OKSİDASYONDA METALLER VE ZEYTİNYAĞI FENOLİKLERİNİN ETKİLEŞİMİ Yasemin Köprücüoğlu, Aziz Tekin Ankara Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü, Ankara e-mail: yasemink_81@mynet.com Oleuropein, hidroksitirozol, tirozol, 3,4-dihidroksifeniletanol-elenoik asit (3,4- DHPEA-EA), 3,4- dihidroksifeniletanol-elenoik asit dialdehit (3,4- DHPEA-EDA) zeytinyağında bulunan önemli fenolik bileşiklerdir. Metaller ise yemeklik yağlara iç faktörlerden veya işleme sırasında makinalardaki metal kısımların kontaminasyonu sonucunda bulaşabilmektedir. Ortamda demir veya bakır gibi çok değerlikli metal iyonlarının bulunması sonucunda, aktif radikallere oksijenin bağlanması ile meydana gelen hidroperoksitler, bu metal iyonlarının değerliklerinde oluşan indirgenme ya da yükseltgenme tepkimelerine bağlı değişim etkisinde kolaylıkla aktif oksit ve peroksit radikallerine dönüşmekte ve reaksiyon otokatalitik bir özellik kazanmaktadır. Zeytinyağındaki fenolik bileşikler, hem radikal yakalayıcı, hem de metalleri şelatlayıcı özellikleri nedeniyle, yağın oksidatif stabilitesine katkı sağlamaktadır. Fakat fenoller, ayrıca metalleri indirgeyebilmektedir. Düşük yükteki metal, hidroperoksitlerin serbest radikallere dekompozisyonunu katalizlemede daha aktif olduğu için polifenollerin metalleri indirgeme özellikleri oksidatif reaksiyonu artırabilmektedir. Bu çalışmada zeytinyağındaki fenolik bileşikler ile metallerin etkileşimi derlenmiştir. Anahtar kelimeler: Fenolik madde, metaller, oksidasyon, zeytinyağı 1.Giriş Oksidasyon, sızma zeytinyağının raf ömrü, görünüşü, tat ve kokusu gibi kalite özelliklerinde değişikliklere neden olmasının yanında, besinsel değerinde azalmaya, antioksidanların kaybına ve toksik maddelerin oluşumuna da neden olmaktadır (1). Lipit oksidasyonu; moleküler oksijen ile lipitlerin reaksiyonu sonucunda oluşur, ancak bu reaksiyonun aktivasyon enerjisi çok yüksektir. Bu nedenle lipit oksidasyonu büyük oranda demir, bakır gibi metal katalistleri ile ışığın hidroperoksitleri parçalaması ile başlamaktadır. Sızma zeytinyağının yüksek oksidatif stabilitesi; başlıca tekli doymamış yağ asidi/çoklu doymamış yağ asidi oranına bağlı olarak yağ asidi kompozisyonundan ve oksidasyonu önlemede başlıca role sahip minör maddelerden kaynaklanmaktadır (2). Sızma zeytinyağının ana antioksidanları karotenler ile lipofilik (tokoferoller) ve hidrofilik fenolikleri içeren fenolik bileşiklerdir (3). Sızma zeytinyağı yüksek miktarda hidrofilik fenolik bileşik içermektedir. Bunlar; hidroksibenzoik ve hidroksisinamik türevlerini içeren fenolik asitler, 3,4-dihidroksifeniletanol (3,4- DHPEA veya hidroksitirozol) ve p-hidroksifenil etanolünü (p-hpea veya tirozol) içeren fenolik alkoller, apigenin ve luteolini içeren flavonoitler, lignanlar ve oleuropein, demetiloleuropein ile ligstrosit türevlerini içeren sekoiridoitlerdir. Bu sekoiridoitler; 3,4- DHPEA veya p-hpea ya bağlı dekarboksimetil elenolik asidin dialdehidik formları (3,4- DHPEA-EDA, p-hpea-eda) ve oleuropein aglikonunun izomeri (3,4- DHPEA-EA) dir (2,4). 3,4- DHPEA, 3,4- DHPEA-EDA ve 3,4- DHPEA-EA gibi o- difenoller, p-hpea ve tokoferollerden daha yüksek antioksidan aktiviteye sahiptirler ve bu nedenle zeytinyağının oksidatif stabilitesinden de sorumludurlar (3). Ekstra sızma zeytinyağında metaller bitki metabolizmasıyla bağlantılı iç faktörlerden veya ziraii uygulamalar (gübre veya pestisit kullanımı) ile yağ ekstraksiyonu boyunca (ezme ve yoğurma 32
