Türkiye'de 2015-2016 İnfluenza Sezonunda Görülen Influenza A(H1N1)pdm09 Virüsünün Moleküler Karakterizasyonu Dilek Güldemir 1,Ayşe Başak Altaş 1,Fatma Filiz Arı 1,Zekiye Bakkaloğlu 1,Özlem Ünaldı 1,Fatma Bayrakdar 1,Gülay Korukluoğlu 1,Ali Rıza Aktaş 1,Rıza Durmaz 2 1, Mikrobiyobiyoloji Referans Laboratuvarları Daire Başkanlığı, ANKARA 2 Yıldırım Beyazıt Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji ABD, ANKARA
Amaç 2015-2016 influenza sezonunda saptanan Influenza A(H1N1)pdm09 virüsünün hemaglütinin (HA) ve nöraminidaz (NA) genlerindeki mutasyonların analiziyle, suşların virülans ve antiviral direnç özelliklerinin ortaya konulmasıdır. 2
Gereç-Yöntem-1 2015-2016 influenza sezonunda Türkiye nin farklı merkezlerinden THSK na gönderilen solunum yolu örnekleri realtime RT-PCR yöntemiyle incelenmiştir. Influenza A(H1N1)pdm09 açısından pozitif bulunan 56 örnek hücre kültüründe üretilmiştir. Bu örneklerden ekstrakte edilen RNA lar ile RT-PCR yapılmıştır. Pozitif bulunan ve DNA miktarı sekans için yeterli olan 49 örneğin HA ve NA bölgelerinin sekans çalışmaları yapılmıştır. 3
Gereç-Yöntem-2 Dünya Sağlık Örgütü tarafından dizayn edilen primerler kullanılarak; 40 izolatın HA geninin tam, 9 izolatın da parsiyel sekansı çıkarılmıştır. Ayrıca 49 izolatın NA bölgesinde, 275. amino asid olan histidin yerine tirozin girmesi sonucu oluşan ve oseltamivir direncine neden olan mutasyonun olup-olmadığı araştırılmıştır. MEGA 7.0.14 software programı kullanılarak 40 izolatın aminoasit dizisi ile A/California/04/2009 (H1N1) suşunun amino asit dizisi karşılaştırılmış ve homoloji oranları saptanmıştır. 4
Bulgular-1 2015-2016 sezonu A(H1N1)pdm09 suşlarının filogenetik analizi HA geninin tam sekansı elde edilen 40 izolatın A/California/04/2009 (H1N1) suşu ile amino asit dizisi homoloji oranının >%96.8 olarak tespit edilmiştir. Suşların kendi aralarındaki homoloji oranının ise >%99,5 olduğu bulunmuştur. NA geninde bulunan ve NA inhibitörlerine dirençten sorumlu H275Y mutasyonu saptanmamıştır. 5
Bulgular-2 6
Bulgular-3 Tablo 1. Pandemi Ve Pandemi Sonrası Dönemde Ülkemizde Sirküle Olan Influenza A/H1N1 Virüsünün HA Geni -HA1 ve Amino asit değişimleri HA2 Domainleri Üzerindeki Amino Asit Değişimlerinin Karşılaştırılması Influenza A (H1N1)pdm 2009 (Pandemi Sezonu) Influenza A (H1N1)pdm 2010-2011 (Postpandemik Sezon) Influenza A (H1N1)pdm 2015-2016 (Geçtiğimiz sezon) Genogruplar P83S (29/29, %100) (16/16, %100) (40/40, %100) Genogrup 6B S84N - - (40/40, %100) Genogrup 6B.1 D97N (3/29, %10.34) (14/16, %87.5) (40/40, %100) Genogrup 6B S162N - (1/16, %6.25) (40/40, %100) Genogrup 6B.1 (potansiyel yeni bir N- glikozilasyon bölgesi) K163Q - - (40/40, %100) Genogrup 6B S185T - (3/16, %18.75) (36/40,%90) Genogrup 6B A186T - (1/16, %6.25) - Genogrup 6 (resertör bağlanma bölgesi) S203T (29/29, %100) (16/16, %100) (40/40, %100) Genogrup 6B R205K - (12/16, %75) - I216V/T - I216V (12/16, %75) I216T (40/40, %100) Genogrup 6B.1 D222E/N (9/25, %37.5) - - V249L (1/29, %3.45) (12/16, %75) - A256T - - (40/40, %100) Genogrup 6B K283N/E K283N (1/29, %3.45) - K283E (40/40, %100) Genogrup 6B I321V (29/29, %100) (16/16, %100) (39/40, %97,5) Genogrup 6B E374K - (15/16, %93.75) (40/40, %100) Virülans veya antijenik drift ile ilişkili S451N - (3/16, %18.75) (40/40, %100) E499K (40/40, %100) 2015-2016 sezonunda incelenen A(H1N1)pdm09 suşlarının %90-100 ünde saptanan amino asit değişiklikleri tabloda yer almaktadır HA1 domain üzerinde virülansla ilişkili reseptör bağlanma bölgelerinde (135, 160, 184, 187, 191, 222, 223 ve 225. amino asitler) mutasyon görülmemiştir. 7
A/California/07/2009 suşundaki Hemaglütinin proteininin üçlü boyutlu kuaterner yapısı (Parida et al., 2016) Bulgular-4 A/California/07/2009 genogrup 6B mutasyonları: Önceki yıllarda da tespit ettiğimiz amino asit değişimleri solda, 2015-2016 sezonunda saptadığımız ilave değişim ise sağda yer almaktadır. P83S* D97N S203T I321V* K163Q S185T A256T K283E A/California/07/2009 genogrup 6B ile ilgili mutasyonlar altı çizili olarak gösterilmiştir. *: Broberg ve ark. göre sadece Rusya kökenlerinde görülen amino asit değişimleri 8
A(H1N1)pdm09 hemaglütinin proteini monomeri (FluSurver-JSmol). Genogrup 6B.1, A/Norway/2650/2015 (sol), genogrup 6B.2, A/Norway/2658/2015 (sağ). Genogrup 6B.1: Kuzey Avrupa da yeni genetik subclade A/California/07/2009 genogrup 6B.1 mutasyonları: Önceki yıllarda da tespit ettiğimiz amino asit değişimleri solda, 2015-2016 sezonunda saptadığımız ilave değişim ise sağda yer almaktadır. S84N S162N I216T A/California/07/2009 üzerindeki amino asit değişimleri farklı renkte gösterilmektedir. İyi bilinen değişiklikler mavi, yaygın varyant markerlar yeşil ile gösterilmiştir. Virülan ve antijenik drift ile ilgili değişiklikler turuncu, potansiyel yeni bir N- glikozilasyon bölgesi mor ile gösterilmiştir. Bulgular-5 Broberg et al., 2016 9
Sonuçlar Bulgularımızı 2009-2010 pandemi ve 2010-2011 pandemi sonrası influenza sezonundaki bulgularımızla mukayese ettiğimizde şu sonuçlar ortaya çıkmıştır: 1. 2015-2016 sezonunda ülkemizde sirküle olan virüsün HA gen bölgesinde önemli değişiklik yoktur; 2. Bu sezonda incelenen virüslerin virülansla ilgili reseptör bağlanma bölgelerinde önemli bir mutasyon yoktur; 3. Suşların çoğunda saptadığımız reseptör bağlanma bölgesi dışındaki amino asit değişimleri, suşların genetik gruplarının belirlenmesinde ve filogenetik analizinde önemli olduğu için takip edilmesi önem arzetmektedir; 4. Ülkemizde hali hazırda oseltamivir direnci sorun oluşturmamaktadır. 10
11