REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ
Rekombinant-DNA teknolojisinin gelişimindeki önemli atlama taşları: 1860-1865 Gregor Mendel Bezelye çaprazlamaları ile döllere gen geçişini ilk kez ortaya çıkardı
1953 Watson ve Crick : DNA' nın çift iplikli sarmal yapısı keşfedildi. 1957 Kornberg : DNA polimeraz izole edildi. 1966 Nırenberg ve ark: Genetik kod çözümlendi. 1967 Gellert : DNA ligaz izole edildi.
1970 Hamilton Smith Restriksiyon enzimlerini (DNA makasları) keşfetti DNA yı belli noktalardan kesebilen enzimler
1972-73 Jackson ve ark : İlk r-dna molekülü oluşturuldu. Boyer ve ark : Gen klonlama tekniğinde plazmidler keşfedildi 1975 Southern : hibridizasyon tekniği geliştirildi. " Southern Blot " tekniği. Kan ve ark : ilk prenatal teşhis
1977 Walter Gilbert ve Allan Maxam, ayrıca Fred Sanger ayrı ayrı laboratuvarlarda DNA nın şifresini çözecek DNA baz dizisini ortaya çıkaran DNA dizileme metodunu geliştirdiler
1978 Yuet Wai Kan ve Andree-Marie Dozy restriction-fragment-length polymorphism (RFLP) yöntemini geliştirdiler
1979 Goeddel ve ark: ilk rekombinant insülin 1982 Palmiter ve Brinster : Transgenik fareler Spradling ve Rubin : Transgenik meyve sinekleri üretildi.
1985-1990 Kary Mullis arkadaşları polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) adı verilen, hızlı DNA klonlaması ve dizi tepitinde önemli bir teknik geliştirdiler
1994; İlk transgenik domates satış izni aldı 1986; İlk hastalık geni pozisyonel klonlama ile tayin edildi ;immun bir hastalık olan kronik granulomatos hastalığı. 1987; Rekombinant hepatit B aşısı üretildi. 1989; ABD de İnsan Genomu Araştırma Ulusal Merkezi kuruldu
1993 Stilman ve Hall : İnsan embriyosunun klonlanması çalışmaları. 1997 Wilmut : Koyun klonlanması (Erişkin memeli hücrelerinden) 1998 İnsan Genom Projesi (İGP) başlatıldı 2000 li yıllar: İGP tamamlandı (2003) DNA çipleri Farmakogenetikte atılımlar Kök Hücre - tedavi
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler Özel kesici enzimler kullanarak DNA molekülünün kesilmesi DNA nın Klonlanması DNA - nukleotid dizisinin hızlı bir şekilde saptanması Nukleik asit hibridizasyonu Genetik Mühendisliği
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler - 1 Özel kesici enzimler kullanarak DNA molekülünün kesilmesi HpA I 5' G-T-T * A-A-C 3' 3' C-A-A * T-T-G 5' Eco RI 5' G *A-A-T-T-C 3' 3' C-T-T-A-A * G 5' Hind III 5' A *A-G-C-C-T 3' 3' T-T-C-G-G * A 5' Pst I 5' C-T-G-C-A * G 3' 3' G * A-C -G-T-C 5' Restriksiyon enzimleri (DNA makasları)
Restriksiyon enzimleri Enzim Elde edildiği kaynak Tanıma bölgesi BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC EcoRI Escherichia coli RY13 GAATTC HaeIII Haemophilus aegyptius GGCC HindIII Haemophilus influenzae Rd AAGCTT HpaI Haemophilus parainfluenzae GTTAAC HpaII Haemophilus parainfluenzae CCGG MboI Moraxella bovis GATC NotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC SfiI Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNNGGCC TaqI Thermus aquaticus TCGA
Restriksiyon enzimi (DNA makası) olan EcoRI çembersel DNA molekülünü keserek yapışkan uçlara sahip doğrusal şekle getirir
RFLP (Parça uzunluk polimorfizmi)
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler - 2 DNA - nukleotid dizisinin hızlı bir şekilde saptanması Enzimatik Yöntem (Sanger Yöntemi) Kimyasal yöntem (Maxam-Gilbert Yöntemi)
DNA dizileme yöntemi dideoksinukleotid, 2, 3 dideoksi CTP.
