MOLEKÜLER BİYOLOJİ Dr. ismail Bezirganoglu
DNA YAPISI Kimyasal anlamda DNA, nükleotid denilen yapıtaşlarından oluşan bir zincirdir. Her nükleotid bir şeker, bir baz ve bir fosfat dan oluşur. Bu bölümün amacı, DNA nın yapısını, canlı hücre içindeki göreviyle birlikte tanımlamaktır.
Primer yapı: Nükleik asitlerin bileşenleri DNA ve RNA olmak üzere iki grupta toplanır. Nükleotid denilen alt birimlerden meydana gelmiştir. NÜKLEOTİD= BAZ+ŞEKER+FOSFORİK ASİT
NÜKLEOTİDLER-NÜKLEİK ASİTLERİN YAPI TAŞLARI Nükleotid= azotlu baz + pentoz şekeri ( 5 karbonlu) + fosfat grubu içerirler
AZOTLU BAZLAR: İKİ ÇEŞİTTİR 9 atomlu, iki halkalı pürinler (Adenin, Guanin) 6 atomlu tek halka içeren pirimidinler (Sitozin, Timin, Urasil) A,C,G,T ve U şeklinde simgelenirler. A,G,C DNA ve RNA da ortak bulunur T->DNA da, U->RNA da bulunur.
ŞEKER= PENTOZ Nükleik aside adını taşıdığı şeker verir. Ribonükleik asitlerde-riboz Deoksiribonükleik asitlerde-deoksiriboz bulunur. Deoksiribozun ribozdan farkı C-2 pozisyonunda OH grubu olmamasıdır.
Nükleozit- baz + şeker NMP = nükleozit + 1 PO 4 NDP = nükleozit +2 PO 4 NTP = nükleozit + 3 PO 4 Nükleik asitlerin yapı taşıdır özel NTPs: ATP & GTP Nükleik Asit Kimyası
NÜKLEOTİTLERDE BAĞLANMA Nükleotid yapısındaki bağlar son derece özgüldür. Şekerin C-1 atomu azotlu bazla kimyasal bağ yapar. Pürinlerde N-9, pirimidin ise N-1 atomu şekerin C-1 atomu ile bağ yapar. Nükleotidlerde fosfat grubu, şekerin C-2, C-3 yada C-5 atomu ile bağ kurar. Bu yapı, biyolojik sistemlerde en yaygın olan ve DNA ve RNA da bulunandır.
POLİNÜKLEOTİTLER İki mononükletit arasında bağ yapısında, iki şekere bağlı fosfat grubu yer alır oluşan bağ fosfodiester bağıdır, çünkü fosforik asit her iki taraftaki alkol grubu ( iki şekerdeki OH grubu ) ile ester bağı yapar. Aynı bağ, RNA da da bulunur. dinukleotitler & trinükleotitler oligonükleotitler (<20) polinükleotitler (>20) Uzun polinükleotid zincirleri varyasyon sağlamaktadır. 1000 nt oluşan bir zincir 4 1000 kombinasyon ile oluşturulabilir. Levene nin tetranükleotid hipotezi bu varyasyonu sağlamamaktadır.
FOSFODİESTER BAĞLARI DNA VE RNA NIN KOVALENT İSKELETİDİR
DNA ve RNA zincirinin uzunluğu Hücresel RNA lar 100 nükleotitden daha kısa olandan birkaç bin nükleotit uzunluğa kadar geniş bir aralıkta olabilir. Nükleotitlerin nt veya bazların sayısı bir uzunluk ölçüsü olarak kullanılır. Hücresel DNA molekülleri birkaç yüz milyon nükleotit uzunluğunda olabilir. Baz çifti (bp) sayısı, çift zincirli DNA nın uzunluk ölçüsü olarak kullanılır. DNA için kullanılan uzunluk birimi 1000 baz çiftine karşılık gelen kilobaz çifti (kb) veya 1,000,000 baz çiftine karşılık gelen megabaz çifti (Mb)
5 ve 3 nün önemi Bir nükleik asit zincirinin 5 ve 3 polaritesi, molekülün oldukça önemli bir niteliğidir. Bu polaritenin anlaşılması replikasyonun ve transkripsiyonun yönünün anlaşılması DNA zincirinin okunması ve laboratuvardaki çalışmalarının gerçekleşmesi için önemlidir. Genel olarak bir DNA veya RNA zinciri 5 ucu solda, 3 ucu sağda olacak şekilde yazılır.
