Kullanım Talimatları SAS-3 Alkaline-Hb Katalog No: 300900
KULLANIM AMACI SAS-3 Alkalin Hb kit agaroz jel elekroforez ile insan hemoglobinlerini ayırmak için tasarlanmıştır. Baş fonksiyonlara sahip bir protein grubu olan hemoglobinler (Hb) ters yönde karaciğerde karbon dioksit ve dokudan oksijen taşımaktadır. Hemoglobinler peptit zincirlerleri oluşturur ve buna globin ve demir protoporfirin Heam denir. Dört polipeptit zincirlerin her biri spesifik bir amino asit sırası oluşturur. Her normal hemoglobin molekülü alfa olmayan bir zincir çifti ve bir alfa zinciri çifti içerir. Normal yetişkin hemoglobininde (HbA), alfa olmayan zincirlere beta denir. Fetal hemoglobinin alfa olmayan zincirine gama denir. Minör (% 3) bir hemoglobin fraksiyonuna HbA 2 denir ve bu alfa ve delta zincirleri içerir. Diğer iki zincir embriyo içinde oluşur. Normal yetişkin eritrositleri içinde majör hemoglobin HbA dir ve eritrosit içinde HbA2 ve Hbf küçük miktarlarda bulunmaktadır. Ayrıca, günümüzde 400'den fazla mutant hemoglobin bilinir özellikle diğer anormal hemoglobin ile kombinasyonunda veya homozigot durumunda bazı hemoglobinler ciddi klinik etkilere neden olabilir. Wintrobe1 de hemoglobin sentezinin anormallikleri üç grupta ayrılır. 1. Anormal protein molekülünün üretimi (orak hücreli anemi gibi). 2. Normal protein sentezinin miktarında azalma (e.g. thalassaemia). 3. Gelişimsel anormallikler (hereditary persistence of foetal haemoglobin (HPFH) gibi ). En sık rastlanan iki mutant hemoglobin HbS ve HbC dir. Hb Lepore, HbE, HbGPhiladelphia, HbD-Los Angeles ve HbO-Arap genellikle daha az görülebilir 2. Elektroforez genellikle hemoglobinopatiyi tanımlamak ve ayırmak için kullanılan en iyi yöntem olarak kabul edilir. Hemoglobin elektroforezin protokolu iki sistemin adım adım kullanımını içerir 3-8. İlk elektroforez alkali tampon ile yapılmaktadır. Ancak, birçok yapısal olarak farklı haemoglobinin elektroforetik benzerliği nedeniyle, değerlendirme elektrik yükü dışında bir özellikle ölçülen asit tampon elektroforez ile desteklenmelidir. Bu yöntem, bir alkalin elektroforetik tampon ve agaroz desteği ile hemoglobinin kompleks etkileşimine dayalıdır. SAS-3 Alkalin Hb prosedürü çeşitli diğer anormal hemoglobinlerin yanı sıra HbS, HbC ve HbF varlığında tamamlayıcı ispatını (Asit Hb analizinden gelen sonuçları ile birlikte) sağlamak için hemolizatin miktarını gerektiren basit bir prosedür. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kılavuzuna başvurun. BİLEŞENLER 1. SAS-3 Alkalin Hb Jel (x10) Koruyucu olarak sodyum azid ile bir Tris/ EDTA / Glisin tamponlu agaroz içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 1
2. Konsantre Mavi Asit Boya (1x75ml) Konsantre mavi asit boya içerir. Şişe içeriği 700ml saf su ile dilüe edilir. Kullanım öncesi karıştırılır ve filtre edilir. İyi kapatılmış bir şişede saklanır. 3. Hemoglobin Lysing Agent (1x50ml) Koruyucu olarak potasyum siyanür, ve tiyomersal ile saf suda Triton X-100 içerir. Paket içindeki Lysing Agent kullanım için hazırdır. 4. Konsantre Boya Arındırıcı Solüsyon (3x100ml) Konsantre boya arındırıcı solüsyon içerir. Şişe içeriği 5 litre saf su ile dilüe edilir. Kapağı sıkıca kapatılarak saklanır. 5. Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım talimatları ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda kurutma kağıdı C içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1. SAS-3 Alkalin Hb Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulmasını belirtebilir,1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3)bakteriyal yada fungal kaynaklı agarozun görülür kontaminasyonunu belirtir. 2. Mavi Asit Boya Konsantre boya 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solüsyonu 15-30 derecede 6 ay stabildir. Boya kapasitesinin azalmasını önlemek için derhal kullanılan boyanın çıkarılması tavsiye edilir. Zayıf boyama performansı, boya solüsyonunun bozulduğunun göstergesidir. 3.Hemoglobin Lysing Agent Lysing Agent 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Partikül kirlenme veya bulanıklık bozulma göstergesidir. 4.Boya Arındırıcı Solüsyon Konsantre boya arındırıcı solüsyon 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilünent edilmiş arındırıcı solüsyon 15-30 derecede 6 ay stabildir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Kat. No. 310200 Numune Aplikatör Ucu (1 x 10) Kat. No. 310300 Numune Aplikatör Ucu (5 x 10) Kat. No. 210100 Tek kullanımlık numune kapları (100) Kat. No. 310907 SAS-3 100 Örnek tepsisi Kat. No. 5331 AFSC Hemo Kontrol Kat. No. 5330 AFSA2 Hemo Kontrol Kat. No. 5329 ASA2 Hemo Kontrol 2
Kat. No. 5328 AA2 Hemo Kontrol Kat. No. 3100 REP Prep Saline solution (0.85% NaCI) NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanmış EDTA ya da heparin antikoagulant edilmiş kandır. Numuneler 1 haftaya kadar 2-6 derecede buzdolabında saklanabilir. Optimal sonuçlar için, salinle yıkanan kırmızı hücreler lizin hazırlamak için kullanılır. Bu plazma proteinlerinin olası girişimini engeller. a) 1000μL saline solüsyonu ile iyi karışmış 200μL tam kanı karıştırın. b) Kırmızı hücrelerin sedimenti için santrifüjleyin. c) 1000μL süzüntü ve atığı uzaklaştırın. d) İlaveten 1000μL saline solüsyonu ekleyin ve iyice karıştırın. e) b-d x2 adımları tekrar edin. f)son santrifüjün ardından 1000μL süzüntüyü uzaklaştırın ve tam kan gibi kalan numuneyi çalışın veya tüm süzüntüyü uzaklaştırın ve yıkanan paketlenmiş hücreler gibi kalan numuneyi işleyin. SAS-3 Hemoglobin Lysing Agent ile 2.5-3.5 g/dl hemoglobin konsantrasyonu için her bir hasta örnek/kontrolü dilüe edin. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Cihaza aşağıdaki parametreleri programlayın: Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık(derece) Voltaj Diğer Elektroforez Numune Yükleme 00:10 21 Hız 1 Numune Uygulama 00:10 21 Hız 1* Elektroforez 30:00 18 450 Kurutma 08:00 62 * SPIFE 3000 / SAS-3 için pozisyon 1 kullanılır. Boyayıcı Boyama 04:00 Dolaşım AÇIK Boya arındırma 01:00 Dolaşım AÇIK Kurutma 15:00 70 Boya arındırma 01:00 Dolaşım AÇIK Boya arındırma 01:00 Dolaşım AÇIK Boya arındırma 01:00 Dolaşım AÇIK Kurutma 12:00 63 2. Aplikatör ucunu cihaz üzerindeki pozisyonuna yerleştirin: 3
* SAS-3 100 örnek tepsisi (310907) 3. i) SPIFE Kombo Kullanıcıları: Numune bazının uygun kuyusu içine 17μl numune pipetleyin. Buharlaşmadan numuneleri koruyun. ii) SPIFE 2000 / 3000 / SAS-3 Kullanıcıları: Tek kullanımlık uygun numune kaplarına 35μl numune pipetleyin. Buharlaşmadan numuneleri koruyun. 4. Jeli paketinden çıkarın ve kaplamasını atın. 5. 2ml REP Prep i bölmenin sol tarafına boşaltın ve dikkatlice bölme içine jeli koyun, bölme içinde iğneler ile jel bağlarındaki delikleri hizalayın ve jelin altında kabarcık oluşturmamaya dikkat edin. Elektrot kollarına elektrotlar eklenir böylece jel blokları ile temasa ederler. 