HBeMONO Revizyon çubuğu, önceki versiyonda yapılan güncellemeleri göstermektedir. Kullanım Amacı İnsan serumu ve plazmasındaki hepatit Be antijen ve hepatit Be antijenine karşı antikorların kalitatif tespiti için enzim immün testidir. Enzim immün testi BEP III Sistemi, BEP 2000 Sistemi veya BEP 2000 Advance Sistemi ELISA işlemcileriyle işlenebilir. Testin otomatik olmayan şekilde çalışılması da mümkündür. Özet ve Açıklama HBe antijeninin ve ilgili antikor anti-hbe'nin sadece hepatit B virüsü enfeksiyonu ile bağlantılı olduğu anlaşılmıştır. HBe antijeni çoğu kez akut bir enfeksiyonun göstergesi olsa da kronik hepatitte de ortaya çıkar 1,2. HBe antijeni hepatit B enfeksiyonunun ilk aşamasında zaten görünür. Hassas bir immüno testi kullanarak, serum HBsAg'sindeki artıştan kısa bir süre sonra veya bazen neredeyse aynı zamanda saptanabilir 3,4. İki antijenin (HBsAg ve HBeAg) titresi virüs çoğalması sırasında hızla yükselir. Ancak, HBsAg'den farklı olarak HBe antijeni seviyesi genellikle ilk görülmelerinden sonra 6 ile 10 hafta içinde oldukça hassas test sistemlerinin saptama limitinin altına düşer 4,5. HBeAg kanda dolaştıkça, karaciğer hastalığının diğer serolojik parametreleri (örneğin yüksek transaminaz) saptanabilir. HBeAg'nin normal eliminasyon süresinin ötesinde dolaşımda kalmaya devam ettiği durumlarda (ki bu daima HBsAg persistansı ile görülür) hastanın kronik agresif hepatit üretme ihtimali vardır 6,7. Bu nedenle, akut hepatit B virüsü enfeksiyonunda HBeAg seviyelerinin izlenmesi teşhis açısından son derece önemlidir 8,9. Klinik seyrinde komplikasyon olmadığında Hepatit B enfeksiyonunun erken iyileşme aşaması sırasında HBeAg artık saptanabilir değildir. Negatif bir HBeAg sonucu sadece enfeksiyon sonrası aşamada değil, akut enfeksiyonun ilk aşamalarında tepe virüs çoğalmasından önce de elde edilebilir 1,2,10. Anti-HBe'nin görünümü bu iki faz arasındaki farklılaştırıcı temeli oluşturur. HBeAg pozitif'ten anti-hbe pozitif'e serokonversiyon, iyileşme gösteren ve komplikasyonsuz bir seyrin iyi bir işaretidir. Yine de bu gibi hastalar HBsAg taşıyıcıları olarak kalabilirler ve kronik inatçı hepatit geliştirebilirler 7,11. Eş zamanlı HBsAg ve HBeAg saptaması olmaksızın saptanan anti-hbe, daha önceki bir hepatit B virüsü enfeksiyonuna işaret eder 5. Prosedürün Prensipleri HBeAg Testi Serum veya plazmadan HBe antijeni saptanması için enzim immüno testi sandviç prensibine dayanmaktadır. Test örneğinde bulunan HBe antijeni monoklonal anti-hbe antikorlarını test plakasının reaksiyon kuyucuklarında bağlar. Anti-HBe/POD Konjugatı (monoklonal) HBe antijenine bağlanır. Konjugatın enzim kısmı Kromojen Çalışma Solüsyonunu maviye dönüştürür. Bu reaksiyon Durdurma Solüsyonu POD ilave edilmesi yoluyla sonlandırılır ve rengin sarıya dönüşmesine sebep olur. Renk yoğunluğu örnek içerisindeki HBeAg konsantrasyonu ile orantılıdır. OQDMG11C48 Rev. 05 TR 2015-04 1/13
Anti-HBe Testi Örnekteki anti-hbe antikorları, pozitif HBeAg Reaktifi ile eklenen HBeAg'yi bağlamak için test plakasının reaksiyon kuyucuklarındaki monoklonal anti-hbe antikorlar ile yarışır. Örnek içerisinde bulunan anti HBe'ye bağlı HBeAg yıkama adımı sırasında çıkarılır. Böylelikle, örnek anti-hbe açısından pozitifse sonraki HBeAg testinde hiç HBeAg saptanmaz veya çok az HBeAg saptanır. Reaksiyon karışımının renk yoğunluğu örnek içerisindeki anti-hbe konsantrasyonu ile ters orantılıdır. Saptama Limiti Reaktifler Bileşim Paul-Ehrlich Enstitüsü'nün referans preparatına dayanarak, Enzygnost HBe monoklonal HBeAg için 1,5 U/mL ve anti-hbe için 1 U/mL saptama limiti göstermektedir. Simgeler Sağlanan Materyaller HBeMONO Enzygnost HBe monoklonal 1 x 96 