Periferik iskemi reperfüzyonun akciğerdeki nitrozatif etkileri ve caffeic acid phenethyl ester in koruyucu rolü

Periferik iskemi reperfüzyonun akciğerdeki nitrozatif etkileri ve caffeic acid phenethyl ester in koruyucu rolü Mukadder ÇALIKOĞLU 1, Ali ÜNLÜ 2, Nehir SUCU 3, Savaş AKTAŞ 4, Lülüfer TAMER 2, İlker ÇALIKOĞLU 5 1 Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı, 2 Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı, 3 Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kardiyovasküler Cerrahi Anabilim Dalı, 4 Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji Anabilim Dalı, 5 Mersin Devlet Hastanesi, Biyokimya Kliniği, Mersin. ÖZET İskemi-reperfüzyon (İR), mikrovasküler fonksiyonların bozulması sonucu lokal ve sistemik inflamatuvar yanıt ile yaygın hasar oluşturabilen bir süreçtir. En sık etkilenen uzak organlar akciğerler ve kardiyovasküler sistemdir. Çalışmamızda İR bağımlı, endotelyal ve mikrovasküler fonksiyonlardaki bozulmayla oluşabilen akciğer hasarında nitrozatif markerların etkisini inceledik. Antioksidan özellikleri ileri sürülen Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE) in İR sürecinde nitrik oksitle ilişkili hasarı önlemedeki rolünü araştırdık. Yirmiiki yetişkin erkek Wistar rat, yedi kontrol, yedi İR ve sekiz İR + CAPE olmak üzere üç gruba ayrıldılar. İR ve CAPE + İR grubundaki ratlarda sağ bacak torakanter majör düzeyinde 8 saat İR oluşturuldu ve CAPE + İR grubundakilere reperfüzyondan önce 10 µm CAPE verildi. Reperfüzyon sonunda kan, bronkoalveoler lavaj (BAL) ve akciğer dokusu elde edildi. Serumda nitrit ve nitrat düzeyleri, BAL miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi, akciğer dokusunda 3-nitrotirozin (3-NT) seviyeleri ve akciğerde lökosit infiltrasyonu araştırıldı. İR ve kontrol grubu karşılaştırıldığında nitrat, MPO ve lökosit infiltrasyonunda artış gözlemlenirken, nitrit ve 3-NT düzeylerinde önemli değişikliğe rastlanılmadı. CAPE kullanımı ile nitrat düzeyleri (p< 0.0001), MPO aktivitesi (p< 0.0001) ve peribronşiyal/perivasküler lökosit düzeylerini anlamlı ölçüde azaltırken (χ 2 = 27.163, p= 0.0001), doku 3-NT seviyelerinde önemli bir değişikliğe yol açmadı. Sonuç olarak, periferik İR sistemik inflamatuvar yanıt ve endotelyal fonksiyon bozukluğuna yol açarak uzak organları etkileyebilir ve bu zararlı etkilerin CAPE ile önlenebileceği söylenebilir. Anahtar Kelimeler: Caffeic acid phenetyl ester, iskemi-reperfüzyon, akciğer. SUMMARY The nitrosative effect of peripheral ischemia-reperfusion on lung and preventive of caffeic acid phenethyl ester Calikoglu M, Unlu A, Sucu N, Aktas S, Tamer L, Calikoglu I Pulmonary Disease, Faculty of Medicine, Mersin University, Mersin, Turkey. Ischemia-reperfusion (IR) is characterized by microvascular disfunction and this involves both direct effected organ and remote organ by systemic inflamatory respons. These remote effects of IR are most frequently observed in the lung and car- Yazışma Adresi (Address for Correspondence): Dr. Mukadder ÇALIKOĞLU, Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı, 33079, MERSİN - TURKEY e-mail: mcalikoglu@hotmail.com 218

