HPV 6/11 FEP. in Vitro Diagnostik kullanım REF TV11-100FEP VER Kullanılan Semboller. REF Liste Numarası 2-8 C/ -20 C de saklayın

Transkript

1 IVD in Vitro Diagnostik kullanım REF TV11-100FEP VER Aladin (Sacace)'de End Point analizi (FEP) ile Flüoresan tespitinin ve HPV 6/11 (Human Papillomavirus 6 & 11) DNA in nükleik asit amplifikasyonu için HPV 6/11 FEP Kullanılan Semboller REF Liste Numarası 2-8 C/ -20 C de saklayın RUO Sadece Araştırma Kullanımı için Dikkat! LOT Lot Numarası VER Versiyon Son Kullanma Tarihi Reaktif İçerir Kullanım Bilgileri Üretici

2 İSİM HPV 6/11 FEP GİRİŞ HPV genital enfeksiyonu dünyada viral etyolojinin en sık cinsel yolla bulaşan hastalıklarından (STDs) biridir (farklı ülkelerde cinsel açıdan aktif genç kadınlarda 20% - % 46 oranında görülür). Servikal kanseri dünyada kadınlarda en sık görülen ikinci kanserdir ve klinik, moleküler, epidemiyolojik ve deneysel kanıt ile dünyada cinsel yolla iletilen bazı HPV genotip ve servikal neoplazi arasında etyolojik ilişki kuruldu. Servikal Intraepithelial Neoplasia (CIN Sınıf I III) in farklı sınıflarından HPV genotipin tespit frekansına dayalı olarak HPV genotip, High-risk HPV tip (16, 18, 31 ve 45), Intermediate-risk tip (33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59, ve 68), ve Low-risk tip (6, 11, 42-44) olarak ayrılmıştır. Genital siğiller (teknik olarak kondilomata acuminata olarak da bilinir) en sık iki HPV tipleri, HPV 6 ve HPV 11 ile ilişkilidir. Birkaç yöntem Pap yayılması, elektron mikroskobu, immunositokimya ile sitolojik tarama, klinik gözleme sahip HPV klinik veya subklinik enfeksiyon teşhisi için kullanılmıştır, fakat bu yöntemler standartdizasyon olmaması, subjektiflik, yetersiz duyarlılık ve tahmin edilebilir düşük değer gibi dezavantajlara sahiptir. HPV teşhisinin en perspektif yolu polimeraz zincir reaksiyonu tarafından yüksek kanserojen riskli Human Papilloma virüsünün DNA dan doğrudan tespitidir. PCR a dayalı yöntemler, servikal swablar veya skrapes, servikovajinal lavaj, dondurulmuş biyopsiler ve formaline sabitlenmiş parafin-gömülü doku gibi klinik örneklerden alınan genital HPV genotiplerinin tiplenmesi ve tespiti için başarılı şekilde kullanıldı. KULLANIM AMACI Kit HPV 6/11 FEP ürogenital swablarda ve İnsan Papillomavirus genotip 6/11 in kalitatif tespiti için bir in vitro Fluorescence End-Point (FEP) testidir. TEST PRENSİBİ Kit HPV 6/11 FEP üç temel aşamaya dayanır: örneklerden DNA izolasyonu, amplifikasyon ve Fluorescence End- Point (FEP) analizler. PCR-mix-1 tüp, internal Kontrol olarak kullanılan β-globine gen, HPV 6 ve 11 in alanına direk olarak karşı primerler içerir. Eğer swab tam olarak hazırlanmazsa (yüksek miktarda mukoz ya da yetersiz miktarda epitel hücre), İnternal kontrol tespit edilemez. HPV 6 FAM kanalında tespit edilir, HPV 11 HEX kanalında ve Human β-globine gene ROX kanalında tespit edilir. KİT İÇERİĞİ Part N 1 DNA-Sorb-A : örnek hazırlama; Part N 2 HPV 6/11 TM : Real Time amplifikasyon. Part N 1 DNA-sorb-A : Lysis Solution, 30 ml; Sorbent, 2 x 1,0 ml; Washing Solution, 100 ml; DNA-eluent, 2 x 5 ml; Transport medium, 30 ml. 100 test için gerekli reaktifler içerir. Part N 2 HPV 6/11 TM : PCR-mix-1-FEP, 2 x 0,6 ml; PCR-Buffer-FRT, 2 x 0,3 ml; TaqF Polymerase, 0,03 ml; PCR-mix-Fon, 0,5 ml; Pos Control Complex C+ (HPV 6, 11, human DNA), 0,2 ml; Negative Control C-, 1,2 ml;* DNA-buffer, 0,5 ml; 120 test için reaktifler içerir. *Ekstraksiyon Negatif Kontrol olarak izolasyon prosedüründe kullanılmalı GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN MATERYALLER Zone 1: Örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da benzeri 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler (5-40 μl; μl; μl)