MTP Enzygnost HBe monoklonal test plakası 1 prç CONJUGATE Anti-HBe/POD Konjugat (monoklonal) 1 x 13 ml REAGENT + HBeAg Reaktifi, pozitif 1 x 13 ml CONTROL + Anti-HBe Kontrol, pozitif 1 x 1,5 ml CONTROL HBe Kontrol, negatif 1 x 2,5 ml WASH POD Yıkama Solüsyonu POD a 1 x 100 ml SUBSTRATE TMB Tampon/Substrat TMB a 1 x 30 ml CHROMOGEN TMB Kromojen TMB a 1 x 3 ml STOP POD Durdurma Solüsyonu POD a 1 x 100 ml EMPTY VIAL CHROM SOL Kromojen Çalışma Solüsyonu için boş şişe 1 prç Yapışkan folyolar 6 prç Polietilen torba 1 prç Barkod değer tablosu 1 prç Kullanım Talimatları 1 prç a Bu bileşenler Enzygnost /TMB ( REF OUVP) için Yardımcı Reaktifler Kitinde de mevcuttur. Test plağı, konjugat, HBeAg Reaktif, pozitif ve anti-hbe Kontrol, pozitif ve HBe Kontrol, negatif her ambalajın üzerinde basılı olan ve her biri sırayla ekteki barkod değerler tablosunda belirtilen 6 haneli lot numarası kombinasyonu ile birlikte kullanılmalıdır. Aynısı, Kromojen TMB ve Tampon/Substrat TMB reaktifleri için de geçerlidir. Enzygnost HBe monoklonal test plakası: HBeAg'ye karşı monoklonal antikorlar ile kaplanmış mikrotitrasyon plağı Anti-HBe/POD Konjugat (monoklonal): HBeAg'ye karşı, peroksidaz ile konjuge edilmiş monoklonal antikorlar Koruyucu: Fenol ( 1 g/l) HBeAg Reaktif, pozitif: Sığır serum albumini ve SYNPERONIC ile stabilize edilmiş, liyofilize rekombinant HBe antijeni Konsantrasyon: Sulandırıldıktan sonra 8 ±5 U HBeAg/mL Koruyucu: Fenol ( 1 g/l) Anti-HBe Kontrol, pozitif: HBe antijenine karşı monoklonal antikorlar içeren insan serumu Konsantrasyon: 30 ±20 U anti-hbe/ml Koruyucu: Fenol ( 1 g/l) HBe Kontrol, negatif: Saptanabilir HBeAg ve anti-hbe içermeyen insan serumu Koruyucu: Fenol ( 1 g/l) Yıkama Solüsyonu POD: Tween içeren fosfat tamponu 2/13 2015-04 OQDMG11C48 Rev. 05 TR
Koruyucu: Fenol ( 1 g/l) Tampon/Substrat TMB: Asetat tampon içinde hidrojen peroksit Koruyucu: N-butanol (%< 1) Kromojen TMB: Tetrametilbenzidin dihidroklorür Durdurma Solüsyonu POD: Sülfürik asit (~ 0,25 mol/l) Uyarılar ve Önlemler İn-vitro tanı amaçlı kullanım içindir. Test, toplu örnekler için değil ayrı ayrı örneklerin test edilmesi için geliştirilmiştir. Uyarı! STOP POD H290, H314: Metaller için korozif olabilir. Ciddi cilt yanıkları ve göz hasarına neden olur. P280, P310, P301, P330, P331, P303, P361, P353, P305, P351, P338, P390, P501: Koruyucu eldiven/koruyucu giysi/gözlük/maske kullanın. Hemen bir ZEHİR DANIŞMA MERKEZİ'ni veya doktoru arayın. YUTULMASI HALİNDE: Ağızınızı çalkalayınız. Kusmaya ZORLAMAYIN. CİLT ÜZERİNDEYSE (ya da saç): Kontamine olmuş tüm giysiler acil olarak çıkarılmalıdır. Cildinizi suyla durulayınız. GÖZLE TEMAS ETMESİ HALİNDE: Suyla bir kaç kere dikkatlice çalkalayınız. Kontakt lens kullanıyorsanız, mümkünse çıkarınız ve gözlerinizi yıkamaya devam ediniz. Malzeme hasarını önlemek için dökülen sıvıyı emdirin. İçeriği ve kabı tüm yerel, bölgesel ve ulusal düzenlemelere uygun şekilde bertaraf edin. DİKKAT! POTANSİYEL BİYOLOJİK TEHLİKE In Vitro Tanı Amaçlı Tıbbi Cihazlara İlişkin AB Direktifi ile uyumlu veya ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından onaylanmış testler kullanılarak, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) 1 ve 2, hepatit B virüsü (HBV) ve hepatit C virüsü (HCV) bakımından, her bir donör ya da donör birimi test edilmiş ve negatif olduğu bulunmuştur. Bilinen hiçbir test bulaşıcı etkenlerin var olmadığı konusunda tam güvence sunamayacağı için, insanlardan elde edilen tüm örneklerin gerekli dikkat ve özen gösterilerek kullanılması gerekmektedir. Güvenlik bilgi formları (MSDS/SDS) www.siemens.com/diagnostics adresinden edinilebilir. Test prosedürünün tamamı boyunca koruyucu