HLA B*5701 Real-TM El Kitabı

In Vitro Tanısal Kullanım İçin Sadece Profesyonel Kullanım için HLA B*5701 Real-TM El Kitabı HLA-B (major doku uygunluk kompleksi, sınıf I, B) Allele 5701Tespiti için Real Time PCR Testi REF H53-100FRT 100

İSİM HLA B*5701 Real-TM GİRİŞ Abacavir HIV e karşı aktivitesi ile nükleosit ters-transkriptaz inhibitör, diğer antiretroviral ajanlar ile kombinasyon halinde, günde bir kez kullanım için uygundur, bu etkinlik, birkaç ilaç etkileşimleri ve olumlu uzun dönem toksisite profilini göstermiştir. Abacavir Tedavisi ve klinik uygulamasını sınırlandıran en önemli yan etkisi tedavinin ilk 6 haftası içinde hastaların % 5-8 etkileyen bir immünolojik aracılı aşırı duyarlılık reaksiyonudur. Abacavire karşı aşırı duyarlılık reaksiyonunun belirtileri spesifik değildir ve ateş, döküntü, yapısal semptomlar, gastrointestinal semptomları ve solunum semptomları içeren bir kombinasyondur ve devam eden doz ile daha ciddi hale gelebilir. Abakavir derhal ve kalıcı kesilmesi belirtileri hızla tersine dönmesini sağlamıştır. Abacavir tedavisinin tekrar başlaması daha ciddi, hızlı ve olası hayati reaksiyonları tetikleyebilecek olması sebebiyle kontrendikedir. 2002 yılında, abakavire karşı aşırı duyarlılık reaksiyonları ve majör doku uygunluk kompleksi sınıf I allele HLA-B * 5701 taşınması tanısı arasında bir ilişki bazı bağımsız çalışmalar tarafından bağımsız olarak bildirildi. HIV enfeksiyonu ile kohort çalışmaları da göstermiştir ki abacavir HLA-B*5701 pozitif hastaların şüpheli aşırı duyarlılık reaksiyonu insidansı önemli ölçüde % 0,5 lere kadar azalır. Bu sebeple pek çok klinik çalışma abacovir ile tedavi edilen HIV pozitif hastalarda majör doku uygunluk kompleksi sınıf I allele HLA-B * 5701 taşınması için farmokogenetik moleküler test önerir. HLA-B*5701 varlığı büyük ölçüde abacavirin yarattığı aşırı duyarlılık ile büyük ölçüde ilişkilendirildiğinden HLA-B*5701 Real-TM testi HIV hastalığına karşı kullanılan abacavire kimin ciddi alerjik reaksiyon geliştireceği tahmin edilebilir. KULLANIM AMACI HLA B*5701 Real-TM biyolojik materyallerde HLA-B (major doku uygunluk kompleksi, sınıf I, B) Allele 5701 in tespiti için kullanılan Real-Time amplifikasyon testidir. HLA B*5701 Real-TM testi Abakavir aşırı duyarlılık reaksiyonları önlenmesi için tarama testi olarak kullanılabilir. TEST PRENSİBİ HLA B*5701 Real-TM Testi iki ana temele dayanır: numuneden genomik DNA nın izolasyonu ve allel spesifik primerler ile amplifikasyon. Floresans şiddetin real-time PCR süresince gerçek zamanlı görüntülenmesi reaksiyon tüplerinin PCR çalışmasının ardından tekrar açılmasına gerek kalmadan biriken ürünleri tespit eder. HLA B*5701 Real-TM PCR kit İç Kontrol IC (human beta-globine gene) içeren kalitatif bir testtir. Bu örnekte hücresel materyallerin kontrolünü sağlar.

