Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 2 El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri M.Querci WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR E UROPA ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri 2 İçindekiler Bölüm 2 El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri GDO lar nasıl belirlenir? 3 DNA ve proteine dayalı yaklaşımların sınırları ve avantajları 4 El kitabının genel sunumu ve dikkat edilecek noktalar 7 Kaynaklar 11
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri 3 GDO lar nasıl belirlenir? Daha önce de belirtildiği gibi transgenik bitkiler genomlarına yeni gen veya genlerin eklenmesi ile karakterize edilirler. Aktarılan bu yeni gen ile yeni bir protein ifade edilir. Bu da bitkiye bazı böceklere ve/veya yabancı otlara direnç gibi yeni bir özellık kazandırı. GDO tanı teknolojisinin temelini değiştirilmemiş çeşit ile transgenik bitki arasındaki bu farkın kullanılması oluşturur. Bu işlem aktarılan yeni DNA nın veya ifade edilen yeni proteinin belirlenmesi, yahut (eğer enzim ise) enzimatik reaksiyonların ürününü tespit etmek için kimyasal analiz yöntemleri kullanılması yolu ile olur. Günümüzde mısır, soya, pamuk gibi tarla bitkilerinde genetik modifikasyonların belirlenmesi için iki bilimsel yaklaşım kullanılmaktadır. Birincisi, ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay) antijen ve antikor arasındaki bağlanma özelliğini kullanarak özel proteinlerin varlığını test eder, diğeri PCR (Polymerase Chain Reaction), tahıla aktarılmış olan DNA sekanslarının belirlenmesine dayanır. Bu yöntemler örnekteki miktar (yüzde) hakkında bilgi verebilir. AB de geçerliliği onaylanan ilk yöntem, pazara sunum için onaylanan birçok GDO nun tespit edilebildiğii PCR a dayalı tayin yöntemidir (Lipp ve ark. 1999). Pietsch ve ark. (1997) tarafından geliştirilen bu metot, aktarılan genin konakçı organizmada işlevselliği için gerekli olan 35S promotor ve nos terminatör kontrol tayinine dayanır. Yöntem geçerliliği IHCP (JRC) nin Gıda Üretimi ve Tüketici Malları Birimi (Food Products and Consumer Goods Unit) tarafından uygun sertifikalı referans materyallerinin üretiminden sorumlu olan JRC, IRMM (Referans Materyaller ve Ölçümler Enstitüsü) ile işbirliği ile koordine edilmiştir. Yukarıda bahsedildiği gibi araştırmalar ayrıca proteine dayalı yöntemlerin geliştirilmesine de yönelmiştir. Roundup Ready soyanın tayininde hassasiyeti yüksek, ELISA tabanlı bir yöntem kullanılması geçerlilik onayı almış olup (Lipp ve ark. 2000) diğer yöntemler de geliştirilmiştir (http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm).
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri 4 DNA ve proteine dayalı yaklaşımların sınırları ve avantajları DNA ya dayalı yaklaşım PCR teknolojisine dayalı analitik yöntemler GDO larda bulunan DNA sekanslarının tayininde artarak kullanılmaktadır. PCR, diğer DNA sekansları ile karışık olan ve düşük miktarlarda bulunan özel DNA parçalarının seçici olarak çoğaltılmasına izin verir. PCR reaksiyonun başlangıcı için gerekli olan küçük tamamlayıcı DNA parçaları primer olarak adlandırılır ve çift olarak kullanılır. Bu primerler ilgilenilen genin zıt dizilerine bağlanmak üzere düzenlenirler (5 ve 3 ). Böylece birçok döngü boyunca primerler arasındaki sekans özel bir DNA polimeraz tarafından kopyalanarak çoğaltır. Bu çoğaltılan parçalar elektroforeze tabi tutulur, böylece varlıkları ve boyutları belirlenebilir. Tarımsal gıda ve yemlik tahıllarda da GDO nun belirlenmesi ve ölçülmesini sağlayan bir çok PCR a dayalı yöntem geliştirilmiştir. Buna ek olarak, genetik kimliğin tanımlanması, GDO tahılların destek zinciri (üreticiden tüketiciye) boyunca ayrılabilmesine ve izlenebilirliğine olanak sağlar. GDO tayini için önşart, gerçekleştirilmiş olan genetik modifikasyon(lar)un türü hakkında, kullanılan promotör ve terminatörü de içine alacak biçimde aktarılan genin moleküler oluşumu üzerine sahip olunan bilgidir. Analiz, hedef geni de kapsayan bütün DNA yı içeren minimum miktarda örnek materyal ile yapılır. PCR, eğitimli eleman ve özel ekipman gerektiren laboratuvara dayalı hassas bir tekniktir. PCR a dayalı tanının bazı ana özellikleri aşağıdaki gibidir: Bir organizmanın tüm genetik materyali ya da genomunda, araştırılan genin bir ya da birkaç kopyasını tespit edebilecek kadar hassas olabilir. Bu yüksek hassasiyetin sonucu olarak, dikkatsizlik sonucu meydana gelen çok düşük seviyelerdeki kontaminasyon dahi yanlış pozitif sonuç verebilir. Bu nedenle çapraz kontaminasyonu önlemek için çok dikkat edilmelidir. İmmunolojik analizlerle kıyasla (primer sentezi ile antikor üretimi karşılaştırıldığında) çok daha kısa bir kimyasal hazırlık süresi gerektirir.
