Tüberkülozda Yeni Tanı Yöntemleri

BÖLÜM 4 Tüberkülozda Yeni Tanı Yöntemleri Ogün Sezer Faruk Çiftçi Erkan Bozkanat Günümüzde tüberkülozla savaşta önemli mesafeler alınmasına karşılık, dünyada her yıl 2-3 milyon insan bu hastalıktan yaşamını yitirmektedir. Dünya nüfusunun yaklaşık üçte birinin Mycobacterium tuberculosis ile infekte olduğu kabul edilmektedir. Hastalığın erken dönemde tanınması ve tedavi edilmesi, bu hastalıktan korunmada en etkili yoldur. Tüberkülozun kesin tanısı, laboratuvar yöntemleriyle konulmaktadır. Laboratuvar tanısı, etkenin hasta örneklerinde gösterilmesi ve izolasyonuyla sağlanır. Tüberküloza yakalandığı düşünülen hastaların tanılarını sağlayacak, tedaviyi yönlendirecek, duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek, hızlı sonuç veren, uygulaması kolay laboratuvar yöntemlerinin günlük kullanıma girmesi önemlidir (1). Yirminci yüzyılın son yirmi yılında laboratuvar tanısında önemli değişiklikler ortaya çıkmıştır. Tüberküloz basilinin varlığını kısa sürede saptamaya yönelik, duyarlılığı yüksek yöntemlerin geliştirilmesinde farklı yaklaşımlar denenmekte ve çeşitli yöntemler geliştirilmektedir. Bu yaklaşımları aşağıda sıralanan başlıklar altında toplayabiliriz (1,2): 1. Hızlı sonuç veren kültür sistemleri 2. Serolojik yöntemler 3. Çeşitli hücrelerden salınan maddelerin belirlenmesi 4. Nükleik asit hibridizasyon yöntemleri 5. Nükleik asit çoğaltma yöntemleri 33

34 Ogün Sezer Faruk Çiftçi Erkan Bozkanat Hızlı Sonuç Veren Kültür Sistemleri BACTEC TB-460 Bactec TB-460 sistemi, izolasyon, idantifikasyon ve antibiyotik duyarlılık testlerinin yapıldığı bir sistem olarak kullanılmaktadır. Middlebrook 7H12 sıvı besiyeri ve C14 işaretli palmitik asit içeren radyometrik bir sistemdir. Sistem, Bactec 12B (Middlebrook 7H12) ve Bactec 13A (Middlebrook 7H13) olmak üzere iki tip besiyeri içermektedir. Ortama ekilen materyal içinde mikobakteri varsa, üreme sırasındaki metabolizması sonucu radyoaktif CO2 oluşur. Oluşan radyoaktif CO2 gazını saptayan okuyucu, üremenin sayısal olarak (0-999 sayısal değerleri arasında) belirlenmesini sağlar ve Growth Index (GI) olarak ölçüm yapılır. Ekim işleminden önce besiyerlerine polimiksin-b, azlosilin, nalidiksik asit, trimetoprim ve amfoterisin-b (PANTA) içeren antibiyotik karışımı eklenmelidir. Ortalama üreme süresi 10 12 gündür. Bu sistemin bir diğer avantajı, sadece bu sistem için uyarlanmış idantifikasyon sisteminin (p-nitro-alfa-acetylamino-beta-hydroxypropiophenone; NAP) bulunması; deoksiribonükleik asit (DNA) prob, PCR-RFLP gibi sistemlerle idantifikasyona uygun olması ve antibiyotik duyarlılık testlerinin yapılabilmesidir. Yapılan çalışmalarda duyarlılık, mikobakteriler için %84-99,4; M. tuberculosis kompleksi için %91 100 arasında bulunmuştur (3). Sistem başarıyla kullanılmakla beraber, sistemde yer alan besiyerlerinin radyoaktif madde içermesi ve cihazda yapılan rutin kontroller sırasında meydana gelen çapraz kontaminasyon sorun oluşturmaktadır. Myco-ESP II Selülöz sünger ve Middlebrook 7H9 sıvı besiyeri içeren şişelerde mikobakterilerin oluşturduğu gaz ve oluşan basıncı ölçerek