gözlüklerin takılması tavsiye edilir. Kullanılan eldivenlerin maruz kalınan materyallere karşı koruma sağlama yeterliliği bilgisi için lütfen üretici talimatlarına uyun. İmha etmek için, katı bulaşıcı malzemelerin en az 1 saat 121 C'de otoklavlanması tavsiye edilir. Aspire edilen tüm sıvılar seri olarak bağlanmış iki kapta toplanmalıdır. Her iki kap içinde insan patojenlerini etkisizleştirebilecek dezenfektan bulunmalıdır. Üretici tarafından belirtilmiş olan konsantrasyonlara ve reaksiyon sürelerine uyulmalıdır. Tampon/Substrat TMB, Kromojen Çalışma Solüsyonu ve Durdurma Solüsyonu POD un ağır metal iyonları ya da oksidasyon maddeler ile temasından kaçınılmalıdır (sıvı ile doğrudan temasa geçen metal parçaları bulunan pipetler kullanmayın). Substrat reaksiyon aşamaları, hipoklorit içeren dezenfektanların yakınında gerçekleştirilmemelidir. Kromojen Çalışma Kromojen Solüsyonu test plağına aktarılmadan önce bir anda mavi renge dönerse solüsyon kontamine olmuş demektir; bu durumda temiz bir kap içerisinde yeni solüsyon hazırlanmalıdır. Yukarıda bahsedilen solüsyonların ciltle temas etmesinden kaçınılmalıdır. Reaktiflerin Hazırlanması Teste başlamadan önce tüm reaktiflerin ve test örneklerinin 18 ile 25 C ye gelmesini sağlayın. Bu adımda test plaklarından folyo torbayı çıkartmayın. Testi işlemeye başlamadan önce gerekmeyen stripleri yuvadan çıkartın ve bunları daha sonra kullanmak üzere ambalajdaki OQDMG11C48 Rev. 05 TR 2015-04 3/13
polietilen torbaya koyun (Bkz. Tablo 1). Reaktifler ile reaktif çalışma solüsyonlarının karıştırılması gerekiyorsa, köpük oluşmasını engelleyin. Her test plağı için 20 ml Yıkama Solüsyonu POD u distile ya da iyonsuzlaştırılmış suyla 400 ml ye seyreltin. Her test plağı için, 1 ml Kromojen TMB'yi, 10 ml Tampon/Substrat TMB (Kromojen Çalışma Solüsyonu) ile, temin edilen boş plastik şişe içinde seyreltin. Işıktan koruyarak saklayın. Kullanılmasının ardından şişeyi distile ya da deiyonize su ile iyice durulayın. Teknik nedenlerden ötürü (aşırı dolum), Kromojen TMB şişesi ile Tampon/Substrat TMB şişesinin tüm içeriklerinin bir araya toplanmasına izin verilemez. Testten önce, bir şişe HBeAg Reaktifi, pozitifi 13 ml damıtılmış veya deiyonize su içinde sulandırın. Nazikçe çalkalayarak karıştırın ve kullanmadan önce reaktifin tamamen çözündüğünden emin olun (yaklaşık 30 dakika). Saklama ve Stabilite Enzygnost HBe monoklonal kitin bileşenleri açılmadan ve belirtilen sıcaklıkta saklandığı takdirde etiketlerin üzerinde belirtilen tarihe kadar kullanılabilir. Açılmış ve ardından sulandırılmış, seyreltilmiş reaktiflerle ilgili stabilite ve saklama verilerinin tamamı için, bkz. Tablo 1. Gerekli Olan Donanım Örnekler Prosedür BEP III: Örnekleri ve kontrolleri manuel olarak dağıttıktan sonra testin otomatik olarak işlenmesi ve değerlendirilmesi BEP 2000/BEP 2000 Advance : Testin tam otomatik olarak gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesi için Pipetler: Sabit veya değişken hacimli piston tipi pipetler veya hacmi ayarlanabilir hacimli tek veya çok kanallı pipetler Testin otomatik olarak işlenmemesi durumunda ek olarak aşağıdakiler de gereklidir: İnkübatör: Kaplanan su banyosu (37 ±1 C) veya benzer inkübasyon yöntemi Yıkama cihazı: Mikrotitrasyon plak yıkayıcı Fotometre: Mikrotitrasyon plakları için uygun fotometre, ölçüm dalga boyu 450 nm, referans dalga boyu 650 nm (uygun olduğunda 615 nm ile 690 nm arası) Testte kullanılan tüm ekipman onaylanmış olmalıdır. Uygun olan örnekler standart laboratuvar teknikleriyle elde edilmiş olan ayrı ayrı örneklerdir (insan serumları veya sitratlı/edta'lı/heparinize edilmiş plazma). Örnekler 2 ile 8 C sıcaklıkta 3 günden fazla saklanmamalıdır. Numuneler bu süre içerisinde dondurulmuşsa, tekrarlanan dondurma çözdürme döngülerinden kaçınılırsa 20 C sıcaklığın altında en az 3 yıl ve 9 ay saklanabilir. Otomatik Çalışılmayan Test Prosedürü HBeAg'nin Saptanması 1. Test şeması: Gereken test plağı kuyucuk sayısı, örnek sayısı alınarak ve HBe Kontrol, negatif ve HBeAg Reaktif, pozitif tayini sayısı (n = 6) eklenerek belirlenir. 