T.C. İZMİR KÂTİP ÇELEBİ ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ

T.C. İZMİR KÂTİP ÇELEBİ ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ Nd:YAG Lazerin Farklı Enerji Ayarlarının İnsan Dişeti Fibroblastlarından Salınan Biyokimyasal Parametreler Üzerine Etkileri Proje No: 2013-2-TSBP-20 Genel Araştırma Projesi (GAP) SONUÇ RAPORU Proje Yürütücüsü: Yrd. Doç.Dr. Mehmet Sağlam Diş Hekimliği Fakültesi, Periodontoloji Araştırmacının Adı Soyadı Yrd. Doç. Dr. Serhat Köseoğlu Yrd.Doç.Dr.Şükrü Enhoş Biyolog Ayşe Çetinkaya Temmuz 2015 İZMİR

İÇİNDEKİLER Sayfa No: ÖZET 1 ABSTRACT 2 1. GİRİŞ / AMAÇ VE KAPSAM 3 2. GENEL BİLGİLER 4 3. GEREÇ VE YÖNTEM 5 4. BULGULAR 8 5. TARTIŞMA VE SONUÇ 10 6. KAYNAKLAR 13

ÖZET Bu çalışmanın amacı Nd:YAG lazerin (1.064 nm) farklı uygulama ayarlarının, kültür ortamında bulunan insan dişeti fibroblastlarındaki (DF) hücre canlılığı/proliferasyonuna ve bu hücrelerden salınan vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve transforme edici büyüme faktörü-beta (TGF-β) üzerine etkilerinin incelenmesidir. DF sistemik olarak sağlıklı bireylerin bağ dokusundan elde edildi. Hücreler şu lazer parametreleri ile muamele edildi: 1W 10 s, 1,5W 10 s, 2W 10 s, 1W 20 s, 1,5W 20 s, 2W 20 s. Hücre canlılığı/proliferasyonu XTT testi ile analiz edildi. VEGF ve TGF-β salınımları ELISA testi ile belirlendi. XTT testinde 24. ve 48. saatlerde lazer uygulanan gruplar ile kontrol grubu arasında anlamlı fark yoktu (p>0.05). VEGF salınımının 24.saatte, sadece 2W20sn grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak daha fazla olduğu gözlenmiştir (p 0.05). 48.saatte ise tüm gruplar arası anlamlı fark yoktu (p>0.05). TGF-β salınımları 24.ve 48. saatlerde farklı lazer uygulama ayarları ile muameleden etkilenmedi (p>0.05). Bu sonuçlara göre 2W 20sn ayarındaki Nd:YAG lazer tedavisi VEGF salınımını arttırarak erken dönemde yara iyileşme proçesini hızlandırabilir. Bu çalışmadaki farklı uygulama ayarları yumuşak doku prosedürlerinde güvenle kullanılabilir. Anahtar Kelimeler: Nd:Yag lazer, gingival fibroblast, vasküler endotelyal büyüme faktörü, transforme edici büyüme faktörü-beta 1

ABSTRACT The aim of this study was to analyze the influence of different application modes of Nd:YAG laser (1.064 nm) on the cell viability/proliferation and expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor-beta (TGF-β) in human gingival fibroblasts (GF). GF were isolated from human gingival connective tissue of systemically healthy individuals. Cells were treated with different laser parameters as follows; 1W 10 s, 1,5W 10 s, 2W 10 s, 1W 20 s, 1,5W 20 s, 2W 20 s. Cell viability/proliferation was examined using the XTT assay. VEGF and TGF-β expressions were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). In XTT experiment, no significant differences were observed in the different laser applications when compared to the control group at 24 and 48h (p>0.05). Statistically significant increases VEGF expressions were noted only in the 2W 20sn laser group when compared to the untreated control group at 24h (p<0.05). There were no statistically significant differences among all groups at 48h (p>0.05). Expression value of the TGF-β was not affected by irradiation of different application modes of lasers at 24 and 48h (p>0.05). These findings suggest that Nd:YAG laser therapy at 2W 20sn may accelerate the wound healing process at early healing period by increasing the expression of VEGF. These different application modes in this study may be used safely in soft tissue procedures. Key Words: Nd:Yag laser, gingival fibroblasts, vascular endothelial growth factor, transforming growth factor-beta 2