üreme değerlendirmesi yapan bilgisayar destekli bir sistemdir. Besiyerinde oluşan gaz basıncındaki değişiklik grafiksel olarak bilgisayarda görüntülenir. Besiyerine ekim yapılmadan önce, mikobakterilerin üremesini destekleyen oleik asit-albumin-dekstroz-katalaz (OADC) ve kontaminasyonu engelleme amacıyla antibiyotik karışımı ilave edilir. Sistem tüm klinik örnekler için uygundur (4). BacT/ALERT (MB/BacT) Sistemi Kolorimetrik olarak besiyerinde oluşan CO2 düzeyini ölçerek mikobakteri üremesini değerlendiren bir sistemdir. Oluşan CO2 besiyerindeki yeşil rengi sarıya dönüştürür. Bilgisayar desteği bulunan sistemde besiyerleri sürekli kontrol altındadır. Sistem olarak oldukça hızlıdır ve duyarlılığı yüksektir. Steril örnekler ekilmeden önce besiyerlerine yeniden yapılandırma sıvısı (tween, gliserol, amarant) ilave edilirken, steril olmayan örneklerin ekiminden önce OADC (oleik asit-albumin-dekstroz-ka-

BÖLÜM 4 Tüberkülozda Yeni Tanı Yöntemleri 35 talaz) ile antibiyotik karışımı (amfoterisin-b, azlosilin, nalidiksik asit, vankomisin, polimiksin-b ve trimetoprim) ilave edilmektedir. Sistem kan dışındaki tüm örnekler için uygundur (5). MGIT (Mycobacteria Growt Indicator Tube) Besiyeri olarak Middlebrook 7H9 sıvısı kullanılır. OADC (oleik asit-albumin-dekstroz-katalaz) ile zenginleştirilmiştir. Antimikrobiyal olarak polimiksin-b, amfoterisin-b, nalidiksik asit, trimetoprim ve azlosilin (PANTA) kullanılır. İdrar ve kan hariç diğer örnekler için uygun bir sistemdir (6). Bactec 9000 MB Besiyerlerindeki oksijen kullanımının fluoresans ile takip edildiği bir sistemdir. Modifiye Middlebrook 7H9 sıvı besiyerlerine ekimden önce PANTA ilave edilir. Sistemde balgam ve diğer solunum yolu örnekleri için Myco/F sputa, kan ve diğer steril vücut bölgelerinden alınan örnekler için MycoF/lytic besiyeri kullanılır. Sistem aralıksız olarak her 10 dakikada bir olmak üzere üremeyi değerlendirmektedir. Bu sistemde tür düzeyinde idantifikasyon ve antitüberküloz ilaçlara duyarlılık saptaması yapılamamaktadır (6). Bactec MGIT 960 Bu sistem için kullanılan tüplerde Middlebrook 7H9 sıvı besiyeri ve dip kısımlarında oksijene duyarlı rutenyum metal kompleksi içeren silikon bulunmaktadır. Klinik örnekler çalışmaya alınmadan önce besiyerlerine OADC ve PANTA ilave edilir. Kullanılan besiyerlerinde üreme olmadığında oksijen varlığına bağlı olarak silikon tabakaya gönderilen UV ışınına karşı fluoresans oluşmazken; mikobakteri veya diğer mikroorganizmalar ürediğinde oksijen kullanılması sonucunda gönderilen UV ışını rutenyum kompleksindeki değişiklik nedeniyle fluoresans vermekte ve oluşan fluoresans miktarı, üreme indeksi olarak değerlendirilmektedir. Tam otomatik bir sistem olmakla birlikte, UV ışığı altında makroskopik olarak da değerlendirme yapılabildiğinden, elle de kullanılmaktadır. Kan dışındaki diğer tüm klinik örnekler için kullanılabilmektedir (7). Septi-Chek AFB Mycobacteria Kültür Sistemi Modifiye Middlebrook 7H9 sıvı besiyeri içeren şişeyle, üç tip modifiye katı besiyerinde (LJ, Middlebrook 7H11, çikolatamsı agar) değerlendirmenin yapıldığı bifazik bir kültür sistemidir. Çikolatamsı agar, kontaminasyonu belirleme amacıyla kullanılır. Kültür işleminden önce besiyerine glukoz, gliserin, oleik asit, pridoksal HCI, katalaz, albumin, azlosilin, nalidiksik asit, trimetoprim, polimiksin-b ve amfoterisin-b içeren karışım ilave edilir. Klinik örneklerin ekiminden sonra besiyerleri ilk 24 saat ters ola-

