ÖZET Yüksek Lisans Tezi ISPARTA, YALOVA, ANKARA İLLERİ VE ÇEVRESİNDE ELMA VE ARMUT BAHÇELERİNDE SORUN OLAN FİTOPLAZMA ENFEKSİYONLARININ BELİRLENMESİ D

ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ ISPARTA, YALOVA, ANKARA İLLERİ VE ÇEVRESİNDE ELMA VE ARMUT BAHÇELERİNDE SORUN OLAN FİTOPLAZMA ENFEKSİYONLARININ BELİRLENMESİ DİDEM CANİK BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI ANKARA 2007 Her hakkı saklıdır

ÖZET Yüksek Lisans Tezi ISPARTA, YALOVA, ANKARA İLLERİ VE ÇEVRESİNDE ELMA VE ARMUT BAHÇELERİNDE SORUN OLAN FİTOPLAZMA ENFEKSİYONLARININ BELİRLENMESİ Didem CANİK Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ Türkiye nin ticari elma ve armut yetiştiriciliği yapılan önemli bölgelerinden olan Isparta-Eğirdir, Yalova ve Ankara illerindeki elma ve armut bahçelerinden temin edilen ve hastalık belirtileri gösteren 201 adedi elma, 133 adedi armut olmak üzere toplam 334 adet yapraklı dal örneği Apple Proliferation Fitoplazma (AP) ve Pear Decline Fitoplazma (PD) enfeksiyonları açısından incelenmiştir. Elde edilen tüm örnekler DAPI boyama, PCR, Nested PCR ve RFLP ye tabi tutulmuştur. Ayrıca elma örneklerine Apple Proliferation Fitoplazmaya karşı DAS ELISA yöntemi uygulanmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda, Isparta-Eğirdir ve Ankara dan toplanan örneklerden toplam 9 adet elma örneğinde Candidatus Phytoplasma mali tespit edilmiştir. Yalova dan alınan elma örneklerinde Candidatus Phytoplasma mali ye rastlanmamıştır. Yalova ve Ankara dan toplanan toplam 11 adet örneğinde Candidatus Phytoplasma pyri saptanmıştır. Isparta-Eğirdir den alınan armut örneklerinde Candidatus Phytoplasma pyri ye rastlanmamıştır. RsaI ve SspI restrüksiyon endonükleaz enzimleri ile yapılan RFLP ile izolatların karakterizasyonu ve benzerlik dizi analizi ile akrabalık dereceleri belirlenmiştir. Ele alınan bu çalışma ile elmada Candidatus Phytoplasma mali enfeksiyonu Türkiye de ilk kez saptanmış olup, yumuşak çekirdekli meyve üretiminin ticari olarak önem kazandığı üç ilde Apple Proliferation ve Pear Decline fitoplazmalarının varlığı araştırılmıştır. 2007, 74 sayfa Anahtar Kelimeler: Fitoplazma, Candidatus Phytoplasma mali, Candidatus Phytoplasma pyri, apple proliferation, pear decline i

ABSTRACT Master of Science Thesis DETECTION OF PHYTOPLASMA DISEASES OF APPLE AND PEAR ORCHARDS AT ISPARTA, YALOVA, ANKARA PROVINCES Didem CANİK Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Protection Supervisor: Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ Shoot and leaf samples taken from totally 334 pome fruit trees that 201 apple and 133 pear trees originated from Isparta-Eğirdir, Yalova and Ankara, which are the commercially important pome fruit growing provinces of Turkey, are investigated for Apple Proliferation (AP) and Pear Decline (PD) phytoplasmas in this research. DAPI staining, PCR, Nested PCR and RFLP analyses were applied for all plant samples. In addition, DAS-ELISA was performed to apple samples for detection of AP phytoplasma. Candidatus Phytoplasma mali was detected totally 9 apple samples from Isparta-Eğirdir and Ankara; however, it was not detected in samples from Yalova. Candidatus Phytoplasma pyri was detected in totally 11 pear samples from Yalova and Ankara provinces. RsaI and SspI restriction endonucleases were used to characterize the isolates by RFLP, and phylogenetic analyses were evaluated according to similarity matrix. This study is the first report on the Candidatus Phytoplasma mali infections in Turkey and the existence of AP. This study also points out the research on PD phytoplasmas in the samples gathered from the three commercially important pome fruit growing provinces. 2007, 74 pages Key Words: Phytoplasma, Candidatus Phytoplasma mali, Candidatus Phytoplasma pyri, apple proliferation, pear decline ii

TEŞEKKÜR Türkiye için yeni bir çalışma konusu olan fitoplazma enfeksiyonlarının belirlenmesine yönelik olarak Isparta, Yalova ve Ankara illeri ve çevresinde elma ve armut bahçelerinde sorun olan fitoplazma enfeksiyonlarının belirlenmesi amacıyla gerçekleştirilen bu çalışmada ilgisini, desteğini ve yardımlarını benden esirgemeyen danışman hocam sayın Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ a teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca moleküler yöntemler ile ilgili çalışmalarımda değerli bilgilerini benden esirgemeyerek katkıda bulunan sayın Doç. Dr. Ali ERGÜL e ve sayın Dr. Harun BAYRAKTAR a; bitki dokularından kesit alınması konusundaki yardımlarından ötürü sayın Yard. Doç.Dr. Nuran Büyükkartal a, Apple Proliferation ve Pear Decline fitoplazmalarının İtalya dan pozitif kontrollerini gönderen sayın Prof. Dr. Assunta BERTACCINI ye, DAS-ELISA çalışmasında kullandığım Apple Proliferation fitoplazma IgG kitini karşılıksız temin eden sayın Walter BITTERLIN e, çalışmalarım sırasındaki yardımlarından ötürü sayın Ziraat Yük. Müh. Göksel ÖZER e, sayın Araş. Gör. Aysun KOLTARLA ya; her zaman yanımda olan, yardımları ve manevi destekleri ile bana destek olan sevgili arkadaşlarım sayın Araş. Gör. Hilal TUNCA, Ziraat Müh. H. Didem SAĞLAM ve Zir. Müh. Candan ERBAŞ a teşekkürü bir borç bilirim. Son olarak, tüm yaşamım boyunca olduğu gibi yüksek lisans çalışmam boyunca da beni hep destekleyen, maddi-manevi her zaman yanımda olan ve sonsuz bir sabırla her türlü fedakarlığı gösteren değerli aileme ve bilhassa kardeşim Erdem CANİK e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Didem CANİK Ankara, Haziran 2007 iii

İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER DİZİNİ... v ŞEKİLLER DİZİNİ... vi ÇİZELGELER DİZİNİ... vii 1. GİRİŞ... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ... 2.1 Fitoplazmaların Morfolojisi ve Taşınma Mekanizmaları İle İlgili Çalışmalar 2.2 Konukçu Bitkide Patojeni Saptamak İçin Yapılan Moleküler Çalışmalar 2.3 Filogenetik Çalışmalar...... 2.4 Vektör Böceklerle İlgili Çalışmalar..... 3. MATERYAL VE YÖNTEM... 19 3.1 Bitki Materyali... 19 3.2 DAS ELISA Yöntemi... 40 3.3 DAPI Boyaması... 41 3.4 DNA İzolasyonu... 41 3.5 PCR Yöntemi... 43 3.6 RFLP Yöntemi... 46 3.7 Genetik İlişkilendirme Analizi ve Dendogram... 46 4. ARAŞTIRMA BULGULARI... 48 4.1 DAS-ELISA Yöntemi... 48 4.2 DAPI Boyaması... 48 4.3 DNA İzolasyonu... 49 4.4 PCR Yöntemi... 50 4.4.1 Direkt PCR... 50 4.4.2 Nested PCR... 51 4.5 RFLP Yöntemi... 54 4.6 Genetik İlişkilendirme Analizi ve Dendogram... 57 5. TARTIŞMA VE SONUÇ... 60 KAYNAKLAR... 65 EKLER... 70 Ek 1 Çalışmada kullanılan bufferlar... 71 Ek 2 Benzerlik dizi analizi... 73 ÖZGEÇMİŞ... 74 7 7 8 14 17 iv