aşamalarında zeytin hamuru ile metalik yüzeyler arasındaki temasla) ya da yağın depolanması sırasında (kullanılan konteynırın tipine göre) maruz kalabilecekleri dış faktörlerden kaynaklanmaktadır (2). Ekstra sızma zeytinyağındaki fenolik bileşikler normal olarak antioksidan davranışı gösterir. Fakat belli koşullar altında prooksidan olabilirler ve oksidasyonu hızlandırırlar. Fenolik bileşikler; metalleri hidroperoksitlerin parçalanmasını katalizlemede daha aktif oldukları düşük yüke indirgeme (örneğin; Fe +3 Fe +2 veya Cu +2 Cu + ) özelliğine sahiptir (1,2). Sızma zeytinyağı gıda endüstrisinde mayonez ve sos gibi ürünlerin üretiminde kullanılmaktadır. Emülsiyon sistemlerinde antioksidanların davranışları yağ fazına göre daha karışıktır. Çünkü emülsifiyer ve ph gibi birçok değişken lipit oksidasyonunu etkilemektedir. Su fazının varlığı antioksidanların aktivitesini genellikle azaltmaktadır, çünkü su ile hidrojen bağı kurarak oluşan kompleksler, hidrojen vererek lipit radikalleri yakalamada etkisizdirler. Gıda emülsiyonlarındaki lipitler, demir ve bakır gibi geçiş metalleri ile suda çözünür maddeleri içeren sıvı fazında dispers halde bulunurlar (1,5). 2. Fenolik bileşikler ile metallerin etkileşimi Yapılan bir çalışmada; 60 o C, ph 3.5, 5.5 ve 7.4 de zeytinyağındaki 4 fenolik maddenin (oleuropein, hidroksitirozol, 3,4-DHPEA-EA ve 3,4-DHPEA-EDA) demir-iii klorürün varlığı ve yokluğunda zeytinyağı/su emülsiyonunun oksidatif stabilitesi (5); diğer bir çalışmada ise ph 5.5 ve 7.4 de zeytinyağı ve yağ-su emülsiyonlarında bakır ile etkileşimleri ve antioksidan aktiviteleri incelenmiştir (1). Elde edilen sonuçlara göre; bakırın yokluğunda zeytinyağının indüksiyon periyodunu uzatan fenolik bileşikler: hidroksitirozol>3,4-dhpea-ea>3,4-dhpea-eda>oleuropein>α-tokoferol şeklinde sıralanmıştır. Bakırın varlığında ise bu fenolikleri içeren örneklerin stabiliteleri en az %90 oranında azalmıştır. Ancak zeytinyağı fenolik bileşiklerinin hepsi tokoferolden çok daha iyi antioksidan aktivite göstermiştir (1). Bütün ph değerlerinde 4 bileşiğin konsantrasyonlarındaki artış ile antioksidan aktivitelerinde de belirgin bir artış gözlenmektedir. Fakat hidroksitirozol ve oleuropein ph 3.5 ve 5.5 de demir-iii iyonlarının varlığında (5), ph 5.5 de bakırın varlığında (1) fenolik konsantrasyonlarındaki artışın etkisi ile belirgin bir prooksidan etki göstermekte iken, sadece ph 7.4 de her iki fenolik bileşik için antioksidan etki gözlenebilmektedir (1,5). Demir-III iyon çözünürlüğü, demir-iii hidroksit formuna sahip olduğu alkali ph da çok düşük olmaktadır (şekil 2.1). Bu nedenle antioksidanların aktivitesi ph 7.4 de demir-iii iyonlarının varlığında çok belirgin bir şekilde indirgenmemektedir (5). 3,4-DHPEA-EDA yüksek konsantrasyonlarda, demir-iii iyonlarının varlığıyla sadece ph 3.5 da prooksidan etki göstermekte iken 3,4-DHPEA-EA, demir-iii ve bakır-ii varlığında bütün ph değerlerinde de antioksidan aktivite göstermektedir (1,5).Alkali çözeltilerde büyük polinüklear demir-iii iyonlarının oluşumu nedeniyle etkili demir-iii iyonları/fenol oranı azalmaktadır. Demir-III iyonlarının pk a larına göre seyreltik çözeltilerde farklı hidroksi kompleksleri oluşmakta ve bu komplekslerin çözeltideki oranları da ph ya bağlı olmaktadır (6). Fe +3 + H 2 O [Fe(H 2 