1- GİRİŞ / AMAÇ VE KAPSAM Lazerler günümüzde tıp ve diş hekimliğinde geniş bir kullanım alanına sahiptir. Lazerler periodontolojide gingivektomi, gingivoplasti, vestibüloplasti, frenektomi ve flep operasyonları gibi yumuşak doku cerrahisinde, diştaşı temizliği, kök yüzeyi düzleştirmesi, kemik cerrahisi gibi sert doku operasyonlarında ve yara iyileşmesinde biyostimülasyon amacıyla kullanılmaktadır. Periodontal yara iyileşmesi, periyodonsiyumdaki dişeti fibroblastları, periodontal ligament fibroblastları ve osteoblastları içeren hücrelerin kompleks etkileşimleri ile gerçekleşmektedir. Yara iyileşmesini hızlandırmada bu hücrelerin sitimülasyonu faydalı olmaktadır. Lazerler uygulamasının, yara iyileşmesi üzerine olan pozitif etkisi, hücrelerin mitotik aktivitesini arttırması, hücrelerden kollajen sentezi ve büyüme faktörlerinin salgılanmasını sağlaması ile ilişkilidir. Bu in vitro çalışmanın amacı; farklı enerji ayarlarındaki Nd:YAG lazer uygulamasının, kültür ortamında bulunan insan dişeti fibroblastlarındaki hücre canlılığı ve proliferasyonuna ve bu hücrelerden salınan büyüme faktörleri üzerine etkilerinin incelenmesidir. Bu sayede Nd:YAG lazerin farklı enerji ayarlarının, bu hücrelerden büyüme faktörlerinin salınımını nasıl etkilediği gözlenecek, elde edilen bilgiler literatüre katkıda bulunurken, kliniklerde lazerlerin daha etkili kullanımını sağlayacaktır. 3

2. GENEL BİLGİLER Lazerler tıpta ve diş hekimliğinde güncel alternatif tedavi yöntemlerinden birisidir (1). Günümüzde lazer uygulamaları diş hekimliğinde diş çürüklerinin temizlenmesi, kavite preparasyonu, oral cerrahi işlemler, diş hassasiyeti tedavisi ve periodontal tedavide yaygın olarak kullanılmaktadır (1-4). Periodontolojide kullanılan lazerler diyod lazerler, Nd:YAG lazer, Er:YAG lazer, Er-Cr:YSGG lazer ve karbon dioksit (CO2) lazer tipleridir (5). Lazerler periodontolojide gingivektomi, gingivoplasti, vestibüloplasti, frenektomi ve flep operasyonları gibi yumuşak doku cerrahisinde, diştaşı temizliği, kök yüzeyi düzleştirmesi ve kemik cerrahisi gibi sert doku operasyonlarında kullanılmaktadır (1, 5). Lazer uygulamalarının periodontal tedavide kullanım yerlerinden biride yara iyileşmesinin stimülasyonu ve bakteriyel dekontaminasyondur (6). Periodontal yara iyileşmesi, periyodonsiyumdaki dişeti fibroblastları, periodontal ligament fibroblastları ve osteoblastları içeren hücrelerin kompleks etkileşimleri ile gerçekleşmektedir (6, 7). Dişeti fibroblastları ağızdaki travmatik ve cerrahi yara iyileşmelerinde önemli rol oynar (8). Yara iyileşmesini hızlandırmada bu hücrelerin sitimülasyonu faydalı olmaktadır (8). Lazerler uygulamasının, yara iyileşmesi üzerine olan pozitif etkisi, hücrelerin mitotik aktivitesini arttırması, hücrelerden kollajen sentezi ve büyüme faktörlerinin salgılanmasını sağlaması ile ilişkilidir (6). Büyüme faktörleri, proliferasyon, farklılaşma ve apoptosis gibi biyolojik olaylarda çok önemli rol oynamaktadırlar (6). Ayrıca farklı dokulardaki yara iyileşme sürecinde hücre-hücre ve hücreekstrasellüler matriks etkileşimlerini yönetirler (6, 7). Transforme edici büyüme faktörü-beta (TGF-β) bir çok hücre tipinde ekstraselüler hücre matriksi yapımını sitimüle etmektedir. Bununla birlikte matriks depozisyonunu, kemotaksisi sitimüle edip, ekstraselüler matriks remodelasyonu için gerekli enzimleri regüle eder. Vasküler entotelyal büyüme faktörü (VEGF) ise endotelyal hücre proliferasyonunu sitimüle eden spesifik bir büyüme faktörüdür. Matriks remodelasyonunda görev yaptığı gibi mikrovasküler hiperpermeabiliteyi de indükler. VEGF anjiyogenezis, enflamasyonda ve yara iyileşmesinde rol oynar (9-11). Nd:YAG lazer 1,064 nm dalgaboyuna sahip diş hekimliği alanında en çok kullanılan lazerlerden biridir (5). Nd:YAG lazer periodontolojide periodontal ceplerin dekontaminasyonu, hastalıklı periodontal ceplerin küretajında ve yumuşak doku cerrahisinde sıklıkla kullanılmaktadır (5). Literatürde diyod lazerlerin kullanıldığı düşük doz lazer 4