Çalıkoğlu M, Ünlü A, Sucu N, Aktaş S, Tamer L, Çalıkoğlu İ. diovascular system. In this study we aim to determine lung damage which induced IR, and endothelial and microvascular disfunction using nitrosavive markers. Previous studies suggest that caffeic acid phenethyl ester (CAPE) has some antioxidant effects. Therefore, we also investigated whether it has a role associated with nitric oxide during IR condition. Twenty-two adult male Wistar rats were divided into three groups: control (n= 7), IR (n= 7), and CAPE + IR (n= 8). 8 h IR period was performed on right hindlimb in the IR and the CAPE with IR group. In the CAPE with IR group, animals received CAPE 10 µm 1 h before the reperfusion. At the end of the reperfusion period, blood, bronchoalveolar lavage (BAL) and lung tissue were obtained, and were used for biochemical and histopathological examination. There was a significantly elevation in serum nitrate, BAL MPO, and leukocyte infiltration in the lung in the IR group compared to the CAPE + IR group. But, serum nitrite and lung 3-NT levels were not different between these groups. While nitrate (p< 0.0001), MPO (p< 0.0001) and leukocyte infiltration (χ 2 = 27.163, p= 0.0001), reduce by using CAPE before reperfusion, tissue 3-NT levels did not change. In conclusion, peripheral IR leads to systemic inflammatory responses and endothelial disfunction-induced NO production, and these harmful effects may reduced by CAPE. Key Words: Caffeic acid phenethyl esther, ischemia reperfusion, lung. İskemi-reperfüzyon (İR); mikrovasküler fonksiyonların bozulması ile hem direkt etkilenen organda, hem de sistemik inflamatuvar yanıtı harekete geçirerek uzak organlardaki arteriyollerde bozulmuş endotel bağımlı dilatasyon, kapiller yatakta artmış sıvı filtrasyonu ve lökosit tıkaçları, postkapiller venüllerde plazma proteinleri ve lökosit ekstravazasyonu ve mikrosirkülasyonun her kademesinde artmış oksijen radikali üretimi ile hasar oluşturabilen bir süreçtir (1,2). Bir serbest radikal olan nitrik oksit (NO) fizyolojik ve birçok patolojik durumda kan akımının düzenlenmesinde önemli rol oynar. İskemi, damar endotelinde hem inflamatuvar hücre infiltrasyonu hem de indüklenebilen nitrik oksit sentazın (NOS) aktivitesini arttırır. Böylece, iskemi sırasında NO seviyeleri artarken, reperfüzyon süresince kan akımının yeniden başlamasıyla, büyük miktarlarda moleküler oksijen dokulara taşınır ve reperfüzyon hasarından sorumlu olduğu düşünülen çok miktardaki serbest oksijen radikali ve süperoksit (O 2 - ) ortaya çıkar (3,4). İskemi sırasında oluşan NO, ya bu radikalin stabil son ürünleri olan nitrit ve nitrata dönüşür, ya da süperoksit (O 2 - ) radikali ile reaksiyona girerek peroksinitrit (ONOO - ) oluşturur (5,6). Peroksinitrit proteinlerdeki tirozin rezidülerinin 3-pozisyonundaki hidroksil grubuna bir nitro grubu ekleyerek, stabil bir son ürün olan 3-nitrotirozin (3-NT) i oluşturur (7). Ayrıca NO, nötrofil aktivasyonunun bir göstergesi olan miyeloperoksidaz enzimi ile reaksiyona girmek suretiyle de proteinlerdeki tirozinin nitrasyonuna yol açabilir (8). 