T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI SÜLEYMANİYE KADIN HASTALIKLARI ve DOĞUM EĞİTİM ve ARAŞTIRMA HASTANESİ

T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI SÜLEYMANİYE KADIN HASTALIKLARI ve DOĞUM EĞİTİM ve ARAŞTIRMA HASTANESİ İNTRAUTERİN İNSEMİNASYON UYGULANAN HASTALARDA SPERM PARAMETRELERİNİN GEBELİK ORANLARINA ETKİLERİ TEZ DANIŞMANI Klinik Şefi: Doç.Dr.A.Süha SÖNMEZ UZMANLIK TEZİ Dr. Erhan DEMİREL İSTANBUL 2006 1

Uzmanlık eğitimim boyunca engin bilgi, beceri ve deneyimlerinden yararlandığım, hiçbir zaman destek ve imkanlarını esirgemeyen iyi bir hekim olmanın ancak iyi ve erdemli bir insan olmakla mümkün olabileceğini kendisini tanıdıkça öğrendiğim klinik şefimiz ve tez hocam sayın Doç.Dr.A.Süha SÖNMEZ e, Klinik şefi sayın Op.Dr.Fehmi YAZICIOĞLU na, Asistanlık dönemim boyunca eğitimime katkılarından ve bizlere kazandırdığı akademik bakış açısından dolayı klinik şef yardımcısı sayın Op.Dr.Levent YAŞAR a, Asistanlık dönemim boyunca ve tez çalışmam sırasında bilgi, deneyim ve tecrübelerini esirgemeyen tez uzmanım başasistan sayın Op.Dr.Serdar KOÇ a, Eğitimim süresince bilgi ve becerilerinden yararlandığım diğer tüm başasistan ve uzman doktorlara, Tüm çalışma arkadaşlarıma, Eşim Dr.Funda Demirel e, EN İÇTEN TEŞEKKÜRLERİMİ SUNARIM. Dr.Erhan DEMİREL İSTANBUL / 2006 2

İÇİNDEKİLER GİRİŞ........ 1 GENEL BİLGİLER...... 2-34 MATERYAL METOT..... 5-37 BULGULAR...... 38-44 TARTIŞMA...... 45-50 SONUÇ........ 51 ÖZET........ 52 SUMMARY....... 53 KAYNAKLAR...... 54-67 3

GİRİŞ İntrauterin inseminasyon infertilite kliniklerinde yaygın olarak kullanılan popüler bir tedavi yöntemidir. İntrauterin inseminasyonun basit, uygulamasının kolay olması, pahalı olmaması ve morbidite oranlarının da diğer yardımcı üreme tekniklerine göre oldukça düşük olması üstünlükleri arasında yer almaktadır. İntrauterin inseminasyonun hasta grubu genel olarak servikal faktör, ovülatuar disfonksiyon, erkek subfertilitesi ve açıklanamayan infertilite hastalarından oluşmaktadır. Yapılan birçok çalışma sonucunda genel olarak kabul edilen görüş IVF te gebelik oranlarının sperm morfolojisiyle bağlantı gösterdiği iken intrauterin inseminasyon için böyle bir bağlantının geçerli olup olmadığı net olarak bilinmemektedir. İntrauterin inseminasyondaki bildirilen farklı ve çelişkili sonuçların nedenleri hasta seçim kriterlerine, kadın infertilitesinin bulunmasına, ovarian stimülasyonun metoduna, sperm hazırlama tekniğine ve uygulanan siklüs sayısına bağlanmakta gebelik oranları yalnız sperm morfolojisiyle ilişkilendirilmekte, fakat hareketli sperm sayısı ile birlikte değerlendirilmesi genellikle göz ardı edilmektedir. Bizim bu çalışmadaki amacımız intrauterin inseminasyondaki gebelik oranlarına göre hareketli sperm sayısı ile morfolojinin birlikte ele alınıp değerlendirilmesi ve optimal sperm parametrelerinin tespit edilmesidir. Böylece yalnız sayı azlığı (izole oligoozoospermi), yalnız hareket azlığı (izole astenozoospermi) ve yalnız şekil bozukluğu (izole teratozoospermi) olan birçok infertilite hastası intrauterin inseminasyonda yüksek gebelik şansına sahip ise doğrudan IVF ve ICSI gibi tedavi yöntemlerine alınıp gereksiz yere daha pahalı, daha girişimsel ve morbiditesi daha yüksek olan yardımcı üreme tekniklerine maruz kalmasını veya intrauterin inseminasyonda düşük gebelik şansına sahip ise de gereksiz yere inseminasyon ile zaman kaybına, masrafa ve morbidite riskine maruz kalmasını önlemektir. 4

GENEL BİLGİLER İnfertilite, çiftlerin bir yıl süre ile korunmaksızın düzenli cinsel ilişkide (haftada iki gün) bulunmasına rağmen gebe kalamamasıdır. Üreme çağındaki çiftlerin %10-15 ini etkilemektedir. Son 20-25 yılda infertilite alanında üç çarpıcı değişiklik olmuştur. Birincisi, başarılı tedavi olasılığını ve üreme üzerindeki temel çalışma olanaklarını arttıran in vitro fertilizasyon ve yardımcı üreme tekniklerinin gelişmesidir. İkincisi, 35 yaş üzerinde olup infertilite konusunda yardım arayışı içinde olan kadınların sayısındaki artıştır. Amerika Birleşik Devletleri nde her beş kadından biri ilk çocuğuna 35 yaşından sonra sahip olmaktadır ki, bu daha öncesine göre önemli bir değişikliktir. Bu artış, daha geniş bir evlenme yaş aralığından ve kadınların iş hayatına bağlı olarak gebeliklerini geciktirmelerinden kaynaklanmaktadır. Üçüncü değişiklik ise yardımcı üreme teknikleri hakkında basın tarafından bilgilendirilen çiftlerin sayısı arttıkça toplumda infertilite konusunda yardım arayışı içinde olanların başvurularının artışıdır. Gerçekte infertil çiftlerin toplumdaki prevalansında son zamanlarda dramatik bir artış olmamıştır. Çiftler, gebelik için belli bir süreye gereksinim olduğunu bilmelidirler. Normalde her ovülatuar siklüsta yalnızca %25 gebelik şansı vardır. Bu şans 3 ayda %57, 6 ayda %72, 12 ayda %85 ve 24 ayda %93 olarak kabul edilmektedir. Kadınlarda fertilite 20-25 yaşlarında pik yapar, 35 yaşından sonra kaliteli oosit yapımı azalır, 40 yaşından sonra minimaldir. Erkeklerde ise 20-30 yaşlarında pik yapar, 40 yaşından sonra hafif azalır ve ileri yaşlara kadar devam eder. ERKEK İNFERTİLİTESİ ERKEK ÜREME FİZYOLOJİSİ Erkek üreme fizyolojisi a) spermatogenez, b) ejakülasyon, c) kapasitasyon ve fertilizasyon olarak üç başlıkta incelenir. Erkek üreme fizyolojisinin ilk basamağı olan spermatogenezi kontrol eden genler Y kromozomunun uzun kolunun (Yd) orta kesimindedir. Spermatogenez için vücuttakinden 2 0 C daha düşük bir skrotum sıcaklığı, arteriyel kandakinin yarısı kadar doku oksijen basıncı ve yeterince testosteron konsantrasyonuna ihtiyaç vardır. Testosteron Leydig 5