uygulamalarının yapıldığı in vitro kültür çalışmalarına rastlanmakla beraber Nd:YAG lazerlerle yapılan in vitro çalışmalar oldukça azdır. Lazerler ile yapılan periodontal tedavide başarılı sonuçlar elde etmek için, kullanılacak ideal enerji ayarlarının iyi bilinmesi gerekir. Periodontal hastalıkların tedavisinde kullanılan lazer uygulamalarının periodontal yara iyileşmesi üzerine etkilerinin bilinmesi periodontoloji literatürüne önemli katkı sağlayacaktır. Ayrıca elde edilen bilgiler ışığında lazerlerin diş hekimliği kliniklerinde daha etkili kullanımı sağlanacaktır. 3. GEREÇ VE YÖNTEM Hücre Kültürü Bu in vitro çalışmada kullanılacak olan dişeti fibroblastları sistemik olarak sağlıklı bireylerin bağ dokusundan izole edildi. Dişeti fibroblastları, üst çene ön bölgede kuron yükseltme operasyonunda çıkarılan, enflamatuvar olmayan sağlıklı dişeti dokusundan elde edildi. Kuron yükseltme operasyonu kliniğimizde rutinde yapılan bir operasyondur. Çalışma için özel bir operasyon olarak yapılmadı. Kuron yükseltme operasyonunda çıkarılan dişeti dokusu tıbbi atık olarak atılmaktadır. Bu çalışmada çıkarılan dişeti dokusu biyopsi olarak kullanıldı. Hastalara dişeti dokusu örnekleri alınmadan önce bilgilendirilmiş onam formu imzalatıldı. Operasyon esnasında çıkarılan sağlıklı dokular hemen biyopsi ortamına (Dulbecco s Modified Minimal Essential Medium (DMEM), %10 Fetal Bovine Serum (FBS), Penisilin- Streptomisin) alındı. Hastalardan alınan dişeti dokusu küçük parçalara ayrıldı, biyopsi mediası ile yıkandıktan sonra petri kaplarına konularak üzerine temiz biopsi mediumu konuldu, % 5 CO 2 içeren nemlendirilmiş ortamda 37 o C de inkübe edildi. Bir gün sonra biyopsi mediası kültür mediası (10% fetal sığır serumu içeren (FBS) DMEM, 100 ünite/ml penisilin, 100 μg/ml streptomisin) (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, İsrail) ile değiştirildi. Konfluent bir görüntü elde edildiğinde, hücreler % 0.25 tripsin (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, İsrail) ve % 0.1 etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) ile pasajlandı. Tüm deneylerde 4. ve 6. pasajlar arasındaki hücreler kullanıldı. Çalışmada 1,064 nm dalgaboyundaki Nd:YAG lazer (Twinlight, AT Fidelis, Fotona, Ljubljana,Slovenia) kullanıldı. Çalışma grupları Tablo 1 de gösterilmiştir. Çalışma gruplarındaki lazer ayarları, dişhekimliği pratiğinde kullanılan ayarlardır. 5