SİMGELER DİZİNİ AP Apple Proliferation bp Base pair (baz çifti) C Santigrat derece CTAB DAPI Hexadecyl-trimethyl-ammonium bromide Diaminophenylindole DNA Deoxyribonucleic acide dntp Deoxyribonucletide 5 triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetra asetik asit ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay EtBr Ethidium Bromide M Molar MgCl 2 Magnezyum klorür ml mililitre mm milimolar µg mikrogram µl mikrolitre µm mikromolar NaCl sodyum klorür ng nanogram PAGE Poliakrilamide gel elektrophoresis (Poliakrilamid jel elektroforezi) PCR Polimerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) PD Pear Decline rdna Ribosomal Deoksiribonükleik asit RE Restriction Endonuclease RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism (Kesilmiş parça uzunluğu benzerliği) rrna Ribosomal Reoksiribonükleik asit rpm Revolution per minute (dakika/devir) TAE Tris-Asetat-EDTA U Unit (ünite) UV Ultraviole V Volt v

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil1.1 Türkiye deki meyve üretim oranları... 1 Şekil1.2 Türkiye deki yumuşak çekirdekli meyve üretim oranları... 1 Şekil 3.1 2005-2006 yıllarında elma ve armut bahçelerinde survey yapılan iller... 19 Şekil 3.2 Elmada Candidatus Phytoplasma mali enfeksiyonu nedeniyle oluşan aşırı 20 tomurcuklanma... Şekil 3.3 Candidatus Phytoplasma mali nedeniyle elmada sürgün aralarında 21 kısalma sonucu oluşan rozetleşme Şekil 3.4 Elmada sağlıklı yaprak gelişimi (a) ve Candidatus Phytoplasma mali fitoplazma enfeksiyonu sonucu stipulların genişlemesi sonucu oluşan yaprak yapısı (b)... 21 Şekil 3.5 Elmada Candidatus Phytoplasma mali enfeksiyonu sonucu sonbahar 22 çiçeklenmesi... Şekil 3.6 Candidatus Phytoplasma pyri ile enfekteli armut ağaçlarında kızarma 22 belirtisi... Şekil 3.7 Candidatus Phytoplasma pyri ile enfekteli armut ağaçlarında sararma 22 belirtisi... Şekil 4.1a AP fitoplazma ile enfekteli, b. Sağlıklı yaprak damarlarından alınan 49 elma floem dokusunun DAPI boyaması sonrası görüntüsü... Şekil 4.2a PD fitoplazma ile enfekteli, b. Sağlıklı yaprak damarlarından alınan 49 armut floem dokusunun DAPI boyaması sonrası görüntüsü... Şekil 4.3 P1/P7 primer çifti ile yapılan direkt PCR sonucu oluşan bantlar 50 Şekil 4.4 16F2n/R2 primer çifti ile yapılan nested PCR ı sonrası oluşan 51 bantlar... Şekil 4.5 P1/P7 Primer çifti ile yapılan direkt PCR ürünlerinin fo1/ro1 primer çifti 52 ile yapılan nested PCR ı sonrası oluşan bantlar... Şekil 4.6 RsaI ile yapılan RFLP profilleri... 54 Şekil 4.7 fo1/ro1primer çifti ile yapılan PCR ürünlerinin SspI restrüksiyon 55 endonükleaz enzimi ile kesimi sonrası oluşan RFLP profilleri... Şekil 4.8 Pear Decline Fitoplazma ile enfekteli armut örneklerinin SspI restrüksiyon endonükleaz enzimi ile kesimi sonrası oluşan RFLP profili... 55 Şekil 4.9 RFLP sonuçlarına göre elde edilen dendogram... 59 vi

ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1 Dünyada ve Türkiye de elma ve armut üretim durumu... 2 2 Isparta, Yalova ve Ankara illerinin elma ve armut üretim durumu... 3 Çizelge 1.3 Fitoplazmaların taksonomik ayrımı. 4 Çizelge 3.1 Alındıkları illere göre elma örneklerinin izolat numaraları, alındığı 23 tarih, bölge, çeşit ve gözlenen belirtiler... Çizelge 3.2 Alındıkları illere göre armut örneklerinin izolat numaraları, alındığı 33 tarih, bölge, çeşit ve gözlenen belirtiler. Çizelge 3.3 Survey yapılan iller ve bu illerden alınan elma örneklerinin çeşitleri... 39 Çizelge 3.4 Survey yapılan iller ve bu illerden alınan armut örneklerinin çeşitleri.. 39 Çizelge 3.5 PCR da kullanılan primerler ve baz dizileri... 44 Çizelge 4.3 AP ve PD fitoplazma enfeksiyonun saptandığı elma ve armut çeşitleri 53 ve bu çeşitlerin alındığı iller saptanan iller ve elma ve armut çeşitleri. Çizelge 4.4 Var olma (1) - olmama (0) durumuna göre bant-birey çizelgesi... 58 vi

1. GİRİŞ Ülkemizde meyve üretimi yılda 13.9 milyon tonluk üretimle tarımsal üretim içinde önemli bir yere sahiptir. Bu üretimin %26 lık kısmını yumuşak çekirdekli meyveler, yumuşak çekirdekli meyveler içinde de üretim miktarının %82 sini 2.570 milyon ton ile elma, % 14 ünü ise 360 bin ton ile armut oluşturmaktadır (Şekil 1.1, 1.2) (Anonim 2005). 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 33% üzüm ve üzümsü meyveler 25% yumuşak çekirdekli meyveler 21% turunçgiller 15% sert çekirdekli meyveler 6% sert kabuklular Şekil 1.1 Türkiye deki meyve üretim oranları (Anonim 2005) 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 82% 14% 4% elma armut ayva Şekil 1.2 Türkiye deki yumuşak çekirdekli meyve üretim oranları (Anonim 2005) 1

Dünyada ve Türkiye deki elma ve armut üretim durumu Çizelge 1.1 de verilmektedir. Çizelge 1.1 Dünyada ve Türkiye de elma ve armut üretim durumu (Anonim 2004) ÜRETİM MİKTARI(binton) ÜRETİM SIRASI DÜNYA ELMA 58.000 ARMUT 17.191 TÜRKİYE ELMA 2.570 3 ARMUT 360 10 Ülkemiz, 2005 yılı itibariyle 36 milyonu meyve veren olmak üzere, toplam 43 milyon adet elma ağacı varlığı ve yıllık 2.570 milyon ton üretimi ile dünya elma üretiminde üçüncü sırada yer almaktadır (Anonim 2005). Üretim çoğunlukla bodur ve yarı bodur anaçlar üzerine aşılı çeşitlerle yapılmaktadır. M9 tam bodur anacı ve MM106 yarı bodur anacı çoğunlukla tercih edilen anaçlar olup; Golden Delicious ve Starking çeşitleri ise en çok üretimi yapılan çeşitlerdir. Türkiye elma üretiminin %21 i 517.735 ton ile Isparta ilinde gerçekleşmektedir (Anonim 2004). Ülkemiz armut üretimi açısından ise, 12 milyon ağaç varlığı ve yıllık 360 bin ton üretim ile dünyada 10. sırada yer almaktadır (Anonim 2005). Armut gen merkezlerinden biri olan ülkemizde yazlık, kışlık, standart ya da yöresel 600' ün üzerinde çeşit bulunmaktadır. Armut üretiminin 60 bin tonu Bursa ilinde gerçekleşmektedir. Ağaç varlığı ve üretim bakımından ilk sırayı alan Ankara, 23.500 ton üretimi ile Bursa dan sonra ülkemizin en önemli armut üreticisi konumundadır (Anonim 2005). Çalışmada ele alınan iller olan Isparta, Yalova ve Ankara nın elma ve armut üretim durumu çizelge 1.2 de gösterilmektedir. 2