2. Örnekleri dağıtın: İlk 4 kuyucuğun (A1-D1) her birine 100 µl HBe Kontrol, negatif, sonraki kuyucuğa (E1) 100 µl HBeAg Reaktif, pozitif ve sonraki kuyucukların her birine 100 µl seyreltilmemiş örnek dağıtın. Serinin sonunda, test plağı sırasına göre, son kuyucuğu 100 µl HBeAg Reaktif, pozitif ile doldurun. 4/13 2015-04 OQDMG11C48 Rev. 05 TR
Yukarıdaki pipetleme şemasına alternatif olarak, HBe Kontrol, negatifi pipetledikten sonra HBeAg Reaktif, pozitifi iki kez pipetlemek de mümkündür. Alternatif pipetleme şeması: 4 kuyucuğun (A1-D1) her birine 100 µl HBe Kontrol, negatif, sonraki 2 kuyucuğa (E1-F1) 100 µl HBeAg Reaktif, pozitif ve sonraki kuyucukların her birine 100 µl seyreltilmemiş örnek dağıtın. Her örnek, kendi pipet ucuyla pipetlenmelidir. Pipetleme işleminin tamamlanmasından sonra test plağını folyo ile kapatın ve derhal inkübatöre koyun. 3. Örnekleri inkübe edin: İnkübasyonu 60 ±2 dakika süreyle 37 ±1 C'de yapın, ardından derhal yıkama adımına geçin. 4. Yıkama: Folyoyu çıkartın ve tüm hazneleri emdirin. Her hazneye yaklaşık 300 µl seyreltilmiş Yıkama Solüsyonu POD doldurun, plakayı emdirin ve yıkamayı bir kez tekrarlayın. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, bir sonraki reaktifin dağıtılması adımına geçin (aksi takdirde kuyucuklar kuruyabilir). 5. Konjugatı dağıtın: Her bir kuyucuğa 100 µl anti-hbe/pod Konjugat (monoklonal) pipetleyin. Ardından test plağını kullanılmamış bir folyo ile kapatın ve derhal inkübatöre yerleştirin. 6. Konjugatı inkübe edin: İnkübasyonu 60 ±2 dakika süreyle 37 ±1 C'de yapın, ardından derhal yıkama adımına geçin. 7. Yıkama: Folyoyu çıkartın ve tüm hazneleri emdirin. Her hazneye yaklaşık 300 µl seyreltilmiş Yıkama Solüsyonu POD doldurun, plakayı emdirin ve yıkamayı üç kez tekrarlayın. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, bir sonraki reaktifin dağıtılması adımına geçin (aksi takdirde kuyucuklar kuruyabilir). 8. Substratın dağıtılması: Her kuyucuğa 100 µl Kromojen Çalışma Solüsyonu pipetleyin ve mikrotitrasyon plağını yeni folyo ile kapatın. 9. Substratın inkübasyonu: Substrat ekleme adımından hemen sonra 18 ile 25 C'de ışıktan koruyarak 30 ±2 dakika inkübe edin. 10. Reaksiyonun durdurulması: Folyoyu çıkartın. Substratın dağıtılması adımındaki ile aynı zamanlamayla kuyucukların her birine 100 µl Durdurma Solüsyonu POD ilave edin. 11. Ölçüm: Test plağını bir saat içerisinde 450 nm de okuyun. Önerilen referans dalga boyu 650 nm'dir veya gerekli durumlarda 615 ve 690 nm arasıdır. Anti-HBe'nin Saptanması 1. Test şeması: Gereken test plağı kuyucuk sayısı, örnek sayısı alınarak ve HBe Kontrol, negatif ve anti-hbe Kontrol, pozitif tayini sayısı (n = 6) eklenerek belirlenir. 2. Örnekleri dağıtın: İlk 4 kuyucuğun (A1-D1) her birine 25 µl HBe Kontrol, negatif, sonraki kuyucuğa (E1) 25 µl anti-hbe Kontrol, pozitif ve sonraki kuyucukların her birine 25 µl seyreltilmemiş örnek dağıtın. Serinin sonunda, test plağı sırasına göre, son kuyucuğu 25 µl anti-hbe Kontrol, pozitif ile doldurun. Yukarıdaki pipetleme şemasına alternatif olarak, HBe Kontrol, negatifi pipetledikten sonra anti-hbe Kontrol, pozitifi iki kez pipetlemek de mümkündür. Alternatif pipetleme şeması: 4 kuyucuğun (A1-D1) her birine 25 µl HBe Kontrol, negatif, sonraki 2 kuyucuğa (E1-F1) 25 µl anti-hbe Kontrol, pozitif ve sonraki kuyucukların her birine 25 µl seyreltilmemiş örnek dağıtın. Her örnek, kendi pipet ucuyla pipetlenmelidir. 