hücrelerince luteinizan hormon (LH) etkisi altında üretilir. Hipofizektomili erişkin ratlarda yapılan çalışmalar eski inanışın aksine spermatogenezin sürdürülmesi için intratestiküler yüksek testosteron seviyesine gerek olmadığını göstermiştir. Ancak spermatogenezin son basamakları için kritik olabilir. Testosteron reseptörleri Leydig, Sertoli ve peritubuler hücrelerde saptanmıştır ancak germ hücrelerinde saptanamamıştır. Normal seviyelerde sperm üretimi için normal seviyelerde hem FSH hem de LH olması gerekmektedir. Yaklaşık 70 gün süren spermatogenez süreci testiste, seminifer tubulusları döşeyen Sertoli hücrelerinde başlar. Bu süreç hipotalamik GnRH nın kontrolündedir ve ön hipofizden gonadotropinleri salgılatır. LH-Leydig-Testosteron ile FSH-Sertoli-İnhibinB negatif feed-back aksları vardır. Sertoli hücresi içindeki spermatogonya primer ve sekonder spermatosit basamaklarıyla bölünerek mayoza girer. Haploid yuvarlak spermatidler oluşur, bunlarda daha başka bölünme olmadan spermatozoa ya farklılaşırlar (spermiogenezis). Akrozomal başlık yoğun DNA içeren sperm başını zarf gibi sarar. Sertoli hücresinden salınan (spermiolizis) spermatozoa, epididimiste 2-14 günlük seyri esnasında olgunlaşırlar ki burada semen içine, motilite ve fertilizasyon potansiyeli kazandıran proteinler sekrete edilir. ERKEK İNFERTİLİTESİNDE ETİOLOJİ İnfertilite evli çiftlerin korunma yapmaksızın 1 yıllık düzenli cinsel ilişki sonrasında gebeliğin oluşamamasıdır. İnsidansı %15 olarak verilmekteyken bu oran son yıllarda giderek yükselmektedir. Erkek faktörü olguların yaklaşık yarısından sorumludur. Son 50 yıl içerisinde sperm sayısında giderek bir düşme olduğu bilinmektedir. Bu alanda yapılan pek çok çalışma olmasına rağmen evli erkeklerde bu sorun büyük bir problem olarak sürmektedir. Çünkü subfertil erkeklerin yaklaşık %25 inde bir neden gösterilememektedir. Dünya Sağlık Örgütü tarafından 7273 evli infertil çift üzerinde, infertilite nedenine göre yapılan bir çalışmada %41 oranında kadın, %24 oranında erkek, %24 kadın ile erkek beraber ve %11 inde de bir neden gösterilememiştir (1). Buradan da anlaşılacağı gibi evli infertil çiftlerin %48 inde mutlaka erkek faktörü işin içine girmektedir. 6

Dünya Sağlık Örgütünün infertil çiftlerin standardize edilmiş araştırma ve tanısı ile ilgili el kitabında erkek faktörünün etiyolojik grupları şu şekilde verilmektedir. 1) Seksüel / Ejakülatuar disfonksiyon 2) İmmünolojik nedenler 3) Neden belirlenememiş grup 4) İzole seminal plazma anormallikleri 5) İatrojenik nedenler 6) Sistemik nedenler 7) Konjenital anomaliler 8) Akkiz testiküler hasar 9) Varikosel 10) Aksesuar bezlerin enfeksiyonu 11) Endokrin nedenler 12) İdiopatik oligozoospermi 13) İdiopatik astenozoospermi 14) İdiopatik teratozoospermi 15) Obstrüktif kriptozoospermi 16) Obstrüktif azoospermi 17) İdiopatik azoospermi Burada sayılan gruplar içersindeki idiopatik grup %30 gibi önemli ölçüde bir yer kaplamaktadır. İşte bugün amacımız bu grubu ileri sperm fonksiyon testleri ile mümkün olduğunca değerlendirerek, sperm defektini açığa çıkarabilmek ve yardımcı üreme teknolojileri ile bu gruptaki hasta çiftlerin çocuk sahibi olabilmelerini sağlayabilmektir. Erkek infertilitesindeki etiyolojik grupları testislere göre başka bir sınıflandırmaya tabi tutacak olursak : Pretestiküler Testiküler Posttestiküler 7

A ) PRETESTİKÜLER NEDENLER 1 ) Kromozomal a )Klinefelter Sendromu 2 ) Hormonal a )Hipogonadotropik hipogonadizm b )Hiperprolaktinemi 3 ) Koital nedenler a ) Erektil disfonksiyon ( Psikoseksüel ) b ) Endokrin / Nöral i ) Diabetik nöropati ii ) Parapleji iii )İlaç nedenli c ) Ejakülatuar yetersizlik i ) Psikoseksüel ii ) Genito-üriner cerrahi iii ) Nöral iv ) İlaç nedenli d ) Koital sıklık B ) TESTİKÜLER NEDENLER 1 ) Konjenital a ) Kriptorşidizm b ) İmmotil silia sendromu (Kartagener Sendromu ) 2 ) Enfeksiyon Orşit 3 ) Vasküler a ) Torsiyon b ) Varikosel 4 ) Anti spermatojenik ajanlar a ) Kemoterapötikler b ) İlaçlar c ) Radyasyon d ) Isı 8

5 ) İmmünolojik 6 ) İdiopatik C ) POSTTESTİKÜLER NEDENLER 1 ) Obstrüktif a ) Epididimal i ) Konjenital ii )Enfeksiyon b ) Vasal i ) Konjenital ii )Akkiz 2 ) Epididimal geçişe bağlı : ( Astenozoospermia ) 3 ) Aksesuar bez enfeksiyonları 4 ) İmmünolojik Gene tedavi planlaması için bir diğer sınıflama şeklindeyse infertil erkek 3 ana gruba ayrılarak incelenmektedir. 1 )Tedavi edilemez steril grup: %12 a ) Primer seminifer tubul yetmezliği %11.9 b ) Total teratozoospermi % 0.1 2 )Olası tedavi edilebilir grup: %13 a ) Obstrüksiyon % 6 b ) Sperm otoimmünitesi % 6 c ) Gonadotropin yetmezliği % 0.5 d ) Koital nedenler % 0.2 e ) Reversibl toksik etkiler % 0.1 3 )Tedavi edilemez subfertil grup: %75 a ) Oligospermi < 1 milyon/ml % 9 1-5 milyon/ml % 8 5-70 milyon/ml %18 b ) Astenospermi ve teratospermi %40 c ) Normospermi %<1 9

Sayılan bütün bu nedenlere yönelik eğer yerine koyulabilecek bir tedavi yöntemi varsa bu uygulanabilir. ( Örn: Hipogonadotropik hipogonadizm, Hiperprolaktinemi gibi..) fakat nedeni belirlenemeyen ve %30 gibi yüksek orandaki bir popülasyon için bu güne kadar ampirik tedavi yöntemlerine başvurulmuştur. Bu tedavilere örnek olarak; gonadotropinler, antiöstrojenler, aromataz inhibitörleri, androjenler, testosteron rebound tedavisi, antibiyotikler, antienflamatuar ajanlar, çeşitli vitaminler, kallikreinler, kaptopril ve tiroksin hormonu verilebilir. Gene son zamanlarda purefsh tedavisinin IVF te fertilizasyon oranlarını arttırdığına dair yayınlar vardır (2) fakat bu tedavinin etki mekanizmasının nasıl olduğuna dair rutinde bakılan bir parametre henüz yoktur. Yardımcı üreme teknolojileri işte bu idiopatik hasta grubunda yeni bir çığır açarak IVF endikasyonları içine erkek faktörü ve açıklanamamış infertilite olgularını da katmıştır. En son olarak da ortaya çıkan mikroenjeksiyon teknikleri ile eskiden imkansız olarak tanımlanan olgularda bile fertilizasyon ve ardından gebelik elde edilebilmektedir. Bunlara örnek olarak; Sertoli cell only sendromu, kriptospermi, Kartagener sendromu (İmmotil silia), %0 motilite ve %0 morfoloji grupları ile tüm obstrüktif azospermiler verilebilir. O halde sonuç, idiopatik olgularda, in vitro ortamda elde edilen spermin fertilizasyon kapasitesinin dikkatle ölçülerek değerlendirilmesi, fertilizasyon sürecinin hangi aşamasında defekt olduğunun saptanması ve ardından da bu defekti düzeltecek veya by-pass edecek bir yöntemle fertilizasyonun başarılmasıdır. FERTİLİZASYON SÜRECİ Fertilizasyon, olgunlaşmasını tamamlamış, kapasite olmuş ve akrozom reaksiyonuna hazır olan spermin kumulus ooforustan penetrasyonu ile başlayan bir olgudur. Kapasitasyon, spermi akrozom reaksiyonuna hazırlar. En belirgin değişiklik, sperm hareketliliğinde proksimal flagellumun aşırı kıvrılması olarak gözlenen hiperaktivasyondur. İn vivo koşullarda kapasitasyon, kadın alt genital organlarında meydana gelir. Akrozom reaksiyonu ise, sperm başını bir kep gibi kaplayan akrozom adındaki organelin membranının eriyerek kaybolmasını içeren bir değişimdir. Akrozom reaksiyonu spermin oositle temas ettiği yerde meydana gelir. İn vivo olarak ise fallop tüplerinde gerçekleşir. Kapasitasyon reversibl, biyokimyasal bir olaydır; akrozom reaksiyonu ise irreversibl ve morfolojik olarak 10

