1.2 Besiyerlerinin Hazırlanması Besiyerleri ticari dehidre frmülasynlardan hazırlandığında üreticinin talimatları tam larak takip edilmelidir. Miktar/hacim, hazırlama tarihi, ph, sterilizasyn şartları ve peratör gibi tüm ilgili veriler kayıt altına alınmalıdır. 1.2.1 Saf Su Besiyeri hazırlamak için kullanılan saf su mikrrganizmaların gelişmesini etkilemesi veya inhibe etmesi muhtemel maddeler (Ör., ağır metaller) içermeyen distile (damıtık) su veya eşdeğeri lmalıdır. Saf su distilasyn (damıtma), deiynizasyn (demineralizasyn) ve ters zms gibi yöntemler ile elde edilebilir. Deiynizasyn yöntemi ile elde edilmiş saf suya deiynize (demineralize) su adı verilir. Saflık düzeyini arttırmak amacı ile iki kere distile edilen saf suya ise bidistile su adı verilmektedir. Distile su klrlanmış sudan hazırlandı ise distilasyndan önce klr nötralize edilmelidir. Nötralizasyn için eşdeğer miktarda Sdyum tiysülfat veya Sdyum sülfit kullanılabilir. Besiyeri hazırlamak için kullanılacak saf suyun elektriksel iletkenliği 25 C da 25 µs/cm (Elektrik direnci larak 0,4 MΩ) den yüksek lmamalıdır. Saf su kullanılmadan önce muhafaza edilecek ise veya iyn değiştirme yöntemi ile üretildi ise mikrbiyljik kntaminasyn kntrlü yapılmalıdır. Besiyeri hazırlamak için kullanılan saf suyun tplam klni sayısı (ISO 6222 ye göre 22 C da 72 saat inkübasyn snunda) 1000 kb/ml yi aşmamalıdır. İdeal larak tplam klni sayısı 100 kb/ml nin altında lmalıdır. EA tarafından yayınlanan rehber dkümana (EA 04/10) göre mikrbiylji labratuvarlarında saf suyun iletkenliğinin haftalık larak mikrbiyljik kalitesinin ise aylık larak kntrl edilmesi tavsiye edilmiştir. Yine aynı rehber dkümana göre distilasyn sistemleri üç ayda bir temizlemelidir. Saf su tercihen dğal cam gibi inert materyalden imal edilmiş ağzı kapalı kaplarda ve alg gelişimi engellemek için dğrudan güneş ışığına maruz bırakılmadan muhafaza edilmelidir. Muhafaza edilen saf suyun havadaki CO 2 i absrbe etmesi nedeni ile ph sının düşebileceği unutulmamalıdır. Bu nedenle muhafaza edilen saf suyun ph sı kntrl edilmelidir. Besiyeri hazırlamak için kullanılacak saf suyun ph sı 5,0-7,5 arasında lmalıdır. 1.2.2 Tartım, Sulandırma ve Çözündürme Gerekli miktarda dehidre besiyeri 0,1 g dğrulukta tartılmalıdır. Bazı frmülasynlar deri ve gözü tahriş edici bileşenler içerebildiklerinden dlayı tartım esnasında maske ve gözlük kullanılmalıdır. Dehidre besiyerinin çözündürülmesi için Brsilikat camdan imal edilmiş cam kaplar kullanılmalıdır. Sdalı cam kapların içindeki slüsynun ph sını yükseltebileceği unutulmamalıdır. Su ve dehidre besiyerinin çk hızlı karıştırılması tpaklanmaya neden labilir. Bunu önlemek için önce gerekli hacmin 1/3 ü kadar su sürekli çalkalayarak kaba ilave edilebilir. Kullanılan su dehidre besiyerine ilave edilmeden önce kesinlikle ısıtılmamalıdır. Agar içeren besiyerlerinin çözündürülmesi için su banysunda ısıtılmaları gerekmektedir. Besiyerleri çözündürme amacı ile hızlı ısıtılmalı ve hızlı sğutulmalıdır. Besiyerleri ısıtılırken aralıklarla çalkalanmalıdır ve kaynamaya başladıklarında su banysundan çıkartılmalıdırlar. Düşük randa agar içeren besiyerleri