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri 5 Analiz için gerekli olan kimyasalların hemen hepsi ticari olarak mevcut olup, bir çok kaynaktan kolayca temin edilebilmektedir. Ancak bunların bazıları, tanısal kullanım için lisans gerektirmektedir. Numune analizi yaklaşık bir gün sürmektedir. Uygun şekilde geliştirilirse PCR, farklı genetik modifikasyon tipleri (transgenik hat olarak da tanımlanır) arasında ayrım yapabilme özelliğine sahiptir. Özel transgenik hatların tanımlanması için var olan tanı yöntemleri ekstra bir geliştirme süreci ve geçerlilik çabasını gerektirir. Proteine dayalı yaklaşım Proteine dayalı yaklaşım, ilgi duyulan proteine karşı geliştirilmiş özel antikorlar kullanır. ELISA özel olarak, yahut diğer benzer olmayan proteinlerin de bulunduğu örnekte, ilgi duyulan proteini belirler veya ölçer. ELISA yöntemi özel bir proteine bağlanması için bir antikor, tespiti çoğaltabilmek için ikinci bir antikor (tercihe bağlı) ve ilgilenilen protein standardı ile karşılaştırılarak, reaksiyonun sonucunu bir renk ürünü olarak ölçebileceğimiz, antikora bağlı bir enzim kullanır. Testin doğru biçimde yapılabilmesi için eğitilmiş personel ve özel ekipman gerekmektedir. ELISA analizinin anahtar özellikleri; PCR dan daha az hassastır, bu nedenle, düşük seviyelerdeki kontaminasyon sonucu oluşan yanlış pozitif sonuçlarla PCR a nazaran daha nadiren karşılaşılır. Analiz geliştirilmesi ve antikor ve protein standartları oluşturmanın yüksek ön maliyeti vardır. Kimyasallar geliştirildikten sonra örnek başına maliyeti düşüktür. Aynı protein özelliğini gösteren farklı transgenik vakalar arasında farkı ayırt edemeyebilir. Proteine dayalı yöntemler kimyasallar ve yöntem gelişimi için önemli bir ön hazırlık zamanı gerektirir. Proteine dayalı testler, ölçülebilir bir protein üretildiğinde pratik ve etkili bir analiz yöntemidir. Ancak genetik olarak değiştirilmiş ürünler yalnızca bazı gelişim safhalarında veya belli bitki bölümlerinde üretilirler ve bunları ELISA ile kolayca ölçmek mümkün olmayabilir.