ÜRÜN KULLANIM KISITLAMALARI Tüm Reaktif sadece in vitro tanısal olarak kullanılabilir. Bu ürünün kullanımı DNA amplifikasyonu (EN375) teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. Kullanım kılavuzu ile tam uyum en iyi PCR sonuçları için gereklidir. Tüm bileşenlerin kutuları üzerindeki etiketler üzerinde yazılı son kullanma tarihlerine dikkat edilmelidir. Kitleri son kullanma tarihinden sonra kullanmayın KALİTE KONTROL Sacace s ISO 13485-Certified Kalite Yönetim Sistemi uyarınca, her lot tutarlı ürün kalitesini sağlamak için önceden belirlenmiş özellikleri karşı test edilir. SAĞLANAN MATERYALLER Reaktif Açıklama Hacim, ml Miktar PCR-mix-1-FRT HLA Renksiz duru sıvı 0.6 2 tüp RT-PCR-mix-2-FL Renksiz duru sıvı 0.3 2 tüp Polimeraz(TaqF) Renksiz duru sıvı 0.03 2 tüp TE-tamponu Renksiz duru sıvı 0.07 2 tüp Pozitif Kontrol DNA HLA B*5701 ve human DNA (C+) Renksiz duru sıvı 0.2 1 tube Negatif Kontrol(C )* Renksiz duru sıvı 0.5 4 tüp * İzolasyon prosedüründe Ekstraksiyonun Negatif Kontrolü olarak kullanılmalıdır. EK GEREKLİLİKLER DNA ekstraksiyon kit. Tek kullanımlık tozsuz eldiven ve laboratuvar önlüğü. Pipetler (ayarlanabilir). Aerosol bariyerli steril pipet uçları ( up to 200 µl). Tüp rakları. Vortex karıştırıcı. 2 mllik reaksiyon tüpleri için masaüstü rotorlu santrifüj. PCR kutusu. Real Time PCR termocycler (örneğin, Rotor-Gene 6000/Q (Qiagen); iq5 (Bio-Rad, USA)). PCR veya PCR-plaka için polipropilen mikrotüp. 2-8 C için buzdolabı. -16 C için derin dondurucu. Kullanılan pipet uçları için atık kutusu. DEPOLAMA TALİMATLARI HLA B*5701 Real-TM PCR kitinin bütün bileşenleri kullanılmıyor olduklarında -16 C veya daha düşük sıcaklıklarda saklanmalıdır. Kit 2-8 C de 3-4 gün transfer edilebilir ama ulaştığı taktirde

derhal -20 C de depolanmalıdır. PCR-mix-1-FRT HLA ışıktan korunmalıdır. KARARLILIK HLA B*5701 Real-TM kit etiketinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kararlıdır. Ürün, etiketin üzerinde belirtilen kontrol tarihine kadar işlemeye devam edecektir. Işık, ısı ve neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerini etkileyebilir. Bu durumdan kaçınılmalıdır. Reaktiflerin sürekli dondurulup-çözülmesinden kaçınılmalıdır. Bu durum reaktiflerin hassasiyetine zarar verebilir. UYARI VE ÖNLEMLER In Vitro Tasıl Tıbbi Cihaz Sadece In Vitro Tanısal kullanım 1. Numuneler e reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven ve göz koruması kullanın laboratuvar önlüğü giyin. Sonrasında ellerinizi güzelce yıkayın. 2. Ağızla pipetleme yapmayın. 3. Çalışma alannda yemek yemeyin, sıvı tüketmeyin, sigara içmeyin, makyaj yapmayın veya kontak lenslerinizi çıkarıp-takmayın. 4. Son kullanma tarihinden sonra bir kiti kullanmayın. 5. Tüm örnekler ve kullanılmayan reaktifleri yerel düzenlemelere uygun olarak atın. 6. Biyogüvenlik Seviyesi 2, bulaşıcı maddeler içeren veya içerdiğinden şüphelenilen malzemeler için kullanılmalıdır. 7. % 0,5 'lik sodyum hipoklorit ya da diğer uygun bir dezenfektan kullanılarak bütün numune veya reaktiflerin tüm döküntülerini temizleyin ve dezenfekte edin. 8. Deri, göz ve mukozanın örnek ve reaktiflerle temasından kaçının. Eğer özelti temas ederse, su ile yıkayınız ve hemen bir doktora başvurun. 9. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine sağlanır. 10. Bu ürünün kullanımı DNA amplifikasyonunda eğitilmiş personel ile sınırlı olmalıdır. 11. PCR reaksiyonları kontaminasyona karşı hassastır. Iyi laboratuvar uygulamaları uyarınca laboratuvarda kontaminasyon riskini en aza indirmek için PCR sürecindaki uygulamaların fiziksel ayrımı gereklidir. 12. Labarotuvardaki çalışma akışı tek yönlü işlemelidir. Ekstraksiyon alanında başlamalı PCR ve ardından tespit alanına doğru devam etmelidir. Önceki basamakların gerçekleştirildiği alanlara örnek, ekipman ve reaktif taşımayın. Kitin bazı bileşenleri koruyucu olarak Sodyum azid içerir. Reaktifin taşınması sırasında metal tubing kullanmayın. PCR analizi, nakliye ve depolama için biyolojik maddelerin örneklemesi üreticinin el