Çizelge 1.2 Isparta, Yalova ve Ankara illerinin elma ve armut üretim durumu (Anonim 2006) Elma (ton) Isparta 497.000 4.250 Yalova 18.250 3.900 Armut (ton) Ankara 40.000 27.000 Yumuşak çekirdekli meyve yetiştiriciliği ülkemizde pek çok bölgede yaygın olarak yapılmasına karşın, bu türler üzerinde gelişen hastalıklar üründe ekonomik olarak önemli kalite ve verim kayıplarına neden olmaktadır. Yumuşak çekirdekli meyvelerde üretimi kısıtlayan hastalık gruplarından birini de fitoplazmalar teşkil etmektedir. Dünyada ve Türkiye de yumuşak çekirdeklilerde viral, fungal ve bakteriyel etmenler oldukça yaygın olarak görülmekle birlikte, son yıllarda ithal tür ve çeşitlerin ekim alanlarının yaygınlaşması sonucunda fitoplazma benzeri belirti gösteren ağaçlarda bir yayılma gözlemlenmektedir. Ağaçta sararma, yan ve ana dallarda cadı süpürgesi tabir edilen aşırı tomurcuklanma belirtileri virus olarak kabul görmekteyken, son yıllarda yapılan elektron mikroskobu ve moleküler çalışmalar sonucunda bitkilerde sözü edilen tarzda belirtiler oluşturan ve fitoplazma olarak adlandırılan patojenler saptanmıştır. Fitoplazmalar, Prokaryotae aleminin Mollicute sınıfında yer alan, floemle sınırlı, hücre duvarından yoksun, hücreleri birbirinden 8-10nm. kalınlığında bir plazma membranıyla ayrılan, 70-1000nm çaplı patojenler olup; tetrasiklin grubu antibiyotiklere karşı hassastırlar (Ishiie et al. 1967, Agrios 1997). Paleomorphic, yani değişken şekillidirler. Obligat parazit olmaları nedeniyle kültür ortamında geliştirilemezler. Konukçu hücrenin sitoplazmasında tomurcuklanarak çoğaldıkları, eşeyli çoğalmanın görülmediği bildirilmiştir (Welliver, 1999). Taksonomik olarak 1967 den 1994 e kadar Mikoplazma benzeri organizmalar (Mycoplasma Like Organisms-MLO) olarak adlandırılmaktayken, Seemüller et al. tarafından 1994 te fitoplazma olarak adlandırılmışlardır. Bugün 75 ayrı fitoplazma; 14 grup ve 38 alt grupta incelenmektedir. Fitoplazmaların taksonomik ayrımı Çizelge 1.3 te verilmektedir. 3

Çizelge 1.3 Fitoplazmaların taksonomik ayrımı (Anonymus 2004) Alem Bölüm Sınıf Takım Familya Cins Tür Bacteria Firmicutes Mollicutes Acholeplasmatales Acholeplasmataceae Candidatus Phytoplasma Candidatus Phytoplasma mali Candidatus Phytoplasma pyri Fitoplazmaların pek çok bitki çeşidinde 600 den fazla hastalığa neden olduğu bildirilmiştir (McCoy et al. 1989, Kirkpatrick 1992). Bitkiden bitkiye taşınmalarının floem dokusuyla beslenen psyllidler (yaprak pireleri) yoluyla (Ploaie 1981), aşı ile ya da Cuscuta spp. gibi parazit bitkilerle olduğu saptanmıştır (Marwitz et al. 1974, Heintz 1986, Seemüller 1990). Ayrıca taşınmada doğal yollarla gerçekleşen kök birleşmesi de etkili olduğu tespit edilmiştir (Kunze 1989, Ciccotti, 2006). Mekanik olarak, tohumla ve polenle taşındıklarına dair bir bulgu yoktur. Karantinaya tabi bitki hastalıkları arasında yer almaktadırlar (Anonymus1978a). Dünyada yumuşak çekirdekli meyve üretim alanlarında sorun olan fitoplazmalar Çizelge 1.4 te verilmiştir. Apple Proliferation Fitoplazma (AP) nın konukçusu elma (Malus spp.) dır. Kültürü yapılan elma çeşitlerinin yanı sıra, yabani çeşitlerde ve süs elmalarında da görülür. %10-80 dolayında ürün kaybına neden olabilmektedir (Anonymus 2006a). Enfekte ettiği ağaçlarda genel olarak, zayıf sürgün oluşumu, aşırı tomurcuklanma nedeniyle oluşan cadı süpürgesi görüntüsü, ana dal ile yan dallar arasında açı azalması ve yaprak uçlarında testere dişlilik belirtilerine neden olur. Bu belirtilerin yanı sıra sürgünlerde kuruma, kabuk üzerinde nekrotik alan oluşumu, tomurcuklarda geç gelişme, uç yapraklarda rozetleşme, erken yapraklanma, yapraklarda küçülme, sararma ve kırmızılaşma, erken yaprak dökümü, yaprak sapında kısalma, ilkbaharda geç çiçeklenme ve sonbahar çiçeklenmesi de enfekteli bitkilerde gözlenen diğer belirtilerdir. Enfekteli bitkilerin meyveleri küçülür, meyve ağırlığında %60 a varan kayıp görülür. 4

Ayrıca lezzette, şeker ve asit oranında azalma ve meyvede yassılaşmaya neden olur. Enfeksiyonun latent, yani belirtisiz olarak da gerçekleşebildiği bildirilmiştir (Seemüller et al. 1994). Pear Decline Fitoplazma (PD) dünyada armut (Pyrus communis L.) yetiştirilen alanlarda yaygın olarak rastlanan ve önemli kayıplara neden olan bir patojendir (Seemüller 1992). İlk kez 1948 de Amerika da tanımlanmıştır (McLarty 1948). Belirtiler ve hastalık şiddeti anaç ve çeşide göre değişmekle birlike, hastalık 3 farklı tipte belirti oluşturmaktadır. Bunlar; hızlı geriye doğru ölüm, yavaş geriye doğru ölüm ve bazen yaprakların kıvrılmasıyla da sonuçlanabilen yaprak kırmızılaşmasıdır. Hızlı geriye doğru ölüm, ağacın birkaç hafta içinde kuruyarak ölümüne yol açar. Yazın ya da sonbaharda ortaya çıkabilir. Özellikle hassas anaçlar üzerinde yetiştirilen armut çeşitlerinde ve yaygın olarak sıcak havalarda ağaç su stresine girdiğinde görülür. Yavaş geriye doğru ölümde, ağaçlarda dikkate değer bir zayıflama, güçten düşme söz konusudur. Sürgün gelişimi yavaşlar veya tamamen durur. Yapraklar küçülür, renkleri açılır, aya etrafında kıvrılır ve meşin gibi bir görünüm alır. Sonbahar renklenmesi normal sarıya dönük veya kırmızımsı olabilir. Ağaçlar uzun süre canlı kalabilir ya da hastalık şiddetine göre birkaç yıl içinde ölebilir. Genç bitkilerde belirtiler kısa sürede ortaya çıkarken 3 yaşından daha yaşlı ağaçlarda yavaş geriye doğru ölüm belirtilerinin ortaya çıkması birkaç yılı bulabilir. Enfekteli bitkilerde meyve verimi ve kalitesi düşer. Tipik olarak yapraklarda geriye doğru kıvrılma ve kızarma görülür. Ayva anacı üzerinde yetiştirilen armutlar çeşitleri Pear Decline fitoplazmaya karşı hassastırlar. Yaprak kırmızılaşması ise yaz sonunda yaprakların kırmızıya dönmesiyle ortaya çıkar bu yapraklarda erken dökülme ve zaman zaman kıvrılarak meşin gibi bir hal alma gözlenir. Doku lokalizasyonu sonucu iletim sisteminde nekrozlara neden olabilir. Aşı ve vektör böceklerle taşınır. Ele alınan bu çalışma ile söz konusu iki patojenin ülkemizin ticari elma ve armut üretiminin yoğun olarak yapıldığı iller olan Isparta, Yalova ve Ankara illerindeki yumuşak çekirdekli meyve alanlarındaki varlığı DAPI (Diaminophenylindole) 5

boyaması, DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich-Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ve moleküler yöntemlerle araştırılmış olmakla birlikte, çalışma elmada enfeksiyon yapan Apple Proliferation fitoplazmanın ülkemizde saptanmasına yönelik olarak yapılan ilk çalışma özelliğini taşımaktadır. 6

