GENETĐK 111-503 EPĐGENETĐK Doç. Dr. Hilâl Özdağ EPĐGENETĐK Epigenetik gen işlevinde çekirdek DNA sının diziliminde bir değişiklik olmaksızın gerçekleşen tersine çevrilebilir kalıtlanabilir değişiklikleri inceler. 1
Epigenetik Kromozomal paketlenme/histon modifikasyonları DNA metilasyon -CpG Islands Imprinting X kromozom inaktivasyonu RNA interferans DNA Metilasyonu DNA temelli olmayan dizilim bilgisinin mayoz veya mitoz yoluyla geçişinin sağlanması. Metillenmiş bir DNA dizilimi replike olduğunda yeni nesil çift sarmalın zincirlerinden yalnızca biri metil şemasını bozulmamış olarak korur, diğer zincirin yeniden metillenmesi gerekir. DNA metiltransferazlar (DNMT): Sitozin nükleotidlerine metil grubu bağlayan enzimlerdir. DNMT ler çıplak sitozinlere metil gruplarını diğer zincirden aldıkları metilasyon şemasına uygun olarak takarlar. 2
DNA Metilasyonu Genomik imprinting X kromozom inaktivasyonu Kromatin modifikasyonu Endojen retrovirusların baskılanması DNA Metilasyonu 3
DNA Metilasyonu DNA Metilasyonu 4
DNA Metilasyonu DNA Metilasyonu 5
Genomik Đmprinting Genomik Đmprinting 6
X kromozom inaktivasyonu X kromozom inaktivasyonu Memeli embriyonik gelişiminin erken safhalarında iki X kromozomundan biri inaktif hale geçer. Đnaktivasyon X kromozomunun proksimal uzun kolunda bulunan ve inaktif X üzerinden transkribe olan bir gen (XIST X inactivation specific trancript) tarafından gerçekleştirilir. X inaktivasyonu erkek ile dişi arasındaki X kromozomu gen ifadesi oranını dengelemeyi sağlayan bir mekanizmadır. 7
X kromozom inaktivasyonu X kromozom inaktivasyonu 8
Kromozomal paketlenme Histon Modifikasyonları 9
Histon Modifikasyonları Histon Modifikasyonları Adapted from Lund and Lohuizen Genes Dev 2004 10
Epigenom Profillemesinde Kullanılan Teknolojiler Epigenom 11
2006 Fizyoloji/Tıp Nobel Ödülü: RNA Đnterferans çift iplikçikli RNA ile genlerin inaktivasyonu keşfi Andrew Z. Fire (1959) Stanford University School of Medicine, Stanford CA,USA Craig C. Mello (1960) University of Massachusetts Medical School Worcester MA, USA Fire A, Xu S, Montgomery M, Kostas S, Driver S, Mello C (1998). "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans". Nature 391 (6669): 806-11 RNA interferans çift iplikçikli RNA nın hücreye girdiği zaman homolog mrna sekansının degradasyonuna yol açmasi ile sonuçlanan transkripsiyon sonrası gen susturma mekanizmasıdır (post-transcriptional gene silencing). 1998 de Andrew Fire ve Craig Mello tarafından Caenorhabditis elegans ta keşfedilmiş ve daha sonra memeliler de dahil olmak üzere pek çok organizmada tanımlanmıştır. 12
RNA Đnterferans http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/how_sirna_works.htm RNA Đnterferans http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/how_sirna_works.htm 13