3 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Tek kullanımlık eldivenler, pudrasız Bio güvenlikli atık kapları Buzdolabı Tüpe racks Zone 2: Real Time amplifikasyonu: Real Time Thermalcycler Tüpler Workstation Aerosol bariyerli pipetörler ( 0,5-10 µl; 5-40 µl kapsiteli) Tüp rackları UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Lizis Solusyonu, guanidine thiocyanate içerir. Guanidine thiocyanate, solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysileri ve göz koruyucuları kullanın. 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Örnekler potansiyel enfeksiyon ajanı olarak kabul edilmeli ve biyolojik kabinlerde Biyogüvenlik Seviye 2 ya da diğer uygun biyogüvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 8. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 9. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 10. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 11. Bu kit DNA-Sorb ekstraksiyon kit ile kullanılmak için tasarlanmıştır. Eğer DNA-Sorb dan başka bir kit ile DNA ekstraksiyonu yapılıyorsa, bu kullanıcı sorumludur. 12. Bu kiti ancak PCR tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 13. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alandan başlayıp Amplifikasyon ve Tespit alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI DNA-sorb-A +2-8 C de saklanabilir. HPV 6/11 FEP -20 C de saklanabilir. Kit 3-4 boyunca 2-8 C de taşınabilir fakat 2-8 C de ve -20 C de saklanmalıdır. KARARLILIK HPV 6/11 FEP Test kit etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Ürünün performansı etiket üzerinde yazılı kontrol tarihi ile sağlanacaktır. Işık, ısı ya da neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerin raf ömrünü etkileyebilir. Tekrarlanan çözdürme ve bu reaktiflerin dondurulması duyarlılığı azaltabildiği için bu durumdan kaçınılmalıdır. KALİTE KONTROL Analiz sertifikası için info@sacace.com dan bilgi alabilirsiniz. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT Aşağıdaki numunelerden HPV 6/11 FEP DNA-Sorb-A (REF K-1-1/A) ile ekstre edilmiş DNA analiz edebilir: Servikal swablar: Bir pamuk veya polyester swab kullanarak servikal ağzından ve ektoserviksin çevresinden fazla mukusu alın. Bu swabı atın. En büyük kıl ektoservikse dokunana kadar servikal ağız içine cm Örnekleme Servikal Fırça yerleştirin. Servikal kanal içine tamamen fırça takmayın. Kanaldan uzaklaştırarak saat yönünün tersi yönünde, 3 kere tam çevirerek fırçayı döndürün. 0,5 ml Transport ortamı (Sacace) ile nükleaz-free 2,0 ml tüp içine fırçayı yerleştirin saniye boyunca ortamda fırçayı şiddetlice sallayın. Tüp içinde fırçayı sonda bırakarak skorlanmış çizgide sapını koparın.