kitabında ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu el kitabının işin başlamadan önce okunması tavsiye edilir. ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, SAKLANMASI VE TAŞINMASI HLA B*5701 Real-TM aşağıdaki materyallerden ekstrakte edilen DNA lar ile kullanılabilir: Tam kan: 0.2 ml 3% EDTA çözeltisi içeren tüpe 2 ml kan toplayın. Uygun karıştırmayı sağlamak için tüpü ters yüz edin. Kan örneği 2 8 C de 48 saate kadar saklanabilir. Orofarengeal sürüntü pamuk uçlu bir steril proba alınır. Süprüntü alındıktan sonra probe 0.5 mllik tüpe yerleştirilir, Transport Medium for Storage and Transportation Respiratory Swabs (REF 958). Probe skor işaretinden kırılmalıdır ki tüp sıkıca kapansın. Örnek en fazla 3 gün için 2-8 C'de muhafaza edilmelidir. Klinik örneklerin,etyolojik ajanların taşınması için ulaştırma ülke, federal, eyalet ve yerel yönetmeliklere uygun olmalıdır. DNA İZOLASYONU Aşağıdaki izolasyon kiti önerilir: DNA/RNA-Prep (Sacace, REF K-2-9). DNA ekstraksiyonunu üreticinin talimatlarına uygun olarak yapın. Tam kan lizis çözeltisine eklenmeden önce hemolitik ( REF 137-CE) ile muamele edilmelidir. Bunun için, 1.5 mllik tüpte 1 ml hemolitiği 0.1 ml tam kana ekleyin. Dikkatlice vorteksleyin. Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, vorteksleyin ve 5 dakika daha inkübe edin. Santrifüj edin (8,000 rpm, 2dak). Supernatantı ayırın ve atın. Lökosit sedimenti derhal lizis edilmeli. Aksi taktirde 3 güne kadar -16 C da ve daha uzun süre -68 C de saklanabilir. DNA ekstraksiyonundan önce boğaz sürüntüsünü Transport Medium for Storage and Transportation of Respiratory Swabs ( REF 957-CE), yerleştirin, güzelce karıştırın ve kısa süreli vortekleyin. REAKTİF HAZIRLIĞI 1. Reaksiyon karışımını hazırlayın. Reaksiyon başına 10 µl PCR-mix-1-FRT HLA 5 µl RT-PCR-mix-2-FL 0.5 µl Polimeraz (TaqF) Reaksiyon karışımı hacmini hesaplarken fazladan bir reaksiyon ekleyin.

Belirli sayıda örnek için reaktif hacmi, µl Örnek sayısı (ekstra reaksiyon dahil değildir) PCR-mix-1-FRT HLA RT-PCR-mix-2-FL Polimeraz(TaqF) 6 70 35 3.5 11 120 60 6.0 18 190 95 9.5 2. Hazırlanan karışımı güzelce vorteksleyin. Tüpün duvarlarında damla kalmadığından emin olun. 3. Klinik ve kontrol örnekleri için gerekli sayıda PCR tüpü hazırlayın. Her reaksiyon tüpüne 15 µl hazırrlanan PCR karışımından ekleyin. 4. DNA ekstraksiyonu sırasında elde edilen 10 µl DNA örneğinden hazırlanan tüplere koyun. 5. Amplifikasyon reaksiyonu: NCA - NCA (Amplifikasyonun Negatif Kontrolü) ile etiketli tübe 10 TE-tamponu ekleyin. C+ - C+ (Amplifikasyonun Pozitif Kontrolü) ile etiketli tübe 10 µl Pozitif Kontrol DNA HLA B*5701 ve insan DNA ekleyin. Real-time cihazınızda sıcaklık profilini aşağıdaki tabloya göre hazırlayın: Durum Sıc, С Süre Rotor tipi cihaz 1 Plate veya modüler tip cihaz 2 floresans tespiti Döngü tekrarı Sıc, С Süre floresans tespiti Bekle 95 15dak 1 95 15 dak 1 Döngü 95 5 s 95 5 s 5 60 20 s 60 20 s 95 5 s 95 5 s Döngü 2 FAM(Green), 40 40 60 40 s 60 50 s FAM, JOE/HEX/Cy3 JOE(Yellow) 1 Örneğin Rotor-Gene 6000/Q (Qiagen) 2 Örneğin, iq5 /iq icycler (BioRad); Mx3005P (Agilent), ABI 7300/7500 Real Time PCR (Applied), SmartCycler (Cepheid). Döngü tekrarı 5