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri 6 Buna ek olarak, özellikle endüstriyel işlemler proteinlerin kolayca bozulmasına sebep olabilir ve bu nedenle işlenmiş gıdalarda ELISA yöntemini kullanmak problemli olabilir. Bu noktalar düşünüldüğünde ELISA ve PCR ayrı ve biri diğerinin yerine geçer yaklaşımlar olarak değil, birbirini tamamlayıcı yöntemler olarak dikkate alınmalıdır. Tablo 1. ELISA ve PCR yöntemlerinin karşılaştırılması Yöntem Test yapılan molekül ELISA Protein 2-8 saat PCR DNA 1-3 gün Süre Kullanım kolaylığı Sonuçlar Orta; laboratuar bilgisi gerektirir; testler tahıla ve çeşide özeldir Zor; özelleşmiş alet ve eğitim gerektirir Özel genetik modifikasyonu tespit edebilir, test numunesinde GDO için nicel tayin yapmak mümkündür Çok hassas, yanlış pozitiflere maruz kalabilir; GDO DNA nın varlığını tespit eder, test numunesinde GDO için nicel tayin yapmak mümkündür
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri 7 El kitabının genel sunumu ve dikkat edilecek noktalar Yöntem geçerliliği hem laboratuvar hem de kontrol otoriteleri açısından kritiktir. İdealinde, performans doğrulama amaçlı olarak, her yöntem hassas, tekrarlanabilir ve hedefe özel sonuçlar sağlamak açısından, sınırlı sayıda deneyimli laboratuarlarca onaylanmalıdır. AB nin JRC birimi ilk olarak Roundup Ready soya içeren işlenmemiş materyal için ELISA ve PCR yöntemlerine, Maximizer mısır (Bt-176) için PCR yöntemine ve işlenmiş gıdada Bt-176 ve Roundup Ready için PCR yöntemine geçerlilik onayı vermiştir (Lipp ve ark. 1999, 2000, 2001). O zamandan beri, hem nitel hem de nicel analizler geliştirilmiş ve onaylanmıştır (GDO tayini ve ölçümü için onaylanmış yöntemler hakkında son bilgi için http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm). Gerek DNA ya, gerekse de proteine dayalı yöntemlerde GDO belirleme ve miktar ölçme işlemleri için örnek hazırlama aşaması kritiktir. İlgilenilen soruna bağlı olarak (örn. nitel veya nicel) her prosedürün sınırlarını bilmek önemlidir. Hem örnek boyutu, hem de örnekleme işlemleri herhangi bir test yönteminden elde edilecek sonuçlar üzerinde büyük etkiye sahiptir. Uygun sertifikalı referans materyallerinin (RM) bulunabilirliği her tayin yöntemi için temel gerekliliktir. Bu kursta kullanılan referans materyaller JRC IRMM de üretilmiştir (Trapmann ve ark. 2002 ve 2001). RM özellikleri ve sertifikaları Bölüm 3 de verilmiştir. Örnek homojenizasyonu kurs kapsamında yer almamakla beraber önemli bir işlemdir. Şekil 1. Kurs sürecinde gerçekleştirilen farklı analiz basamaklarını özetlemektedir. DNA izolasyonunun optimize edilmesi, PCR ile çoğaltılmaya uygun DNA nın kalitesi ve varlığı için temel işlemdir. Bu konu, özellikle marketteki bir çok gıda ürünü, endüstriuel olarak işlenmiş soya ve mısırdan türetildiği için çok önemlidir. DNA gıdanın işlenmesi esnasında, özellikle suyun varlığındaki ısıl işlemler sebebi ile parçalanabilir. Böylece gıdadaki GDO ların varlığının belirlenmesine izin verecek kadar uzun olan DNA parçalarının miktarı( araştırmaya konu olan yeni gen diziliminin tamamını içerene), gıda işlendikçe azalabilir. Ek olarak, uygun DNA izolasyonu, örnekte bulunan önleyici maddelerin ortamdan ayrıştırılmasına olanak vermelidir. Bu konudan Bölüm 4 de bahsedilecektir. DNA izolasyonu için farklı metotlar geliştirilmiştir. Bir çok ticari şirket tarafından özel kullanıma hazır kitler de piyasa da mevcuttur. Farklı uygun protokollerin performans ve geçerliliği kurs esnasında
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri 8 tartışılacaktır. Ancak ticari şirketler ile ilişiklendirilmemek için,farklı örneklerde uygunluğu gösterilmiş, geçerli ve çok yönlü ir protokol olan CTAB metodu DNA izolasyonu için kullanılmıştır. DNA izolasyonundan sonra örnekler (ve PCR ürünleri) agaroz jel elektroforezi ile analiz edilir (Bölüm 5). PCR yönteminin prensipleri, avantajları ve zorluklarından Bölüm 6 da bahsedilmiştir. Yukarıda belirtildiği gibi, GDO tayini için modern tekniklerin etkili kullanımı, yeterli bilginin varlığına bağlıdır. GDO tayini, genetik modifikasyonun tipi ve hedef gen sekansı hakkında en azından kısmi bilgi de gerektirir. Transgenik hatlar MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready soyanın özellikleri Bölüm 7 de verilmiştir. Onaylanmış GDO ların tayininde farklı PCR yaklaşımları geliştirilmiştir. PCR hassasiyeti doğru primerlerin seçilmesine dayanır. PCR primerleri, transformasyon işleminde kullanılan farklı genetik elementlere yönlendirilebilir. Genel kapsamlı PCR tayin sistemleri genellikle tarama yöntemleri olarak adlandırılır transformasyonda en sıklıkla kullanılan