4 doku mekanik homojenizör ile homojenize edilmiş ve PBS sterilde çözülmüş (önerilen DNA-Sorb-C REF K- 1-6/50 bu kitte dahil değildir, ama ayrı ayrı sipariş edilebilir) Sıvı-bazlı sitoloji numuneler (Cytoscreen, PreservCyt) (bu kitte önerilen DNA-Sorb-D REF K-1-8/100 dahil değildir ama ayrı ayrı sipariş edilebilir) Toplamadan hemen sonra örneklerin çalışılması önerilir. 24 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri 2 8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik faktörlerin transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solusyonu ve Yıkama Solusyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar C ye kadar ısıtılır. Bir tüpte Ekstraksiyonun Negatif Kontrolü olacak şekilde gerekli miktarda 1,5 ml polipropilen tüpler hazırlayın. 2. Herbir tüpe 300 μl Lizis Solusyonu ekleyin. 3. Uygun tüplere 100 μl Örneklerden ekleyin. 4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri ekleyin: Cneg işaretli tüpe 100 μl C (Negatif Kontrol amplifikasyon kiti ile sağlanır) ekleyin. 5. Tüpleri vorteksleyin ve 65 C de 5 dakika inkübe edin. 5-7 saniye santrifüj edin. Eğer numune tamamen çözülmemişse, maksimum hızda ( ) 5 dakika yenicen santrifüj etmenizi ve supernatantı DNA ekstraksiyonu için yeni bir tüpe aktarmanızı öneririz. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 20 μl ekleyin saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 3 dakika inkübe edin. Bu adımı tekrar edin. 8. Tüm tüpleri 5000g de 30 saniye santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9. Her bir tüpe 500 μl Yıkama Solusyonu ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 30 saniye vorteksleyin. Her bir tüpten supernatantı atın. 10. Aşama 9 u tekrar edin ve tüm tüpleri kapakları açık şekilde 65 C de 5-10 dakika inkübe edin. 11. Pelleti 100 μl DNA-eluent içinde yeniden süspense edin. 65 C de 5 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. 12. Tüpleri 12000g de 1 dakika santrifüj edin. 13. Supernatant amplifikasyon için hazır DNA içerir. Eğer amplifikasyon, ekstraksiyon ile aynı günde yapılmayacaksa hazırlanan örnekler maksimum 5 gün için 2-8 C de saklanabilir ya da 20 /-80 C de dondurulabilir. PROTOKOL: 1.Örnek (N) ve kontroller (N+2) için yeterli miktarda reaksiyon tüpü hazırlayın örnek için Miks hazırlayın: PCR- buffer-frt içeren tüpe 30 μl TaqF DNA Polymerase ekleyin. Dikkatlice tüpü vorteksleyin. Bu miks +4 C de 3 ay saklanabilir. 3. Her bir örnek için yeni bir steril tüpe 10 µl PCR-mix-1-FEP ve 5 µl PCR- buffer-frt/ TaqF DNA Polymerase (Tablo 2 bakın) ekleyerek Reaksiyon Miks hazırlayın. 4. Her bir reaksiyon tüpüne 15 μl Reaksiyon Miks ekleyin ve 10 μl ekstrakte DNA örneği ekleyin µl PCR-mix-1-FEP ile 2 tüp hazırlayın ve Fon olarak işaretleyin. Her tüpe 15 µl PCR-mix-Fon ekleyin. 6. Her bir panel için 2 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol işaretli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; Amplifikasyon Pozitif Kontrol işaretli tüpe 10 µl Positive Control C+ ekleyin; 7. Termocyler içine tüpleri koyun. Tablo 2. N numune sayısı kadar reaktif miktarları için pipetleme şeması Örnek: PCR-mix-1-FEP PCR- buffer-frt/ TaqF DNA Polymerase Örnek: PCR-mix-1-FEP PCR- buffer-frt/ TaqF DNA Polymerase Örnek: PCR-mix-1-FEP PCR- buffer-frt/ TaqF DNA Polymerase