3-NT protein nitrasyonunun indirekt ve stabil ürünü olup, nitrozatif stresi göstermede yaygın olarak kullanılmaktadır (9,10). Propiller, güçlü antimikrobiyal, antiinflamatuvar, antioksidan ve antineoplastik aktiviteleri olan ve bal arıları tarafından toplanan ürünlerdir. Propillerin aktif bir komponenti olan Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE) bu biyolojik aktivitelerin tümünden sorumlu olabilir ve 10 µmol konsantrasyonda kullanıldığında insan nötrofillerinde reaktif oksijen türlerini tam olarak bloke ettiği gösterilmiştir (11-15). Yine son yıllarda yapılmış çalışmalarda CAPE nin antioksidan özelliği ve İR den direkt etkilenen organ ve dokularda reaktif oksijen ve nitrojen türlerine bağlı olarak gelişen İR hasarını önlediği gösterilmiştir (13,14, 16-19). Bu çalışmada amacımız, deneysel olarak oluşturulan periferik İR nin uzak hedef organ olan akciğerdeki etkilerini belirlemektir. MATERYAL ve METOD Bu çalışmada 200-250 g ağırlığında, 22 yetişkin erkek Wistar rat kullanıldı. Hayvanlar, yedi kontrol, yedi İR ve sekiz İR + CAPE olmak üzere üç gruba ayrıldılar. 100 mg/kg intramusküler (IM) ketaminle uyutulduktan sonra sağ bacak torakanter majör proksimali düzeyine bir turnike koyularak dört saat süresince iskemi oluşturuldu. Sonrasında turnikeler alınarak dört saat reperfüzyon oluşturuldu. İR + CAPE grubundaki ratlara daha önceki çalışmalarda önerilen doz olan 219

Periferik iskemi reperfüzyonun akciğerdeki nitrozatif etkileri ve caffeic acid phenethyl ester in koruyucu rolü 10 µm CAPE reperfüzyondan bir saat önce intraperitoneal olarak uygulandı (16,17). Aynı miktarda salin solüsyonu aynı yolla İR grubundaki ratlara uygulandı. Reperfüzyon dört saat sürdürüldü ve bitiminde biyokimyasal incelemeler için çıkan aortadan 5 ml kan alındı. Reperfüzyon sürecinin sonunda, yarı steril şartlarda İR ve IR + CAPE grubundaki ratlara midsitrenotomi yapıldı. Sol ana bronş klemplendikten sonra trakeadan sağ akciğere 0.07 mol -1 etilen diamin tetraasetik asit içeren 2 ml salin solüsyonu üç kez enjekte edildi ve geri çekildi. Böylelikle toplam 3-4 ml bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısı elde edildi. Bu işlemin bitiminden sonra sol akciğer çıkarıldı ve histopatolojik inceleme için %10 luk formaldehid içinde fikse edildi. Nitrit ve nitrat ölçümü: Kısa yarı ömrü ve radikal yapısı sebebiyle NO nun direkt olarak saptanması zor olduğundan plazmada stabil son ürünleri olarak nitrit ve nitratın ölçümü kullanılmaktadır (20). Nitrit ve nitrat düzeyleri spektrofotometrik metod ile saptandı (Roche, Mannheim, Germany). Nitrat redüktaz enzimi varlığında nitratın nitrite indirgenmesine ve oluşan nitritin sulfanilamid ve N-etilendiamine dihidroklorid ile reaksiyona girerek oluşan kromojenin 550 nm de ölçümü prensibine dayanır. NO nun serumdaki direkt göstergeleri olarak kabul edilen nitrit + nitrat değerleri ölçüldü (20). Doku 3-NT ölçümü: Akciğer doku örnekleri ilk olarak 6 N HCl içinde 100 C de 24 saat inkübasyon ile hidrolize edildi. Daha sonra örnekler filtre edilerek HPLC sistemi (HP 1050 DAD) kullanılarak analiz edildi. Analitik kolon 5 µm por ölçülü spherisorb ODS-2 ters faz kolonu idi. Sitrat-asetat tamponu izokratik şartlar altında mobil faz olarak dakikada 1 ml gidecek şekilde kullanıldı. 3-NT pikleri UV dedektörde 274 nm dalga boyunda ölçüldü. 3-NT pikleri retansiyon süresine göre belirlendi. Çıkan 3-NT pikleri ekzojen 3-NT eklenerek piklerin büyütülmesi ile doğrulandı (21). 