ısıtıldıklarında köpürebilirler ve taşabilirler. Bunu önlemek için ısıtılırken sık çalkalanmalıdırlar. Besiyerlerinin sterilizasyn için cam tüplere veya kaplara taksim edilmeden önce berrak ve iyi karışmış bir slüsyn haline geldiklerine emin lunmalıdır. Su banysuna alternatif larak ısıtıcılı manyetik karıştırıcı kullanılabilir. Otklav esnasında besiyerlerinin ph sında genellikle bir miktar (0,1-0,2 birim) azalma lmaktadır. Aksi belirtilmediği sürece besiyerlerinin sterilizasyn snrasında ölçülen ph değerinin istenen ph değerinden en fazla ±0,2 birim farklı lması beklenir. ph tklav öncesi veya tklav snrası ölçülebilir. ph ölçümü besiyeri 25 C ye sğutulduktan snra gerçekleştirilmelidir. Çk yüksek lmamak kşulu ile ph ölçümü daha yüksek sıcaklıklarda (Ör., 45 C) yapıldı ise snuçlara sıcaklık düzeltmesi yapılmalıdır. Sıvı besiyerlerinin ph sının ölçülmesi için bir miktar besiyeri bir erlenmayere alınmalıdır ve manyetik karıştırıcıda bir süre karıştırıldıktan snra ph ölçülmelidir. Agarlı besiyerlerinin ph sının ölçülmesi için bir miktar besiyeri uygun sıcaklığa kadar sğutulur. Katılaşmış besiyeri küçük parçalar halinde bir test tüpüne, tüpün yarısını dlduracak şekilde aktarılır ve üzerine 3 ml distile su ilave edilir ve 5 d bekletildikten snra besiyerinin ph sı ölçülür. Ticari dehidre frmülasynlardan besiyerlerinin hazırlanmasında uygun nitelikte saf su kullanıldığı takdirde ph ayarlamasına gerek kalmayacaktır. Otklav öncesi ph ayarlaması gerektiğinde 1 N HCl veya 1 N NaOH slüsynları kullanılmalıdır. Bazı kaynaklara göre ph farkının 0,5 birimin altında lması durumunda tklav snrası ph ayarlaması yapılabilir. Şayet tklav snrası ölçülen ve beklenen ph değerleri arasındaki fark 1
0,5 birimden fazla ise besiyeri kullanılmamalıdır. Otklav snrası ph ayarlaması için filtrasyn ile steril edilmiş 0,1 N NaOH veya 0,1 N HCl slüsynları ve steril pipetler kullanılmalıdır. ph ölçümü yapılan kaptaki besiyerinin hacmi ve ph sının ayarlanması için gerekli lan asit veya alkali slüsynu miktarı ile tüm besiyeri hacmi için gerekli asit veya alkali slüsynu miktarı belirlenebilir. Sterilizasyndan önce sn aşama besiyerlerinin tüp veya daha küçük hacimde kaplara taksim edilmeleridir. Sterilizasyn için kullanılacak kabın hacmi besiyeri hacminin 1,2 ile 3 katı arasında lmalıdır. Otklav ile sterilizasyn esnasında su kaybına bağlı larak besiyeri hacminde bir miktar azalma lacaktır. Hacimdeki bu azalma özellikle kantitatif analizlerde başlangıç süspansiynunun (90 ml veya 225 ml) veya ileri dilüsynların (9 ml) hazırlanması için kullanılacak dilüentler için önemlidir. Dilüentlerin tklav snrası hacim kaybı kntrl edilmelidir. Dilüent hacimlerinde tklav snrası azalma %5 in altında lmalıdır. Diluentlerin tklav ile sterilizasyndan kaynaklanacak kayıp kadar fazla hacimde (Ör., 9 ml yerine 9,2 ml) taksim edilmeleri önerilebilir. Besiyerleri taksim edilmelerinin ardından 2 saat içinde steril edilmelidirler. Otklav ile sterilizasyn öncesinde vida kapaklı tüp ve şişelerin kapakları gevşetilmelidir ve kntaminasynu önlemek için tklav snrası tekrar sıkıştırılmalıdırlar. 