Grup I: Kontrol grubu (Lazer uygulanmayan grup) Grup IV: Güç:2W Zaman: 10 sn Grup II: Güç: 1 W Zaman: 10 sn Grup V: Güç: 1 W Zaman: 20 sn Grup III: Güç: 1.5 W Zaman: 10 sn Grup VI: Güç: 1.5 W Zaman: 20 sn Grup VII: Güç: 2 W Zaman: 20 sn Hücrelere lazer uygulaması 300 μm lik fiber optik uç yardımı ile yapıldı. Fiber uç, hücrelerin bulunduğu petri kabından 2 mm uzaklıkta konumlandırılarak lazer uygulaması yapıldı. Deney gruplarına proliferasyon testi, canlılık testi (MTT) ve ELİSA testi yapılacak ve üç kere tekrar edildi. Dişeti fibroblastlarının morfolojisinin değerlendirilmesi Dişeti fibroblastlarının morfolojisini ultrastrüktürel seviyede incelemek için, lazer uygulaması sonrası dişeti fibroblastlarından inverted mikroskop yardımı ile fotoğraf alındı. XTT (2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide) Testinin Gerçekleştirilmesi: Dondurulmuş XTT ve aktivasyon solüsyonları kullanılmadan önce 37 ºC deki su banyosunda çözüldü. Bir adet 96 kuyucuklu plate için, 0.1ml aktivasyon solüsyonu 5ml XTT solüsyonuna eklenerek reaksiyon solüsyonu hazırlandı. Karbondioksit inkübatöründe 37 ºC de, %5 CO2 ortamında 96 kuyucuklu platelerde ki hücrelere lazer uygulamasından 24 ve 48 saat sonra kuyucuklara 50 μl reaksiyon solüsyonu ilave edildi. 37 ºC de 4 saat inkübe edildi sonra plate shakerda hafifçe karıştırıldı. Sonrasında 96 kuyucuklu platelerin abzorbans yoğunluk değerleri ELİSA plate okuyucuda 450 ve 630 nm de okutuldu. Yaşayan hücreler koyu mavi formazan ürünü oluştururken, ölü hücrelerde boya gözlenmez. 630 nm de okunan abzorbans değerleri 450 nm de okunan değerlerden çıkarıldı. Sonrasında kontrol amaçlı sadece media içeren boş 6

(blank) kuyucuğa ait abzorbans değeride son ölçülen değerden çıkarılarak asıl abzorbans değerleri ölçüldü. Deneyler üç kez tekrarlandı. ELISA TESTLERİ VEGF ELISA Testi Kuyucuklar ilk önce 400µl lik yıkama solüsyonu ile yıkandı. Standartlar çiftli çalışıldı. Standartların hazırlanmasına 100 µl lik örnek dilüenti ve 100 µl lik standart solüsyonu kullanıldı. 100 µl örnek dilüenti boş (blank) kuyucuklara eklendi. 50 µl örnek dilüenti ise örnekler için olan kuyucuklara eklendi. Sonra 50 µl lik örnekler örnek kuyucuklarına eklendi. Sonra plate oda sıcaklığında 400rpm deki shakerda 2 saat inkübe edildi. Daha sonra plate 6 kez yıkandı ve sonrasında kuyucuklara 100 µl biyotin-konjugat eklendi. Sonra plate oda sıcaklığında 400rpm deki shakerda 1 saat inkübe edildi. Daha sonra plate 6 kez yıkandı ve sonrasında kuyucuklara 100 µl Streptavidin-HRP eklendi. Sonra plate oda sıcaklığında 400rpm deki shakerda 1 saat inkübe edildi. Daha sonra plate 6 kez yıkandı ve sonrasında kuyucuklara 100 µl TMB Substrate solüsyonu eklendi. Sonra plate oda sıcaklığında yarım saat inkübe edildi. Daha sonra100 µl stop solüsyonu eklenerek 450 nm de okutuldu. TGF-β ELISA Testi Hücre kültürü süpernatant örnekleri assay buffer ile 1:10 oranında sulandırıldı. Kuyucuklar ilk önce 400µl lik yıkama solüsyonu ile yıkandı. Standartların hazırlanmasına 100 µl lik assay buffer ve 100 µl lik standart solüsyonu kullanıldı. 100 µl assay buffer boş (blank) kuyucuklara eklendi. 60 µl assay buffer ise örnekler için olan kuyucuklara eklendi. Sonra 40 µl lik örnekler örnek kuyucuklarına eklendi. Sonra plate oda sıcaklığında 400rpm deki shakerda 2 saat inkübe edildi. Daha sonra plate 5 kez yıkandı ve sonrasında kuyucuklara 100 µl biyotin-konjugat eklendi. Sonra plate oda sıcaklığında 400rpm deki shakerda 1 saat inkübe edildi. Daha sonra plate 5 kez yıkandı ve sonrasında kuyucuklara 100 µl Streptavidin-HRP eklendi. Sonra plate oda sıcaklığında 400rpm deki shakerda 1 saat inkübe edildi. Daha sonra plate 5 kez yıkandı ve sonrasında kuyucuklara 100 µl TMB Substrate solüsyonu eklendi. Sonra plate oda sıcaklığında yarım saat inkübe edildi. Daha sonra100 µl stop solüsyonu eklenerek 450 nm de okutuldu. Verilerin İstatistiksel Analizi Verilerin istatistiksel analizi SPSS 20. Yazılımı ile yapıldı. Elde edilen veriler normal dağılım gösterdiği için parametrik testler yapıldı. Gruplar arası analizlerde tek yönlü varyans analizi ve çoklu karşılaştırmalarda Tukey HSD testi uygulandı. Grup içi analizlerde ise bağımlı örneklerde T testi kullanıldı. P 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. 7