DNA dizileme yöntemi
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler- 3 Nukleik asit hibridizasyonu: Southern transferi : DNA hibridizasyonu Nouthern transferi : RNA hibridizasyonu
Nukleik asit hibridizasyonu Southern Transferi
Rekombinant dna teknolojisinde kullanılan yöntemler - 4 DNA Klonlaması Vektör kullanarak canlı hücrede DNA çoğaltımı ; *Plazmid *Virus genetik materyeli Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile çoğaltım işlemi (tüpte)
Plasmid PBR322 nin genetik haritası. İki tane antibiyotik dirençlilik geni taşır
Kimerik DNA (veya Rekombinant- DNA) oluşturma: Plazmid DNA sının yabancı DNA molekülü ile birleştirilmesi
Bakteri kullanarak DNA veya Gen Klonlanması
Bakteri (E. coli) tarafından rekombinant memeli Proinsulin sentezi
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR veya PCR) Kalıp DNA DNA polimeraz (Yüksek ısıya dayanıklı) Primerler dntp ler ( CTP-ATP-GTP-TTP)
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler - 5 Genetik Mühendisliği Transgenik hayvan ve bitkiler üretmek Transgen: Yabancı gen (veya DNA) Transgenik: Yabancı geni taşıyan organizma Transgenik model oluşturmak: Hücrelere yeni gen nakli ( bir gen üzerinde değişiklik yaptıktan sonra -mutant gen- normal genin yerine sokulması) ile farklı özellikler taşıyan organizmaların üretilmesi.
Transgenik hayvan oluşturma yöntemleri; 1- Döllenmiş yumurtaya gen transferi ile transgenik hayvan (fare) üretimi 2- Embriyonik kök hücrelerine (EKH) gen transferi ile transgenik hayvan (fare) üretimi
Transgenik fare: Döllenmiş yumurta hücresine büyüme hormonu geni eklenen transgenik fare dev boyutlarda.
Rec- DNA Teknolojisinin Kullanıldığı Alanlar
Rekombinant DNA teknolojisinin biyomedikal önemi Birçok hastalığın moleküler temelini anlamak (ailesel hiperkolesterolemi, orak hücre anemisi, talessemi, kistik fibroz, müsküler distrofi) Rec-DNA teknolojisi kullanılarak tedavi etmek (örn: insülin, büyüme hormonu, plazminojen aktivatörü) Aşılar üretmek (hepatit B) Tanı (AIDS testi) Tedavi (gen tedavisi)
Prenatal tanıda Beta thalessemia, Duchenne müsküler distrofi, Frajil-X sendromu
Kanser teşhisinde retroviruslar Onkogenler Mutant genler
Aşı üretiminde Yenebilir aşıların üretimi Muz patates gibi ürünlere hepatit B, Kolera aşılarının klonlanması Çocuklar ölmesin Şekerde yiyebilsinler
Biyoteknolojik çalışmalarda Çevre mühendisliğinde biyolojik savaş süper bakteriler oktan, ksilen, naftalin ve karışık hidrokarbonlar gibi petrol artıklarını kullanabilen bakteri türlerinden, tüm bu özellikleri bir arada taşıyan mikroorganizma.
Hastalıkların moleküler seviyedeki patolojik tanıları Diyabet ateroskleroz ve koroner arter hastalıkları Alzheimer, şizofreni, parkinson
Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 1 proteinleri kodlayan genlerde meydana gelen mutasyonlar sonucu hasarlı veya eksik protein üretimine dayanır. Bu patolojilere göre genetik hastalıklar Bir proteinin alt gruplarını oluşturan proteinlerde mutasyon Thalessemia ler (Otosomal resesif) Enzim hasarları Aminoasidopatiler;Fenilketonuri, (Otosomal resesif) Lizozomal depo hastalıkları; Tay-Sacs hastalığı (Otosomal resesif). İnklüzyon hücre hastalığı (protein trafiğindeki hata)
Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 2 Reseptör proteinlerindeki hatalar ve eksiklikler Ailesel Hiperkolesterolomi (Otosomal dominant) Transport proteinlerindeki hatalar Kistik fibrozis (Otosomal resesif) Yapısal proteinlere bağlı hastalıklar Ducshenne Müsküler distrofi ( Kasta Distrophin protein eksikliği ) (X e bağlı) Osteogenesis imperfecta ve Ehlers Danlos ( kollogen sentez hataları ) (Otosomal dominant)
Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 3 Nörodejenaratif hastalıklar Alzheimer Hastalığı (Otosomal dominant veya çok nedenli) Büyüme veya farklılaşma proteinlerinde hasarlar Kalıtsal meme ve ovaryum kanserleri : ( BRCA1- BRCA2 mutasyonlarına bağlı ) (otosomal dominant)
Viral ve bakteriyal enfeksiyonlarda patojenin tespitinde Tüberküloz bakterisinin tespiti m. tuberculosis (PCR ile ) ayrıca alt tiplerinin tayini Hepatit virusu Herpes simplex onko-virusların tayini
DNA çipleri
Biyoteknolojik çalışmalarda İlaç sanayisinde; Antitripsin Kistik fibrozda
Adli Tıpta şüpheli suçlunun tayini veya babalık tayini
Gen Tedavisi AMAÇ: Mutant fenotipi düzeltmek
Gen tedavisi için kullanılan vektörler: Viral Vektörler: * Retroviruslar * Adenoviruslar Viral Olmayan Vektörler : * Çıplak DNA (plazmid içine sokulmuş hedef DNA) * Lipozomlar içine sokulmuş DNA paketleri * Protein-DNA bileşenleri (hücre yüzey reseptörlerine bağlanan protein ve DNA bileşeni) * Yapay kromozomlar
Retroviruslar: viral genom, konak hücre DNA sına katılır. Adenoviruslar: viral genom, konak hücre DNA sına katılmaz kromozom dışında sitoplazmada genetik materyal olarak bulunur. insersiyonal mutasyona neden olmaz.