1.2.3 Sterilizasyn Besiyerlerinin ve ayıraçların sterilizasynu basınçlı buhar sterilizasynu (Otklav) ve filtrasyn ile gerçekleştirilebilir. Gram negatif bakterilerin sayımı veya izlasynu için kullanılan bazı besiyerleri yalnızca kaynatılarak kullanılmaktadır. Kaynatma ile tüm Gram negatif bakteriler ve spr luşturmayan Gram pzitif bakteriler yk edilir. Isıya dayanıklı spr luşturan Gram pzitif bakterilerin gelişmesi ise besiyerinin seçiciliği ile engellenir. 1.2.3.1 Otklav ile Sterilizasyn Otklavlar yüksek basınç ile su buharının daha yüksek sıcaklığa ulaşabilmesini sağlayan cihazlardır. Suyu kaynatmak için gerekli ısı aynı hacimdeki suyu buhar haline getirmek için gerekli ısıdan 7 kat azdır. Otklavın etkinliği su buharının bu yüksek ısı kapasitesi ile açıklanabilir. Otklav kelimesi Aut ve Clavis (Latince; anahtar) kelimelerinden gelmektedir. Basınç arttığı zaman cihazın kapağının tmatik larak kilitlenmesinden dlayı bu isim verilmiştir. İdeal larak tklavın sterilizasyn sıcaklığını ±3 C içinde kruyabilmesi gerekmektedir. Otklav ile sterilizasynda yaygın larak kullanılan sıcaklık ve zaman kmbinasynu 121 C (15 psi) ve 15 dakikadır. Büyük hacimdeki besiyerlerinin ısınma ve sğuma süreleri küçük hacimdeki besiyerlerine nazaran daha kısadır. Bir litrelik hacimdeki besiyerleri için uygun sterilizasyn döngüsü 100 ml hacimdeki besiyerleri için uygun lmayabilir. Uygulanan sterilizasyn prsesi yüksek hacimdeki besiyerleri için yetersiz kalabilir veya düşük hacimdeki besiyerleri aşırı ısınabilir. Bir litrenin üzerindeki hacimler farklı sterilizasyn döngüsü gerektirebilir. Bu nedenle ldukça farklı hacimdeki besiyerlerinin (tüp ve şişelerin) birlikte sterilizasynundan mümkün lduğu sürece kaçınılmalıdır. Besiyerleri tklav ile ikinci kez steril edilmemelidirler. Agarın ısı iletimi ldukça zayıftır ve agar içermeyen besiyerlerinin agarlı besiyerlerine nazaran ısı penetrasynu düşüktür. Rutin uygulamalarda sıvı ve agarlı besiyerlerinin tklav ile birlikte sterilizasynu için uygun maksimum hacimler sıvı besiyerleri için 1 L, agarlı besiyerli için 200 ml dir. Tabl 1.1 Cam şişe içindeki sıvı besiyerinin ısı penetrasyn sürelerinin karşılaştırılması Hacim 121 C a ulaşma süresi (d) 500 ml 18 1 L 22 2 L 27 5 L 37 Besiyerlerinin sterilizasynunda tplam ısı girişi kavramı önemlidir. 50 C ın üzerinde ve özellikle 100 C ve 121 C arasında geçen ısınma ve sğuma sürelerinin uzun lması tplam ısı girişini kayda değer randa arttırmaktadır. Tplam ısı girişindeki artış besiyeri perfrmansını azaltabilir. Örneğin, fazla ısı yüksek karbnhidrat içeren besiyerlerinde karbnhidratlar ve amin asitler arasında Maillard reaksiynu luşmasına neden labilir. 2
Maillard rekasiynu snucu bazı temel aminasitler mikrrganizmalar tarafından metablize edilemez hale gelebilirler. Bu nedenle tklav işlemi snrası basınç sıfır lduğu zaman besiyerleri bekletilmeden tklavdan çıkartılmalı ve sğutulmalıdır. Otklav ile gerçekleştirilen sterilizasynun etkinliği Otklav Bantları, Kimyasal indikatörler (Brwne s tüpleri) ve Biyljik İndikatörler (Spr indikatörleri) ile kntrl edilebilir. Otklav bantları arzu edilen sıcaklığa ulaşıldığının kntrlüne yöneliktir. Ancak istenilen sıcaklığın ne kadar süre krunduğuna