gözlenebilen bir olgudur. Gerçek akrozom reaksiyonu, yalnızca canlı spermlerde görüldüğünden, akrozomun dejenerasyonu dolayısıyla meydana gelen membran değişikliklerinden kaynaklanan yalancı akrozom reaksiyonu ndan ayırt edilmelidir. Akrozomun en önemli özelliği ekvatoryal segment denilen bölümde barındırdığı akrozomal enzimlerdir. Bu enzimlerden en önemlisi hyalüronidaz olup spermin kumulus ooforusu geçmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Kumulusu geçen spermatozoa, zona pellicudaya sıkıca bağlanır. Bu aşamada sperm plazma membran reseptörleri ile zona pellucida arasındaki etkileşimler açısından önemlidir. Zona pellucidaya bağlanmış sperm, bu sırada akrozomal kepini kaybetmeye dolayısıyla akrozom reaksiyonuna başlar. Böylece ekvatoryal segment denen akrozomal bölgenin alt kısmındaki bölümde yoğunlaşmış diğer akrozomal enzimler ve kapasitasyon ile hiperaktive olmuş sperm hareketliliği sayesinde sperm zona pellucidayı geçer. Zona pellicudayı geçen sperm perivitellin boşluğu geçip ooplazmaya tutunur. Bu ilk tutunma, ekvatoryal segmentin hemen üzerindeki bölümde meydana gelir. Bu tutunma sonrasında sperm ile oolemma arasındaki füzyon gerçekleşir ve spermin plazma membranı eriyerek sperm oosit plazma membranının bir parçası haline gelir. Sperm-oosit füzyonunu takiben, oosit metabolik olarak aktive olur ve kortikal granüllerin ekzositozunu takiben mayoz tamamlanır. Kortikal granül aktivasyonu sayesinde zona proteinlerinin geçirgenliği değişir ve ek sperm girişi engellenir, buna oosit zona reaksiyonu adı verilir. Fertilizasyon öncesinde oosit nükleusu mayozun ikinci metafaz safhasında tutulmuştur. Redüksiyon bölünmesinden sonra oosit haploid nükleus içerir ve maternal pronükleusu oluşturur. Bu esnada sperm nükleusu dekondanse olur ve paternal pronükleusu oluşturur. Maternal ve paternal pronükleuslar yakın temas haline gelir ve nükleer zarfları disentegre olur. Kromozomları birleşir. Bu kromozomal birleşme fertilizasyonun sonu ve embriyonik gelişmenin başlangıcı olarak kabul edilir. TANISAL TESTLER İnfertilite problemi ile kliniğe başvuran çiftlerin %48 inde erkeğe bağlı bir faktörün olması erkek fertilizasyon potansiyelinin araştırılmasını bir ön koşul olarak beraberinde getirmektedir. Yardımcı üreme tekniklerinin ( Asiste Reproductive Technologies =ART ) gün geçtikçe daha 11

sofistike boyutlara ulaşması, bilim adamlarının erkek ve dişi gametler üzerindeki araştırmalarının daha da yoğunlaşmasına ve bu konudaki bilgi birikiminin artmasına yol açmıştır. İnsan sperminin fertilizasyon kabiliyeti ile ilgili yalnızca son on yıl içerisinde bile onlarca test tanımlanmıştır. Bunlardan çoğu deneysel olarak kullanılmış ve rutindeki yerini alamamıştır. Bu bölümde yalnızca rutinde kullanılan testlerden söz edilecektir. 1. Klasik Semen Analizi Erkek fertilizasyon potansiyelinin araştırılmasındaki ilk adım klasik semen analizidir. Bu analizin çerçevesi Dünya Sağlık Örgütü tarafından bir kitap halinde hazırlanmış ve dünyada en çok kullanılan referans kitap haline gelmiştir. Klasik Semen Analizi Görünüm: Homojen, gri-opak Viskozite: <2cm Likefaksiyon Süresi: <60dk. Volüm: >2ml ph: 7.2-8.0 Sperm Sayısı: >20milyon/ml Total Sperm Sayısı: >40milyon/ml Total Motilite: >%50 (a)hızlı ileri hareket: >%25 Morfoloji: >%30 WHO kriteri (>%14 Kruger strict kriteri) Beyaz küre: <1milyon/ml İmmünobead test: <%20 partikülle kaplı sperm MAR Testi: <%10 partikülle kaplı sperm Bioasseyler Hemizona indeks: >%35 HOS Test : >%60 şişme Sperm Penetrasyon Assay : >%10 penetrasyon Diğer Testler α-glukozidaz(nötral): >20mU. Çinko(total): >2.4mmol 12

Sitrik asit(total): Asit fosfataz(total): Fruktoz(total): >52mmol >200U. >13mmol Klasik semen analizi için incelenecek ejakülat 3 ila 8 günlük cinsel perhiz sonrasında mastürbasyon ile steril bir kaba alınmalı ve en geç 30 dakika içerisinde tetkik yapılacak laboratuara getirilmiş olmalıdır. Ejakülatın makroskobik muayenesinde görünümü, miktarı, likefaksiyon zamanı, viskozitesi ve ph ı değerlendirilir. Semen analizinin en önemli kısmını ise mikroskobik inceleme oluşturmaktadır. Bunun için kullanılacak yöntem ve alet çok iyi seçilmelidir. Laboratuarda rutin olarak kullanılmakta olan hemositometrilerin sperm sayım sonuçlarındaki doğruluğu bu aletlerdeki spermin konulduğu bölümün derinliğinin çok fazla olması nedeniyle tartışmalıdır. Bunu önlemek amacı ile 1978 yılında Makler tarafından sperm sayımı için özel olarak tasarlanmış Makler sperm sayım aletleri kullanılmaktadır. Semen örneğinin incelendiği gözeneğin 10mm derinliğinde olması spermatozoanın tek bir düzlemde serbest hareketine olanak sağlamakta, ayrıca sayım daha kolay yapılabilmektedir. Bu alet ile hareketlilik yüzdeleri de daha kesin olarak saptanabilmektedir. Mikroskobik incelemede sperm sayısı, hareketliliği, yuvarlak hücre sayısı, aglütinasyonun varsa derecelendirilmesi, morfoloji ve yuvarlak hücrelerin sınıflandırılması incelenir. Sayı Spermin sayısı, hemositometre kullanılıyorsa seyreltilerek, Makler sayım aleti kullanılıyorsa seyreltilmeden değerlendirilir. Güvenilir bir değerlendirme için ideal olan 100 karedeki spermleri saymaktır. Kullanılan alete bağımlı olarak, tek karedeki ortalama sperm sayısı temel alınıp sayım milyon/ml olarak ifade edilir. Hareketlilik Dünya Sağlık Örgütü hareketliliği 4 sınıfta değerlendirmektedir: a ) Hızlı doğrusal progresif hareket b ) Yavaş doğrusal ya da doğrusal olmayan hareket c ) Progresif olmayan hareket 13