SONUÇ ANALİZİ Sonuçlar eşik hattı ile floresan eğrisinin çakışmasına göre (ya da çakışmamasına ) aygıtın yazılımı tarafından yorumlanır. DNA HLA*B5701,JOE (Yellow)/HEX/Cy3 kanalında ve IC, FAM (Green) kanalında tespit edilir. Amplifikasyonun hem pozitif hem negatif kontrolleri ekstraksiyonun negatif kontrolü ile geçerse sonuçlar ilgili kabul edilir (bkz tablo 1). Tablo 1. Kontrollerin sonuçları Kontrol Kontrol Kanallarda Ct yeri FAM /Green JOE/Yellow/HEX Yorumlama C DNA ekstraksiyon Neg Neg OK NCA Amplifikasyon Neg Neg OK C + Amplifikasyon Pos (< sınır değer*) Pos (< sınır değer*) OK Örnek Joe (Yellow)/HEX/Cy3 kanalındaki sonuçlar pozitif ise ve bu kanaldaki Ct değeri Fam (Green) kanalındakinden yüksek ama 5 döngüden fazla değilse ( bkz tablo 2) pozitif sayılır. Örnek Joe (Yellow)/HEX/Cy3 kanalındaki sonuçlar negatif ise veya bu kanaldaki 5 döngünün Ct değeri Fam (Green) kanalındakinden yüksek ise ( bkz tablo 2) negatif sayılır. Joe (Yellow) ve Fam (Green) Ct değerleri arasındaki normal fark 2-3 döngüdür. Tablo 1. Örnekler için sonuçlar Ct değeri ve sonuç Örnek RotorGene iq, iq5, Мх3005, ABI FAM, IC JOE, HLA FAM, IC HEX, HLA C+ < 25 < 25 < 29 < 29 (pozitif) (pozitif) (pozitif) (pozitif) Klinik örnek < 25 < Ct (FAM)+5 < 29 < Ct (FAM)+5 (pozitif) (pozitif) (pozitif) (pozitif) KALİTE KONTROL ANALİZİ HLA B*5701 Real-TM PCR kit örnekteki hücresel materyalin varlığını kontrol etmeyi sağlayan İç Kontrol içerir ( insan beta-globine gen). Eğer örnek doğru şekilde hazırlanmazsa veya epitel hücreler yetersiz miktarda ise İç Kontrol tespit edilmeyecektir. Örnek hazırlığını, Amplifikasyonu ve tespit basamaklarının doğru şekilde işlendiğinin doğrulanması için ekstraksiyonun Negatif Kontrolü (NCE), Negatif Amplifikasyon Kontrol (NCA), pozitif Amplifikasyon Kontrol (C+) gereklidir. Kontroller beklenen aralığın dışında ise (Kontroller için sonuçlar tablosuna bkz), bu çalışmada kullanılan bütün örnekler ve kontroller örnek hazırlık aşamasından başlanarak tekrarlanmalıdır.