2. KAYNAK ÖZETLERİ Apple Proliferation ve Pear Decline Fitoplazmaları üzerinde ülkemizde ve dünyada yapılan çalışmalar aşağıda verilmiştir. 2.1 Fitoplazmaların Morfolojisi ve Taşınma Mekanizmaları ile İlgili Çalışmalar Doi et al. (1967) Mikoplasma benzeri organizmaları (Mycoplasma Like Organisms- MLO) ilk kez elektron mikroskobuyla saptanmışlar ve adlandırılmışlardır. Kurçman (1977) kültür bitkilerinde yapmış olduğu çalışmalarda elmalarda gözlemsel olarak proliferation belirtilerinin mevcut olduğunu bildirmiştir. Seemüller (1990) AP fitoplazmanın aşı ve floem yolu ile beslenen psyllidler tarafından taşındığını saptanmıştır. Seemüller (1992) yumuşak çekirdekli meyvelerde sorun olan en önemli fitoplazmaların Apple Proliferation Fitoplazma ve Pear Decline Fitoplazma olduğu bildirilmiştir. Lorenz et al. (1995) yumuşak çekirdekli meyvelerde görülen bir fitoplazma olan Apple Chat Fruit fitoplazmanın dünyada sadece Lord Lamborne çeşidi elma yetiştirilen yerlerde görüldüğü bildirmiştir. 7

Seemüller et al. (1998) AP fitoplazmanın belirtilerinin ortaya çıkışının etmen fitoplazmanın konukçu bitkideki kolonizasyona, iklime ve konukçu bitkinin gelişme durumuna göre değişiklik gösterdiğini bildirmiştir. Bisognin et al. (2006) Mikro çoğaltım ile elde edilen anaçlarda Malus sieboldii, D2212, H0909, Golden delicious ve M9 u Apple Proliferation a hassas olarak bildirmişlerdir. Jarausch et al. (2006) Apple Proliferation fitoplazma enfeksiyonlarıyla mücadele için dayanıklı anaç kullanımını araştırdıkları çalışmalarında Malus sieboldii ve M sieboldi X M. domestia anaçlarının kullanımının teşvik edilebileceğini, ayrıca dayanıklılık özelliklerinin döllere geçmesi özelliğinin ıslah çalışmalarında kullanıldığını bildirmişlerdir. Pedrazzoli et al. (2006) AP fitoplazmanın yılın farklı dönemlerinde aşı ile taşınmasını araştırdıkları çalışmalarında, Candidatus Phytoplasma mali nin ağacın toprak üstü aksamında yılın farklı dönemlerinde farklı konsantrasyonlarda bulunduğunu, mart ve nisan aylarında alınan gözlerle yapılan aşılama ile taşınmanın en az olduğunu bildirmişlerdir. 2.2 Konukçu Bitkide Patojeni Saptamak İçin Yapılan Moleküler ve Serolojik Çalışmalar Davis and Lee (1993) PCR ile çoğaltılmış 16SrRNA ile MLO ların saptanması ve tanılanması çalışmasında, farklı primerler kullanılarak PCR ile 16SrRNA bölgesini çoğaltmışlardır. Kullanılan farklı primerlerin bir sonucu olarak farklı uzunluklarda bantlar elde edilmiş, bu PCR ürünleri RFLP ye tabi tutarak AP ve PD fitoplazmanın da aralarında bulunduğu fitoplazma enfeksiyonlarını belirlemişlerdir. 8

Lee et al. (1993) MLO ların teşhisi ve sınıflandırılması için 16S rrna nın çoğaltılması ve analizi çalışmalarında, 16SrRNA nın PCR ile çoğaltılarak RFLP uygulanması sonucu AP ve PD fitoplazmalarında aralarında bulunduğu 40 fitoplazma izolatını sınıflandırmışlardır. Lorenz et al. (1995) AP ve PD fitoplazmalarının ribozomal ve nonribozomal DNA nın PCR ile çoğaltılmasıyla saptanması çalışmasında, söz konusu fitoplazmaları PCR, RFLP ve DAPI boyaması ile belirlemişler; iki fitoplazma arasındaki benzerlikten dolayı spesifik primerler kullanılsa dahi bu fitoplazmaların tüm strainlerinin belirlenemeyeceğini bildirmişlerdir. Jarausch et al. (1996) AP fitoplazmayı laboratuar koşullarında konukçusu Catharanthus roseus bitkisine aşılamışlardır. Çalışmalarında farklı anaç ve çeşitler kullanmışlar, örnekleri DAPI boyaması, AP fitoplazma spesifik primerlerle PCR ve RFLP analizlerine tabi tutmuşlardır. MM106 anacını invitro koşullar için enfeksiyon belirtilerinin gözlenmesinde en iyi anaç olarak bildirmişlerdir. Kullanılan farklı AP fitoplazma izolatlarının laboratuvar koşullarında enfeksiyon oluşumunda farklı sonuçlar gösterdiğini, bazı izolatlardan sonuç alınabildiği halde bazılarından alınamadığını bildirmişlerdir. Smart et al. (1996) 16S-23S rrna ara bölgesinin sekansına dayalı fitoplazma spesifik PCR primerleri geliştirmişler, bu ara bölge sekansı kullanılarak elde edilen primerlerin Apple Proliferation ve Pear Decline fitoplazmalarının dahil olduğu GrupX uda kapsayan fitoplazma gruplarının ayrımında yüksek hassasiyet gösterdiklerini ve farklı gruptan fitoplazmaları çoğaltmadıklarını saptamışlardır. Universal fitoplazma primerleri ile yapılan PCR sonrası ara bölgenin sekansından elde edilen primerlerle yapılacak ikinci PCR nun grupları belirlemede kullanılabileceğini belirtmişlerdir. 9

Kison et al. (1997) Meyve ağaçlarında fitoplazma enfeksiyonlarının belirlenmesinde en hassas, yaygın ve güvenilir yöntemin spesifik primerlerle yapılan PCR olduğunu bildirmişlerdir. Kumert and Rufflord (1997) AP ve PD fitoplazmaların tespiti için örneklere PCR ve PCR-ELISA uygulamışlardır. Spesifik primerle klasik PCR ile enfekteli bitkilerde her iki fitoplazma da saptanırken, çalışmada kullandıkları kitin primerleri ile yaptıkları PCR sonucunda PD fitoplazmanın saptanamadığını bildirmişlerdir. Sonuçta PCR-ELISA nın AP fitoplazmanın belirlenmesinde kullanılabileceğini; PD fitoplazmanın belirlenmesinde ise uygun olmadığını belirtmişlerdir. Poggipollini et al. (2001) AP grubunda bulunan fitoplazmalarında yer aldığı 157 örnekle yaptığı çalışmada fitoplazmaların belirlenmesinde DAPI boyaması, PCR ve Nested PCR dan yararlanmış; DAPI boyamasının çalışılan örneklerin %76.2 de enfeksiyonu saptamış olmakla birlikte grup ayrımı yapmaksızın fitoplazmaları tespit ettiği için en düşük hassasiyetli metod olarak bildirmişlerdir. Buna karşılık AP grup fitoplazmaların saptanmasında fo1-ro1 primer çifti ile yapılan PCR ın en hassas metod olduğunu belirtmişlerdir. Heinrich et al. (2001) Meyve ağaçlarında AP, PD fitoplazma ve Avrupa sert çekirdekli sarılık fitoplazmasının belirlenmesine yönelik yapmış oldukları çalışmada 16SrRNA bölgesinden yararlanarak yeni primerler geliştirmişlerdir. Geliştirdikleri bu primerler ile AP fitoplazmanın tespiti için antiserum kullanarak IC-PCR (Immunocapture Polimeraz Zincir Reaksiyonu) uygulamışlar ve AP fitoplazmanın tespitinde IC-PCR nun yine antiserumla uygulanan bir başka yöntem olan DAS ELISA ya göre daha spesifik olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca aynı çalışmada fitoplazmalrın tespitinde bitki dokusundan kaynaklanan PCR önleyici bileşiklerin bileşikler bulunabileceğini ve bu bileşiklerin farklı konsantrasyonlarda hedef DNA lar kullanılarak farklı primer çiftleriyle yapılan PCR ile elemine edilebildiğini saptamışlardır. 10