O) 6 ] 3+ [Fe(H 2 O) 6 ] 3+ + H 2 O [Fe(H 2 O) 5 (OH)] 2+ + H 3 O + (pk a1 =2.9) [Fe(H 2 O) 5 (OH)] 2+ + H 2 O [Fe(H 2 O) 4 (OH) 2 ] + + H 3 O + (pk a2 =3.9) [Fe(H 2 O) 4 (OH) 2 ] + + H 2 O [Fe(H 2 O) 3 (OH) 3 ] + H 3 O + (pk a3 =6.5) Şekil 2.1 Alkali çözeltilerde büyük polinüklear demir-iii iyonlarının oluşumu Emülsiyon sistemlerinde demir konsantrasyonunu artırmak su fazındaki demir konsantrasyonunu da artırmaktadır. Demir, ph 7.0 ile karşılaştırıldığında ph 3.0 da daha fazla çözünmekte ve damla yüzeyine daha yakın olmaktadır. Bu durum düşük ph lı sistemlerde, yüksek demir konsantrasyonunun prooksidan 33
aktivitesini açıklamaktadır (7).Yağ-su emülsiyonlarında polar olmayan fenolikler lipit damlalarıyla etkileşimde oldukları için polar fenoliklere göre daha etkili antioksidanlardır. Ayrıca polar antioksidanlar su fazındaki demir ile daha etkili interaksiyona girer ve fenoliklerin metal indirgeme güçleri oksidasyon hızını artırdığı için bu durum polar fenoliklerin artan prooksidan aktivitelerini açıklayabilmektedir (7). Zeytinyağı polifenollerinin polarite sırası ise; hidroksitirozol> oleuropein> 3,4- DHPEA-EDA> 3,4- DHPEA-EA> α-tokoferol şeklindedir (5). Ayrıca FRAP (demir-iii-indirgeme antioksidan potansiyeli) testi ph 7.4 de herhangi bir demir-iii indirgeme aktivitesi göstermemekte iken ph 3.5 ve 5.5 de demir-iii indirgeme yetenekleri: hidroksitirozol, α-tokoferol> oleuropein> 3,4-DHPEA-EA> 3,4- DHPEA-EDA şeklinde sıralanmaktadır (5). Bütün fenolik bileşiklerinin demir-iii ü indirgeme kapasitelerinden 5 kattan fazla bakır-ii indirgeme kapasitesine sahip oldukları görülmektedir. Hidroksitirozolün ph 5.5 de bakırı indirgeme kapasitesi düşüktür ve diğer zeytinyağı fenolik bileşiklerinden de farklıdır. Aynı ph da α-tokoferol; oleuropein, 3,4- DHPE-EA ve 3,4-DHPE-EDA nın indirgeme kapasitesinin %50-55 ini, hidroksitirozolün ise %64 ünü göstermektedir. Bakır-II şelatlama tampon çözeltisinin (PBS tampon çözelti) varlığında ph 5.5 e göre ph 7.4 de hidroksitirozol hariç bütün bileşikler düşük indirgeme kapasitesi göstermektedir. Fakat şelatlama tampon çözeltisinin yokluğunda (MOPS tampon çözelti) bütün bileşikler tokoferol ve askorbik asitten daha fazla bakır-ii indirgeme kapasitesi göstermektedir. Kompleks oluşumu, metallerin indirgenmesi için gerekli olduğu için PBS tampon çözeltisindeki hidroksitirozolün yüksek indirgeme kapasitesi bakır-ii ile oluşturduğu kompleksin düşük stabilitesini yansıtmaktadır. Ayrıca emülsiyon sistemlerinde, bakır-ii yi indirgeme kapasitesi daha düşük olan bileşiklerin daha zayıf antioksidan aktivite gösterdikleri de görülmektedir (1). Yapılan çalışmada demir-ii iyonlarının zeytinyağındaki fenolik maddeler tarafından şelatlanma aktivitesi incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre fenolik maddelerin demir-ii iyonlarını şelatlayamadıkları fakat demir-ii iyonlarının hava ile oksidasyonu sonucunda oluşan demir-iii iyonlarını şelatlayabildikleri görülmektedir. Bu nedenle demir-ii iyonlarının oksidasyon reaksiyonu, demir-iii iyonları oluşumunun arttığı yönde değiştirilebilmektedir. Fakat Fe +2 nin oksidasyon hızı fenolik maddelere bağlıdır. Oksidasyon hızı 3,4-DHPEA-EA, 3,4-DHPEA-EDA, oleuropein ve hidroksitirozol fenolik maddeleri için 1:1:5:10 oranı şeklinde gerçekleşmektedir (6). Demir-III iyon konsantrasyonunun fenolik bileşik konsantrasyonundan çok daha düşük