36 Ogün Sezer Faruk Çiftçi Erkan Bozkanat rak bekletilir ve sürenin sonunda dik konuma getirilir. Kültür süresince besiyerleri ara sıra hafifçe çalkalanarak sıvı besiyerinin katı besiyerlerine teması sağlanmalıdır. Sistem kan dışındaki bütün klinik materyaller için uygundur (4,6). Versa TREK Modifiye Middlebrook 7H9 sıvı besiyerine OADC ilave edilen besiyerleri kullanılır. Besiyerine iki farklı tip antibiyotik kombinasyonu eklenebilir. Birincisi, polimiksin-b, azlosilin, fosfomisin, nalidiksik asit ve amfoterisin-b den (AS) oluşur. İkinci içerikteyse polimiksin-b, vankomisin, nalidiksik asit ve amfoterisin-b (PVNA) yer alır. Kontaminasyon riski düşük örneklerde AS kullanılırken, riskin yüksek olduğu örneklerde PVNA kullanılır. Okuyucu ve inkübasyon sistemi bir arada yer almaktadır. Besiyeri şişeleri inkübasyon sırasınca sallanmaktadır. Şişeler üzerindeki basınç, şişelerin bağlı olduğu bilgisayar destekli sistemle takip edilir (4,6). Serolojik Yöntemler Serolojik yöntemler, tüberküloz tanısı için kullanılmaya başlanan en eski yöntemlerdendir. Ancak çevrede yaygın olarak bulunan M. tuberculosis kompleksi dışındaki mikobakterilerin çapraz tepkimeye yol açan antijenleri nedeniyle duyarlılık ve özgüllük sorunlarının çözülemeyişi günlük pratiğe girmesine engel olmuştur. 1972 yılında, enzime bağlı immünosorban (ELISA) yönteminin tanımlanması ile serolojik tanıda dramatik bir değişim ortaya çıkmıştır. Zamanla M. tuberculosis te bulunan antijenlerin saflaştırılabilmesi, bu antijenleri özgül olarak tanıyan monoklonal antikorların elde edilebilmesi, serolojik tanıyı yeniden gündeme getirmiştir. Duyarlılık ve özgüllük, çalışılan yönteme ve aranan antijen veya antikora göre değişmektedir. Yapılan çalışmalarda antikor aranmasında duyarlılık %24 100 ve antijen aranmasında duyarlılık %39-94 arasında bulunmuştur. Bu testlerin özgüllüğü ise, tek özgül epitopa antikor yanıtı arandığında %100 e yaklaşmaktadır. Ancak olumlu sonuçlar genellikle hastalığın ileri devrelerinde elde edilmektedir. Bu nedenle günümüzde ancak klasik yöntemlere yardımcı bir test olarak kullanılabilirler. Serolojik yöntemler üç grupta toplanabilir. Bunlar, mikobakterilere özgül antijenler veya bunlara karşı oluşan antikorları saptayan testler ile tüberküloz infeksiyonu sırasında artan interferon gamma (İFN-γ) ölçüm testlerinden oluşur. Mikobakteri antijenlerinin fraksiyonlarına ayrılması, izolasyonu ve analizi için geliştirilen tekniklerdeki ilerlemeler sonucunda, M. tuberculosis in, bazılarında karbonhidrat ve glikolipit kısımları bulunan çeşitli protein antijenleri gösterilmiş ve yapısal özellikleri ayrıntılı biçimde tanımlanmıştır. Tüberkülozlu hastaların serumundan, dolaşan antijenler izole edilmiş ve bunların tanı amacıyla kullanılabilirlikleri araştırılmıştır.