Laimer da Camara Machado et al. (2001) Virusleri ve fitoplazmaları invitroda konukçuları üzerine aşılama suretiyle saptanmasına yönelik yapmış oldukları çalışmada yumuşak ve sert çekirdekli meyve ağaçlarından aldıkları örnekleri in-vitroda konukçularına aşılamış ve daha sonra fitoplazma gruplarına spesifik primerlerle PCR ve Nested PCR a tabi tutmuşlardır. Sonuç olarak fitoplamaların çoğaltma materyali ile sağlıklı bitkilere taşındığını bildirmişlerdir. Errea et al. (2002) Pear Decline fitoplazmanın mevsimsel dağılımı ve taşınması konulu çalışmalarında örnekleri DAPI boyamasına ve Nested PCR a tabi tutmuşlardır. Çalışmanın sonucunda, kış aylarında alınan dormant tomurcuklarla ilkbaharda yapılan aşılamanın fitoplazma taşınmasını engellediği ve spesifik primerler kullanılarak kışın dormant tomurcuklardan da fitoplazmanın tespit edilebildiğini bildirmişlerdir. Loi et al. (2002) Apple Proliferation fitoplazmaya karşı monoklonal antibody geliştirmişlerdir. AP ile enfekteli Catharantus roseus bitkisinden elde ettikleri özsu ile BALB/C faresinin myeloma hücreleri arcılığıyla antibody elde etmişler, elde ettikleri antibodyleri DAPI boyama ve IF(Immuno Flouresans) teknik ile fitoplazma ile enfekteli olduklarını saptadıkları bitki özsuları ile ELISA yöntemine tabi tutmuşlardır. Sonuç olarak elde ettikleri monoklonal antibodylerin, bitkide fitoplazma konsantrasyonun yüksek olduğu haziran-kasım ayları arasındaki dönemde, fitoplazmaların belirlenmesinde PCR kadar güvenilir sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Garcia-Chapa et al. (2003a) Farklı armut çeşitlerinde Pear Decline fitoplazmanın Nested PCR ile mevsimsel olarak saptanmasına ilişkin 3 farklı çeşitte 43 örnekle yaptıkları çalışmada P1/P7 ve fo1/ro1 primerleri ile PCR ve DAPI boyamasından yararlanmışlardır. Sonuçta PCR ın söz konusu fitoplazmanın tespitinde en hassas yol olduğunu, PD fitoplazmanın iklime göre farklılık göstermekle birlikte en iyi sonbahar aylarında belirlendiğini, kışın toprak altı organlarda patojen varlığının belirlenebildiğini, 11

ilkbaharda özellikle nisan-mayıs aylarında fitoplazma konsantrastonunun en düşük seviyede olduğunu bildirmişlerdir. Garcia-Chapa et al. (2003b) PD fitoplazmanın armut ağaçlarında vektör böceklerde tespit edilmesinde Nested PCR ve ribozomal olmayan problarla dot-blot analizinden yararlanmışlardır. Sonuç olarak fitoplazma enfeksiyonunun ve vektör böceklerin saptanmasında PCR unun yanı sıra 60 C de %50 lik formamide ile yapılan dot-blot hibridizasyon analizininde kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Ember et al. (2003) Macaristan da yumuşak çekirdekli meyve ağaçlarında fitoplazmaların tespiti çalışmalarında AP ve PD fitoplazmaları ile yaptıkları biyolojik indeksleme, PCR, Nested PCR ve RFLP çalışmaları sonucunda söz konusu fitoplazmaların belirlenmesinde moleküler yöntemlerin en etkili yol olduğunu bildirmişlerdir. Fialova et al. (2003) Çek cumhuriyetinde elma bahçelerinde fitoplazma enfeksiyonlarının belirlenmesine yönelik yaptıkları çalışmada; cadı süpürgesi görünümü, aşırı tomurcuklanma, yaprak ayasında genişleme ve testere dişlilik belirtileri gösteren ağaçlardan aldıkları örneklerden direkt ve nested PCR yapıp, elde ettikleri PCR ürünlerini RFLP ye tabi tutmuşlardır. Sonuçta cadı süpürgesi ve aşırı tomurcuklanma belirtilari gösteren örneklerin AP fitoplazma ile enfekteli olduklarını, Ap fitoplazmanın latent olarakta görülebildiğini bildirmişlerdir. Duduk et al. (2006) Sırbistan da fitoplazma enfekteli meyve ağaçları çalışmalarında elma ve armutunda içinde bulunduğu meyve ağaçlarında fitoplazmaların belirlenmesine yönelik PCR-Nested PCR çalışmalarında nükleik asit izolasyonunda yaprak orta damarı ve floem dokusu kullanmışlar, elde edilen DNA yı P1/P7 universal fitoplazma primerleri ile PCR a tabi tutmuşlardır. Ardından R16F1/B6 ve R16F2/R2 primer 12

çiftlerini kullanarak çift nested PCR yapmışlardır. Elde edilen Nested PCR ürünlerini RFLP ye tabi tutmuşlardır. Sonuç olarak elma ve armut ağaçlarında Apple Proliferation ve Pear Decline fitoplazmalarını sözü geçen moleküler çalışmalarla tespit etmişlerdir. Franova et al. (2006) Çek Cumhuriyetinde çeşit denemesi parseline ait 13 elma ve 17 armut bitkisiyle yaptıkları çalışmada, örneklerin P1/P7 universal fitoplazma primerleri ile direkt PCR ını yapmışlar, elde ettikleri PCR ürünlerini Nested PCR a tabi tutmuşlardır. Nested PCR ürünlerinin RFLP analizi ile örneklerde Apple Proliferation ve Pear Decline fitoplazmaların tespit etmişler, belirti göstermeyen örneklerin her zaman PCR da negatif olduğunu, belirti gösteren örneklerin ise bir kısmının PCR da negatif olduğunu bildirmişlerdir. Serçe vd (2006) 2003-2005 yıllarında sert çekirdekli meyvelerde Avrupa Sert Çekirdekli Meyve Sarılık Fitoplazması (ESFY-European Stone Fruit Yellows) ve armutta Pear Decline fitoplazmayı araştırdıkları çalışmalarında Bursa ilinde Candidatus Phytoplasma pyri enfeksiyonunu P1/P7 ve R16F2/R2 primer çiftleriyle yaptıkları PCR ve RFLP analizleriyle Deveci ve Akça çeşidi birer izolat olmak üzere iki izolatta saptadıklarını bildirmişlerdir. Sertkaya vd (2005) Adana, Hatay ve İçel illerinden topladıkları 14 armut örneğini P1/P7 primer çifti ile direk PCR a, direkt PCR ürünlerini R16F2n/R2 ve fo1/ro1 primer çifti ile Nested PCR a tabi tutmuşlardı. Elde ettikleri pozitif PCR ürünlerini SspI vebsaai enzimleri ile RFLP profilerini çıkarmışlardır. Sonuçta Pear Decline fitoplazmayı Türkiye de ilk kez moleküler olarak saptamışlardır. 13