olduğu lipit sistemlerinde, şelatların yüksek stabilitesi fenolik bileşiklerin antioksidan özelliklerine katkıda bulunmaktadır (zeytinyağındaki fenolik maddeler Ph(OH) 2 ile gösterilmektedir). ph 3.5: [Fe(H 2 O) 5 (OH)] 2+ + Ph(OH) 2 [Fe(H 2 O) 3 (OH)Ph(O) 2 ] + 2 H 3 O + ph 5.5: [Fe(H 2 O) 4 (OH) 2 ] + + Ph(OH) 2 [Fe(H 2 O) 2 (OH) 2 Ph(O) 2 ] - + 2H 3 O + Oluşan [Fe(H 2 O) 2 (OH) 2 Ph(O) 2 ] - şelatlarından EDTA nın ilavesiyle fenollerin geri kazanım hızı, diğerine göre daha yavaş, indirgenme potansiyeli ise daha negatiftir. Bu nedenle bu şelatlar indirgenmeye daha dirençli ve daha iyi metal şelatörleridir. ph 3.5 da bütün [Fe(H 2 O) 2 (OH) 2 Ph(O) 2 ] şelatları, ph 5.5 deki [Fe(H 2 O) 2 (OH) 2 Ph(O) 2 ] - şelatlarından daha az stabilite göstermektedir. Bu yüzden demir-iii iyonları ph 3.5 da daha etkili indirgenmektedir (6). ph 3.5 da 3,4-DHPEA-EA, 3,4-DHPEA-EDA, oleuropein ve hidroksitirozol demir-iii iyonları ile 1:1 oranında tersinir kompleksler oluştururken, hidroksitirozol ayrıca demir-iii iyon/fenol molekülü >1 içeren kompleksler de oluşturmuştur. ph 5.5 da 3,4-DHPEA-EA veya 3,4-DHPEA-EDA nın demir-iii iyonları ile oluşturdukları kompleksler göreceli olarak stabildirler ve bu fenolik bileşiklerin antioksidan aktiviteleri, kısmi olarak metal şelatlama aktivitelerinden kaynaklanmaktadır. ph 7.4 de demir-iii iyon/ 34
fenol molekülü>1 içeren kompleks hidroksitirozol ile meydana gelmiştir. Bu ph da 3,4-DHPEA-EA, 3,4- DHPEA-EDA, oleuropein çözünmeyen kompleksler oluşturmuştur. Bu üç ph değerinde, hidroksitirozol demirin yokluğunda en stabil bileşik iken demirin varlığında fenolik bileşikler içinde stabilitesi en fazla etkilenen bileşik olmuştur. Sonuç olarak hidroksitirozol yüksek şelatlama kapasitesine sahip olmasına rağmen demir-iii iyonları ile oluşturduğu kompleksler düşük stabilite göstermektedir (6). Zeytinyağı fenolik bileşiklerinin stabilitesi bakırın varlığında ph 5.5 ve 7.4 de incelenmiş ve her iki ph değerinde ve bakır-ii nin yokluğunda, 3,4-DHPEA-EA ile karşılaştırıldığında hidroksitirozolün belirgin bir şekilde yüksek stabilite gösterdiği görülmüştür. Bakırın varlığında ise hidroksitirozolün stabilitesi belirgin bir şekilde azalmakta ve hatta 3,4-DHPEA-EA dan bile fazla etkilenmektedir. ph 7.4 de bakırın varlığında en iyi stabiliteyi 3,4-DHPEA-EDA göstermektedir. Bu sonuçlar; hidroksitirozolün, bakırın prooksidan aktivitesini azaltmaktaki düşük kapasitesini açıklamaktadır (1). Sızma zeytinyağındaki fenolik bileşiklerin, ABTS.+ [2,2 -azinobis(3-etilbenzotiazolin)-6-sülfonik asit,diamonyum tuzu] radikalini yakalama aktivitesi incelenerek polar bileşiklerin antioksidan aktivitesinin, temel olarak radikal yakalama yeteneklerinden kaynaklandığı belirlenmiştir (2). DPPH (1,1- difenil-2-pikrilhidrazil) radikali yakalama aktivitesi 3,4-DHPEA-EA >>hidroksitirozol> oleuropein> α- tokoferol> 3,4-DHPEA-EDA şeklinde sıralanmaktadır. Bu sonuçlara göre demir-iii iyonunun varlığında hem en yüksek radikal yakalama aktivitesine sahip olmasından hem de göreceli olarak düşük demir indirgeme kapasitesinden dolayı 3,4-DHPEA-EA nın yüksek antioksidan aktivitesine sahip olduğu açıklanabilmektedir (5). Reaksiyon ile oluşturulan 3,4-DHPE-EDA-bakır kompleksi ph 5.5 de 3,4- DHPE-EDA ya göre daha yüksek DPPH radikali yakalama aktivitesi göstermektedir. Hatta hidroksitirozol ve oleuropein-bakır kompleksleri ph 7.4 de ph 5.5 e göre aynı oranlarda ve daha yüksek radikal yakalama aktivitesi göstermektedir. Hidroksitirozol ve oleuropeinin ph 7.4 deki düşük stabiliteleri ve yüksek indirgeme kapasiteleri, emülsiyon sistemlerinin yüksek stabilitelerini açıklayamazken, bakır ile oluşturdukları komplekslerinin yüksek radikal yakalama aktiviteleri bu ph daki yüksek antioksidan aktivitelerini açıklamaktadır (1). 