6. Jelin yüzeyi kurutma kağıdı C ile kurutulur, kurutma kağıdı alınır. 7. Alkaline-Hb test programını seçin ve uyarıları izleyin, numuneleri uygulayın, elektroforezi yapın ve jeli inkübe edin. 8. Elektroforezi takiben, elektrotları alın ve Gel Block Remover kullanarak her iki jelin kurutucusunu alın. 9. Boyama kabı jel tutucusuna jel tutturulur. 10. Boyama ünitesinde Alkaline-Hb test programı seçilir ve izleyen uyarılar, Boyama, Boya arındırma ve jel kurutmadır. 11. Boyama döngüsünün sonunda, boyama alanından jeli alın. Jel şimdi incelenmek için hazırdır. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Kalitatif Değerlendirme: Numunelerde bulunan hemoglobin tiplerinin olası kimliği tamamlanmış jelin görünür değerlendirmesi ile tespit edilebilir. Hemo kontrolleri bant tanımlanması için bir markır sağlar. Kantitatif Değerlendirme: Jel üzerinde her hemoglobin tipinin relative yüzdesi 595nm de ölçülen tamamlanmış jelin dansimetre ile tespit edilebilir. Şekil 1 en sık rastlanan hemoglobin türlerinin mümkün kimliğini gösterir. 4
Hemoglobin değişkenleri klinik semptomlarla ayırt edilmezler bundan dolayı araştırmacıların öncelikli ilgisini çekmezler. Değişken varlığı Talasemi sendromlar, yaşam boyu siyanoz, hemolitik anemi veya eritrositler veya orak bozukluğuna neden olduğunda veya eğer heterozigot genetik olarak yeterli yaygınlığa sahipse klinik olarak önemlidir. HbS-S, HbS-D-Los Angeles, ve HbS-O Arab ın kombinasyonları ciddi orak bozukluklara neden olurlar. HbH, E-Fort Worth ve Lepore dahil olan çeşitli değişkenler talasemik bir kan resmine neden olur. 2 Patoloji ve frekans açısından en önemli iki değişken hemoglobin Hbs ve HbC2 dir. Orak hücreli anemi (HbSS) acı verici ve ölümcül bir hastalıktır. Yaklaşık olarak 5-6 ayın ilk aylarında ortaya çıkar. Klinik seyri vücudun neredeyse tüm organlarında enfarktüs, halsizlik, letarji ve anemi ile sıcaklık artışı ve ağrı olması ile kendini gösterir. Homozigot HbCC tek tek eritrosit içinde HbC in kristalleşmesi ya da çökelmesine neden olan hafif hemolitik anemiye maruz kalır. HbSC hastalık vakalarında orak-hücreli anemi daha hafif bir hemolitik anemi ile karakterize edilmektedir. Diğer zincirler normal olarak sentezlenirken globin(α veya β) zincirinin azalmış sentezinden dolayı hipokromi ve mikrositoz tarafından hemoglobin bozuklukları talasamiaları karakterize edilir. 9, 10 Kararsız globin zincirleri bu dengesiz sentezin sonuçlarıdır. Kırmızı hücre içinde bu çökelme, hücrenin kısa ömürlü organlarının dahili ile oluşturur. Hücrenin ömrünü kısaltan inklüzyon cisimcik formunda kırmızı hücre içinde çökerler. α- talasemi de α zincirleri azalır yada oluşmaz ve β-talasemi de β zincirleri etkilenir. Hemoglobin sentezinin başka kantitatif bozukluğu, kalıtsal persistan fetal hemoglobini (HPFH), doğumdan sonra yaklaşık dört ayda gama zinciri sentezinin bitmesi ile oluşan mekanizmaların genetik bir hatasını gösterir ve HbF in yüzdesinin artmasına neden olur. HPFH için homozigot normal gelişime sahiptir, asemptomatiktir ve anemiye sahip değildir. En sık hemoglobin anormallikleri: Orak Hücre özelliği HbA 2 in normal bir miktarını ve HbA ve HbS gösteren bir heterozigot durumdur. Sitrat agarda sonuçlar HbA ve HBS göçmen pozisyonlarındaki (bölge) hemoglobinleri gösterir. Orak Hücre Anemi Ancak HbF in küçük bir miktarında var olmasına rağmen, bu bir homozigot durumdur ve neredeyse sadece HbS gösterir. Orak-C Hastalığı Bu bir heterozigot durumudur, HbS ve HbC gösterir. Orak Hücre -Talasemi Hastalığı Bu durum HbA, HbF, HbS ve HbA 2 gösterir. Orak Hücre β o -talasemi HbA içinde yoktur. Orak Hücre β + -talasemi HbA içinde azaltılmış miktarda bulunur. Talasemi-C Hastalığı Bu durum HbA, HbF ve HbC gösterir. C Hastalığı Bu homozigot durumdur ve neredeyse sadece HbC gösterir. 5