3. Anti-HBe'nin bağlanması: Örnekleri dağıttıktan sonra doğrudan 25 µl örnek veya kontrol içeren her bir kuyucuğa 75 µl HBeAg Reaktif, pozitif ekleyin ve ardından folyo ile kapatın. HBeAg testinde anlatıldığı gibi sonraki adımları gerçekleştirin, yani 3. adım Örneklerin inkübasyonu ile işleme devam edin. BEP III Sistemi için prosedür BEP III kullanılırken test plakları örnek dağıtma adımına kadar hazırlanmalıdır ( Otomatik Çalışılmayan Test Prosedürü bölümünde adım 1 ile 2 arası). Kısmen yüklü test plaklarının en az yarı plağa kadar suyla doldurulmuş stripler (6 test stripi) ile desteklenmesini sağlayın. Hemen ardından açık test plaklarını, yani folyo ile kapatılmamış olanları BEP III içine OQDMG11C48 Rev. 05 TR 2015-04 5/13
yerleştirin. Takip eden tüm işlem adımları analiz cihazı tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir (bkz. BEP III Kullanım Kılavuzu). BEP III yazılımındaki inkübasyon süresi ayarları, Otomatik Çalışılmayan Test Prosedüründe tarif edilen sürelerden teknik nedenlerden farklı olabilir (sistem hızı), ancak bunlar BEP III üzerinde Enzygnost için doğrulanmıştır. BEP 2000 Sistemi için prosedür Örnek dağıtma adımları ve bunu takip eden işlemler analiz cihazı tarafından tamamen otomatik olarak yapılır (bkz. BEP 2000 Kullanım Kılavuzu). Kısmen yüklü test plaklarının en az yarı plağa kadar suyla doldurulmuş stripler (6 test stripi) ile desteklenmesini sağlayın. Örneklerin BEP 2000 System ile çalışılması Otomatik Çalışılmayan Test Prosedürü altında verilen bilgiden farklı olsa da Enzygnost 2000 Sistemi üzerinde BEP için doğrulanmıştır. Kalite Kontrolünün Yapılması Doğrulama Kriterleri Testin değerlendirilmesi için aşağıdaki kriterler karşılanmış olmalıdır: HBeAg Testi 1. HBe Kontrol, negatif: -0,010 A 0,100 2. HBeAg Reaktifi, pozitif: A 0,800 Eğer dört HBe Kontrol, negatif absorbans değerlerinden biri tanımlamaların dışındaysa bu değer yok sayılabilir. Tüm HBeAg Reaktif, pozitif absorbans değerleri ilgili tanımlamalar ile uyumlu olmalıdır. Anti-HBe Testi 1. HBe Kontrol, negatif: A 0,400 2. Anti-HBe Kontrol, pozitif: -0,010 A 0,150 Eğer dört HBe Kontrol, negatif absorbans değerlerinden biri tanımlamaların dışındaysa bu değer yok sayılabilir. Tüm anti-hbe Kontrol, pozitif absorbans değerleri ilgili tanımlamalar ile uyumlu olmalıdır. Bu şartlar karşılanmadığı takdirde ilgili test değerlendirme için geçerli değildir. Bu durumda BEP III ve BEP 2000 yazılımı geçersiz test sonucu uyarısı verir. Geçersiz işleme yol açan nedenler araştırıldıktan sonra test tekrar edilmelidir. Sonuçlar Değerlendirmeler BEP III ve BEP 2000 Sistemleri için otomatik olarak yapılır. Lütfen ilgili Kullanım Kılavuzuna başvurun. Yazılım desteği olmadan değerlendirme işlemi yapılmaktaysa, aşağıda belirtilen noktalar dikkate alınmalıdır. Cut-off değeri kullanarak değerlendirme HBeAg Testi Cut off değerini hesaplamak için, HBe Kontrol (negatif) geçerli absorbans değerlerinin ortalamasını kullanın ve 0,050 değerini ekleyin: Ā neg. + 0,050 = Cut off değeri Cut-off değerine dayanarak örnekler aşağıda belirtildiği gibi sınıflandırılmıştır: HBeAg negatif A < cut-off değeri - %10 HBeAg pozitif A > cut-off değeri + %10 HBeAg şüpheli cut-off değeri - %10 A cut-off değeri + %10 Anti-HBe Testi Cut off değerini hesaplamak için, HBe Kontrol (negatif) geçerli absorbans değerlerinin ortalamasını kullanın ve 0,5 ile çarpın: Ā neg. x 0,5 = cut-off değeri Cut-off değerine dayanarak örnekler aşağıda belirtildiği gibi sınıflandırılmıştır: Anti-HBe negatif A > cut-off değeri + %10 6/13 2015-04 OQDMG11C48 Rev. 05 TR