BÖLÜM 4 Tüberkülozda Yeni Tanı Yöntemleri 37 Ayrıca, mikobakterilerin plazma membranında bulunan antijenler, antijen 5, lipoarabinomannan (LAM), sitoplazmik antijenler ve diğer antijenleri tespit eden çeşitli serolojik test kitleri hazırlanmıştır (8). Antijen Saptanmasına Dayanan Testler İdrar, Balgam ve Serumda Lipoarabinomannan Saptanması Lipoarabinomannan (LAM), mikobakterilerin hücre duvarında bulunan bir lipopolisakkarittir. LAM ın, doğal mikobakteri infeksiyonu sırasında antikor yanıtını indüklediği bilinmektedir. M. tuberculosis ten saflaştırılan LAM, mikobakteri infeksiyonlarının serolojik tanısında kullanılmıştır. İdrar örneklerinde bulunan tüberküloz basil varlığını ortaya koymak için, LAM ı kantitatif olarak saptayan bir test geliştirilmiştir. Bu, ön deney verilerine göre duyarlılığı %93 ve özgüllüğü %95 olan bir testtir. Pozitif ve negatif öngörü değeri, sırasıyla %48,7 ve %87,4 olarak hesaplanmıştır. İdrarda, anti-lam ELISA testi ile alınan %45,8 pozitifliğin ve %77,9 negatifliğin doğru sonuçlandığı tespit edilmiştir. Tüberkülozun endemik olduğu alanlarda, özellikle akciğer tüberkülozunun diğer belirteçleri ile birlikte olduğunda, anti-lam negatifliğinin pratik önemi vardır. Anti-LAM ELISA testi, yayma sonuçları ile birlikte değerlendirildiğinde, yayma pozitif akciğer tüberkülozlu hastaların %90,6 sında ve yayma negatif olanların %52,5 inde pozitif sonuçlanmıştır. İdrar dışında, akciğer tüberkülozlu hastaların balgam ve serumunda bulunan mikobakteri antijen veya antikorlarını tespit eden, immün blotlama ve immünoassay temelli testler geliştirilmiş ve bu testlerle hızlı tanı konulduğu belirtilmiştir. Bu testlerden biri olan balgamda LAM ı tespit eden test, LAM a karşı farelerde oluşturulan monoklonal antikorların kullanıldığı antikor yakalama yöntemine dayanır. M. tuberculosis e karşı tavşanlarda oluşturulan antikorlar tespit edici kaynak olarak kullanılır. Bu test, balgamda bulunan LAM ın tespitinde, özgül ve duyarlı bir test olup, tüberküloz tanısında oldukça yararlıdır (9). Vücut Sıvılarındaki Antijenlerin Saptanması Antijen saptanması amacıyla sandviç ELISA, inhibisyon ELISA, lateks aglütinasyon ve zıt pasif hemaglütinasyon yöntemine dayanan testler kullanılmıştır. Bu yöntemlerin çoğunda ses dalgaları ile parçalanan mikobakteriler, ekstrakte edilen glikolipitler, PPD, antijen 5 (38 kda), antijen A60, 45/47 kda luk antijenler, antijen Kp90, 30 kda luk antijen, P32 antijeni, kord faktörü (trehaloz imikolat) ve LAM antijen olarak kullanılmaktadır. Antijen olarak kord faktörü kullanılan ELISA testinin, akciğer tüberkülozu tanısında duyarlılığı %66,6-74,1 ve özgüllüğü %95,2-99,0 olarak bulunmuştur. Antijen 5 ve LAM dışında, bu testlerin çoğunda, mikobakteri antijenlerine karşı oluşan poliklonal antikorlar kullanılmaktadır. Testlerin duyarlılığı %40-75 ve özgüllüğü %90-99 arasında değişmektedir (8).