ortak sekanslara özel primerlerin dizaynı ile elde edilebilir. Bunlar genellikle promotör ve terminatör gibi düzenleyici sekanslardır. Genetik olarak değiştirilmiş bitkiler, aktarılan yapısal gene göre kategorize edilebilir. Reaksiyon hassasiyetini yönlendirmenin diğer bir yolu, değişik genetik elementlerdeki yerleşmiş DNA sekanslarına özel (promotor-yapısal gen, yapısal gen-terminatör) primerler seçmektir. Özel ve tam sekans bilgisi varlığında ise, genetik olarak değiştirilmiş bitki için gerçekten özel analiz metotları geliştirmek mümkün olur. Yalnızca bu özel hatta bulunan özgün bir sekans kombinasyonu seçme yolu ile bu hatta özel analiz yöntemleri geliştirilebilir. Bu genellikle entegre edilen yabancı DNA ile konak DNA arasındaki birleşme bölgesini boydan boya kapsayan DNA dizilimine karşılık gelen bir primer geliştirilerek elde edilir. Eklenen DNA (T-DNA) ile konak-dna arasındaki birleşme bölgesi, oldukça hassas PCR testi için ideal bir hedef sağlayan, gerçekten özgün bir nukleotid sekansıdır. Kurs boyunca uygulanan metotlar Şekil 1 de özetlenmiştir. Bölüm 8 de detaylı bir biçimde açıklanacaktır. Metotların deneysel kısımları ve protokoller Bölüm 9 da bulunabilir. Yukarıda belirtildiği gibi numunede GDO varlığının nicel tespitine duyulan ihtiyaç, yalnızca nitel cevaba (varlığı/yokluğu) değil, verilen numunede GDO varlığının göreceli ölçümün az veya çok hassas göstergesine (seçilen metoda bağlı olarak) izin
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri 9 veren bir çok PCR a dayalı yöntemin geliştirilmesine neden olmuştur. En sıklıkla kullanılan DNA ya dayalı iki yaklaşım karşılaştırmalı PCR ve real-time PCR dır (Bölüm 10). Real time PCR halihazırda sadece bir kaç ticari şirket tarafından üretilen çok özel ve karmaşık bir cihaz kullanılarak yapılır. Kurs süresince takip edilecek protokoller Bölüm 11 de bulunabilir. Son olarak, Bölüm 12 de, genetik olarak değiştirilmiş organizmaların varlığının tespiti için serolojik yaklaşım hakkında genel bilgi verilerek özellikle ELISA tekniği anlatılacak ve Roundup Ready özel ELISA testinin protokolü sağlanacaktır.
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri 10 Örnekleme Homojenizasyon Kurs sırasında uygulanmayacaktır. DNA ekstraksiyonu İşlenmiş ve işlenmememiş materyaller Bitki DNA sının PCR ile kontrolü + Bitki DNA sı saptandı - Bitki DNA sı saptanamadı Soya için lektin-pcr ve mısır için zein-pcr PCR ile tarama Düzenleyici elementlerin saptanması (35S promotör ve nos terminatör) + - GD bitki GD olmayan bitki GD bitkiyi nested PCR ile tanımlama GD bitkiyi ELISA ile tanımlama Spektrofotometre ile DNA miktarının belirlenmesi Real-time PCR ile GD miktar tayini Şekil 1. Kurs sırasında uygulanacak yöntemler için iş akış şeması
El Kitabının Sunumu, Çalışma Yöntemleri ve Kurs Bilgileri 11 Kaynaklar Lipp, M., Anklam, E. and Stave, J.W. (2000). Validation of an Immunoassay for detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food fractions using reference materials: Interlaboratory study. Journal of AOAC International 83, 919-927. Lpp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction for the detection of genetically modified organisms in various processed foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504. Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J., and Anklam,E. (1999). IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically modified soybeans and maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923-928. Pietsch, K., Waiblinger, H.U., Brodmann, P., and Wurz, A. (1997). Screening- Verfahren zur Identifizierung gentechnisch veranderter plfanzlicher Lebenmittel. Deutsche Lebensmittel Rundschau 93, 35-38. Trapmann, S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E., Le Guern, L., Kramer, G.N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R. Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M and Anklam, E. (2002). The certification of reference materials of dry-mixed soya powder with different mass fractions of Roundup Ready TM soya. Certified Reference Materials IRMM-410S. (https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/ attachements/erm-bf410_report.pdf) (accessed January 2010) Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G.N., Schimmel, H., Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, and Anklam, E. (2002). The certification of reference materials of dry-mixed maize powder with different mass fractions of MON810 maize. Certified Reference Materials IRMM-413. (https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/ attachements/erm-bf413_report.pdf) (accessed January 2010)