DNA nın sekonder yapısı 1940-1953 Erwin Chargaff, Maurice Wilkins, Rosalind Franklin, Linus Pauling, Francis Crick, James Watson arasında yarış 1953 yılında Nature- The Double Helix yayını ile sona ermiştir. Watson- Crick için yapıyı aydınlatmadaki en önemli kaynaklar Hidrolize edilmiş DNA nın baz kompozisyon analizleri DNA nın X ışını kırınımı çalışmalarıdır.
Watson ve Crick in ortaya çıkardığı gibi DNA genelde hücrede birbirine sarılan çift zincir olarak yer alır. çift zincirli DNA (ds DNA) veya dubleks DNA olarak da ifade edilen DNA çift sarmalı, bazı virüslerde bulunan tek zincirli DNA (ssdna) dan farklıdır. DNA nın yapısı, organizmaların üreme ve gelişmesi için gerekli olan genetik bilgiyi çoğaltmalarına ve muhafaza etmelerine izin verir. Çeşitli kimyasal kuvvetler, DNA, çift sarmalının oluşumunu sağlar. Bunlar bazlar arasındaki hidrojen bağları ile bazların kümeleşmesine yol açan hidrofobik etkileşimleri içerir.
Bazlar arasında hidrojen bağları oluşur Termodinamik olarak kararlı hidrojen bağları, birbirine sarılan DNA zincirlerinin karşılıklı zincirlerdeki azotlu bazlar arasında oluşur. Bazlar arasındaki hidrojen bağları komp lementer baz eşleşmesi olarak ifade edilir.
Baz istiflenmesi, DNA çift sarmalına kimyasal kararlılık sağlar Bazlar nükleotid oluşturmak üzere bir şekere bir fosfata bağlandığında, suda çözünebilir hale gelirler fakat yine de çözünmezlikleri hala çözeltideki DNA nın tam konformasyonu üzerinde büyük sınırlamalara sebep olur. Eşleşmiş nispeten yassı bazlar sarmal dönüş sebebiyle birbirlerinin üzerine istiflenme, raflaşma yığılma eğilimindedirler. Çift zincirli DNA nın bu özelliği baz istiflenmesi olarak bilinir.
CHARGAFF KURALI Herhangi bir türe ait DNA nın nükleotidlerine parçalandığında serbest kalan nukleotidlerde adenin miktarının timine, guanin miktarının da sitozine daima eşit olduğunun saptanmasıdır. Yani Chargaff kuralı na göre doğal DNA moleküllerinde adeninin timine veya guaninin sitozine oranı daima 1 e eşittir. (A/T=1 ve G/C=1) Pürinler= pirimidinler (A+G=T+C) İşte Watson ve Crick bu bulguları değerlendirerek böyle özelliklere sahip DNA makro molekülünün sekonder yapısına ait bir model geliştirdiler.
X-IŞINI KIRINIMI DNA zincirleri X-ışını bombardımanına tutulur ve molekülün atomik yapısına göre saçtığı ışınlar belirlenir. Buna göre; 1947- William Astbury DNA da 3.4 A aralıklarla tekrarlayan yapıların varlığını doğrulamış ve DNA nın bir çeşit sarmal yapıda olduğunu ileri sürmüştür. 1950-1953- Rosalind Franklin 3.4 A aralıklarla tekrarlayan yapıların varlığını doğrulamış ve DNA nın bir çeşit sarmal yapıda olduğunu daha saf örnekler kullanara gösterebilmiştir.
DNA daki baz eşleşmesi modelin genetik açıdan en önemli özelliğidir. Bu yerleşim nedeniyle eksen boyunca büyük ve küçük oluklar ortaya çıkar. Sağ el sarmalının uzaydaki konformasyonu, Watson Crick in verilerine en uygun olanıdır.
DNA ÇİFTE SARMALINDA ZİNCİRLER BİRBİRLERİNİN TAMAMLAYICISIDIR.