4. BULGULAR Dişeti fibroblastlarının morfolojisinin değerlendirilmesi Mikroskop altında yapılan incelemelerde farklı lazer enerji uygulanan gruplarda gingival fibroblastlarda morfolojik bir değişim saptanmadı. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında gingival fibroblastlar normal mekik (spidle) şekilli olduğu gözlendi. XTT sonuçları Farklı lazer enerji ayarları uygulamaları sonrası 24. ve 48. saatlerde gingival fibroblastların canlılığı/proliferasyonu açısından kontrol grubu ile arasında anlamlı fark bulunamamıştır (p 0.05). Farklı lazer enerji ayarları gruplarının da birbirleri ile arasında gingival fibroblast canlılığı/proliferasyonu açısından 24. ve 48. saatlerde anlamlı fark bulunamamıştır (p 0.05) Grup içi analizlerde 24. ve 48. saatler arasında canlılık/proliferasyon açısından hiçbir grupta anlamlı fark gözlenememiştir (p 0.05) (Figür 1). Figür 1. 24 ve 48. saatlerde kontrol ve lazer uygulanan grupların optik dansite (net abzorbans) değerleri ELISA testleri sonuçları VEGF ELISA testi sonuçları Farklı lazer enerji ayarları uygulamaları sonrası 24.saatte gingival fibroblastların VEGF salınımı açısından gruplar arası anlamlı fark bulunmuştur. VEGF salınımının, 2W20sn grubunda kontrol ve 1W10sn gruplarına göre anlamlı olarak daha fazla olduğu gözlenmiştir 8

(p 0.05). Diğer lazer gruplarında ise kontrol grubuna göre anlamlı fark gözlenememiştir (p 0.05). Farklı lazer enerji ayarları uygulamaları sonrası 48.saatte gingival fibroblastların VEGF salınımı açısından gruplar arası anlamlı fark bulunamamıştır (p 0.05). Grup içi analizlerde 24. ve 48. saatler arasında VEGF salınımı açısından 1,5W20sn grubu hariç bütün gruplarda anlamlı fark gözlenmiştir (p 0.05). VEGF salınımının 24. saatten 48. saate doğru artış eğiliminde olduğu gözlenmiştir (Figür 2). Figür 2. 24 ve 48. saatlerde kontrol ve lazer uygulanan gruplarda VEGF (pg/ml) seviyeleri. *Gruplar arası istatistiksel fark, **Grup içi istatistiksel fark (24 ve 48. Saatler arası) TGF-β ELISA testi sonuçları Farklı lazer enerji ayarları uygulamaları sonrası 24. ve 48.saatlerde gingival fibroblastların TGF-β salınımı açısından gruplar arası anlamlı fark bulunamamıştır (p 0.05). Grup içi analizlerde 24. ve 48. saatler arasında TGF-β salınımı açısından açısından hiçbir grupta anlamlı fark gözlenememiştir (p 0.05) (Figür 3). 9