38 Ogün Sezer Faruk Çiftçi Erkan Bozkanat Antikor Saptanmasına Dayalı Tüberküloz Tanı Yöntemleri Tüberkülozlu hastaların serumunda mikobakteri antijenlerine karşı oluşan antikorlar monoklonal veya poliklonal antikorlar kullanılarak saptanır. Çevredeki mikobakterilerle çapraz reaksiyonlar nedeniyle, yanlış pozitif test sonuçları alınabilmektedir. Mikobakteri antijenlerinin saflaştırılması için geliştirilen yöntemler yenidir. Mevcut testlerin birçoğunda, farklı araştırmacılarca farklı sonuçlar alınmıştır. Burada dikkate alınması gereken önemli bir nokta, mikobakteri hastalıklarında ortaya çıkan bağışıklık yanıtlarının, HLA sınıf II allotipleri ile ilişkili olması ve farklı hastalarda aynı antijenlerin tanınmamasıdır. Bu nedenle, antikor bazlı mikobakteri tespit sistemlerinin başarısı sınırlıdır (8). MPB-64 Transdermal Yama Testi MPB-64, M. tuberculosis kompleksine özgü bir antijendir. MPB-64 antijeni, aktif tüberkülozlu hastaları tespit etmek için, transdermal yama testi şeklinde uygulanır. Bu testte, yama uygulanmasından 72 saat sonra pozitif reaksiyon alınır ve bir hafta pozitif kalır. Özgüllüğü %100 ve duyarlılığı %87.8 dir. Tüberkülin testi pozitif olan ve tüberkülozlu olmayan kontrollerde, transdermal MPB-64 yama testi negatiftir. Transdermal MPB-64 yama testi, tedavisi tamamlanan tüberkülozlu hastalarda negatifleşmektedir. Bu nedenle, aktif tüberkülozlu hastaların tanısı dışında, tedavinin izlenmesinde de yararlıdır (10). Çeşitli Hücrelerden Salınan Maddelerin Belirlenmesi Adenozin Deaminaz (ADA) Pürin metabolizmasında işlevi olan bir enzimdir. Özellikle plevra, periton, perikart ve BOS gibi sıvılarda,ve boşluklarda tüberküloz basili bulunduğu zaman ADA düzeyi yüksek çıkabilir. Bu boşluklara ait malignitelerde ADA düzeyi yüksek bulunabilmekle beraber, yükseklik genellikle tüberkülozdaki kadar belirgin değildir. Yapılan çalışmalarda plevral sıvı için duyarlılık %55 90, özgüllük %55 89 olarak saptanmıştır. Lizozim Lizozimin tüberküloz plörezi olgularının plevral sıvısında belirgin bir şekilde arttığı ve bunun da tanıda yararlı olabileceği gösterilmiştir. Ancak ADA ve IFN gama ile karşılaştırıldığında daha düşük tanı değerine sahip olduğu görülmüştür. İnterferon gamma (İFN-γ) üretiminin ölçülmesi Son yıllarda gerek immünoloji gerekse mikrobiyal genetik bilimlerinde kaydedilen gelişmeler, tüberküloz infeksiyonu tanısında yeni tanı yöntemlerinin geliştirilmesini sağ-

BÖLÜM 4 Tüberkülozda Yeni Tanı Yöntemleri 39 lamıştır. BCG suşlarında ve tüberküloz dışı mikobakterilerin çoğunda bulunmayan, bu nedenle M. tuberculosis e özgü sayılan RD1 geni ürünleri olan ESAT-6 ve CFP-10, spesifik-t hücrelerinin belirlenmesinde, tüberküloz tanısında test edilmiştir. Bu testler interferon-gamma (İFN-g) tabanlı testler olup, daha önceden tüberküloza özgü antijenler ile duyarlaşmış T hücrelerinin salgılamış olduğu İFN-γ yanıtının belirlenmesi ilkesi ile çalışmaktadır. Yüksek düzeyde İFN-γ üretimi, tüberküloz infeksiyonu göstergesi olarak kabul edilmiştir. Antijene özgü T hücrelerinin tüberküloz tanısında kullanılmasını esas alan iki ticari test kiti mevcuttur. Bu testler Quantiferon-TB ve T-SPOT.TB testleridir (8,11). Quantiferon-TB Test İlk nesil Quantiferon-TB testi, M. tuberculosis e karşı duyarlaşmış lenfositlerden salgılanan IFN-γ nın belirlenmesi ilkesine dayanmaktadır. Hastadan alınan tam kan örneği PPD ve kontrol antijenler ile 16-24 saat inkübe edilir. Eğer kişi daha önce testte kullanılan antijenlerle karşılaşmışsa mononükleer hücreler İFN-γ salgılar. Süpernatantta daha sonra ELISA yöntemiyle İFN-γ varlığı ve miktarı belirlenir. Tüberküloz