Anti-HBe pozitif A < cut-off değeri - %10 Anti-HBe şüpheli cut-off değeri - %10 A cut-off değeri + %10 Sonuçları şüpheli olan test örnekleri çifte tayin yapmak üzere tekrar test edilmelidir. Yeniden test ederken çift saptamanın ortalama değeri cut-off değerinin üzerindeyse veya bu değere eşitse ya da cut-off değerinin altındaysa, ilk kuşkulu sonuç göz ardı edilebilir ve örnek uygun şekilde pozitif veya negatif olarak değerlendirilebilir. Prosedürün Sınırlamaları 1. Antikoagülanlar (sitrat, EDTA, heparin) ve romatoid faktörleri test sonuçlarını etkilemez. 2. Lipemik ve ikterik örnekler test sonucunu etkilemez. 3. Hemolitik örnekler hatalı biçimde yükseltilmiş reaktivite sergileyebilir. 4. EBV, HAC, kızamık virüsüne karşı IgM antikorları içeren örnekler ve ANA içeren örnekler test sonuçlarını etkilemez. 5. Hemofili hastalarından alınan örneklerin test sonucunu etkilediği gözlemlenmemiştir. 6. Diyaliz hastalarından alınan örnekler ve otoantikorlar bakımından pozitif olan örnekler yüksek reaktivite sergileyebilir. 7. Isıyla etkisizleştirilmiş örnekler (1 saat, 56 C) antijen testine daha düşük değerler üreten HBe antijenin ortaya çıkan denatürasyonu olarak kullanılamaz. 8. Yetersiz şekilde koagüle olmuş serumlar ve mikrobiyolojik olarak kontamine olmuş örnekler kullanılmamalıdır. Partikül niteliğindeki tüm bileşenler (örneğin fibrin pıhtıları, eritrositler) test öncesinde örnekten çıkarılmalıdır. 9. Eritilmiş örnekler kullanılırken materyalin iyice homojen hale geldiğinden emin olun. 10. Kontrol serumları, doğal insan serumundan hazırlanmıştır. Bu nedenle bulanıklık meydana gelebilir, ancak bunun test sonucu üzerinde hiçbir etkisi yoktur. 11. İnkübasyon evresinde test plağı titreşimden korunmalıdır. İnkübatör olarak su banyosu kullanılıyorsa, sağlam bir yüzdürme yardımcısı veya sirkülasyonsuz bir su banyosu kullanılmalıdır. Plağın kuyucukları, ısısı termostatla kontrol altında tutulan suyla temas halinde olmalıdır. Suyun mikrobiyal kontaminasyonunu önlemek için stabilizörler kullanıldığı takdirde, bu gibi bir kontaminasyon spesifik olmayan reaksiyonlara neden olabileceğinden, test plağının yüzeyinin ya da yuvaların sıvıyla temas etmemesi için dikkat edilmelidir. 12. Hepatit B virüsünün çekirdek öncesi bölgesindeki ve çekirdek promotor bölgesindeki mutasyonlar HBe üretememeleriyle tanımlanmıştır. HBe üretememenin yanı sıra bu HBe eksi mutantlar hâlâ enfeksiyözdür ve yerini alabilir 12. 13. Ürün performansını optimize etmek ve ürün özelliklerini karşılamak amacıyla Siemens Healthcare Diagnostics çeşitli analizörlerde bu reaktiflerin kullanımını onaylamıştır. Kullanıcı tarafından belirlenen değişiklikler sistem performansını ve test sonuçlarını etkileyebileceği için Siemens tarafından desteklenmemektedir. Reaktiflerin Siemens Uygulama Kitapçıklarında veya prospektüslerde belirtilenler dışındaki analizörlerde kullanımı veya kullanım talimatlarında yapılan değişikliklerin geçerliliği kullanıcı tarafından onaylanmalıdır. 14. Bu testin sonucu her zaman hastanın tıbbi geçmişi, klinik durumu ve diğer bulgularla birlikte yorumlanmalıdır. Performans Özellikleri Hassasiyet ve Özgüllük Duyarlılık ve kesinlik çalışmalarının sonuçları Tablo 2 ve 4'te özetlenmektedir. Duyarlılığı belirlerken 216 HBeAg pozitif örnekler ve 224 anti-hbe pozitif örnekler iki bağımsız çalışmada incelenmiştir. Ortalama duyarlılık sonuçları şöyledir: OQDMG11C48 Rev. 05 TR 2015-04 7/13