Gen transferinde çeşitli yöntemler vardır: Rekombinant- DNA'nın lipid vezikülleri (lipozomlar) ile hücreye sokulması. Virus genomu içine ilgili DNA parçasının sokularak tranfeksiyon Nukleus içine mikroenjeksiyon ile rekombinant- DNA'nın sokulması.
Gen tedavisi Vektörler iki yoldan organizmaya verilir Ex vivo: Organizma dışına alınan mutant hücrenin düzeltilerek yeniden organizmaya verilmesi In vivo: Dışarıda hazırlanan normal geni taşıyan vektörün organizmaya verilmesi
Ex vivo Gen tedavisi örnekleri SCID: Ciddi kombine immun yetmezlik hastalığı Adenozin deaminaz (ADA ) mutasyonu Kemik iliğinden kan kök hücreleri çıkarılır. Sağlam gen bir vektör yardımı ile kök hücreye nakledilir. Kök hücre organizmaya geri sokulur. DMD : Duchen müsküler distrofi : Distrofin proteini mutant.
Gen tedavisi örnekleri 1 Ailesel Hiperkolesterolemi ;LDLR: Düşük dansiteli lipoprotein reseptör geninde mutasyon. (LDLR: Karaciğerde sentezlenir ) Kalp ve damar hastalıklarına yatkınlık nedeni LDLR- / LDLR- hastaların karaciğer hücreleri alınır, normal gen retroviruslar ile hepatositlere sokulur, düzeltilmiş hücreler portal ven ile vücuda verilir.
Gen tedavisi örnekleri 2 İn vivo Kistik fibroz: Klor kanal proteini mutant. Adenoviruslara normal gen sokulup sprey yolu ile burun mukozasına verilir.
Homolog rekombinasyon ile gen inaktivasyonu
Klonlama
DNA mikroenjeksiyonu; klonlanmış plazmid DNA sının mikroenjeksiyon ile döllenmiş fare yumurta hücresindeki erkek pronukleusu içine aktarılışı
Dolly 1996 da Keith Campbell and Ian Wilmut tarfından Roslin enstitüsünde, (Edinburgh, İskoçya) da klonlandı
Mikroenjeksiyon
İnsan Genom Projesi
1990 da ABD de İnsan Genom Projesi başlatıldı (US Department of Energy and the National Institutes of Health) 15 yıllık plan içinde bitirilmesi planlandı Teknolojideki hızlı gelişmeler ile 4 yıl önce bitirildi http://www.ornl.gov/techresources/human_genome/home.html
İGP ile ilk başta 3 milyon DNA baz çiftinin % 97.7 sinin dizilenmesi amaçlandı ilerleyen yıllarda 2000 yazında % 90 nının çözülmesi amaçlandı ancak 1 Mayıs 2000 de; 2,540,358,000 bazlık dizi (% 79.1) tespit edildi Sonuç olarak 2003 te %100 lük dizi tespiti amaçlandı %18.6 (598,586,000 baz) tespit adildi
1 Aralık 1999 da, İlk insan kromozunun tümü dizilendi: kromozom 22
İnsan Genom Projesi ile; Gen bilgi bankaları Kalıtsal hastalıklara çareler Genetik danışma
Genomik cografya. İnsan genomu çeşitli yollarla haritalanabilir Fiziksel harita genetik bağlantı haritası