3.Sonuç Sonuç olarak; metalik maddelerin olmadığı zeytinyağında ve emülsiyon sistemlerde fenolik bileşiklerin antioksidatif etkileri yüksektir. Geçiş metallerinin bulunması durumunda, bu bileşiklerin antioksidan özellikleri azalmakta ve hatta bazı koşullarda prooksidan bile olabilmektedirler. Fenolik bileşikler, radikalleri yakalama ve metalleri şelatlama özellikleri ile antioksidatif etkiye sahip olurken; geçiş metallerini, hidroperoksitlerin parçalanmasını katalizlemede daha aktif oldukları düşük yüke de indirgeyerek oksidasyonu hızlandırmaktadırlar. Bütün fenolik bileşiklerinin Fe-III ü indirgeme kapasitelerinden 5 kattan fazla Bakır-II indirgeme kapasitesine sahip oldukları görülmektedir. Fenolik bileşiklerin yoğun faza eklenmesi bakırın varlığında bile lipit oksidasyonunun indüksiyon periyodunu uzatmaktadır. Zeytinyağı-su emülsiyon sistemlerinde ise hidroksitirozol ve oleuropein, ph 3.5 ve 5.5 de Fe-III iyonlarının varlığında, ph 5.5 de bakırın varlığında prooksidan etki göstermekte iken, ph 7.4 de her iki fenolik bileşik için antioksidan etki gözlenebilmektedir. 3,4-DHPEA-EDA yüksek konsantrasyonlarda, Fe-III iyonlarının varlığıyla sadece ph 3.5 da prooksidan etki göstermekte iken 3,4- DHPEA-EA, Fe-III ve Bakır-II varlığında bütün ph değerlerinde de antioksidan aktivite göstermektedir. Oksidasyon; sızma zeytinyağının raf ömrü, görünüşü, tat-kokusu gibi kalite özelliklerinde değişikliklere, ayrıca besinsel değerinde azalmaya, antioksidanların kaybına ve toksik maddelerin oluşumuna neden olması ve geçiş metallerinin de oksidasyonu hızlandırması nedeniyle bu konuda çalışmaların arttırılması önerilmektedir. 35
Kaynaklar (1)Paiva-Martins F, Santos V, Mangericao H, Gordon M H. 2006. Effects of copper on the antioksidant activity of olive polyphenols in bulk oil and oil-in-water emulsions. J.Agric.Food Chem. 54, 3738-3743 (2)Bendini A, Cerretani L, Vecchi S, Carrasco-Pancorbo A, Lercker G. 2006. Protective effects of extra virgin olive oil phenolics on oxidative stability in the presence or absence of copper ions. J.Agric.Food Chem. 54, 4880-4887 (3)Servili M, Selvaggini R, Esposto S, Taticchi A, Montedoro G F, Morozzi G. 2004. Health and sensory properties of virgin olive oil hydrophilic phenols:agronomic and technological aspects of production that affect their occurrence in the oil. J. Chromatogr. A.1054, 113-127 (4)Kayahan M, Tekin A. 2006. Zeytinyağı Üretim Teknolojisi. TMMOB Gıda Mühendisleri Odası, 110-115 s, Ankara. (5)Paiva-Martins F, Gordon M H. 2002. Effects of ph and ferric ions on the antioxidant activity of olive polyphenols in oil-in-water emulsions. J. Am. Oil Chem. Soc. 79 (6), 571-576. (6)Paiva-Martins F, Gordon M H. 2005. Interactions of ferric ions with olive oil phenolic compounds. J. Agric. Food Chem. 53, 2704-2709 (7)Osborn H T, Akoh C C. 2003. Effects of natural antioxidants on iron-catalyzed lipid oxidation of structured lipid-based emulsions. J. Am. Oil Chem. Soc. 80 (9), 847-852 36