.000.000 HPV enfeksiyonlarının sadece %1 inde servikal kanser gelişimi 10.000.000 riski vardır Düşük Dereceli Displazi 30.000.000 Servikal HPV Enfeksiyonu 300.000.000 olgu/yıl
HPV Tanısında Zorluklar 2- Yüksek riskli tipler
HPV Tanısında Zorluklar 2- Yüksek riskli tipler
HPV Tanısında Zorluklar HPV geçici enfeksiyonlara neden olabilir!!! (Klinik özgüllük ) HPV testleri bütün yüksek riskli HPV tiplerini saptayamayabilir!!! (Klinik duyarlılık ) HPV testleri yalancı pozitif sonuçlar verebilir!!! (Analitik özgüllük )
Çözüm? mrna Saptayan Testler Sadece HPV onkogenlerinin ekspresyonunu gösterdiği için kanserleşme olasılığı yüksek enfeksiyonlarda pozitifleşir!!! Onkogen ekspresyonunu gösterdiği için yalancı pozitiflik oranı düşüktür!!! Klinik özgüllüğü DNA testlerine göre daha yüksektir!!!
Majör kapsid proteini Transformasyon proteini, prb inhibisyonu DNA replikasyonu Minör kapsid proteini E2: DNA replikasyonunun transkripsiyonel düzenlenmesi Transformasyon proteini; Büyüme faktör reseptörü (PDGF) ile etkileşim E4:Geç yapısal olmayan protein; hücre iskeletinin bozulması?
Onkogenez Mekanizması Erken proteinler E5, E6, E7 E5 Transkripsiyon faktörlerini kodlayan proto-onc ekspresyonunda artış
Onkogenez Mekanizması E6 p53 inhibisyonu
Onkogenez Mekanizması E7 Rb inhibisyonu Anti-Oncogenes Retinoblastoma Rb Gene Adenovirus HPV - E7 E1A Rb protein Rb 105kD Rb Rb Stops replication Cell cycle continues 56
ÖNEMLİ HPV nin neden olduğu kanserlerde E6 ve E7 onkogenlerinin ekspresyon artışı kesinlikle gereklidir. H. zur Hausen H. Zur Hausen. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat Rev Cancer, 25 (2002), pp.342-350.
NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) PreTect HPV-Proofer (Norchip) NucliSENS Easy Q (BioMerieux) Servikal yayma örneklerinden E6/E7 onkogenlerine ait mrna saptar. E6/E7 mrna saptadığı genotipler: 16, 18, 31, 33, 45
PCR + Prob Saptama Aptima (Gen-Probe) Nükleik asit amplifikasyonu + problarla saptama E6/E7 mrna saptadığı genotipler: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68
mrna Testleri Değerlendirmesi 273 CIN2/3 hastada yapılmış KLİNİK DUYARLILIK VE ÖZGÜLLÜK çalışması..
mrna Testleri Değerlendirmesi Duyarlılık % Özgüllük % PPV % HybridCapture 2 99,6 28,4 36,1 (DNA) Amplicor 98,9 21,7 33,5 (DNA) HPV-Proofer 73,6 73,1 52 (RNA) Aptima HPV 95,2 42,2 39,9 (RNA) Linear Prob 98,2 32,8 37,7 (DNA)
mrna Testleri Değerlendirmesi Gynecologic Oncology; 120 (3): 430-438, March 2011 HPV mrna tests for the detection of cervical intraepithelial neoplasia: A systematic review E.A. Burger, H. Kornør, M. Klemp, V. Lauvrak, I.S. Kristiansen Department of Health Management and Health Economics, University of Oslo The Norwegian Knowledge Centre for Health Services
mrna Testleri Değerlendirmesi 1996-2010 arasında yayınlanmış 3179 çalışma Derleme kriterlerine uyan 12 yayın Altın standart sitolojik atipi Duyarlılık Özgüllük NASBA %41-86 %63-85 PCR + Prob %91-95 %42-56
mrna Testleri Değerlendirmesi