d ) Hareketsiz Her ne kadar hareketlilik kabaca yukarıdaki dört grupta inceleniyorsa da, özellikle yardımcı üreme tekniklerinde kullanılacak tanı kriterleri doğrultusunda modifikasyon gerekliliği duyulmuş ve hareketli olan spermler iki sınıfta değerlendirilmiştir. Buna göre hareketlilik yavaş, tembel ya da hareketin belirgin bir morfolojik defekt ile sınırlandırıldığı durumlar olarak tanımlanmış ve progresif hareket, hızlı ve doğrusal progresif hareket olarak tanımlanmıştır. Morfoloji Spermin fertilite kapasitesinin morfolojik inceleme ile etkin bir indeks olarak değerlendirilmesi 1951 yıllarına kadar uzanır. Kruger ve arkadaşları (3) tarafından Strict kriterler ile morfoloji değerlendirilmesinin tanımlanmasıyla bu parametre giderek artan bir önem kazanmıştır. Bu yöntem ilk kez 1986 yılında yayınlanmış ve 1990 yılında Menkveld ve arkadaşları (4) tarafından modifiye edilmiştir. Kısa süre içerisinde rutin incelemede yerini alan bu yöntemin, Dünya Sağlık Örgütü kriterlerine göre morfoloji değerlendirilmesi yöntemine olan üstünlüğü de gösterilmiştir. Kompüterize Semen Analizi Klasik semen analizinde standardizasyon için yapılan çalışmalar ve teknolojik gelişmelerin doğrultusunda kompüterize semen analizi ortaya çıkmıştır. Günümüzde pek çok infertilite merkezinde yaygın olarak kullanılan kompüterize sistemler, özellikle sperm sayısı ve motilite analizi için kullanılmaktadır. Bu sistemlerin kullanılmaya başlaması ile ejakülattaki hareketli sperm sayısının hesaplanmasının ötesinde spermlerin hızı, doğrusal hareketliliği, kuyruk vuruş sıklığı gibi manüel yöntemler ile değerlendirilemeyecek özellikleri de değerlendirebilmektedir. Yakın bir geçmişte de, sperm morfolojisinin de değerlendirilebileceği kompüterize sistemler tanımlanmış ve kullanıma girmiştir. Dünya Sağlık Örgütü de kompüterize semen analizini, rutin semen değerlendirmesi protokolünün içine katmıştır. Bunun yanında kompüterize semen analiz sistemlerinin kullanımının pratik olmaması, pahalı olması ve alete bağlı zaman zaman ciddi kalibrasyon hatalarının zaman kaybına yol açması dezavantajlarıdır. Kompüterize sistemlerin manüel değerlendirme ile olan korelasyonu da bu sistemlerin rutin kullanımın ötesinde, araştırma merkezlerinde bilimsel çalışmalarda kullanılmasının daha uygun olacağını göstermektedir. 14

2. İmmünolojik Testler Spermatogenez esnasında sperm yüzeyinde antijenler oluşmaktadır. Fakat gerek erkek gerekse dişi üreme organlarının yapısal bütünlüğü ve epiteliyal döşemesi, sperm antijenlerinin sistemik kan ya da lenf akımına karışmasını önleyici bir bariyer oluşturur. Erkekte vazektomi, testiküler veya epididimal yaralanma ya da enfeksiyonlar antisperm antikorları (ASA) oluşmasına neden olabilmektedir. Anti Sperm Antikorları (ASA ) Değerlendirilmesi Literatürde ASA değerlendirmesi için pek çok teknik tanımlanmışsa da günümüzde en çok kullanılan iki yöntem miksed antiglobulin reaksiyon testi (MAR test) ve immünobead testidir (IBT test). Dünya Sağlık Örgütünün verdiği alt değer, sperme yapışık partikül yüzdesini %10 olması ve bu değer üzerinde olan örneklerde muhtemel bir immünolojik faktör düşünülmesidir. MAR testinin IBT testine üstünlüğü pratik bir test olması ve IBT de 0.5 ila 2ml ye varan semen örneği gerekirken, MAR için gereken volümün 10 mikrolitre olmasıdır. ASA değerlendirilmesi özellikle semen analizinde aglütinasyonun saptandığı ve açıklanamayan infertilite olgularında ayırıcı tanı yönünden çok değerlidir. Sperm Servikal Mukus Etkileşimi Değerlendirme in vivo (Postkoital test, PCT) ya da in vitro ( Slide testi, Kurzok Miller testi, Kremer testi ) olarak yapılır. Postkoital test 100 yıl kadar önce Sims tarafından tanımlanmış olmakla birlikte, testin pratikliği ve duyarlılığı üzerine tartışmalar günümüzde de sürmektedir. Gerek pratikliği gerekse standardizasyonu dolayısıyla günümüzde pek çok merkez Kremer testi kullanmaktadır. Olası yanlış negatif sonuçlara engel olmak açısından bovin servikal mukusu, insan donör mukusu ve donör semeni kullanılarak da in vitro testler yapılabilmektedir. Servikal mukus fizyolojik olarak, progresif hareketli ve morfolojik olarak normal olan spermi süzer. Bu nedenle öncelikle bu iki parametrenin değerlendirilmesi gerekir. 15

3. Bioasseyler Dünya çapında infertilite merkezlerinin sayısındaki büyük artış ve gametler üzerinde yapılan araştırmaların yoğunlaşması pek çok biyokimyasal ve fonksiyon testlerinin tanımlanmasına yol açmıştır. Zaman içerisinde tanımlanan testler tanısal değeri, pratikliği, maliyeti yönünden irdelenmiş ve yalnızca birkaçı infertilite laboratuarlarında rutin olarak kullanım alanı bulmuştur. Kreatinin Kinaz Değerlendirilmesi Sperm enerji sentezi ve transportu açısından anahtar enzim olan kreatin kinaz, Huszar ve arkadaşları (5) tarafından sperm kalitesini belirleyen hücresel marker olarak tanımlanmıştır. Sertoli hücrelerindeki spermatogenezisin önemli bir anahtar enzimi sperm sitoplazmik ekstrüzyonundaki defekt ile yükselir. Bu yükselme kreatin kinaz konsantrasyonları arasındaki doğru orantı tanısal test amacıyla kullanılmaktadır. Oligospermik spermler ile yapılan bir çalışmada, oligospermik olup da IVF ile fertilizasyon yeteneği kanıtlanmış semen örneklerindeki kreatin kinaz aktivitesinin fertilizasyon potansiyelini belirleyici özelliği, özellikle oligospermik örneklerin ayırıcı tanısında bu testin değerini vurgulamaktadır (5). Akrozomal Enzim Aktivitesi Tayini Akrozin ve hyalüronidaz sperm akrozom reaksiyonu ve fertilizasyon üzerindeki tartışılmaz yeri, bu proteinlerin aktivitesinin değerlendirilmesi ve tanısal testlerde kullanılmasına neden olmuştur. Spermatozoanın proteolitik potansiyelinin ölçülmesi, jelatin ile kaplı lamların üzerine yayılıp inkübe edilen semen örnekleri ile gerçekleştirilmektedir. Bu yöntemle gerek akrozin gerekse hyalüronidazın aktivitesi saptanır. Sperm başı çevresindeki halo oluşumu, aktivite göstergesi olarak değerlendirilip, sonuçlar halo oluşturan sperm yüzdesi ve oluşan haloların çapının ölçümü ve bu değerin ortalaması hesaplanarak değerlendirilir. Bu testlerin IVF sonuçlarını belirleyici değeri bilinmemektedir. Goodpasteure ve arkadaşları (6) tarafından akrozomal enzim aktivitesi spektrofotometrik yöntemlerle de değerlendirilmiştir. Bu tekniğin dezavantajı, hasta grupları arasında akrozin sonuçlarının çakıştığı geniş bir aralık bulunmasıdır. Bu sebeple, globozoospermi gibi spesifik durumlarda tanımlayıcı test olarak kullanılmaktadır. Akrozomal aktivite değerlendirilmesine bir başka yaklaşım ise akrozom reaksiyonu yüzdesini ölçmektir. Her ne kadar, bunun değerlendirilmesindeki en iyi metot elektron mikroskobisi ise de, 16