Figür 3. 24 ve 48. saatlerde kontrol ve lazer uygulanan gruplarda TGF-β (pg/ml) seviyeleri. 5. TARTIŞMA VE SONUÇ Bu projede Nd:YAG lazerin farklı enerji ayarlarının gingival fibroblastların canlılığına/proliferasyonuna ve bu hücrelerden VEGF ve TGF-β gibi büyüme faktörlerinin salınımına olan etkisi araştırılmıştır. Gutknecht ve ark. Nd:YAG lazerin yumuşak dokuda güvenli kullanım ayarlarını belirlemek için, Nd:YAG lazerin fibroblast hücre kültürü üzerine histolojik etkilerini araştırmışlardır. Bu çalışma sonucunda 2.1W 20sn enerji ayarının fibroblast hücrelerinde termal bir hasar oluşturmadığını ancak 30 sn ve üzeri uygulamaların hücrelerde termal hasara neden olduğunu gözlemlemişlerdir. 2W 30 sn enerji ayarının hücrelerin DNA metabolizmasında ve hücre bölünme oranlarında inhibisyona neden olduğunu ancak bu durumun hücre morfolojisini dejeneratif olarak değiştirmediğini belirtmişlerdir. Yine aynı çalışmada 2.4 W 30sn enerji ayarının hücrelerde spontan piknoza sebep olduğunu, 2.4W 40 sn enerji ayarının ise hücrelerde tam bir nekroza sebep olduğunu rapor etmişlerdir (12). Chen ve ark. ait diğer bir çalışmada ise Nd:YAG lazerin hücre morfolojisi ve canlılığı açısından gingival fibroblastlar üzerine biyolojik etkinliği incelenmiştir. Bu çalışmada farklı enerji ayarları (1W 10 sn, 1,5W 10 sn, 2W 10sn, 3W 10 sn) gingival fibroblast hücre kültürleri üzerine neredeyse kontak şekilde ve 2mm uzaktan olacak şekilde uygulanmıştır. Neredeyse kontak olacak şekilde uygulanan gruplarda hücre canlılığında anlamlı azalmalar gözlenirken, 2mm uzaktan uygulanan gruplarda hücre canlılığında anlamlı bir azalma gözlenmemiştir (13). Yang ve ark. 10

ise Nd:YAG lazerin periodontal ligament fibroblastları üzerine etkinliğini inceleyen bir çalışma yapmışlar. Bu çalışmada farklı enerji ayarları (0,5 W, 1,0 W, 1,5 W, 2,0 W, 2,5 W ve zamanlarının (10 s,20 s,40 s,60 s) etkinliğini incelemişlerdir. Çalışmanın sonucunda 10sn uygulanan enerji ayarlarında ve 20 sn uygulanan 0.5W ve 1W ayarlarında hücre canlılığında anlamlı bir azalma gözlenmemiştir (14). Bir başka çalışmada ise Nd:YAG lazer Saos-2 osteoblastları, H-end endotelyal hücreleri, and NIH/3T3 fibroblastları üzerine 1W ve 1.4 W enerji dozlarında, 10sn ve 400µm lik fiber optik uç ile 2mm uzaktan uygulanmıştır. Bu uygulanan dozların test edilen hücre tiplerinin canlılığını olumsuz yönde etkilemediği gözlenmiştir (15). MC3T3-E1 osteoblastları üzerinde yapılan bir başka çalışmada ise Nd:YAG lazer 0.75 W (farklı enerji yoğunluklarında 1,5, 3 ve 5 J/cm 2 ) enerji ayarında farklı sürelerde (4-12 sn), 300µm lik fiber optik uç ile hücrelerden 3 cm uzaktan uygulanmıştır. Lazer uygulanan gruplarda kontrol grubuna kıyasla hücre proliferasyonunda anlamlı düşüş gözlenmiştir (16). Bizim çalışmamızda ise farklı enerji ayarlarındaki lazer uygulaması gingival fibroblastların canlılığını olumsuz şekilde etkilememiştir. Çalışmamızda Nd:YAG lazer 300 μm lik fiber optik uç yardımı ile ve 2mm uzaktan uygulanmıştır. Çalışmamızın sonuçları Chen ve ark.(13), Yang ve ark.(14) ve Chiellini ve ark.(15) yaptıkları çalışmaların sonuçları ile uyumludur. Literatürde lazerlerin büyüme faktörleri salınımı üzerine etkisini inceleyen farklı çalışmalar mevcuttur. Bu çalışmalarda genellikle diyod lazer kullanılırken, Nd:YAG lazer kullanılan çalışmalar azdır. Saygun ve ark. yaptıkları bir çalışmada 685 nm dalga boyundaki diyod lazeri 2 J/cm 2 enerji yoğunluğunda, 140 sn gingival fibroblastlara tek doz ve ardarda 2 gün çift doz uygulamışlar ve bu hücrelerden temel fibroblast büyüme faktörü (bfgf), insülin benzeri büyüme faktörü (IGF-1) ve IGF-1 reseptörü (IGFBP3) salınımını incelemişlerdir. Çalışma sonucunda lazer uygulamaları gingival fibroblastlardan bfgf, IGF-1 ve IGFBP3 salınımını arttırmıştır (17). Damante ve ark. ise iki farklı dalga boyundaki diyod lazeri (660 nm ve 780nm) 40±6.24 mw enerji ayarında gingival fibroblastlara uygulamışlar ve bu hücrelerden keratinosit büyüme faktörü (KGF) ve bfgf büyüme faktörlerinin salınımına bakmışlardır. Çalışmanın sonucunda KGF salınımı kontrol ve lazer gruplarında aynı iken, bfgf salınımı 780 nm lik diyod lazer uygulamalarına istatistiksel olarak daha fazla bulunmuştur (18). Hakkı ve ark. yaptığı bir çalışmada ise diyod lazer faklı enerji ayarlarında (Enfekte cep modu 2 W, 20 s/cm 2 kesikli mod, periodontal cep modu 1.5 W, 20 s/cm 2 kesikli mod ve biyostimülasyon modu 0.3 W, 20 s/cm 2 devamlı dalga modu) gingival fibroblastlara uygulanmış ve bu uygulamalar sonrası 11