deri testi (TDT) ile karşılaştırıldığında okuyucu veya uygulayıcıya bağlı hatalar söz konusu değildir. İnterferona dayalı testler içinde FDA (ABD Gıda ve İlaç Dairesi) onayını ilk alan testtir. CDC (Centers for Disease Control and Prevention; ABD Hastalık Kontrol Merkezi) tarafından yapılan çok merkezli bir çalışmada, Quantiferon ile TDT arasında orta derecede uyum saptanmıştır. Bu testlerin kullanılmasında bazı kısıtlamalar söz konusudur. Daha önceden BCG aşısı yapılmış olması, tüberküloz dışı mikobakteriler ile karşılaşılması ve önceden TDT pozitif olunması, testin yalancı pozitifliğine neden olur (14). Quantiferon-TB Gold Testi (QFT-Gold) İkinci nesil Quantiferon-TB testi olup antijen olarak PPD yerine ESAT-6 ve CFP10 antijenini kullanmaktadır. Bu testte tüberküloza özgü antijenlere karşı oluşan İFN-γ yanıtının in vitro belirlenmesi esastır. İki basamaklı bir testtir. İlk olarak heparinize tam kan ESAT-6, CFP-10, mitojen veya negatif kontrol antijenler ile inkübe edilir. On altı-yirmi dört saat inkübasyon döneminden sonra serum ayrıştırılır ve süpernatantta ELISA yöntemiyle IFN-γ düzeyi belirlenir. Test sonuçları uluslararası birim olarak verilir. Mitojen ile uyarılan plazma örneği test edilen her bireyde pozitif kontrol olarak alınır. FDA bu testin tüberküloz hastalığı veya latent tüberküloz infeksiyonu düşünülen durumlarda in vitro tanısal test olarak kullanılmasına onay vermiştir. QFT-Gold testinin tüberküloz hastalığının gelişmesindeki pozitif veya negatif tanısal tahmin değeri belirlenebilmiş değildir. Bununla birlikte bu test tüberkülin deri testinde olduğu gibi latent infeksiyon ile aktif hastalık arasında ayırım yapamaz. Bu yüzden pozitif sonuç elde edildiğinde latent tüberküloz infeksiyonu tanısı konulabilmesi için klinik ve radyolojik olarak aktif hastalığın olmadığının gösterilmesi gerekmektedir. Diğer benzer testlerde de olduğu gibi, bu testin tanısal değeri incelemenin yapıldığı popülasyondaki tüberküloz hastalığı prevalansı ile ilişkilidir. Bu yüzden bu testin sonucu yorumlanırken

40 Ogün Sezer Faruk Çiftçi Erkan Bozkanat epidemiyolojik, fiziksel ve diğer tanısal bulguların göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Negatif tüberkülin deri testi ve negatif QFT-Gold testi tüberküloz hastalığı belirti ve bulguları olan bireyde tüberküloz tanısını ekarte ettirmez. Bu testin performansı bağışıklık sisteminin baskılandığı veya bozulduğu AİDS hastalarında, immünosupressif tedavi alan hastalarda, yüksek doz steroid tedavisi alanlarda, anti-tnf-α tedavisi alanlarda, hematolojik veya diğer solid organ kanseri olanlarda, diyabetlilerde, kronik böbrek yetmezliği olan hastalarda detaylı olarak çalışılmamıştır. Sözü edilen bu durumların hepsinde tüberkülin deri testinin duyarlılığı düşmektedir. Bu durumlarda IFN-γ üretiminde de düşüklük olabileceği göz önüne alındığında, tek başına negatif QFT-Gold testinin tüberküloz infeksiyonunu dışlamayacağı ortaya çıkmaktadır. QFT-Gold testi tüberkülin deri testinin kullanıldığı her klinik durumda kullanılabilir. Temaslı taraması, sağlık çalışanlarının tüberküloz infeksiyonu açısından taranması, göçmenlerde tüberküloz infeksiyonunun aranması ve seri olarak tüberküloz infeksiyonunun araştırılmasında tüberkülin deri testinin yerine kullanılabilir. Pozitif QFT-Gold testi tıpkı pozitif tüberkülin deri testi gibi değerlendirilmelidir (14). T-SPOT.TB Testi Son yıllarda özgün mikobakteriyel antijenlerle uyarılan T hücrelerinin salgıladıkları IFN-γ yanıtlarının belirlenmesi ilkesiyle çalışan bazı deneysel tanı yöntemleri kullanılmaya başlanmıştır. Bunlardan biri olan ELISPOT testi, kişinin