PROBLEM GİDERME 1. Ekstraksiyon Negatif Kontrolü için IC (Fam (Green) kanalı) sinyal olmaması. Örneklerin yniden test edilmesi gerekir. PCR inhibe edilmiştir. Önerilen bir DNA ekstraksiyon yöntemi kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarına uygun olduğundan emin olun. Reaktiflerin saklama koşulları talimatlara uygun değildir. Depolama koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değildir. PCR koşulları kontrol edin ve IC tespiti için protokolde bildirilen floresan kanalı seçin Reaktiflerin pipetlenmesi sırasında örneğe IC eklenmemiştir. DNA ekstraksiyon işlemi sırasında dikkat edin. 2. Joe (Yellow)/Cy3/HEX ve Fam (Green) kanallarında Pozitif Kontrol sinyali yoktur. Reaktiflerin saklama koşulları talimatlara uygun değildir. Depolama koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değildir. Amplifikasyon protokolünü kontrol edin ve manuelde belirtilen floresans kanalını seçin. Reaktif hazırlığıaşamasınıkontrol edin. 3. Negatif Kontrol ile sinyal gözlenmesi. DNA ekstraksiyon işlemi sırasında kirlenme. Tüm numuneler sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol ile tüm yüzeyleri ve aletleri dezenfekte edin. Ekstraksiyon prosedürü boyunca sadece filtreli pipet ucu kullanın. Tüpler arası pipet uçlarını değiştirin. DNA ekstraksiyonunu yeni bir set reaktif ile tekrarlayın. 4. Bir örnekte Fam(Green) ve Joe (Yellow) deki Ct değerleri 5 döngüden fazla varyasyon. PCR hazırlama işlemi sırasında genomik malzeme ile kirlenme. Örnek sonucu geçersizdir, örneklerin yeniden test edilmesi gereklidir. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Hassasiyet HLA B*5701 Real-TM PCR kitinin analitik hassasiyeti 1 х 103 hücre/1 ml örnek ten az olamaz. HLA B*5701 Real-TM PCR kitinin iddia edilen özellikleri ek reaksiyon kiti, DNA/RNA-Prep (Sacace, REF K-2-9), kullanıldığında garanti altındadır.

Özgünlük HLA B*5701 Real-TM PCR kitin analitik özgünlüğü spesifik primerler ve probların seçimi ve sıkı reaksiyon koşulları ile sağlanır. Primer ve problar dizi karşılaştırma analizi ile gen bankalarında yayınlanan tüm dizilere olan mümkün benzerlikleri için kontrol edildi. HLA B*5701 Real-TM PCR kitinin özgünlüğü labaratuvar klinik deneylerle doğrulanmıştır. İŞARET LİSTESİ Liste Numarası DİKKAT! Lot Numarası <n> test için yeterli içerik In Vıtro Tanısal Kullanım için Sürüm Saklama sıcaklığı NCA Negatif Kontrol (Amp) Üretici C Negatif Kontrol (Ekst) Kullanım için talimatlara danışın. C+ Pozitif Kontrol (Amp) Son kullanma tarihi IC İç Kontrol Referanslar High sensitivity of human leukocyte antigen-b*5701 as a marker of immunologically confirmed abacavir hypersensitivity in white and black patients. Saag M et al. Clin Infect Dis 46: 1111 1118, 2008. Association between presence of HLA-B*5701, HLA-DR7, and HLA-DQ3 and hypersensitivity to HIV-1 reversetranscriptase inhibitor abacavir. Mallal S, Nolan D et al. Lancet. 2002 Mar 2;359(9308):722-3. HLA-B*5701 screening for hypersensitivity to abacavir. Mallal et al N Engl J Med. 2008 Feb 7;358(6):568-79. Value of the HLA-B*5701 allele to predict abacavir hypersensitivity in Spaniards. Rodríguez-Nóvoa S, García-Gascó P, Blanco F, González-Pardo G, Castellares C, Moreno V, Jiménez-Nácher I, González-Lahoz J, Soriano V. AIDS Res Hum Retroviruses. 2007 Nov;23(11):1374-6. Prospective HLA-B*5701 screening and abacavir hypersensitivity: a single centre experience.waters LJ, Mandalia S, Gazzard B, Nelson M. AIDS. 2007 Nov 30;21(18):2533-4. Abacavir hypersensitivity reaction in primary HIV infection. Stekler J, Maenza J, Stevens C, Holte S, Malhotra U, McElrath MJ, Corey L, Collier AC. AIDS. 2006 Jun 12;20(9):1269-74. The pharmacogenetics of antiretroviral therapy. Phillips EJ. Curr Opin HIV AIDS. 2006 May;1(3):249-56. **icycler ve iq5, Bio-Rad Laboratories ın ticari markasıdır. * Rotor-Gene Technology,Qiagen ın ticari markasıdır. * MX3005P,Agilent Technologies ın ticari markasıdır. *ABI,Applied Biosystems ın ticari markasıdır. * SmartCycler,Cepheid ın ticari markasıdır. Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, 44 22100 Como Italy Tel +390314892927 Fax +390314892926 mail: info@sacace.com web: www.sacace.com