gingival fibroblastlardan IGF, VEGF, TGF-β ve tip I kollajen mrna salınımları incelenmiştir. IGF, VEGF, TGF-β mrna salınımları lazer gruplarında kontrol grubuna kıyasla artarken, tip I kollajen mrna salınımı yalnız biyositimülasyon modunda artmıştır (6). Nd:YAG ile yapılan çalışmalar bakıldığında, Chiellini ve ark. Nd:YAG lazeri 1W ve 1.4 W enerji dozlarında, 10sn uygulamışlar ve lazer uygulanan osteoblast hücrelerinden osteopontin, alkalen fosfataz (ALP) ve runt-related transkripsiyon faktörü salınımının, fibroblastlardan tip I kollajen salınımının ve endotelyal hücrelerden ise vinkulin salınımının arttığını rapor etmişlerdir (15). Kim ve ark. ise Nd:YAG lazeri 0.75 W (farklı enerji yoğunluklarında 1,5, 3 ve 5 J/cm2) enerji ayarında farklı sürelerde (4-12 sn) uygulayıp, MC3T3-E1 osteoblastlarından ALP ve kemikle ilişkili gen salınımlarına bakmışlardır. Nd:YAG uygulamasının ALP aktivitesini, endojen kemik morfogenetik protein-2 (BMP-2) yi ve gen salınımını arttırdığını rapor etmişlerdir (16). Üşümez ve ark. ise wistar ratlarda yara modeli oluşturup, farklı dalga boyundaki lazerlerin (660, 810, 980, and 1,064 nm) yara iyileşmesinde rol oynayan büyüme faktörleri üzerine olan etkisini incelemişlerdir. Çalışmanın sonucunda TGF-β salınımı farklı dalga boyundaki lazer uygulamalarından etkilenmez iken, platelet kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) salınımı en yüksek Nd:YAG lazer grubunda, bfgf salınımı ise en yüksek 980nm diyod lazer ve Nd:YAG grubunda rapor edilmiştir (19). Bizim çalışmamızda ilk 24 saatte 2W 20 sn grubunda VEGF salınımı, kontrol ve 1W 10 sn grubuna göre anlamlı olarak fazlaydı. Diğer lazer uygulanan gruplarda VEGF salınımı kontrol grubuna nazaran fazla gibi gözükse de istatistiksel bir önem bulunamadı. 48.saatteki VEGF salınımları açısından gruplar arası fark gözlenmedi. Lazer uygulanan gruplar TGF-β salınımını hem 24. hemde 48. saatlerde anlamlı bir şekilde etkilememiştir. Bu sonuç Üşümez ve ark. (19) wistar ratlarda yaptığı çalışma ile uyumlu bulunmuştur. Çalışmamızda lazer grupları ile kontrol grupları arasında anlamlı farkların bulunamaması örnek sayısının az olması, bunun yanında elimizdeki lazerin biyositimülasyon dozu olan 0.25 W ın kullanılmaması, kullandığımız uçun çapı veya uygulama uzaklığı ile ilişkili olabilir. Bu çalışmanın sonucu olarak Nd:YAG lazerin bu çalışmada kullanılan enerji ayarları hücre canlılığını etkilemediği için, bu dozlar yumuşak doku uygulamalarında güvenle kullanılabilir. Yara iyileşmesi bakımından erken dönemde 2W 20sn uygulaması faydalı olabilir. 12