Talasemi Major Bu durum Hbf, HbA ve HbA 2 gösterir. SINIRLAMALAR Bazı anormal hemoglobinler benzer elektroforetik mobilite ve diğer metodolojiler tarafından farklı olmalıdır. Testler için gerekli olanlar: 1. Asit Hb elektroforez tespit edilmiş anormal hemoglobinlerin onaylanması için bir test takibini gerektirir. 2. Globin zincir analizi (hem asit ve hem de alkali) ve yapısal çalışmalar nadiren bazı hemoglobinleri olumlu olarak tanımlamak için gerekli olabilir. 3.Anyon değişimli kolon kromatografisi HbA 2 miktarının belirlenmesi için en doğru yöntemdir. HbS in varlığında HbA 2 in kantitasyonu için Helena Biyoteknoloji Orak-Thal Quik Sütun Yöntemi (Kat. No 5334) veya Helena Biyoteknoloji Beta-Thal HbA 2 Quik Sütun Prosedürü (Kat. No 5341) tavsiye edilir. HbA 2 kantitasyonu, b-talasemi özelliğinin teşhisinde en önemli tanısal testlerden biridir. 4.HbF (1-10%) in düşük seviyesi Helena Biyoteknoloji HbF-QuiPlate prosedürü (Kat. No 9.325) kullanarak radyal immunodiffuzyon tarafından doğru şekilde miktarı belirlenebilir. REFERANS DEĞERLERİ Doğumda, normal bir bireyin eritrositinde hemoglobin çoğunlukla fetal hemoglobindir, HbF. Çoğu yetişkin hemoglobinlerin bazıları, HbA ve HbA2 in küçük bir miktarı da bulunur. Ergenlikte ve bir yaşın sonunda çoğunlukla hemoglobin % 2 HbF den daha az ve 3.7% HbA 2 kadar olan HbA bulunur. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Tekrarlanabilirlik Doğrusallık Yöntemin doğrusallığı, jel performansı gibi densitometre özelliğinin bir fonksiyonudur. Her müşteriye tavsiye edilen laboratuarda kullanılan densitometreye bağlı yöntemin doğrusallığının belirlenmesidir. 6
BİBLİYOGRAFİ 1. Wintrobe, Maxwell M., Clinical Hematology, 6th Edition, Lea and Febiger, Philadelphia, 1967. pages 145-167. 2. Fairbanks, V.F., The Nomenclature and Taxonomy of Hemoglobin Variants, Diagnostic Medicine, Nov/Dec., 53-58, 1980. 3. Schneider, R.G., Hightower, B.J. and Barwick, R.C., Laboratory Identification of the Hemoglobins, Lab Management, 1981; August: 29-43. 4. Center for Disease Control, Laboratory Methods for Detecting Hemoglobinopathies, U.S. Department of Health and Human Services/Public Health Service, 1984. 5. Schneider, R.G., Methods for Detection of Hemoglobin Variants and Hemoglobinopathies in the Routine Clinical Laboratory, CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, 1978. 6. Schneider, R.G., Hightower, B., Hosty, T.S., Ryder, H., Tomlin, G., Atkins, R., Brimhall, B., and Jones, R.T., Abnormal Hemoglobins in a Quarter Million People, Blood, 1976; 48(5) : 629 637. 7. Huisman, T.H.J. and Schroeder, W.A., New Aspects of the Structure, Function and Synthesis of Hemoglobins. CRC Press, Cleveland, 1971. 8. Schmidt, R.M., Huisman, T.H.J.,and Lehmann, H., The Detection of Hemoglobinopathies. CRC Press, Cleveland, 1974. 9. Weatherall, D.J. and Clegg, J.B., The Thalassemia Syndromes, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1972. 10. Lehman, H. and Huntsman, R.G., Man s Haemoglobins, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1974. 7