Duyarlılık ilk reaktif yeniden test reaktifi HBeAg testi %98,1 %99,1 Anti-HBe testi %97,8 %99,1 Özgüllüğü belirlerken 2502 HBeAg negatif örnekler ve 2406 anti-hbe negatif örnekler üç bağımsız çalışmada incelenmiştir. Ortalama kesinlik sonuçları şöyledir: Özgüllük İlk başta negatif tekrar test negatif HBeAg testi %99,4 %99,5 Anti-HBe testi %99,6 %99,8 Hassasiyet Not Sonuçlar 5. Tabloda özetlenmektedir. Testlerin spesifik performans özellikleri için alıntılanan değerler tipik sonuçları temsil etmektedir ve Enzygnost HBe monoklonala ait özellikler olarak değerlendirilmemelidir. Bibliyografya 1. McCollum RW, Zuckerman AJ. Viral hepatitis: report on a WHO informal consultation. J Med Virol 1981;8:1-29. 2. Arnold W, Hess G, Meyer zum Büschenfelde KH. Klinische Bedeutung des Hepatitis-Be- Antigen-Antikörper-Systems. Dtsch Med Wschr 1980;105:127-31. 3. Baraldini M, Facchini A, Miglio F, et al. Radioimmunoassay for hepatitis B e antigen and antibody: correlations with viral replication and prognostic value. Vox Sang 1981;41:139-45. 4. Smith AM, Tedder RS. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for hepatitis B e antigen and antibody. J Virol Methods 1981;3:1-11. 5. Mushahwar IK, Dienstag JL, Polesky HF, et al. Interpretation of various serological profiles of hepatitis B virus infection. Am J Clin Pathol 1981;76:773-7. 6. Norkrans G, Lindberg J, Frösner G, et al. Clearance of hepatitis B e-antigen in chronic hepatitis B infection. Scand J Gastroenterol 1982;17:383-7. 7. Reichlin B, Stalder GA, Gudat F, et al. Nachweis von HBeAg, Anti-HBe und Dane-Partikeln im Serum von HBs-Trägern und bei Patienten mit chronischer HBsAg-positiver Hepatitis. Schweiz Med Wochenschr 1982;112:523-4. 8. El Sheikh N, Woolf IL, Galbraith RM, et al. The "e" antigen as a marker of chronic liver disease in hepatitis B antigen-positive patients and blood donors. Digestion 1975;12:279. 9. Fay O, Edwards VM, Mosley JW, Redeker AG. The e antigen as an index of chronic hepatitis B virus infection. Gastroenterology 1975;68:1081. 10. Frösner GG. Die Aussagekraft serologischer Untersuchungsmethoden bei Virushepatiden. Med Klin 1982;77:236-45. 11. Feinman SV, Berris B, Sinclair JC, et al. e antigen and anti-e in HBsAg-carriers. Lancet 1975;2:1173-4. 12. Tong S, Kim KH, Chante C, et al. Hepatitis B virus e antigen variants. Int J Med Sci 2005;2:2-7. 8/13 2015-04 OQDMG11C48 Rev. 05 TR
Simgelerin Tanımı Tekrar kullanmayınız YYYY-MM-DD Son kullanma tarihi LOT Lot Numarası REF Katalog Numarası Dikkat, ekteki dokümanlara başvurunuz Üretici EC REP Avrupa Birliği Yetkili Temsilcisi <n> sayıda test için yeterlidir Biyolojik Tehlikeler IVD In Vitro Diyagnostik Tıbbi Cihaz Saklama derecesi Kullanım talimatlarına başvurunuz Steril değil CE İşareti CONTENTS İçindekiler Sulandırma hacmi LEVEL Seviye Isı ve güneş ışığından uzak tutun BEP, BEP 2000 Advance ve Enzygnost, Siemens Healthcare Diagnostics firmasının ticari markalarıdır. SYNPERONIC, ICI firmasının ticari markasıdır. 2010 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH. Tüm hakları saklıdır. 2015-04 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 35041 Marburg/Germany www.siemens.com/diagnostics OQDMG11C48 Rev. 05 TR 2015-04 9/13
Tablo 1 Saklama ve Stabilite Materyal/reaktif Durum Saklama Stabilite b Enzygnost Anti-HBe monoklonal test plağı, kalan şeritler Anti-HBe/POD Konjugat (monoklonal) açıldıktan sonra 2 8 C kurutucu madde içeren torbada açıldıktan sonra 2 8 C 18 25 C 4 hafta 4 hafta 2 gün HBeAg Reaktifi, pozitif sulandırdıktan sonra 2 8 C 20 C 4 hafta 3 ay Anti-HBe Kontrol, pozitif HBe Kontrol, negatif açıldıktan sonra 2 8 C 20 C 4 hafta 3 ay Kromojen TMB açıldıktan sonra 2 8 C son kullanma tarihi Tampon/Substrat TMB açıldıktan sonra 2 8 C son kullanma tarihi Kromojen Çalışma Solüsyonu 1+10 seyreltilmiş 2 8 C 15 25 C ışıktan korunan kapalı kutu 5 gün 8 