Kaynaklar 1. Ishikawa I, Aoki A, Takasaki AA, Mizutani K, Sasaki KM, Izumi Y. Application of lasers in periodontics: true innovation or myth? Periodontol 2000 2009; 50: 90-126. 2. Keller U, Hibst R, Geurtsen W, et al. Erbium:YAG laser application in caries therapy. Evaluation of patient perception and acceptance. J Dent 1998; 26: 649-656. 3. Pick RM, Colvard MD. Current status of lasers in soft tissue dental surgery. J Periodontol 1993; 64: 589-602. 4. Liu HC, Lin CP, Lan WH. Sealing depth of Nd:YAG laser on human dentinal tubules. J Endod 1997; 23: 691-693. 5. Aoki A, Sasaki KM, Watanabe H, Ishikawa I. Lasers in nonsurgical periodontal therapy. Periodontol 2000 2004; 36: 59-97. 6. Hakki SS, Bozkurt SB. Effects of different setting of diode laser on the mrna expression of growth factors and type I collagen of human gingival fibroblasts. Lasers Med Sci 2012; 27: 325-331. 7. Wikesjo UM, Selvig KA. Periodontal wound healing and regeneration. Periodontol 2000 1999; 19: 21-39. 8. Kreisler M, Christoffers AB, Al-Haj H, Willershausen B, d'hoedt B. Low level 809-nm diode laser-induced in vitro stimulation of the proliferation of human gingival fibroblasts. Lasers Surg Med 2002; 30: 365-369. 9. Grazul-Bilska AT, Johnson ML, Bilski JJ, et al. Wound healing: the role of growth factors. Drugs Today (Barc) 2003; 39: 787-800. 10. Cross KJ, Mustoe TA. Growth factors in wound healing. Surg Clin North Am 2003; 83: 531-545, vi. 11. Janis JE, Kwon RK, Lalonde DH. A practical guide to wound healing. Plast Reconstr Surg 2010; 125: 230e-244e. 12. Gutknecht N, Kanehl S, Moritz A, Mittermayer C, Lampert F. Effects of Nd:YAG-laser irradiation on monolayer cell cultures. Lasers Surg Med 1998; 22: 30-36. 13. Chen YJ, Jeng JH, Lee BS, Chang HF, Chen KC, Lan WH. Effects of Nd:YAG laser irradiation on cultured human gingival fibroblasts. Lasers Surg Med 2000; 27: 471-478. 14. Yang MB, Ding Y, Jiang JQ, Deng H, Tian H. [Effect of pulsed Nd: YAG laser irradiation on periodontal ligament fibroblast cultures]. Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi 2005; 23: 467-470. 15. Chellini F, Sassoli C, Nosi D, et al. Low pulse energy Nd:YAG laser irradiation exerts a biostimulative effect on different cells of the oral microenvironment: "an in vitro study". Lasers Surg Med 2010; 42: 527-539. 16. Kim IS, Cho TH, Kim K, Weber FE, Hwang SJ. High power-pulsed Nd:YAG laser as a new stimulus to induce BMP-2 expression in MC3T3-E1 osteoblasts. Lasers Surg Med 2010; 42: 510-518. 17. Saygun I, Karacay S, Serdar M, Ural AU, Sencimen M, Kurtis B. Effects of laser irradiation on the release of basic fibroblast growth factor (bfgf), insulin like growth factor-1 (IGF-1), and receptor of IGF-1 (IGFBP3) from gingival fibroblasts. Lasers Med Sci 2008; 23: 211-215. 18. Damante CA, De Micheli G, Miyagi SP, Feist IS, Marques MM. Effect of laser phototherapy on the release of fibroblast growth factors by human gingival fibroblasts. Lasers Med Sci 2009; 24: 885-891. 19. Usumez A, Cengiz B, Oztuzcu S, Demir T, Aras MH, Gutknecht N. Effects of laser irradiation at different wavelengths (660, 810, 980, and 1,064 nm) on mucositis in an animal model of wound healing. Lasers Med Sci 2014; 29: 1807-1813. 13