2.3 Filogenetik Çalışmalar Deng and Hiruki (1991) Kültürü yapılabilen ve yapılamayan Mollicute lerde 16SrRNA nın çoğaltılması adlı çalışmalarında 6 farklı Mycoplasma benzeri organizma ile çalışmışlar ve 5 farklı PCR primeri kullanmışlardır. Bu primerleri kültüre alınabilen ve alınamayan 6 farklı Mollicute de denemişler; sonuç olarak kültürü yapılabilen ve yapılamayan Mollicute lerin uygun bir DNA izolasyonu ile farklı polimeraz zincir reaksiyonu koşulları uygulanarak saptanabileceği ve filogenetik analizlerinin yapılabileceğini bildirmişlerdir. Schneider et al. (1993) PCR ile çoğaltılmış 16SrRNA nın kesim yeri analizi ile bitki patojeni MLO ların sınıflandırılması çalışmalarında yabancı ot, tek yıllık ve çok yıllık bitkilerden oluşan 52 izolatta Apple Proliferation ve Pear Decline ın da aralarında bulunduğu fitoplazmalarla çalışmışlar ve bu izolatları AluI ve RsaI restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesmişleredir. Araştırma sonuçlarına göre; aynı grupta yer alan izolatların arasındaki benzerliğin % 97.8 ila %99.5 arasında olduğu; farklı gruplardakilerin ise %89.6 ila %92 benzerlik gösterdiğini bildirmişlerdir. Lee et al. (1994) MLO grup spesifik oligonükleotid primerler kullanarak yaptıkları Nested PCR çalışmalarında enfekteli bitkilerin 16S rrna bölgelerini PCR ile klonlayıp Nested PCR a tabi tutarak bitki patojeni MLO ları gruplandırmışlardır. Lee et al. (1995) İtalya da çok yıllık ağaçlarda decline simptomlarına neden olan fitoplazmaların belirlenmesi çalışmalarında 16SrRNA nın RFLP analizi sonucu decline simptomlarına neden olan, AP fitoplazmanın da aralarında bulunduğu fitoplazmaları taksonomik olarak gruplandırmışlardır. 14

Seemüller et al. (1998) fitoplazmaları 16SrRNA larına göre gruplandırılmışlardır. Bu gruplandırmaya göre Apple Proliferation ve Pear Decline fitoplazmaları Grup X da yer almışlardır. Jarausch et al. (2000) 100 AP fitoplazma izolatıyla yaptıkları nonribozomal parça sekansı ve PCR-RFLP ile AP fitoplazmanın genetik çeşitliliğinin saptanması çalışmalarında nonribozomal parça sekansı ile elde ettikleri primerlerle AP, AT1 ve AT- 2 olarak üç farklı alt tür belirlemişdir. Bu alttürlerin oluşumunda nokta mutasyonlarının rol oynadığını ve her bir alt türün kesim bölgesindeki farklılıklarla polimorfizm oluşturduğunu bildirmişlerdir. Cainelli et al. (2003) AP fitoplazma ile enfekteli 300 bitkide yaptıkları araştırmada PCR- RFLP ile Ap fitoplazmanın alttürleri olan AT-1, AT-2 ve AP nin ortaya çıkışının çeşitle, anaçla ve belirtilerin görülme zamanıyla arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. Çalışmalarının sonucunda AT-1 ve AT-2 alttürlerinin görülme oranının daha yüksek olduğunu saptamışlardır. Buna karşın AP alttürü ile enfekteli bitkilerin bazılarının Fat/Ras primer çifti kullanıldığında PCR pozitif çıkarken, AP13/AP10 spesifik primer çifti kullanıldığında pozitif sonuç vermediğini saptamışlardır. Jarausch et al. (2003b) Ap fitoplazmanın bilinen üç farklı alt türü olan AP, AT-1 ve AT- 2 yi virülenslikleri ve vektör ilişkisi açısından alt türlere spesifik primerlerle PCR- RFLP uygulayarak incelemişlerdir. Ele alınan alt türlerden AP nin en yaygın ve virülensi en yüksek alt tür olduğunu, virülenslik ve yaygınlık açısında AT-2 nin ikinci sırada gözlendiğini ve AT-12 in en az sıklıkla rastlanan alt tür olduğunu bildirmişlerdir. Yaprak ayasında genişlemenin tüm alt türlere spesifik bir belirti olduğunu, yapraklarda kırmızılaşmanın AT-1 e, sonbahar çiçeklenmesinin ise AT-2 alt türüne özgü belirtiler olduğunu saptamışlardır. 15

Seemüller and Schneider (2004) Candidatus Phytoplasma mali, Candidatus Phytoplasma pyri ve Candidatus Phytoplasma prunorum, (Apple Proliferation, Pear Decline ve European Stone Fruit Yellows) fitoplazmalarına sebep olan patojenler üzerindeki çalışmasında, Apple Proliferation ve Pear Decline fitoplazmalarına filogenetik analizlerle nükleotid dizilişleri arası fark eşik değer olarak %2.5 un altında olan yapıları Candidatus olarak adlandırıldığını belirtmişlerdir. Franova et al. (2005) P1/P7 primer çifti ve F2/R2 primer çifti ile Nested PCR ve RFLP çalışması ile yapmış olduğu çalışmada Apple Proliferation fitoplazmanın dallarda hafiften şiddetliye kadar farklı seviyelerde kıvrılma, şiddetli tomurcuklanma ve stipullarında genişleme belirtilerine neden olduğunu bildirmiştir. Çalışmada kullanılan 14 bitkiden 1 tanesindende elde ettikleri sonuca göre, sözü edilen belirtilerin karışık enfeksiyon olarak tabir edilen ve 16SrI-B, 16SrI-C ve 16SrX-A altgruplarına dahil fitoplazmaların bir arada yaptıkları enfeksiyon sonucunda da görülebileceğini bildirmiştir. Martini et al. (2006) Candidatus Phytoplasma mali nin kuzeydoğu İtalya da yayılışının moleküler olarak saptanması için yaptıkları çalışmada, belirti gösteren 89 bitki örneği ve 457 vektör böceği direk PCR ve nested PCR a tabi tutmuşlardır. Elde ettikleri ürünleri AluI enzimi ile kesim yapmışlardır. Örnekleri aynı zamanda Loi et al.,2002 ye göre monoklonal antibodylerle serolojik testlerede tabi tutmuşlar ve ELISA ile PCR pozitif olmasına rağmen AT-1 izolatını tespit edememişledir. Sonuçta PCR ile pozitif reaksiyon gösteren AP,AT-1 ve AT-2 izolatlarının varlığını saptamakla birlikte, ELISA ile AP ve AT-2 izolatlarının tespiti yapılırken; AT-1 izolatının tespit edilemediğini bildirmişlerdir. 16