rutinde bunu uygulamak mümkün değildir. Alternatif olarak üçlü boyama (7), akrozomal içeriğe karşı kullanılan monoklonal antikorlar (8), klortetrasiklin fluoresans (9) ve floursein izosiyenat (FITC) ile işaretlenmiş Pisum Sativum aglütininleri gibi lektinler ve fıstık aglütinini gibi yöntemler de tanımlanmış (10) olup bunlardan en çok Pisum Sativum aglütinini kullanıma girmiştir. Poliklonal antikorların yardımı ile akrozin dışında da birçok proteinin aktivitesi de değerlendirilebilmektedir. Bu konuda yapılan en geniş ve kapsamlı çalışma Senn ve arkadaşları (11) tarafından gerçekleştirilmiş olup akrozin, hyalüronidaz, aktin, dinein ve tübülinin aktiviteleri ve IVF sonuçları ile korelasyonları incelenmiştir. Akrozin ve tubulin antikorlarına karşı reaksiyon gösteren sperm yüzdeleri IVF sonuçları ile en yüksek korelasyonu gösteren değerler olarak bulunmuştur. 4. Fonksiyon Testleri Hipoosmatik Şişme Testi Sperm membran bütünlüğünün fizyolojik ölçümü için kullanılan bir test olup Jeyendran ve arkadaşları (12) tarafından tanımlanmıştır. Özellikle çok kolay uygulanabilir olması testin pek çok merkez tarafından kullanılmasına neden olmuşsa da testin tanısal değeri konusunda ciddi soru işaretleri bulunmaktadır (13,14). Sperm Penetrasyon Testi ( SPT ) Yanagimachi ve arkadaşları (15) tarafından zonalarından arındırılmış hamster yumurtalarında insan spermlerinin penetrasyon kabiliyeti olarak tanımlamıştır. Sperm kapasitasyonu, akrozom reaksiyonu, oolemma ile füzyonu ve ooplazmadaki dekondensasyonu ölçebilmektedir. Ayrıca testin metodolojisi ve değerlendirilmesi ile de ilgili ciddi sorunlarla karşılaşılabilmektedir. Karşılaştırmalı çalışmalarda strict metodu ile morfoloji değerlendirilmesi uygulandığında, SPT ile normal morfolojinin yüksek derecede korelasyon gösterdiği, dolayısıyla testlerin birbirleri yerine kullanılabilecekleri görülmüştür (16). Hemizona Test ( HZT ) Türe özgün özellikler nedeniyle insan spermi yalnızca insan oositlerinin zonalarıyla bağlanabilmektedir. Bu nedenle zona bağlanması yalnızca insan oositlerinin kullanımı ile test 17

edilebilir. Burkman ve arkadaşları (17) tarafından tanımlanan hemizona testi ile ikiye bölünmüş insan oositlerinden elde edilen zonalarla, gerek hastaların kendi spermleri gerekse donör spermleri kullanılarak aradaki fark değerlendirilebilmektedir. Tanısal değeri yüksek olmakla birlikte metodolojik yönden hem çok fazla materyal gerektirir hem de çok zahmetlidir. ERKEK İNFERTİLİTESİNDE TEDAVİ Erkek infertilitesi kendini çoğunlukla oligo-(sayı azlığı), asteno-(hareketlilikte azalma) ve terato-(normal morfoloji yüzdesinde azalma) zoospermi olarak gösterilir. Erkek infertilitesinde gerek medikal gerekse cerrahi pek çok tedavi yöntemi denenmişse de günümüzde en etkin tedavi yöntemi yardımcı üreme tekniklerinin kullanımıdır. 1.Medikal Tedavi Erkek infertilitesinde medikal tedavi spermatogenez ve sperm fonksiyonlarının medikal stimülasyonuna yönelik kullanılan preparatlardan oluşmaktadır. Söz konusu preparatlar çok çeşitli olup bunların içerisinde etkin olanları çok az sayıdadır. Androjenler Spermatogenezin indüksiyonu, devamlılığı ve aynı zamanda posttestiküler matürasyonu üzerinde etkilidir. Testosteron ve dehidrotestosteron aynı zamanda seminal sıvının oluşumu ve androjen bağımlı aktivitelerden sorumlu ana metabolitlerdir. Gerek androjenler gerekse antiöstrojenlerin kullanımı (klomifen, tamoksifen) ile gerek spermiogramlarda düzelme gerekse gebelik yüzdelerinde artış sağlanamamıştır. Testolakton Testosteronun östradiole dönüşümünü bloke eden bir aromataz inhibitörüdür. Hipofizden östradiol feed-back ini azaltıp FSH düzeylerinin artmasını sağlar. Kullanımı ile gebelik oranlarının karşılaştırıldığı çalışmalar yapılmamıştır. 18

Gonadotropinler Steroid ve gametogenetik testiküler fonksiyonların ana kontrolörü olan gonadotropinler erkek infertilitesindeki ilk tedavi yaklaşımıdır. İnsan gonadotropinlerinin gerek üriner gerekse rekombinant olanlarının kullanımı ile özellikle hipogonadotropik hipogonadizm olgularında spermatogenezin oluşmasında yaklaşık %80 başarı sağlanmaktadır. Normogonadotropik, azospermik veya oligozoospermik erkeklerde gonadotropin tedavisi ile sperm kalitesinde geçici düzelmeler görülmüştür (18). Gonadotropin Releasing Hormon (GnRH) GnRH pulsatil olarak salgılanan bir hormon olduğundan, kullanımında da bu pulsatilite taklit edilmiştir. Fakat kullanım yönteminden bağımsız olarak GnRH kullanımının gonadotropin kullanımına üstünlüğü ya da kötülüğü saptanamamıştır. Gerek gonadotropinler gerekse GnRH kullanımının gebelik oranları üzerine olumlu etkileri henüz tam olarak gösterilememiştir. Kallikrein Kallikrein-kinin sistemine ait komponentlerin hem erkek hem de dişi üreme sistemi sekresyonlarında mevcut olduğu bilinmektedir. Bu komponentler ise spermin dişi genital sisteminde transportu, sperm hareketliliğinin stimülasyonu ve spermatogenezin stimülasyonu ile ilgilidir. Kallikrein kullanımı ile sperm metabolizmasında artış, testiküler kan akımında artış, Sertoli hücrelerinin fonksiyonlarında artış, yardımcı üreme organlarının sekretuar aktivitesinin stimülasyonu sağlanmaktadır. Kallikreinin klinik kullanımı ile özellikle oligozoospermik hastalarda kullanım sonrası eşlerinin gebe kalma yüzdelerinde zayıf fakat anlamlı bir artış gözlenmiştir (19). Pentoksifilin Bir metilksantin bileşiği olup kafein ve teofilin ile aynı farmakolojik sınıfa aittir. Kafeine olan üstünlüğü yarı ömrünün daha uzun ve suda çözünülürlüğünün daha fazla olmasıdır. Kan viskozitesini azaltır ve eritrosit fleksibilitesini arttırarak periferik kan akımını arttırır. Bu gruba ait ajanların fosfodiesterazı inhibe ederek hücre içi camp düzeylerini arttırdığı bilinmekte ve bu 19

yolla sperm motilitesinde artışa neden olacağı savunulmaktadır. Pentoksifilin ayrıca testiste mikrosirkülasyonu arttırarak sperm parametreleri üzerinde olumlu etki yapması beklenmektedir. Pentoksifilinin erkek infertilitesinde en yaygın kullanımı in vitro sperm hareketliliğinin stimülasyonu amacıyladır. Yapılan çalışmaların çoğu in vitro kullanımda sperm hareketlilik yüzdesinde belirgin artışlar olduğunu göstermektedir, fakat kullanım sonrası fertilizasyon ve gebelik oranlarına pozitif etkisi tartışmalıdır (20,21,22,23,24,25). Antioksidanlar Özellikle açıklanamayan erkeğe bağlı infertilite vakalarında hidroksil radikali (OH), süperoksit anyonu (O 2) ve hidrojen peroksit (H 2O 2) gibi reaktif oksijen türlerinin sperm fonksiyonu ve fertilizasyon kapasitesi üzerine etkilerinin ortaya çıkması ile antioksidanların erkek infertilitsinde kullanımı artmıştır. Reaktif oksijen türleri seminal lökositlerden ve sperm hücrelerinin kendisinden oluşur (26), sperm lipid membranlarının peroksidasyonu ve yağ asidi peroksitlerini oluşturarak sperm metabolizmasına zarar verir. Reaktif oksijen türlerini detoksifiye etmek ya da yok etmek amacıyla en çok kullanılan antioksidan, E vitamini ile in vitro spermoosit füzyon kapasitesini arttırmak mümkündür. E vitamininin bu amaçla oral kullanımı istenen seminal plazma düzeyine ulaşılamadığından in vitro kullanımı uygundur. Bu amaçla pıhtılaşmayı aktive eden faktör (PAF), lizo-paf, lizofosfotidil kolin ve pentoksifilin de kullanılmış olup bunların tümünün in vitro kullanımının in vivo kullanımlarına daha üstün olduğu bilinmektedir. Bir başka antioksidan glutatyon ile yapılan plasebo kontrollü çalışmada (27) ise varikosel veya piyospermi tanısı almış oligospermik subfertil hastalarda sperm hareketliliği ve morfolojisinde düzelme kaydedilmiştir. Alvarez ve arkadaşları glutatyon peroksidazın memeli spermatozoasında düşük motiliteye yol açan spontan lipid peroksidasyonunu önlediğini göstermiştir (28). Antioksidan ajanların klinik kullanımdaki yerini belirlemek için daha ileri geniş kapsamlı çalışmalar gerekmektedir. Antibiyotikler ve Antienflamatuarlar İnfertil çiftlerin bazılarında erkek partnerin prostatovesikülit insidansı yüksek olsa da pek çok vakada enfeksiyon ile subfertilite arasında doğrudan bir bağ kurmak mümkün değildir. Bakteriyel kültürün pozitif olduğu kronik aksesuar organ enfeksiyonlarında antibiyotiklerin yeri kaçınılmaz olmakla birlikte tedavinin üzerine direk etkisi şüphelidir. 20