3-NT nmol/mg protein olarak verildi. BAL miyeloperoksidaz (MPO) ölçümü: MPO nötrofillerin azurofil granülleri içerisinde bulunur ve lökosit sekestrasyonunun saptanmasında basit, kantitatif bir yöntem olarak kullanılmaktadır. MPO aktivite ölçümü o-dianozidin redüksiyonunu ve redükte o-dianozidinin absorbansının 410 nm de ölçümüne dayanmaktadır (22). Histopatolojik değerlendirme: Akciğer dokusu %10 formalin ile fiske edildikten sonra ışık mikroskobik inceleme için rutin hazırlıklar yapıldı. Parçalar (4 µm) mikrotom ile kesildi ve hematoksilin-eozin ile boyandı. Hazırlanan preparatlarda inflamatuvar değişiklikleri değerlendirmek üzere lökosit sayımı yapıldı. Mikroskobik değerlendirme için Olympus B X 50 ışık mikroskobu kullanıldı ve fotoğraflar Olympus PM10SP sistem ile çekildi. Lökosit infiltrasyon düzeyini ifade etmek için her bir preparat 10 alana bölünerek değerlendirildi ve her alanda 400 hücre sayılarak lökosit yoğunluğu skorlandı. Skor 0: Ekstravasküler lökosit yok; 1: < 10 lökosit; 2: 10-45 lökosit; 3: > 45 lökosit olarak ifade edildi. İstatistik analiz: Veriler ortalama değer ± standart hata olarak sunuldu (23). Gruplar arası farklılıklar ANOVA test ile analiz edildi. Anlamlılık p< 0.05 olarak tanımlandı. Histopatolojik verilerin değerlendirilmesinde χ 2 ve Z-approximation testleri kullanıldı. p< 0.05 istatistiksel anlamlı kabul edildi. BULGULAR IR uygulaması sonucunda serum nitrat düzeyi önemli derecede artarken (p< 0.01) nitrit düzeylerinde belirgin bir değişiklik gözlemlenmedi. Artan sistemik nitrat düzeylerine karşılık, akciğerde lokal 3-NT düzeylerinde herhangi bir değişiklik saptanmadı. BAL MPO seviyesi İR grubunda belirgin yüksek bulunup, CAPE uygulanan grupta anlamlı düşüş gösterdi. Benzer şekilde, reperfüzyon öncesi CAPE uygulanması ile serum nitrat seviyelerinin de kontrol grubuna yakın düzeylere indiği gözlendi. Serum nitrit ve akciğer dokusunda 3-NT düzeylerinde İR sürecinde anlamlı bir değişiklik gözlenmedi ve CAPE kullanımının herhangi bir etkisine rastlanılmadı. Gruplara ait biyokimyasal veriler Tablo 1 de izlenmektedir. Histopatolojik değerlendirme: Akciğer dokularının ışık mikroskopi ile değerlendirilmesi sonucunda gruplar arasında peribronşiyal ve perivasküler lökosit infiltrasyonu bakımından anlamlı fark saptandı (χ 2 = 27.163, p= 0.0001). 220

Çalıkoğlu M, Ünlü A, Sucu N, Aktaş S, Tamer L, Çalıkoğlu İ. Tablo 1. Gruplardaki nitrit, nitrat, 3-NT düzeyleri ve miyeloperoksidaz aktivitesi. Serum Serum BAL Doku Nitrit Nitrat Miyeloperoksidaz aktivitesi 3-NT (µmol/l) (µmol/l) (U mg -1 protein h -1 ) (nmol/mg protein) Kontrol (n= 7) 9.4 ± 3.44 43 ± 12.5 0.11 ± 0.05** 5.3 ± 4.3 İR (n= 7) 11.4 ± 4.16 90.5 ± 6.5* 1.69 ± 0.67*** 6.4 ± 3.8 CAPE + İR (n= 8) 13 ± 7.1 50 ± 28.6 0.34 ± 0.27 6.2 ± 2.6 * p< 0.01, kontrol ile CAPE + İR grubu arasındaki fark, ** p< 0.0001, kontrol ile İR grubu arasındaki fark, *** p< 0.0001, İR ile CAPE + İR grubu arasındaki fark. İR grubunda yedi ratın 6 (%85.7) sı skor 3 derecesinde lökosit infiltrasyonuna sahipken, bu skor CAPE ile tedavi edilen gruptaki ratlardan sadece birinde saptandı (p= 0.002). Benzer şekilde CAPE grubunda sekiz ratın 3 (%37.5) ünde skor 1 lökosit infiltrasyonu varken, İR grubunda bu skora hiç rastlanmadı (p= 0.03). Sonuçta akciğerdeki lökosit infiltrasyonu kontrol grubunda skor 0, IR grubunda skor 2 ve 3, CAPE grubunda ise skor 1 ve 2 de yoğunlaşmıştı. Veriler Tablo 2 de izlenmektedir. Resim 1, 2 ve 3 te kontrol, İR ve CAPE + İR gruplarının akciğerlerinde peribronşiyal ve perivasküler lökosit infiltrasyonu sunulmuştur. Tablo 2. Gruplar arasındaki lökosit infiltrasyon skorları. Lökosit infiltrasyon skoru Grup 0 1 2 3 Toplam Kontrol 5 (%71.4)* 2 (%28.6) 7 (%100) İR 1 (%14.3)** 6 (%85.7)*** 7 (%100) CAPE + İR 3 (%37.5)**** 4 (%50) 1 (%12.5) 8 (%100) χ 2 = 27.163, p= 0.0001, İR: İskemi-reperfüzyon, CAPE: Caffeic Acid Phenethyl Ester * Kontrol- İR grubu arasındaki fark (p= 0.005) ve kontrol-cape + İR grubu arasındaki fark (p= 0.01), ** IR-CAPE + İR grubu arasındaki fark (p= 0.029), *** Kontrol-İR grubu arasındaki fark (p= 0.001) ve İR-CAPE + İR grubu arasındaki fark (0.002), **** İR-CAPE + İR grubu arasındaki fark (0.03), Diğer skorlar bakımından gruplar arasında anlamlı fark bulunmadı (p> 0.05). Resim 1. Kontrol grubunda terminal ve respiratuar bronşiyoller, alveoler duktus yapıları (hematoksilin & eozin x 40). Resim 2. İR grubunda peribronşiyal ve perivasküler lökosit infiltrasyonu, terminal bronşiyoller ve alveoler yapılar (hematoksilin & eozin x 100) 221

Periferik iskemi reperfüzyonun akciğerdeki nitrozatif etkileri ve caffeic acid phenethyl ester in koruyucu rolü İR sonucu serumda NO artışını gözledik ve bunun hipoksik ve inflamatuvar süreç olan İR sırasındaki NOS ekspresyonunun artışı ile ilgili olabileceğini düşünmekteyiz. Ancak nitrozatif stresin bir göstergesi olan 3-NT düzeyleri için akciğer dokusunda anlamlı bir değişiklik bulmadık. Resim 3. CAPE + IR grubunda terminal ve respiratuar bronşiyoller, alveoler duktus yapıları (hematoksilin & eozin x 40) TARTIŞMA İR sürecinin, reaktif oksijen radikallerinin artışı ve güçlü kemotaktik özellikleri olan birçok inflamatuvar mediatörün salınması ile karakterize bir doku hasarına neden olduğu bilinmektedir (2,24,25). Bu sürecinin uzak organlar üzerindeki etkileri en sık akciğerler ve kardiyovasküler sistemde görülmektedir (2). Bu çalışmada bacakta oluşturulan İR sırasında endojen NO üretiminin bir göstergesi olan serum nitrat düzeylerinin; lökosit infiltrasyon ve aktivasyonunun bir ifadesi olarak da BAL da MPO aktivitesinin anlamlı artış gösterdiğini saptadık. Bir serbest radikal olan nitrik oksit (NO), nitrik oksit sentazın (NOSs) L-arjinin ile etkileşimi sonucu oluşur, birçok fizyolojik ve patolojik durumda kan akımının düzenlenmesinde önemli rol oynar. İnflamatuvar ve hipoksik bir süreçle sonlanan İR, endotelyal NOS nin yapısal ve özellikle de indüklenebilir izoformlarının ekspresyonuna ve dolayısıyla NO artışına neden olabilir (26,27). NO artışındaki bir diğer muhtemel mekanizma nötrofillerin aktivasyonu ve etkilenen dokuya sekestrasyonudur (28). Bugüne kadar İR hasarı konusunda yapılan yoğun çalışmalara karşın, İR sürecinden NO nun ne yönde etkilendiği açık değildir. Koltuksuz ve arkadaşları tarafından bir testiste oluşturulan İR nin, sadece o testiste ve iskemi sırasında NO yu arttırdığını, reperfüzyon sırasında ise azalttığını, ancak karşı testisi etkilemediğini gözlemlemişlerdir (16). Biz bacakta oluşturulan Nötrofil aktivasyonunun kantitatif bir ifadesi olan MPO nun birçok patolojik süreçte reaktif oksijen radikallerinin aşırı üretimine neden olduğu bilinmektedir (29). Çalışmamızda BAL da MPO aktivitesini artmış bulduk ama bu artışın da akciğer dokusunda 3-NT düzeylerini etkilemediğini gözledik. Bunun nedeni periferik İR sırasında BAL- MPO artışına rağmen akciğer dokusunda yeterli NO sentezinin olmaması ve MPO aracılıklı tirozin nitrasyonunun gerçekleşmemesi olabilir. Bu durum, İR den direkt etkilenen dokuda üretilerek sistemik dolaşıma salınan NO nun uzak organda protein nitrasyonuna yol