2.4 Vektör Böceklerle İlgili Çalışmalar Agrios 1997 her vektör böceğin her fitoplazmayı taşımadığı; aralarında çoğunlukla spesifik bir ilişki olduğunu bildirmiştir. Avient et al. (1997) İspanya da PD simptomları gösteren armut örnekleri ve vektör böcek olduğu düşünülen Cacopsylla pyri ile yaptıkları PCR ve RFLP çalışması ile söz konusu fitoplazmanın karakterizasyonunu yapmışlar ve Cacopsylla pyri nin vektör böcek olduğunu saptamışlardır. Elde ettikleri sonuçlara göre iki yaşlı bitkilerde 1 yaşlı bitkilere oranla enfeksiyonun daha fazla görüldüğünü bildirmişlerdir. Cainelli et al. (2003) Apple Proliferation fitoplazmanın anaç, çeşit ve görülme dönemleri açısından çeşitliliğini incelemişlerdir. Toplanan enfekteli yaprak ve psyllid örneklerini AP grubuna spesifik primerlerle PCR ve nested PCR ye tabi tutmuşlar, elde ettikleri PCR ürünlerine RFLP uygulamışlardır. Sonuçta AT-2 alt türünün ele alınan bitki örneklerinde ve vektör böcek Cacopsylla costalis (syn. Cacopsylla costa) da en yaygın olan alt tür olduğunu ve vektör böceğin sadece kışlayan erginlerinin fitoplazmayı taşıdığını bildirmişledir. Cacopsylla costalis in AT-2 alt türünü yaygın olarak taşıdığını, Cacopsylla mali nin ise AT-2 ve AT-1 alt türlerini hemen hemen aynı oranda taşıdığını bildirmişlerdir. Jarausch et al. (2003a) AP fitoplazmanın psyllid vektörleri ile taşınmasını araştırdıkları çalışmalarında mart-mayıs ayları arasında toplanan Cacopsylla picta nın kışlayan ve erken dönem erginlerini AP fitoplazma ile enfekteli olduğu bilinen pozitif örneklerle 2-3 haftalık bir dönemde beslenmelerini sağlamış, daha sonra vektör böcekleri AP grup spesifik primerleri ile PCR na tabi tutmuşlardır. Sonuçta Cacopsylla picta nın çalışmada ele alınan bölge olan güneybatı Almanya da AP fitoplazmanın en önemli vektörü olduğunu, taşınmada kışlayan erginlerin ilk baharda ortaya çıkan erken dönem 17

erginlerden daha etkin bir rol oynadığını saptamışlardır. Ayrıca İtalya da önemli bir AP fitoplazma vektörü olan Cacopsylla melanoneura ve Cacopsylla mali nin ele alınan bölgede önemsiz denebilecek kadar az oranda taşınmada rol oynadığını bildirmişlerdir. Çağlayan vd (2006) Bursa dan alınan Deveci armut çeşidi ile yaptıkları PCR-RFLP çalışması ile Pear Decline fitoplazmasını armutta ve vektörü Cacopsylla pyri de saptamışlardır. Setkaya vd (2006) 2003-2004 yıllarında Adana, Hatay ve Mersin illerinden temin ettikleri, Pear Decline fitoplazma belirtileri gösteren 92 armut ve 12 ayva örneğinde yaptıkları PCR-RFLP çalışması sonucu 7 armut bitkisinde Candidatus Phytoplasma pyri enfeksiyonu saptadıklarını, ayva örneklerinde ise enfeksiyona rastlamadıklarını bildirmişlerdir. Ayrıca 2 adet Cacopsylla pyri ergininde Candidatus Phytoplasma pyri saptadıklarını bildirmişlerdir. Tedeschi and Alma (2004) Apple Proliferation fitoplazmanın taşınmasında Cacopsylla melanoneura (Förster) nın farklı dönemleri ile yaptıkları çalışmada etmen fitoplazmayı taşımada en çok kışı geçiren erginlerin etkili olduğunu bildirmişlerdir. Tedeschi et al. (2006) farklı fitoplazma gruplarının vektörleri ve bu vektörlerin hangi dönemlerinin fitoplazma taşıdığını araştırdıkları çalışmalarında İtalya da AP fitoplazma vektörü olarak bilinen Cacopsylla melanoneura ve AP fitoplazma ile enfekteli bitki örneklerini P1/P7 universal fitoplazma primerleri ile direk, fo1/ro1 grup spesifik primerleri ile Nested PCR na tabi tutmuşlardır. Sonuçta Cacopsylla melanoneura nın sadece erginlerinin fitoplazmayı taşıdığını, yumurta, nimf ve yeni dönem erginlerin etmen fitoplazmayı barındırmadıklarını ve taşınmada rolleri olmadığını bildirmişlerdir. 18

3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Bitki Materyali Çalışmada bitki materyali olarak Ankara, Isparta, Yalova illeri elma ve armut yetiştirme alanlarında hastalık etmeni fitoplazmalar ile enfekteli olduğundan şüphelenilen, hastalık belirtisi gösteren ve göstermeyen elma ve armut ağaçlarından alınan yapraklı genç dallar kullanılmıştır. Bitki materyali 2005 ve 2006 yıllarında mayıs ve kasım ayları arasındaki dönemde Ankara, Isparta ve Yalova illerinin üretici bahçeleri ve Yalova Atatürk Bahçe Kültürleri Enstitüsü elma adaptasyon deneme bahçesi, Eğirdir Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü ve Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi elma ve armut parselleri ile, Haymana Araştırma ve Uygulama çiftliği elma bahçelerine düzenli olarak yapılan surveylerle temin edilmiştir (Şekil 3.1). Şekil 3.1 2005-2006 yıllarında elma ve armut bahçelerinde survey yapılan iller 19

Apple Proliferation fitoplazmanın saptanması için örnek alınmasında, ana dal ile yan dallar arasında belirgin açı daralması, yapraklarında testere dişlilik olan, yan yaprakları küçülmüş, eylül ayı sonunda sonbahar çiçeklenmesi gösteren ve meyvelerinde küçülme olan elma ağaçların tercih edilmiştir (Şekil 3.2-3.3-3.4-3.5). Pear Decline fitoplazmanın saptanması içinse, belirgin sararma, zayıflık ve geriye doğru ölüm ile anormal kızarma gösteren armut ağaçlarından alınan örnekler testlemeye tabi tutulmuştur (Şekil 3.6-3.7). Belirti gösteren ağaçların yanı sıra belirti göstermeyen ağaçlardan da tesadüfi olarak örnek alınmıştır. Örnek alımında çeşit seçimi özel olarak gözetilmemiş olup; survey yapılan alanlarda yetiştirilen çeşitlerden örnekleme yapılmıştır. Örnekler survey yapılan bahçelerin yaklaşık %20 sini temsil edecek şekilde alınmıştır. Toplanan örnekler polietilen poşetlere konularak, alındığı yer, tarih, çeşit, bahçe sahibine ilişkin verileri içerecek şekilde etiketlenmiş ve ısı yalıtımlı taşıma torbaları ile labotatuvara getirilmiştir. DAPI boyaması ve DAS-ELISA testleri için taze materyal kullanılmış olup, moleküler çalışmalar ve tekerrürleri için örnekler -20 C de deepfreezde saklanmıştır. Şekil 3.2 Elmada Candidatus Phytoplasma mali enfeksiyonu nedeniyle oluşan aşırı tomurcuklanma 20

Şekil 3.3 Candidatus Phytoplasma mali nedeniyle elmada sürgün aralarında kısalma sonucu oluşan rozetleşme a b Şekil 3.4 Elmada sağlıklı yaprak gelişimi (a) ve Candidatus Phytoplasma mali fitoplazma enfeksiyonu sonucu stipulların genişlemesi sonucu oluşan yaprak yapısı (b) 21

Şekil 3.5 Elmada Candidatus Phytoplasma mali enfeksiyonu sonucu sonbahar çiçeklenmesi Şekil 3.6 Candidatus Phytoplasma pyri ile enfekteli armut ağaçlarında kızarma belirtisi Şekil 3.7 Candidatus Phytoplasma pyri ile enfekteli armut ağaçlarında sararma belirtisi 22

Söz konusu etmenlerin belirlenmesi için toplanan örnekler DAS-ELISA, DAPI boyaması, PCR ve Nested PCR ve RFLP ye tabi tutulmuştur. Isparta-Eğirdir, Yalova, Ankara illerinde yapılan düzenli surveyler sonucu temin edilen toplam 334 adet olmak üzere; 201 adet elma, 133 adet armut örneği alındığı tarih, bölge, izolat numaraları, çeşitleri ve gözlenen belirtilerle birlikte Çizelge 3.1 ve Çizelge 3.2 de sunulmaktadır. Çizelge 3.1 Alındıkları illere göre elma örneklerinin izolat numaraları, alındığı tarih, bölge, çeşit ve gözlenen belirtiler İzolat no Alındığı tarih Alındığı bölge Çeşit Gözlenen belirti 1 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Rozetleşme 2 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Rozetleşme 3 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Rozetleşme 4 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Rozetleşme 5 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Stipullarında genişleme 6 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Rozetleşme 7 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Yapraklarda testere dişlilik 8 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Yapraklarda testere dişlilik 9 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Yapraklarda testere dişlilik 10 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Stipullarında genişleme 11 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Stipullarında genişleme 12 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Stipullarında genişleme 13 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Stipullarında genişleme 14 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Stipullarında genişleme 15 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starking Stipullarında genişleme 23