periferik mononükleer hücrelerinin in vitro şartlarda bu antijenlerle uyarılıp daha sonra oluşan IFN-γ yanıtının çift sandviç ELISA yöntemiyle belirlenmesi ilkesine dayanmaktadır (11,14). Nükleik Asit Hibridizasyon Yöntemleri Mikobakterilerin kromozamal DNA veya ribozomal RNA larının, bunlara özgül olarak bağlanabilen DNA veya RNA probları yardımı ile, tür düzeyinde belirlenmesi mümkündür. Bu yöntemlerin özgüllüklerinin yüksek olmasına karşılık duyarlılıkları düşüktür. Prob olarak kullanılan moleküllerin örneğe yeterince bağlanabilmesi için örnekte önemli miktarda nükleik asit bulunmalıdır. Problar sadece kültürde üremekte olan mikobakterilerin erken saptanması ve tiplendirilmesi için kullanılmaktadır. Yöntemin duyarlılığını artırmak için dallanan DNA sinyal artırma sistemi adı verilen yeni bir teknik üzerinde çalışılmaktadır (1). Nükleik Asit Çoğaltma Yöntemleri İnfeksiyon etkenlerinin klasik yöntemlerle saptanamayacak kadar az olduğu durumlarda, belirlenmek istenen etkende bulunan bir nükleik asit dizisi, saptanması

BÖLÜM 4 Tüberkülozda Yeni Tanı Yöntemleri 41 mümkün olan düzeye ulaşana kadar çoğaltılır. Bu yöntemlerden polimeraz zincirleme tepkimesi (polymerase chain reaction; PCR), zincir ayırma çoğaltması (strand displacement amlification; SDA), transkripsiyona bağlı çoğaltma (transcription mediated amplification; TMA), ligaz zincirleme tepkimesi (ligase chain reaction; LCR) tüberküloz tanısında kullanılmaya başlanmıştır (1). PCR Mullis ve arkadaşları tarafından geliştirilen yöntem, mikroskop ve kültür yöntemleriyle saptanması zor veya olanaksız olan tüberküloz tanısında en fazla kullanılan yöntemlerden biridir (12). Bu yöntemde çoğaltılması istenen DNA örneği, DNA replikasyonu için gereken maddelerle birlikte, üç farklı sıcaklıktaki bir döngü (siklus) içinde tutulur. İlk basamak denatürasyondur. DNA nın iki zinciri 94-95 C ye kadar ısıtılarak ayrılır. İkinci basamak bağlanmadır (annealing). Ortamdaki DNA polimeraz, DNA ya bağlanıp replikasyonu başlatabilmesi için primer adı verilen oligonükleotide ihtiyaç duyar. Ortama konmuş ve sadece çoğaltılmak istenen DNA dizisini özgül olarak tanıyan iki primer, sıcaklığın (55-70 C ye) düşürülmesiyle, birbirlerinden ilk basamakta ayrılmış olan kalıp DNA tek zincirlerine bağlanır. Üçüncü basamak primerlerin uzamasıdır. Ortama konmuş ve optimum çalışma sıcaklığı 72 C olan Termus aquaticus (Taq) polimerazı (ya da ısıya dayanıklı başka polimerazlar) bu sıcaklıkta primerlerden başlayarak DNA sentezi yapar. Bu üç basamak bir döngüyü oluşturur ve her tekrarlanışında iki primer arasında kalan özgül DNA parçası çoğaltılarak iki katına çıkarılmış olur. Yeni sentezlenen DNA da bir sonraki döngüde kalıp olarak kullanılır ve bu DNA parçaları geometrik olarak artar (1,13). SDA SDA yöntemi PCR ye benzeyen, izotermal bir amplifikasyon yöntemidir. Yöntemin özgüllüğü, aranan etkene özgü DNA dizilerini tanıyacak primerlerin kullanılmasına bağlıdır. On basil/ml den az mikobakteri tanı için yeterlidir. Yöntemin özgüllüğü yine sadece aranan etkene özgü DNA dizilerini tanıyacak primerlerin kullanılmasına bağlıdır (1,13). TMA TMA da SDA gibi izotermal bir amplifikasyon yöntemidir. Bu yöntemde çoğaltılan hedef nükleik asit ribozamal RNA dır. Bir mikobakteri içinde 2000 in üzerinde rrna bulunur. Bu nedenle, 1 basil/ml olması tanı için yeterlidir. Testin duyarlılığı yüksektir. Tüm işlemin tek bir tüpte gerçekleşmesi kontaminasyon riskini azaltır. Hedef rrna olduğu ve RNA dış ortamda DNA dan daha labil olduğu için, çapraz kontaminasyon riski de azdır. Yalancı negatiflik ve pozitiflik oranı PCR den düşüktür (1,13).