dair fikir vermediklerinden dlayı tek başına sterilizasyn kntrlü için yeterli değillerdir. Brwne s tüpleri ısıya duyarlı slüsyn içeren cam tüplerdir. Tüplerdeki slüsynun rengi yüksek sıcaklıkta belirli süre tutulduklarında kırmızıdan yeşile dönüşür. Sıcaklığın yanı sıra zaman faktörüne bağlı snuç verdiklerinden dlayı tklav bantlarından daha güvenilirdirler. Bununla birlikte Brwne s tüplerinin tklav kazanı içinde yalnızca yerleştirildikleri yer için sterilizasyn şartlarını gösterdiği unutulmamalıdır. Otklavın hacmi göz önünde bulundurularak birden çk tüp kullanılması daha güvenilir bir yöntemdir. Gebacillus stearthermphilus sprları ısıya ldukça dayanıklı lduklarından sterilizasyn prsesinin etkinliğinin kntrlü amacı ile kullanılabilirler. Dğrudan G. stearthermphilus sprlarını içeren besiyeri ampulleri veya spr stripleri şeklinde ticari biyljik indikatörler mevcuttur. Strip frmu kullanıldığında strip sterilizasyn snrası aseptik bir şekilde strip ile birlikte sağlanan besiyerinin içine alınmalıdır. Biyljik indikatörlerdeki spr sayısı (10 6 ) G. stearthermphilus un 121 C için D değerine (D değeri; Belirli bir sıcaklıkta mikrrganizma sayısının 10 kat azalması için gerekli süre) göre belirlenmektedir. Biyljik indikatörler tklav snrası G. stearthermphilus un ptimum gelişme sıcaklığı lan 60 C da 24-48 saat inkübe edilirler. Sterilizasyn snrasında canlı kalan sprlar lduğu takdirde inkübasyn esnasında vejetatif duruma gelecekler ve besiyerinin bileşiminde bulunan karbnhidratı kullanacaklardır. Bu durumda yine besiyeri bileşiminde bulunan ph indikatörü nedeni ile besiyerinin rengi değişecektir. Bu snuç yetersiz sterilizasynu gösterir. Brwne s tüplerinde lduğu gibi biyljik indikatörlerin tklav kazanı içinde yalnızca yerleştirildikleri yer için sterilizasyn şartlarını gösterdiği unutulmamalıdır. Otklavın hacmi göz önünde bulundurularak birden çk biyljik indikatör kullanılması daha güvenilir bir yöntemdir. Yukarıda anlatılan tüm kntrl yöntemlerinin rtak dezavantajı istenilen sıcaklığın aşıldığı durumları işaret edememeleridir. Besiyerlerinin istenilen sıcaklığın üzerinde steril edilmesi besiyerlerinin özelliklerini kaybetmesine neden labilir. Fazla ısınmanın kntrl edilmesinin tek ylu ise dğrudan besiyeri sıcaklığının ısılçift (thermcuple) ile izlenmesidir. Isılcift kullanımının mümkün lmadığı durumlarda sterilizasyn sıcaklığına dayanıklı materyalden imal edilmiş maksimum termmetreler kullanılabilir. Günümüzde birçk tklav mdelinde bütünleşik ısılçift ve sıcaklık kayıt sistemleri mevcuttur. Güvenilir ölçümler için kullanılan ısılçiftlerin izlenebilir kalibrasynlarının gerçekleştirilmesi gereklidir. 1.2.3.2 Filtrasyn ile Sterilizasyn Filtrasyn ile sterilizasyn yöntemi ısıya duyarlı slüsynların sterilizasynu için kullanılmaktadır. Filtrasyn ile sterilizasyn vakum altında veya basınç ile 0,22 µm pr çapındaki ticari steril membran filtreler ile gerçekleştirilebilir. Filtrasyn ekipmanları birleştirilmiş larak tklav ile sterilize edilebilir veya ayrı steril edilerek laminar flw kabin içinde birleştirilebilir. 