Sperm Antikorlarına Karşı İmmünsüpresyon Yüksek dozda kortikosteroid kullanımı ile izo ve otoantikorların azaltılmasıdır. Plasebo kontrollü yapılan çalışmalarda steroid kullanılan gruplarda gebelik oranlarının daha yüksek olduğu gözlenmiştir (29,30). 2. Yardımcı Üreme Teknikleri (ART) Yardımcı üreme teknikleri, erkek ve dişi gametlerin birbiri ile döllenmesini kolaylaştıran in vitro yöntemler olup bu tedavi yöntemlerine başlamadan önce gerek kadın gerekse erkek detaylı bir biçimde incelemeden geçmelidir. İnfertilitenin gerekçesi başka tedavi yöntemleri ile düzeltilebilinecek ise ART dışı yöntemlerin öncelikle denenmiş olması gerekmektedir. İnfertil çiftler için gerek in vivo gerekse in vitro yöntemler ile döllenme, semen parametrelerinin normalliği ile doğru orantılı olarak başarı gösterdiği için semen parametrelerinin ART dışı yöntemler ile düzeltilmesi ile ART tümüyle seçenek dışı bırakılabilir. Sperm Hazırlama Yöntemleri Yardımcı üreme teknolojilerinin pek çoğunda semen laboratuar ortamında işlenmektedir. Semen; seminal plazma, sperm, beyaz küreler, kontamine bakteriler ve hücresel artıklardan oluşmaktadır. Doğal ilişki ile döllenme sırasında sperm servikal mukus içerisinden geçerken seminal plazmadan fizyolojik bir filtrasyon ile ayrılır ve kadın üst genital traktüsüne erişir. Böylece motil spermler ovum ve fallop tüplerinin çevresine erişirken diğer seminal plazma bileşenleri alt genital kanalda kalır. İşte yardımcı üreme tekniklerinde kullanılan sperm hazırlama yöntemlerinin primer amacı, spermi seminal plazma ve kontamine bakterilerden kurtarmak hızlı ve kaliteli bir sperm popülasyonu elde etmektir. Günümüzde çeşitli sperm hazırlama teknikleri kullanılmasına rağmen hangi tekniğin en iyi olduğu konusunda tam bir görüş birliğine henüz varılamamıştır (31,32,33,34). Kullanılan tekniğin cinsine göre işlem sırasında %10-50 arasında sperm kaybı meydana gelir. Kullanılan yöntemin komplike olması ile doğru orantılı olarak, elde edilen motil sperm sayısı artmakta, fakat totalde kaybedilen sperm sayısının fazla artmasına neden olmaktadır. 21

Normal ilişki sonrasında kapasitasyon kadın genital kanalında postkoital 5-6 saat içerisinde gerçekleşirken in vitro ortamda bu amaçla uygun kültür solüsyonları kullanılarak semen hazırlama işlemi ile stimülasyon sağlanır. Kapasitasyonun in vitro ortamda indüklenmesi istenirken akrozom reaksiyonu için durum böyle olmayıp spermin zona pellicuda ile in vivo ortamda karşılaştığı zaman olması gerekmektedir. Sperm hazırlama işlemi için kullanılan kültür solüsyonları tamponlanmış izotonik tuz solüsyonlarıdır. Tampon bileşiği solüsyonun ph ının devamlılığını sağlar. Eğer bir CO 2 inkübatörü varsa bikarbonat tampon kullanılabilir eğer CO 2 li inkübatör yoksa HEPES tamponu ph devamlılığı sağlar. İnsan veya bovin serum albümini ise tamponun protein kaynağı olup uzun süreli inkübasyon ve kapasitasyonun indüklenmesi için gereklidir. Son olarak Ca ++ ve K + da kapasitasyonun oluşabilmesi için gerekli elementlerdir. Sık kullanılan sperm hazırlama solüsyonlarına örnek olarak Hams F10, BWW ve modifiye human tubal fluid (HTF) sayılabilir. HTF, fallop tüplerinden salgılanan sekresyonun sentetik eşdeğeridir. En basit sperm hazırlama yöntemi semenin yıkanarak sperm hücrelerinin ayrılmasıdır. Ejakülat kültür solüsyonu ile 1/5 1/10 oranında karıştırılarak 300g de 10 dakika santrifüj edilir, pellet (topak) üstü atılır bu işlem 1-2 kez tekrarlandıktan sonra son pellet 0.5cc %1 HSA (Human Serum Albümin) ya da %10 hasta serumu içeren kültür solüsyonu içerisinde çözünür. İyi bir hazırlama yöntemi olmayıp, pellet içerisinde hücresel artıklar ve ölü spermler kalabileceğinden yalnızca sperm hücrelerinin izolasyonunu sağlar. Beyaz küreler ve defektli spermler motil sperme zarar verecek bileşikler salgılarlar. Bu bileşikler içerisinde lizozomal enzimler ve reaktif oksijen türleri oosite de zarar verebileceğinden ART de basit yıkama yerine daha geliştirilmiş yöntemler kullanılır. Basit yıkamanın avantajı ise çabuk ve ucuz olmasıdır. Sperm hazırlama tekniğiyle ortamdan uzaklaştırılanlar; HÜCRELER Normatif sperm Yuvarlak hücreler İmmatür germ hücreleri Lökositler MADDELER Prostaglandinler Lenfokinler-Sitokinler Serbest oksijen radikalleri Antijenik proteinler Swim up Bilinen en eski yöntemlerden olup normospermik olgularda standart olarak kabul edilmektedir. Sperm Rise olarak da tanımlanmış olup self (aktif) migrasyon esasına dayanır. İşlemin kolay olup, ucuz ekipman gerektirmesi avantajları arasında sayılabilir. Sperm basit 22