açacak düzeyde olmaması veya hipoksiden direkt olarak etkilenmeyen uzak organda NOS ekspresyonunun yeterli düzeyde olmadığını düşündürmektedir. NOS nin olmaması peroksinitrit oluşturmak üzere serbest oksijen radikalleri ile reaksiyona girecek NO üretiminin oluşmaması ile sonlanır. Böylelikle peroksinitrit aracılıklı nitrozatif hasar gelişmemiş olabilir. Aslında mikrosirkülasyonda NO nun koruyucu rolünün olduğu bilinmektedir. Ancak, aşırı miktarda üretilen NO, hipoksik ortamda artmış olan reaktif oksijen ürünleri ile birleşip zararlı özellik kazanabilir; yüksek miktarda NO ve peroksinitrit oluşumunu azaltarak İR bağımlı hasarın önlenebileceği ileri sürülmektedir (30). İR hasarının direkt etkilenen dokularda CAPE tarafından azaltıldığını gösteren çalışmalar vardır (11,13-15,23). Bu çalışmada da reperfüzyon öncesi CAPE uygulaması ile serum NO düzeyleri ve BAL MPO aktivitesinde anlamlı azalma gözledik. Ayrıca akciğer dokusunun histopatolojik incelemesi de CAPE nin perivasküler ve peribronşiyal lökosit infiltrasyonunu azalttığını gösterdi. Uzak organda MPO aktivitesi ve lökosit infiltrasyonunun azaltılması reaktif oksijen radikallerinin üretiminin azalması ile paraleldir. Bu çalışmada her ne kadar akciğer dokusunda zararlı oksijen radikalleri ile birleşecek yeterli NO nun olmadığı düşünülse de, serumda artan NO ile reaksiyona giren bu radikallerin hücre zarlarında lipid peroksidasyonuna 222

Çalıkoğlu M, Ünlü A, Sucu N, Aktaş S, Tamer L, Çalıkoğlu İ. veya hücrelerin çeşitli enzim aktivitelerinde ve enerji metabolizmalarında bozulmalara neden olabileceği düşünülebilir. Bu zararlı etkileri önlemek amacıyla CAPE nin antioksidan özelliğinden yararlanmak faydalı olabilir. KAYNAKLAR 1. Welbourn CRB, Goldman G, Peterson IS. Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury: Central role of the neutrophil. Br J Surg 1991; 78: 651-5. 2. Carden DL, Granger DN. Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury. J Pathol 2000; 190: 255-66. 3. Bulkley GB. Free radical mediated reperfusion injury: A selective review. Br J Cancer Suppl 1987; 8: 66. 4. Love S. Oxidative stress in brain ischemia. Brain Pathol 1999; 9: 119-31. 5. Cardillo C, Kilcoyne CM, Cannon RO, et al. Xanthine oxidase inhibition with oxypurinol improves endothelial vasodilator function in hypercholesterollemic but not in hypertensive patients. Hypertention 1997; 30: 57-63. 6. Beckman JS, Beckman TW, Chen J, et al. Apperent hydroxyl radical production by peroxynitrite: Implication for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci 1990; 87: 1620-4. 7. Ischiropoulos H, Zhu L, Chen J, et al. Peroxynitrite-mediated tyrosine nitration catalyzed by superoxide dismutase. Arch Biochem Biohys 1992; 298: 438-45. 8. Beckman J, Koppenol W. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: The good, the bad, and the ugly. Am J Physiol 1996; 271: 1424-37. 9. Van Der Vliet A, Eiserich JP, Shigenaga MK, Cross CE. Reactive nitrogen species and tyrosine nitration in the respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: 1-9. 10. Eiserich JP, Hristova M, Cross CE, et al. Formation of nitric oxide-derived inflammatory oxidants by myeloperoxidase in neutrophils. Nature 1998; 391: 393-7. 11. Hepsen IP, Bayramlar H, Gültek A, et al. Caffeic acid phenethyl ester to inhibit posterior capsule opacification in rabbits. J Cataract Refract Surg 1997; 23: 1572. 