DNA molekülü kendini oluşturan nukleotidlerin sayısına bağlı olarak, büyüklüğü türden türe değişen, uzun zincir şeklinde bir yapı gösterir. İnsanda bu zincirin uzunluğu açıldığında 2 metreye kadar varabilir. Bütün halinde eldesi zincirin hassas ve kırılgan yapısından ötürü çok güçtür. Nukleotidlerin yapısı bazik olmasına karşın oımurgadaki PO4(fosforik asit) grubunun varlığı polinükleotid zincirlerin asit özellikte olmalarına yol açar ve nükleik asit terimi de bu özellikten kaynaklanır. DNA çift sarmalının dikkate değer ve önemli bir özelliği, molekülü oluşturan zincirlerin birbirlerinden kolaylıkla ayrılabilmesi ve yeniden birleşebilmesidir. Protein sentezi ve DNA replikasyonu (kendi kopyasını oluşturması) bu özellik sayesinde meydana gelebilir. DNA nın iki zinciri, birbirine sadece H bağları ve hidrofobik etkileşimlerle bağlı olmaları nedeni ile, nükleotidleri arasındaki kovalent bağlardaki herhangi bir kopma olmaksızın çözülebilir (denatürasyon). Aynı şekilde çözülmüş molekülün zincirleri tamamlayıcı bazları arasında H bağlarının oluşumu ile birleşip sarmal yapıyı yeniden oluşturabilir (renatürasyon).
DNA NIN FORMLARI Tek-krista-X-ışını analizi çalışmaları ile 5 A luk çözünürlük 1 A a kadar düşürülmüştür. A-DNA right handed (11 baz/ 1 tam dönüş/çap 23 Å) yüksek tuz kons. Yada dehidrasyon koşullarında baskındır. B-DNA right handed (normal, 10 baz/tdönüş, çap 20 Å) Z-DNA left handed (all GC, 12 bases/turn, 18 Å) Fizyolojik koşullarda rasgele bir DNA dizesinde en stabil form B formudur. A formu su dışında birçok çözeltide oluşan bir formdur. Z formu: sola doğru dönen heliks yapısındadır. Z formu bazı genlerin ekspresyonlarının regulasyonunda rol alabilir.
FARKLI DNA FORMLARININ ÖZELLİKLERİ
FARKLI DNA FORMLARI
DNA-RNA Double stranded - single stranded RNA da T yerine U bulunur.tipleri mrna, rrna, trna snrna (RNA processing) Telomerase RNA (replikasyon) antisense RNA (regulasyon)
DNA VE RNA ARAŞTIRMALARINDA KULLANILAN ANALİTİK YÖNTEMLER U.V ışığının soğurulması (254-260 nm arasında en fazla) Çökelme Davranışı- Nükleik asitler çeşitli gradiyent santrifügasyon işlemleri ile ayrılabilirler. Çökelme özelliği molekülün yoğunluğu, kütlesi ve biçimine bağlıdır ve Svedberg katsayısı (S) olarak ölçülür.
NÜKLEİK ASİTLERİN DENATÜRASYONU VE RENATÜRASYONU DNA nın denatürasyonu sonucu H- bağları kopa, çift zincir çözülür ancak kovalent bağlar kırılmaz. Isı yada kimyasal yolla olabilir. Denatürasyon sırasında DNA akışkanlığı azalır, U.V absorbsiyonu ve denge yoğunluğu artar. Isı sonucu oluşan denatürasyona erime-melting denir Isıtılan DNA nın U.V absorbsiyonundaki artışa hiperkromik kayma denir. Erime sırasında, DNA nın 260 nmdeki absorbsiyonu sıcaklığa karşı grafiklenirse br erime profili elde edilir. Bu eğrinin orta noktasına erime sıcaklığı (Tm) denir. DNA zincirinin %50 sinin açıldığı sıcaklıktır.
DNA NIN ISI İLE DENATÜRASYONU
DNA NIN DENATÜRASYONU
KISMEN DENATÜRE DNA
DNA HİBRİDİZASYONU DNA çifte sarmalı ve RNA denatüre olabilir. Anneal: Denatüre segmentin tekrar çifte sarmal oluşturması Farklı türlerin nükleik asidleri hibrid formlar oluşturabilirler. Türler ne kadar yakınsa hibridizasyon o kadar kolay gerçekleşir. Nükleotidler ve nükleik asidler non enzimatik transformasyona uğrarlar.