1.2.4 Agarlı Besiyerlerinin Yeniden Eritilmesi Agarlı besiyerlerinin yeniden eritilmesi için su banysu veya mikrdalga fırın kullanılabilir. Su banysunda eritme suyun kaynama sıcaklığında gerçekleştirilir. Mikrdalga ile eritme ise cihazın defrst mdunda yapılmalıdır. Besiyerleri eritildikten snra termstatik kntrllü su banysunda 47 C-50 C sıcaklığa sğutulmalıdır. Her eritme işleminin agarın jelleşme kuvvetini azaltacağından dlayı besiyerleri yalnızca bir kez yeniden eritilmelidir ve eritilmiş besiyerleri en fazla dört saat içinde kullanılmalıdır. Asit ve ısı kmbinasynu agarı tamamen hidrlize edeceğinden dlayı asitleştirilmiş Patat Dextrse Agar yeniden eritilmemelidir. 1.2.5 Katkıların ilavesi Bazı besiyeri katkıları tksik bileşenler içerebilir. Bu nedenle katkı slüsynlarının hazırlanmasında üretici talimatlarına uyulmalıdır. Üretici tarafından aksi beyan edilmediği sürece hazırlanan antibiytik slüsynları aynı gün kullanılma veya yalnızca bir kez dndurmak kşulu ile dndurularak muhafaza edilmelidirler. 3
Isıya duyarlı katkılar 47 C-50 C a sğutulmuş besiyerine ilave edilmelidir. Katkılar besiyerine ilave edilmeden önce da sıcaklığına getirilmelidir. Sğuk katkı slüsynları besiyerindeki agarın jelleşmesine neden labilir. BİYOLOJİK İNDİKATÖRLER SICAK BUHAR STERİLİZASYONU Gebacillus stearthermphilus 1.2.6 Petrilerin hazırlanması ve muhafazası Su banysunda 47 C-50 C a sğutulmuş agarlı besiyeri petrilere besiyeri kalınlığı en az 3 mm lacak şekilde (90 mm çapındaki petriler için 18-20 ml) dökülür. İnkübasyn süresi 2 günden fazla veya inkübasyn sıcaklığı 40 C ın üstünde ise besiyeri kalınlığı 3 mm nin üzerinde lmalıdır. Petriler kapakları kapanarak besiyerinin katılaşması için düz ve serin bir yüzeyde bekletilirler. Kntaminasyn riskini azaltmak için besiyerleri laminar flw kabin içinde dökülebilir. Petri kutuları üzerine hazırlama veya sn kullanım tarihleri yazılmalı ve besiyerleri tanımlanmalıdır. Bu amaçla labratuvarlar tarafından geliştirilen kdlama sistemleri de kullanılabilir. İyi izle edilmiş klniler elde etmek ve klnilerin yayılmasını önlemek için kullanmadan önce besiyerlerinin yüzeylerinin kurutulması önemlidir. Kurutma Şekil 1.1 de gösterildiği şekilde 25 C-50 C arasında etüvde veya laminar flw kabin içinde yapılabilir. Kurutma işlemine besiyeri yüzeyinde su damlası gözlenmeyinceye kadar devam edilmelidir. Besiyerleri kesinlikle daha fazla kurutulmamalıdır. Su kaybının artması bazı durumlarda mikrrganizmaların gelişmesini lumsuz etkileyebilir. Şekil 1.1 Petri kutusundaki besiyerlerinin kurutulması 4
GOSSELIN Avrupa nın lider petri kutusu üreticisidir. GOSSELIN petri kutuları aseptik şartlar altında temiz da teknljisine göre üretilmektedir ve birçk endüstriyel tmatik agar dlum cihazı ile uyumludur. GOSSELIN, Mikrranizma ve partikül kntrlleri Bağımsız labratuvarlar tarafından gerçekleştirilen mikrbiyljik testler Byutsal kntrller Termal testler (55 C) Satıh düzlük testleri Ham madde testleri (Ağır metal) Saydamlık testleri ile yüksek kalitede, saydam, ısıya dayanıklı, hafif ve mükemmel düzgün satha sahip petri kutuları üretir. Petri kutularındaki besiyerleri kullanılmadan önce bakterilerin termal şka girmemesi için da sıcaklığına getirilmelidirler. 5