12. Hepsen IF, Er H, Cekic O. Topically applied water extract of propels to suppress cornean neovascularization in rabbits. Ophthalmic Res 1999; 31: 426-31. 13. Ilhan A, Koltuksuz U, Ozen S, et al. The effects of caffeic acid phenethyl ester on spinal cord ischemia/reperfusion injury in rabbits. Eur J Cardiothorac Surg 1999; 16: 458-63. 14. Koltuksuz U, Özen S, Uz E, et al. Caffeic acid phenethyl ester prevents intestinal reperfusion injury in rats. J Pediatr Surg 1999; 34: 1458-62. 15. Sud ina GF, Mirzoeva OK, Puskareva MA, et al. Caffeic acid phenethyl ester as a lipoxygenase inhibitor with antioxidant properties. FEBS Lett 1993; 329: 21. 16. Koltuksuz U, Irmak MK, Karaman A, et al. Testicular nitric oxide levels after unilateral testicular torsion/detorsion in rats pretreated with caffeic acid phenethyl ester. Urol Res 2000; 28: 360-3. 17. Ozyurt H, Irmak ÖK, Akyol O, Sogut S. Caffeic acid phenethyl ester changes the indices of oxidative stress in serum of rats with renal ischemia-reperfusion injury. Cell Biochem Funct 2001; 19: 259-63. 18. Irmak MK, Koltuksuz U, Kutlu ON, et al. The effect of caffeic acid phenethyl ester on ischemia-reperfusion injury in comparison with alpha-tocopherol in rat kidneys. Urol Res 2001; 29: 190-3. 19. Chen YJ, Shiao MS, Wang SY. The antioxidant caffeic acid phenethyl ester induces apoptosis associated with selective scavenging of hydrogen peroxide in human leukemic HL-60 cells. Anticancer Drugs 2001; 12: 143-9. 20. Moshage H, Kok B, Huizenge JR, Jansen PLM. Nitrite and nitrate determination in plasma: A critical evaluation. Clin Chem 1995; 41: 892-6. 21. Kamisaki Y, Wada K, Nakamoto K, et al. Sensitive determination of nitrotyrosine in human plasma by isocratic high-performance liquid chromotagrophy. J Chromatogr B Biomed Appl 1996; 685: 343-7. 22. Golowich SP, Kaplan SD. Methods in enzymology. Vol 2. New York: Academic Press Inc, 1955: 769. 23. Çalıkoğlu M, Tamer L, Sucu N, et al. The effects of the caffeic acid phenethyl ester on tissue damage in lung after hindlimb ischemia-reperfusion. Pharmacol Res 2003; 48: 397-403. 24. Sucu N, Unlu A, Tamer L, et al. Effects of trimetazidine on tissue damage in kidney after hindlimb ischemia-reperfusion. Pharmacological Research 2002; 46: 345-9. 25. Seekamp A, Ward PA. Ischemia-reperfusion injury. Agents Actions Suppl 1993; 41: 137-52. 26. Demers P, Elkouri S, Sirois MG, Cartier R. Effects of acute rejection on L-arginine/iNOS pathway in canine heart transplantation. Can J Cardiol 2003; 19: 419-25. 27. Pararajasingam R, Weight SC, Bell PR, et al. Endogenous renal nitric oxide metabolism following experimental infrarenal aortic cross-clamp-induced ischemia-reperfusion injury. Br J Surg 1999; 86: 795. 28. Adams LB, Hibbs JB, Taintor RR, et al. Microstatic effect of murine-activated macrophages for Toxoplasma gondii: Role of synthesis of inorganic nitrogen oxides from L-arginie. J Immunol 1990; 144: 2725. 29. Hoy A, Tregouet D, Leininger-Muller B, et al. Serum myeloperoxidase concentration in a healthy population: Biological variations, familial resemblance and new genetic polymorphisms. Eur J Hum Genet 2001; 9: 780-6. 30. Morisue A, Wakabayashi G, Shimazu M, et al. The role of nitric oxide after a short period of liver ischemia-reperfusion. J Surg Res 2003; 109: 101-9. 223