5 Not: Karışımların miktarlarının hesaplanması reaktifler dikkate alınarak 2 kontrol ve 1 ekstra örnek için yapıldı. PCR Protokol Termocylerda aşağıdaki programı çalıştırın. Adım Т, C Zaman Döngü döngü dk sn sn sn 72 1dk sn 1 Durakla 10 Adım 1 Amplifiye edilen örnekler bir hafta 2-8 o С de saklanabilir. SONUÇ ANALİZLERİ Bu kiti kullanmadan önce lütfen Aladin Operating Manueli okuyun. 1. Ana menüde Edit (Yaz) ve Test System(Test sistemi) seçerek ALA-1 programı açın. 2. Yeni bir pencerede New(Yeni) seçin ve HPV 6/11 adını girin (Eğer henüz eklenmemişse). OK basın. HPV 6 için Fam kanalını ve HPV 11 için Hex kanalını seçin. 3. Fam/HEX alanına bu değerleri ayarlayın: t- 2.0 ve t Rox kanalında t- 2,0 ve t+ 2,5 değerleri ile İnternal Kontrol tespitini seçin ve İnternal Kontrol/Neg değerini 3.0 olarak ayarlayın. Save tıklayın. 5. Güvenlik aralığını % de 100 olarak ayarlayın. 6. Save(Kaydet) butonunu tıklayın. Fluorescence tespiti: 1. Gücü açın ve ALA_1 programı başlatın. 2. Yeni bir proje oluşturun. Bunu yapmak için, yeni bir proje oluşturmak için Project Create new menüsüne gidin. Açılan proje penceresinde yeni proje ayarlamayı seçin. Projenin adını girin, rotor türünü seçin (48 x 0.2), test-sistemini seçin ve sonrasında Sample kutusunda örnek için bir isim girin. 3. Ctrl+F komutu ile Fon Kontrolü, F12 ile Negatif ekstraksiyon Kontrol ve F11 ile Pozitif PCR kontrol ekleyin. 4. Sample kutusundaki sayılara göre Aladin in karüseli içine örnek ve kontrol tüplerini transfer edin. 5. Cihaz kapağını kapatın ve araç çubuğunda Run butonuna tıklayın ya da Project menüsüne gidin ve Run tıklayın. 6. Analiz tamamlandığında sonuçlar tabloda otomatik olarak gösterilir. File menüsünde Save as komutunu seçerek bir rapor dosyasında sonuçları kaydedin. 7. Pozitif örnek HPV 11 için HPV 11-pozitif olarak, HPV 6 için örnek pozitif HPV 6-pozitif olarak, negatif HSVnegatif ve geçersiz HSV-geçersiz olarak görünür. Eğer örneklerin sayısı rotordaki soketlerden daha yüksekse, örneklerin sonraki serisi ilgili proje kolonunda yeni bir seri numarasına otomatik olarak sahip olacaktır. Tablo 2. Kontrol sonuçları Kontrol Kontrol adımları Fam kanal Joe kanal Rox kanal Yorum NCS DNA izolasyon Neg Neg Neg Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon Neg Neg Neg Geçerli sonuç Pos Complex C+ Amplifikasyon Poz Poz Poz Geçerli sonuç PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Analitik özgüllük Primerler ve probların analitik özgüllüğünü negatif örnek ile doğrulanmıştır. Bu örnekler spesifik HPV 6,11 primerler ve problar ile sinyal vermezler. Kit HPV 6/11 FEP in özgüllüğünü 100% dür. Kit HPV 6/11 FEP ın potansiyel çapraz-reaktivitesi kontrol grubuna karşı aşağıdaki tabloda test edilmiştir. Diğer patojenler ile herhangi bir çapraz-reaktivite gözlenmedi.

6 Tablo 1: Başka patojenler ile kitin özgüllük testi: Kontrol Grubu Sonuçlar Adenovirus type 2 - Adenovirus type 3 - Adenovirus type 7 - Cytomegalovirus - Epstein Barr virus - Human immunodeficiency virus 1 - Hepatitis B virus - Hepatitis C virus - Herpes simplex virus 1 - Herpes simplex virus 2 - Human herpes virus 6 - Human herpes virus 8 - HPV groups β, γ, μ (1,3,4,5,8,37,38,65,20,24,49,50,15) - HPV group α (7, 10, 16, 18, 26, 27, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 53, - 58, 59) Analitik duyarlılığı Kit HPV 6/11 FEP, 500 kopya/ ml den az olmayan % 100 duyarlılıkla testlerin HPV 6 & 11 DNA tespitini sağlar. Tespit, negatif numuneler tarafından kontrol standardını ve dilüsyonlarını gerçekleştirir. Hedef bölge: L1 gene SORUN GİDERME 1. Ekstraksiyonun Negatif Kontrolu için IC sinyal vermez ya da zayıf verir. PCR inhibe olur. Size önerilen DNA ekstraksiyon yöntemini kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun. Ekstre edilmiş DNA pipetlenmeden önce maksimum hızda ( g) 2 dakika boyunca bütün tüpleri tekrar santrifüj edin ve dikkatlice süpernatantı alın. Reaksiyonda inhibe olan sorbent pellete dokunmayın. Reaktif saklama koşulları talimatlara uygun değildir. Saklama koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değildir. PCR şartlarını ve protokolde rapor edilmiş flüoresans kanalını IC tespit için seçin. Reaktifleri pipetleme işlemi sırasında örneğe IC eklenmedi. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında dikkat edin. 2. Pozitif kontrol sinyal vermez ya da zayıf verir. PCR koşulları talimatlara uygun değildi. Amplifikasyon protokolunu kontrol edin ve manuel de rapor edilmiş fluoresans kanalını seçin. 3. Negatif Kontrol ekstraksiyonu ile Fam sinyal verir. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü sırasında sadece filtre uçları kullanın. Tüpler arası geçişte uçları değiştirin. Reaktiflerin yeni bir seti ile DNA ekstraksiyonunu tekrar edin. 4. PCR Negatif Kontrolu (DNA-buffer) ile herhangi bir sinyal verir. PCR hazırlık işlemi sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Sonunda Pozitif kontrolü pipetleyin. Reaktiflerin yeni bir seti ile PCR hazırlanmasını tekrar edin. Sacace Biotechnologies Srl 44 Scalabrini str., Como, Italy