saat Yıkama Solüsyonu POD açıldıktan sonra 1+19 seyreltilmiş 2 8 C 2 8 C 18 25 C son kullanma tarihi 1 hafta 1 gün b Durdurma Solüsyonu POD açıldıktan sonra 2 8 C son kullanma tarihi her komponenti en geç son kullanma tarihine kadar kullanın Tablo 2 Duyarlılık İki bağımsız tesiste (K, M) gerçekleştirilen duyarlılık testleri şu sonuçları ortaya koymuştur: Örnek paneli Örnek sayısı ilk reaktif yeniden test reaktifi (M) (K) HBeAg pozitif HBeAg pozitif 109 107 108 104 109 105 (M) (K) anti-hbe pozitif anti-hbe pozitif 96 128 93 126 95 127 Tablo 3 Aldatıcı Panel Örnek paneli Örnek sayısı ilk reaktif yeniden test reaktifi HBeAg pozitif anti-hbe pozitif 65 112 59 105 59 107 Bu paneller daha çok HBeAg/anti-HBe için geçiş aşamasından alınan örnekleri içermektedir. Azalan duyarlılık değerleri immün komplekslerinin oluşmasına bağlanabilir. 10/13 2015-04 OQDMG11C48 Rev. 05 TR
Tablo 4 Özgüllük Üç bağımsız tesiste (K, M, L) gerçekleştirilen kesinlik testleri şu sonuçları ortaya koymuştur: HBeAg testi Enzygnost HBe monoclonal Örnek paneli Örnek sayısı ilk reaktif yeniden test reaktifi (M) normal negatif serumlar normal negatif plazma örnekleri 804 396 3 0 3 0 (K) normal negatif serumlar 528 0 0 (L) HBV olmayan hastalardan alınan negatif sera HBV hastalardan alınan negatif sera kritik sera c 584 124 66 8 5 0 7 3 0 Anti-HBe testi Örnek paneli Örnek sayısı ilk reaktif yeniden test reaktifi (M) normal negatif serumlar normal negatif plazma örnekleri 791 387 2 1 1 0 c (K) normal negatif serumlar 521 1 1 (L) HBV olmayan hastalardan alınan negatif sera HBV hastalardan alınan negatif sera kritik sera c potansiyel olarak enterferans özelliği olan faktörler içeren örnekler, örn. otoantikorlar, hemolitik ve ikterik örnekler Tablo 5 Hassasiyet Kesinliği araştırmak için, örnekler 5 günün her birinde 8 kat eşleşme ile test edilmiştir. Varyasyon katsayılarının (CV) hesaplanması varyans analizi ile gerçekleştirilmiştir. HBeAg testi 572 78 57 1 4 1 0 2 1 Örnek Ortalama absorbans Test içi CV (%) Testler arası CV (%) F1 0,036 6,4 11,4 F2 0,102 3,8 9,3 F3 0,282 4,1 8,7 Anti-HBe testi Örnek Ortalama absorbans Test içi CV (%) Testler arası CV (%) F1 1,421 3,6 6,3 F2 0,808 3,2 3,4 F3 0,458 7,4 4,4 OQDMG11C48 Rev. 05 TR 2015-04 11/13
Tablo 6 HBeAg Testi için Test Prosedürü Reaktiflerin Hazırlanması Transfer: 4 x 100 µl HBe Kontrol, negatif 1 x 100 µl HBeAg Reaktif, pozitif Her bir örnekten 100 µl 1 x 100 µl HBeAg Reaktif, pozitif İnkübasyon: 60 ±2 dakika (37 ±1 C) Kısmen doldurulmuş plaklar olması halinde plakaların yarısını dolduracak kadar su dolu stripler ekleyin Yıkama 2 x BEP 2000 tam otomatik test işleme 100 µl Konjugat İnkübasyon: 60 ±2 dakika (37 ±1 C) BEP III otomatik test işleme Yıkama 4 x 100 µl Kromojen Çalışma Solüsyonu İnkübasyon (ışıktan korunarak): 30 ±2 dakika (18-25 ) 100 μl Durdurma Solüsyonu (maksimum 60 dak. sonra) Ölçüm: 450 nm ye karşı 650 nm Test sonucu 12/13 2015-04 OQDMG11C48 Rev. 05 TR
Tablo 7 Anti-HBe Testi için Test Prosedürü Reaktiflerin Hazırlanması Transfer: 4 x 25 µl HBe Kontrol, negatif 1 x 25 µl anti-hbe Kontrol, pozitif Her bir örnekten 25 µl 1 x 25 µl anti-hbe Kontrol, pozitif 75 µl HBeAg Reaktif, pozitif İnkübasyon: 60 ±2 dakika (37 ±1 C) Yıkama 2 x Kısmen doldurulmuş plaklar olması halinde plakaların yarısını dolduracak kadar su dolu stripler ekleyin BEP 2000 tam otomatik test işleme 100 µl Konjugat İnkübasyon: 60 ±2 dakika (37 ±1 C) BEP III otomatik test işleme Yıkama 4 x 100 µl Kromojen Çalışma Solüsyonu İnkübasyon (ışıktan korunarak): 30 ±2 dakika (18-25 ) 100 μl Durdurma Solüsyonu (maksimum 60 dak. sonra) Ölçüm: 450 nm ye karşı 650 nm Test sonucu OQDMG11C48 Rev. 05 TR 2015-04 13/13