Çıkarımlar E6/E7 mrna testlerinin klinik özgüllüğü HPV-DNA testlerine göre daha yüksektir (daha az yalancı pozitiflik) Test edilen tip sayısına bağlı olarak PCR- Prob yönteminin (14 tip) klinik duyarlılığı NASBA yöntemine (5 tip) göre yüksektir. NASBA yönteminin klinik özgüllüğü PCR- Prob yöntemine göre yüksektir. mrna Testleri Değerlendirmesi
NASBA Hacettepe Çalışması Ön Sonuçlar Çalışma Grubu: Kadın Doğum: Kunter Yüce Coşkun Salman Patoloji-Sitoloji: Alp Usubütün Sevgen Önder Mikrobiyoloji: Selim Badur Ahmet Pınar Koray Ergünay İpek Tüney
NASBA Hacettepe Çalışması Ön Sonuçlar Glaxo-Smith-Kline: Kit Desteği Biomerieux: Cihaz Desteği Sitolojik atipi saptanan 78 olgu SurePath sitolojik örnekleme sistemi Nuclisens EasyMag tam otomatize silika temelli ekstraksiyon ve nükleik asit eldesi Nuclisens EasyQ HPV NASBA sistemi
İnternal kontrol Tip 16 Tip 18 Tip 31 Tip 45 Tip 33
Hasta sayısı tip HPV mrna saptanan örneklerin tiplere göre dağılımı
NASBA Hacettepe Çalışması Ön Sonuçlar Çalışılan örneklerin sitolojik değerlendirmeye göre dağılımı ASCUS LSIL HSIL AGC SCC Adenokarsino m Toplam (+) 21 16 2 4 1 1 45 (-) 14 16 2 0 0 1 33 Toplam 35 32 4 4 1 2
NASBA Hacettepe Çalışması Ön Sonuçlar Çalışılan örneklerin patolojik değerlendirmeye göre dağılımları CIN1 CIN3 Kronik servisit SCC Endometrial adenokarsinom Proliferatif endometrium Endometrial polip Sekretuar endometrium Toplam (+) 5 0 9 1 1 1 2 2 21 (-) 1 1 3 0 1 0 0 0 6 Toplam 6 1 12 1 2 1 2 2
NASBA Hacettepe Çalışması Ön Sonuçlar Çalışmaya olgu eklenmesi sürmektedir. Olguların klinik takibi sürmektedir. Olguların HPV-DNA çalışmaları planlanmıştır. Pozitif mrna saptanan olguların E6/E7 sekans analizleri planlanmıştır.
mrna Testlerinde Son Gelişmeler 1- A hybrid-capture assay to detect HPV mrna ratios in cervical specimens. Lowe B, Fulbright A, Nazerenko I J Virol Methods, Oct. 20, 2011 Hybrid-capture yöntemiyle kanser hücre serilerinde ve az sayıda klinik örnekte tip 16 ve 18 için denenmiş. E6-7/E2 mrna oranının kanserleşmeye gidişte daha yüksek bulunduğu ve servikal kanser biyomarkeri olarak kullanılabileceği ileri sürülüyor.
mrna Testlerinde Son Gelişmeler 2- Type-specific human papillomavirus E6/E7 mrna detection by real-time PCR improves identification of cervical neoplasia. Andersson E, Kärrberg C, Rådberg T,Blomqvist L, Zetterqvist BM, Ryd W, Lindh M, Horal P J Clin Microbiol, Nov., 49, 2011 Real-time PCR yöntemiyle servikal klinik örneklerden E6/E7 mrna saptanması Duyarlılık NASBA dan yüksek (0,83 / 0,75), özgüllük aynı bulunmuş (0,76 / 0,77)
SONUÇ 1- mrna testlerinin tanısal değeri yüksek olmakla birlikte testlerin doğruluk ve kesinlik sınırlarının tam saptanması için daha standardize çalışmalara gereksinim vardır. 2- Büyük sorun olan klinik özgüllük düşüklüğü, mrna testleriyle azaltılmıştır. Yüksek yalancı pozitiflik Hasta psikolojisi Gereksiz kolposkopi endikasyonu Sağlık harcamalarının artması
SONUÇ 3- NASBA yönteminin klinik özgüllüğü PCR-Prob yöntemine göre daha yüksektir. 4- PCR-Prob yönteminin klinik duyarlılığı NASBA yöntemine göre daha yüksektir.