Çizelge 3.1 Alındıkları illere göre elma örneklerinin izolat numaraları, alındığı tarih, bölge, çeşit ve gözlenen belirtiler (devam) 16 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Meyvede küçülme, stipullarda genişleme 17 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Meyvede küçülme, stipullarda genişleme 18 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Meyvede küçülme, stipullarda genişleme 19 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Rozetleşme 20 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Rozetleşme 21 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Rozetleşme 22 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Yapraklarda testere dişlilik 23 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Rozetleşme 24 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Belirtisiz 25 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Meyvede küçülme 26 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Meyvede küçülme 27 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Stipullarda genişleme 28 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Stipullarda genişleme 29 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Stipullarda genişleme 30 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Starkrimson Stipullarda genişleme 31 25.05.2006 Isparta-Eğirdir Starkrimson Stipullarda genişleme 32 25.05.2006 Isparta-Eğirdir Starkrimson Dallar arasında açı azalması 33 25.05.2006 Isparta-Eğirdir Starkrimson Belitisiz 34 25.05.2006 Isparta-Eğirdir Starkrimson Belirtisiz 35 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Krimson Meyvede küçülme 36 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Krimson Meyvede küçülme 37 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Krimson Meyvede küçülme 38 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Krimson Meyvede küçülme 39 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Krimson Meyvede küçülme 24

Çizelge 3.1 Alındıkları illere göre elma örneklerinin izolat numaraları, alındığı tarih, bölge, çeşit ve gözlenen belirtiler (devam) 40 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Krimson Yapraklarda testere dişlilik 41 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Krimson Rozetleşme 42 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Krimson Rozetleşme 43 25.05.2006 Isparta-Eğirdir Krimson Rozetleşme 44 25.05.2006 Isparta-Eğirdir Krimson Stipullarda genişleme 45 25.05.2006 Isparta-Eğirdir Krimson Stipullarda genişleme 46 25.05.2006 Isparta-Eğirdir Krimson Stipullarda genişleme 47 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Stipullarda genişleme 48 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Stipullarda genişleme 49 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Stipullarında genişleme 50 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Rozetleşme 51 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Yapraklarda testere dişlilik 52 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Yapraklarda testere dişlilik 53 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Yapraklarda testere dişlilik 54 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Yapraklarda testere dişlilik 55 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Belirtisiz 56 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Belirtisiz 57 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Stipullarda genişleme 58 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Stipullarda genişleme 59 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Granysmith Stipullarda genişleme 60 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Golden Stipullarda genişleme 61 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Golden Stipullarında genişleme 62 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Golden Stipullarda genişleme 63 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Golden Stipullarda genişleme 25

Çizelge 3.1 Alındıkları illere göre elma örneklerinin izolat numaraları, alındığı tarih, bölge, çeşit ve gözlenen belirtiler (devam) 64 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Golden Stipullarında genişleme 65 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Golden Stipullarda genişleme 66 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Golden Yapraklarda testere dişlilik 67 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Golden Yapraklarda testere dişlilik 68 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Golden Dallar arası açı azalması 69 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Jerseymac Stipullarda genişleme 70 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Jerseymac Stipullarda genişleme 71 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Jerseymac Stipullarda genişleme 72 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Jerseymac Stipullarda genişleme 73 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Jerseymac Rozetleşme 74 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Jerseymac Meyvede küçülme 75 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Jerseymac Yapraklarda testere dişlilik 76 17.09.2005 Isparta-Eğirdir Jerseymac Stipullarda genişleme 77 05.08.2005 Yalova Starkrimson Rozetleşme 78 05.08.2005 Yalova Starkrimson Rozetleşme 79 05.08.2005 Yalova Starkrimson Rozetleşme 80 05.08.2005 Yalova Starkrimson Meyvede küçülme, rozetleşme 81 05.08.2005 Yalova Starkrimson Meyvede küçülmerozetleşme 82 05.08.2005 Yalova Starking delicious Meyvede küçülme 83 05.08.2005 Yalova Starking delicious Meyvede küçülme 84 05.08.2005 Yalova Starking delicious Meyvede küçülme 85 05.08.2005 Yalova Starking delicious Meyvede küçülme 86 05.08.2005 Yalova Golden Dallar arası açı azalması 26

Çizelge 3.1 Alındıkları illere göre elma örneklerinin izolat numaraları, alındığı tarih, bölge, çeşit ve gözlenen belirtiler (devam) 87 05.08.2005 Yalova Golden Meyvede küçülmerozeyleşme 88 05.08.2005 Yalova Golden Rozetleşme 89 05.08.2005 Yalova Golden Meyvede küçülme 90 05.08.2005 Yalova Golden Rozetleşme 91 05.08.2005 Yalova Starking Rozetleşme 92 05.08.2005 Yalova Starking Yapraklarda testere dişlilik-meyvede küçülme 93 05.08.2005 Yalova Starking Yapraklarda testere dişlilik-meyvede küçülme 94 05.08.2005 Yalova Starking Yapraklarda testere dişlilik-meyvede küçülme 95 05.08.2005 Yalova Starking Yapraklarda testere dişlilik-meyvede küçülme 96 05.08.2005 Yalova Sturdespur Yapraklarda testere dişlilik 97 05.08.2005 Yalova Sturdespur Yapraklarda testere dişlilik 98 05.08.2005 Yalova Sturdespur Yapraklarda testere dişlilik 99 05.08.2005 Yalova Sturdespur Yapraklarda testere dişlilik 100 05.08.2005 Yalova Sturdespur Belirtisiz 101 05.08.2005 Yalova Braeburn Meyvede küçülmerozetleşme 102 05.08.2005 Yalova Braeburn Meyvede küçülmerozetleşme 103 05.08.2005 Yalova Braeburn Meyvede küçülmerozetleşme 27

Çizelge 3.1 Alındıkları illere göre elma örneklerinin izolat numaraları, alındığı tarih, bölge, çeşit ve gözlenen belirtiler (devam) 104 05.08.2005 Yalova Braeburn Meyvede küçülmerozetleşme 105 05.08.2005 Yalova Braeburn Meyvede küçülme 106 05.08.2005 Yalova Goldensmith Dallar arası açı azalması- Yapraklarda testere dişlilik 107 05.08.2005 Yalova Goldensmith Yapraklarda testere dişlilik 108 05.08.2005 Yalova Goldensmith Yapraklarda testere dişlilik 109 05.08.2005 Yalova Goldensmith Belirtisiz 110 05.08.2005 Yalova Goldensmith Belirtisiz 111 05.08.2005 Yalova Jonathan Yapraklarda testere dişlilik 112 05.08.2005 Yalova Jonathan Yapraklarda testere dişlilik 113 05.08.2005 Yalova Jonathan Yapraklarda testere dişlilik 114 05.08.2005 Yalova Jonathan Yapraklarda testere dişlilik 115 05.08.2005 Yalova Jonathan Yapraklarda testere dişlilik 116 05.08.2005 Yalova Mutsu Rozetleşme 117 05.08.2005 Yalova Mutsu Rozetleşme 118 05.08.2005 Yalova Mutsu Meyvede küçülme, rozetleşme 119 05.08.2005 Yalova Mutsu Meyvede küçülme, rozetleşme 120 05.08.2005 Yalova Mutsu Meyvede küçülme, rozetleşme 121 05.08.2005 Yalova Vistabella Rozetleşme 122 05.08.2005 Yalova Vistabella Rozetleşme 28