yıkama yöntemi ile tüp dibinde hazırlandıktan sonra üzerine kültür solüsyonu ilave edilir. Hareketli spermler bu media içinden yukarıdaki katmana yüzer. Üst kısımdan alınan spermler ART sırasında kullanılır. Uygulamada 1/3 oranında kültür solüsyonu ile ejakülat dilüe edilir ve 500g de 10 dakika santrifüj edilir. Pelletin üst kısmı atıldıktan sonra üzerine 2cc kültür solüsyonu ilave edilir ve 500g de 10 dakika yeniden santrifüj edilir, süpernatan atıldıktan sonra üzerine 0.5cc kültür solüsyonu ilave edilip, tüp 37 0 C de 45 derece eğimde %5 CO 2 li ortamda 30-60 dakika inkübe edilir. Daha sonra pellete dokunulmadan süpernatan dikkatle aspire edilerek işlemde kullanılır. Swim up ile bol miktarda progresif hareketli sperm elde edilebilmesine rağmen, sperm sayısında önemli ölçüde düşüş olur, bu nedenle şiddetli erkek faktöründe kullanımı kısıtlı kalmaktadır diğer bir deyişle oligozoospermik olgularda kullanımı kısıtlıdır. Ayrıca işlem süresinin uzun olması ve viskoz ejakülatlarda iyi sonuç vermemesi de kısıtlamalar getirmektedir. Swim down Ejakülat, dansitesi seminal sıvıdan daha fazla olan bir solüsyon üzerine konularak 30-60 dakika 37 0 C de 45 derece eğimde %5 CO 2 li ortamda inkübe edilir, tüpün en altından 0.5cc aspire edilerek ART de kullanılır. Basit olması ve santrifüj kullanılmaması avantajı olup progresif hareketli sperm elde etme şansı çok azdır. Bu yöntem içerisinde albümin gradientleri de kullanılmaktadır. Percoll Percoll; (pvp) poly vinyl pyralidon ile kaplanmış 15-30nM çapında kollaidal silika partiküllerini içeren bir solüsyondur. Hücre, virüs ve subsellüler partikülleri dansite gradient santrifügasyon yöntemi ile ayırır. Yoğunluğu 1.0-1.3gr/ml arasında olacak şekilde gradientler oluşturabilir, hücrelere karşı herhangi bir toksik etki yoktur ve biyolojik membranlardan geçemez. İşlem sırasında semen Percoll gradientinin üzerine katmanlandırılır, gradientler geçişli veya geçişsiz olabilirse de işlem kolaylığı açısından geçişli ve en çok da %45-%90 gradientleri kullanılmaktadır. Hazırlanan bu süspansiyon santrifüj edildiğinde spermler santrifüj hareketi doğrultusunda birbirine paralel ve başları aşağıda olarak dizilirler. Normal morfolojiye sahip ve/veya progresif hareketli spermler ejakülat içerisinde dansitesi en fazla olan yapıdır. Santrifügasyon sonrası tüpün en altında dansite gradientinin en yoğun olduğu bölgede, normal morfolojiye sahip ve motilitesi en yüksek olan spermler toplanır. Uygulama şu şekildedir: 23

İzotonik Percoll solüsyonu, saf Percoll ve 10 kez konsantre edilmiş kültür solüsyonunun 9/1 oranında birleştirilmesi ile elde edilir. Daha sonra bu solüsyondan değişik yüzdelerde katmanlar hazırlanır. Bu katmanların en yoğunu altta olmak üzere konik tabanlı bir tüp içersine 1cc olmak üzere yerleştirilir ve üzerine maksimum 3cc ejakülat yayılarak 200-300g de 20-30 dakika süreyle santrifügasyon yapılır. İşlem bittiğinde tüpün en üstünde seminal plazma, bir altta hareketsiz, daha altta az hareketli ve en dipte de pellet içerisinde progresif hareketli ve morfolojik açıdan diğer katmanlardakinden daha iyi kalitede olan spermler toplanmış olur. Daha sonra pipetle en alttaki pellet hassas bir şekilde diğer bir tüpe aktarılır ve Percoll ün toksik etkilerinden kurtulmak için 2 kez basit yıkama yöntemi ile yıkanarak, Percoll uzaklaştırılır. Percoll uygulamasının dezavantajları fazla zaman alması, medianın pahalı olması ve seçilmiş spermlerden silika partiküllerini ayırmak için yeniden yıkama ve santrifüj gerektirmesidir. Minipercoll uygulamasında ise gradientler 0.3cc olarak hazırlanır. Glasswool ile sperm hazırlama Oligo ve/veya astenozoospermik olgularda yüksek oranda motil sperm elde edilmesinde tanımlanmış bir diğer yöntem de Glasswool uygulamasıdır. Anormal membranı olan, hareketi yavaş veya hareketsiz spermler Glasswool (cam yünü) fibrillerine takılarak kalırlar. Çabuk yapılabilmesi, pahalı ekipman gerektirmemesi, viskoz ejakülatlarda çok iyi sonuç vermesi, yüksek oranda HOS(+) sperm eldesi ve bu yolla elde edilen spermlerin zona-free hamster yumurtalarını etkin bir şekilde penetre etmeleri avantajları olup, dezavantaj olarak da sperm membranı üzerinde ultrastrüktürel bozulmalara neden olmakla suçlanmıştır. Uygulama şu şekilde gerçekleştirilir. Özel tip cam yünü 2cc lik bir enjektör içine 6-7mg tartılarak yerleştirilir ve 4-5cc kültür solüsyonu ile yıkanır. Daha sonra ıslatılmış cam yünü üzerine maksimum 2cc ejakülat eklenerek 37 0 C de 5 dakika içinde süzülmesi beklenir. Ardından 0.4cc kültür solüsyonu ile glasswool içerisinde kalmış ejakülatın da süzülmesi sağlanır ve süzülen tüm sperm fraksiyonu 1/3 oranında kültür solüsyonu ile dilüe edilerek 300g de 10 dakika santrifüj edilir ve süpernatan atıldıktan sonra pellet medium içerisinde resüspanse edilerek kullanılır. Daha pek çok semen işleme teknikleri olmasına rağmen en sık kullanılanlar yukarda sayılan teknikler olup diğerleri de bunların bir kombinasyonu şeklindedir. Örnek: Hyalüronik asit (Sperm Select) veya ficoll swim up da kullanılan medium hyalüronik asit/ficoll olup işlem temelde gene bir swim up işlemidir. Yüksek dansiteli media içine santrifügasyonda da percoll dışında nycodenz uygulaması yapılabilir, filtrasyon uygulamalarından da glasswool yerine sephadex column filtrasyonu (Sperm prep.) örnek olarak verilebilir. 24

İn Vitro Ortamda Sperm Motilitesinin Arttırılması Pentoksifilin Bir metilksantin derivatı olup hücre içi camp seviyesini fosfodiesteraz aktivitesini inhibe ederek yükseltir. Bu nedenle in vitro motilite stimülanı olarak kullanılmaktadır. Adenozin Bileşikleri ve Analogları Sperm adenilat siklazını aktive ederek hücre içi camp seviyelerini arttırırlar, bunlara örnek olarak 2-deoksiadenozin ve 2-O-metiladenozin verilebilir. Tek başına (35,36,37) veya pentoksifilin ile beraber kullanılmış (38,39) olup başarılı olduğuna dair yayınlar vardır. İntrauterin İnseminasyon (IUI) Sperm hücrelerinin seminal plazmadan ayrılıp stimüle edildikten sonra uterus içerisine verilmesi intrauterin inseminasyon olarak adlandırılmaktadır. IUI, seminal plazma içerisindeki prostaglandinlerin şiddetli uterin kasılmalara neden olması ve olası bakteriyel kontaminasyon dolayısıyla uygun hazırlama yöntemleri kullanılıp seminal plazmadan arındırılmış, hareketli spermlerle yapılmalıdır. İnseminasyon için kullanılacak miktarın 0.5cc yi geçmesinin de uterusta kontraksiyonlara yol açabileceği ve ağrılı olabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. Ovaryumların hormonal stimülasyonu ile multipl folikül sağlanması, IUI için rutin kullanılan yöntemlerden biridir. Erkek faktörüne bağlı infertilite olgularında klomifen sitrat ile stimülasyon sonucu siklüs başına gebelik yüzdeleri %6 ila %8 arasındadır. Stimülasyon HMG ile yapıldığında siklüs başına gebelik oranları %10 ila %15 arasında olup Ho ve arkadaşları tarafından yapılan karşılaştırmalı bir çalışmada (40) bu ajan ile stimüle edilmiş hastalardaki gebelik oranları %14.3 iken; doğal, stimüle edilmemiş ve IUI yerine cinsel ilişki denenmiş olgularda bu oran %0 olarak verilmektedir. IUI da başarı oranları sperm parametrelerindeki defekt veya defektlerin sayısı ve ciddiyetiyle doğru orantılıdır. Bu nedenle IUI yöntemi, hastalarda in vivo ortamda döllenmenin oluşabileceği düşünüldüğü vakalarda uygulanmalıdır. Bu amaçla kullanılacak kriterler arasında en önemli yeri strict kriterler ile değerlendirilmiş sperm morfolojisi (MEUSC) almakta olup IUI için limit >%4 normal morfolojidir. 25