A. Hücreye giren uzun çift iplikçikli RNA, RNAi nin baslamasını indükler. B. Đlk olarak RNAseIII enzimi olan Dicer RNAya bağlanır. C. Dicer çift iplikçikli RNAyı 3 uçlarda 2 baz çifti çıkıntı (overhang)oluşturacak şekilde,21-23 baz çifti uzunluğunda sirnalara (small interfering RNA) keser. D. sirnalar RISC e (RNA Đnduced Silencing Complex) inkorpore olur. Ago proteini RISCin başlıca bileşenidir. Ago sirna dupleksindeki anlamlı (sense,passenger) iplikçiği ayırır ve uzaklaştırır. Böylece RISC aktive olmus olur. E-F. sirna nın anlamsız ipliği (antisense,guide) RISC i homolog mrna ya yönlendirir ve hedef mrna endonukleolitik olarak degrede edilir 14
Temel bilim uygulamalarına ek olarak RNAi gelecekte tıp alanında önemli bir rol oynamaktadır. Đnterferon cevabından dolayı memelilere uzun dsrna vermek problematiktir. Bu sorunun çözümü sirna kullanımıdır. Sirna Therapeutics ve Alnylam Pharmaceuticals isimli şirketler sırası ile macular dejenerasyon ve solunum yolu syncytial virüsünün tedavisi için ilk olarak sirna kullanarak klinik denemelere başlamışlardır. RNAi kullanılabilecek diğer klinik uygulamalar kanser tedavisi, antiviral aktivite ve Huntington hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklardır. Halen RNAi alanındaki en önemli araştırma alanlarından biri ise hücrelere sirnanın etkin şekilde taşınmasını sağlamaya yöneliktir. Đnsan genlerinin yaklaşık üçte biri mirnalarla regulasyon için potansiyel hedeflerdir. Şu anda bilinen yaklaşık 533 insan mikro RNAsı mevcuttur, kanser gibi bazı hastalıklarda mirna ifade düzeninin değiştiği gözlenmiştir. mirbase`de bugün itibari ile 5000`den fazla mirna girişi yapilmistir (farkli organizmalarda) RNAi nin biyokimyasını anlamak için açıklık getirilmesi gereken sorular RISC aktivitesi nasıl düzenlenir? Holo-RISC enzimini hangi faktörler oluşturmaktadır? Tanımlanan RNAi bileşenlerinin biyokimyasal fonksiyonları nelerdir? Degradasyon-bağımsız RISC etkileyici mekanizmalar nelerdir? Hedef mrna nasıl tanınır, RISC e nasıl yüklenir veya salınır? Degredasyon yapmayan Ago proteinlerinin fonksiyonları nelerdir? 15
Uzun çift iplikçikli RNA Dicer R2D2 ATP Mikro RNA ATP Argonaute Efektör moleküller RİSC mrna yıkılması Kromatin modifikasyonları Translasyonel inhibisyon mirna`lar saçtokası yapısı içeren en az 60-70 bç`lik transkriptler halinde sentezlenir. Bu uzun pri-mirna transkriptleri bir ya da daha cok mirna kodlayabilirler Drosha-Pasha (insan DGCR8) protein kompleksi pre-mirna oluşturur. Sitoplazmaya transfer edilen mirna Dicer ve partner protein ile (Drosophila R2D2, insan TRBP) saçtokası yapısını keser mirna hedef mrnadaki komplementerliğine göre ya translasyonel represyona ya da hedef mrnanın yıkılmasına yol açar. mirna da 5`uçtaki 2-8. bazlar seed region oluşturur ve mirnanın işlevi için bu bölgenin tamamı ile hedef mrnaya komplementer olması gerekmektedir. mirna lar 3`UTR bölgelerine bağlanarak translasyonel represyon sağlarlar. mirna`larin tek hücrelilerde de bulunması RNA inaktivasyonunun çok hücreye geçişten önce varolan bir mekanizma olduğunu göstermistir 16
RNAi bazlı gen inaktivasyonu 17
Mükemmel olmayan komplementerlik örnekleri: mirna sekansları pembe, mrna sekansları yeşil A) A) Birincisi mirna bazlı represyon mekanizmasını calışmak için tasarlanmış bir sirna. Đkincisi ise endojen let-7a mirnasının lin 28 mrnasi ile öngörülmüş interaksiyonu B) B) Endojen mrnalar ve tanımlanmis mrna-mirna örnekleri 18