42 Ogün Sezer Faruk Çiftçi Erkan Bozkanat LCR LCR, iki küçük DNA primeri ve onları birleştiren termostabil ligaz enzimi kullanarak, DNA kopyalarını hızla oluşturmak için geliştirilmiş bir sistemdir. Bu işlemin sikluslar şeklinde tekrarlanmasıyla her siklusta yeni hedef DNA lar elde edilmiş olur. PCR ye göre daha özgüldür ve otomatik saptama sistemi vardır. Kontaminasyon kontrol sisteminin bulunmayışı dezavantajıdır. LCR ile örnekte 7-8 bakteri/ml bulunması pozitif sonuç almak için yeterlidir (1,13). KAYNAKLAR 1. Kocagöz T. İnfeksiyon hastalıklarının laboratuvar tanısında moleküler yöntemler. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Yayını P: 2000;189-95. 2. Adekambi T, Colson P, Drancourt M. RpoB-based identification of nonpigmented and late pigmenting rapidly growing mycobacteria. J Clin Microbiol 2003;41:5699-708. 3. Somoskovi A, Ködmön C, Lantos A, Partfai Z, Tamasi L, Füzy J, Magyar P. Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated Bactec MGIT 960 system, the Bactec 460 TB system and Löwenstein-Jensen medium. J Clin Microbiol 2000;38:2395-7. 4. Drobniewski FA, Caws M, Gibson A, Young D. Modern laboratory diagnosis of tuberculosis. The Lancet Infect Dis 2003;3:141-7. 5. Benjamin WH, Waites KB, Moser SA. The MB/Bac T is a sensitive method of isolating Mycobacterium tuberculosis from clinical specimens in a laboratory with a low rate of isolation. J Clin Microbiol 2000;38:3133-4. 6. Uzun M. Örneklerin işlenmesi ve kültür yöntemleri. 21. yüzyılda tüberküloz sempozyumu ve II. tüberküloz tanı yöntemleri kursu kongre kitabı. 2003;S:285-90. 7. Huang TS, Chen CS, Lee SS, Huang WK, Liu YC. Comparasion of the Bactec MGIT 960 and Bactec 460 TB systems for detection of mycobacteria in clinical specimens. Ann Clin Lab Sci 2001;3:279-83. 8. Özerol Hİ. Tüberkülozun serolojik tanısı. 21. yüzyılda tüberküloz sempozyumu ve II. tüberküloz tanı yöntemleri kursu kongre kitabı. 2003;S:411-27. 9. Hamasur B, Bruchfeld J, Haile M, et al. Rapid diagnosis of tuberculosis by detection of mycobacterial lipoarabinomannon in urine. J Microbiol Methods 2001;45:41-52. 10. Nakamura RM, Einck L, Velmonte MA, et al. Detection of active tuberculosis by an MPB-64 transdermal patch: a field study. Scand J Infect Dis 2001;33:405-7. 11. Ewer K, Deeks J, Alvarez L, et al. Comparasion of T cell based assay with tuberculin skin test for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection in a school tuberculosis outbreak. Lancet 2003;361:1168-73. 12. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via polymerase catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 1987;155:335. 13. Saniç A, Eroğlu C.Tüberküloz tanısında PCR Tüberkülozun serolojik tanısı. 21. yüzyılda tüberküloz sempozyumu ve II. tüberküloz tanı yöntemleri kursu kongre kitabı 2003;S:311-6. 14. Soysal A, Bakır M. Tüberküloz infeksiyonunda yeni tanı yöntemleri. Çocuk Enfeksiyonları Dergisi 2007;1:151-7.