IUI yöntemine alternatif olarak intraservikal inseminasyon (ICI) ve intraperitoneal inseminasyon (IPI) yöntemleri tanımlanmıştır. ICI nin hipospadias gibi mekanik nedenlerle erkek infertilitesi dışında erkek infertilitesi tedavisinde yeri yoktur. IPI ise yapılan kontrollü karşılaştırılmalı gebelik oranları açısından IUI a üstünlük göstermediği için yalnızca servikal stenoz nedeniyle uterusa ulaşılamayan durumlarda kullanılacak bir yöntem olduğundan erkek infertilitesi tedavisinde bir yeri yoktur. IUI ın bir diğer kullanım alanı ise retrograd ejakülasyon olgularıdır. Burada önce mesane içi kültür solüsyonu ya da ağızdan bikarbonat verilerek bazik hale getirilir, takiben hastadan mastürbasyon yapıp, idrarını steril bir kaba yapması söylenir. Bu materyalden elde edilecek spermleri kullanarak inseminasyon yapılabilir. İn Vitro Fertilizasyon (IVF) Yardımcı üreme teknikleri içerisinde en çok kullanılan ve en kontrollü yöntemdir. İn vitro fertilizasyon ve embriyo transferi vücut dışında yumurta ile spermin kültür ortamında yan yana konularak döllendirilmesi anlamına gelmektedir. Mikromanüplasyon Sperm değerleri çok düşük olan erkeklerde kullanılan bir yöntem olduğu için erkek infertilitesi olgularında vazgeçilmez laboratuar tekniği haline gelmiştir. Mikromanüplasyon fertilizasyonu artıran birçok gamet hazırlama tekniğinden oluşmaktadır. Bu teknikler assisted hatching, parsiyel zona diseksiyonu, zona drilling, subzonal sperm enjeksiyonu ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonudur. Bu teknikler arasında en invaziv olan intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu ile en yüksek fertilizasyon ve gebelik oranları elde edilmektedir (41,42). 3. Cerrahi Tedavi Erkek infertilitesinde kriptorşidizm, varikosel gibi birçok durumda tedavi amaçlı veya ART de cerrahi yolla sperm elde etme amacı ile MESA, PESA, TESA ve TESE gibi çeşitli cerrahi yöntemlerine başvurulmaktadır. 26

KADIN İNFERTİLİTESİ KADIN ÜREME FİZYOLOJİSİ Menstrüel siklüs düzenli aralıklarla görülen vajinal kanamalarla karakterizedir. Adet kanamalarının düzenliliği hipotalamus, hipofiz ve over arasındaki koordinasyona ve buna bağlı olarak hedef organ endometriumda meydana gelen değişikliklere bağlıdır. Her döngü (siklüs) adetin birinci günü başlar ve bir sonraki adetin başlayacağı gün öncesi biter. Ortalama siklüs 28 gün sürerse de 21-40 arasında değişebilir. Menstrüel siklüs sırasıyla foliküler ve luteal olmak üzere iki kısıma ayrılır. Luteal faz değişiklik göstermeyip 14 gün sürerken foliküler faz çok değişkenlik gösterebilir ve 7-21 gün sürebilir. Foliküler Faz Bir önceki siklüsün sonunda serum FSH düzeyi yükselmeye başlar ve siklüsün foliküler fazının ilk beş gününde de devam eder. FSH daki bu yükselme daha önce büyümeye başlayıp 1-2 mm çapına ulaşan 3-30 antral folikülün büyümelerini sürdürebilmelerini sağlar. Bu grup folikülden sadece bir tanesi büyümesini sürdürecek, diğerleri ise atreziye uğrayacaktır. FSH foliküldeki granüloza hücrelerinden aktivin ve inhibin salgılatır. İnhibin pitüiter bezden FSH sentez ve salgısını doğrudan inhibe eder ve teka hücrelerinden LH a bağımlı androjen salgısını da artırır. İnhibin birbirine disülfid bağları ile bağlı iki peptitten oluşur. İnhibin A ve İnhibin B denilen iki tipi vardır. Bunlarda α ünitesi ortaktır, β ünitesi farklılık gösterir. Yalnızca β alt ünitelerinin bir araya gelmesiyle aktivinler oluşur ve etkileri inhibinin tam tersidir. Aktivin aromataz aktivitesini artırarak östrojen sentezini uyarırken FSH reseptörlerinin çoğalmasını da stimüle eder. İnhibin ise teka hücrelerinden androjen salgılatır ki bu da östrojen yapımı için ön madde görevi görür. Ancak artan östrojen ve inhibin negatif feed-back ile FSH ı baskılar ve sonuçta siklüsün 5-7. günlerinde düşmeye başlar. 19 karbonlu androjenler olan androstenedion ve testosteron, teka ve interstisyel hücrelerden salgılanarak östrojen sentezi için ara madde görevi görürler. Ara androjen olan androstenedion ayrıca deri ve yağ gibi çevre dokularda da testosteron ve östrojenlere dönüşebilir. Teka hücrelerince sentezlenen bu 19 karbonlu androjenler granüloza hücrelerine diffüze olurlar. 27

Granüloza hücrelerinde androstenedion halkalarının aromatize olmasıyla 18 karbonlu östrojenlere dönüştürülürler. Östrojen sentezindeki teka ve granüloza hücrelerinin bu ortaklığıyla açıklanan teoriye iki hücre iki gonadotropin teorisi denir. FSH reseptörü açısından en zengin olan folikül dominans kazanıp gelişirken diğerleri geriler. Dolaşımdaki FSH, foliküler fazın ikinci yarısında düşerken bazal LH da yavaş yavaş yükselir. FSH ve östrojen sinerjistik olarak granüloza hücrelerinde LH reseptörlerinin oluşumunu indüklerler. Östrojen gonadotropin salgısının en güçlü inhibitörü iken 200-300pg/ml düzeylerinde 50 saat kadar kalması hipofize pozitif feed-back etki yapar ve LH ın ani yükselmesine (surge) neden olur. Artan östrojen pitüiter bezin GnRH ya duyarlılığını logaritmik olarak artırır ve GnRH nın gonadotropin salgılatıcı etkisi LH piki olana kadar devam eder. Ovülasyon Ovülasyon, ovumun olgun folikülden tuba uterinaya atılmasıdır ve LH ın ani yükselmesinden 12 saat sonra gerçekleşir. LH da en yüksek noktaya östrojenin pikinden 24 saat sonra ulaşır. LH en yüksek düzeyine ulaştığında östrojen düzeyi düşmeye başlamıştır. Ovülasyonda gözlenen bir fenomen matür granüloza hücrelerinden glikozaminoglikan salgılanmasıdır. LH pikini izleyerek artan bu salgı oosit ve onu çevreleyen granüloza hücrelerinin folikül duvarıyla olan bağlantısının gevşemesine neden olur. Bu da ovumun salınmasını kolaylaştırır. Yine LH etkisiyle salınan prostaglandin F 2α (PG F 2α), folikül çeperini çevreleyen düz kasların kasılmasına, dolayısıyla ovumun salınmasına yardım eder. Bu nedenle ovülasyon öncesi aspirin gibi prostaglandin inhibitörlerinin alınması ovumun salınmasını önleyerek luteinized unruptured follicule sendromuna yol açabilir. Luteal Faz Oositin salınması ile luteal faz başlar. Luteinize olmuş granüloza ve teka hücrelerinden oluşan korpus luteum kisti oositi destekleyen ve endometriumu implantasyona hazırlayan progesteronu salgılar. Progesteron salgısı LH surge ünden 6-8 gün sonra maksimuma ulaşır. Buna paralel olarak östrojen de yükselir. Hamilelik olmazsa 6-8 günden sonra progesteron düşmeye başlar ve siklüs sonunda iyice düşmesiyle adet kanaması başlar. Korpus luteumdan progesteron salgısı LH kontrolü altındadır. LH salgısı pulsatil olduğundan progesteron da pulsatil salgılanır ki, aynı gün 28