ENSTRÜMENTAL ANALİZ HPLC-2 HPLC dedektörleri 1 2 HPLC Dedektörleri kolonda birbirinden ayrılan maddeler hareketli faz ile birlikte dedektöre gelirler. Dedektör maddenin derişimi ile doğru orantılı bir özelliğini ölçmelidir. Gürültü (noise) örnekleri HPLC için ideal bir dedektör Geniş bir konsantrasyon aralığında yüksek duyarlılığa sahip olmalı Düşük gürültü seviyesine sahip olmalı Basınç ve sıcaklıktaki değişikliklere de duyarsız olmalıdır. Gürültü seviyesi: ortamda örnek olmadığında elde edilen pikler. Genellikle ortamdan sadece su geçrilerek belirlenir. Gürültü seviyesi dedektörün hassasiyeti hakkında bilgi verir. 3 4 HPLC de kullanılan dedektörler Absorbans Dedektörü Floresans Dedektörü Refraktif index dedektörü (Kırılma İndisi Dedektörü) Elektrokimyasal Dedektör İletkenlik Dedektörü Absorbans dedektörler En çok kullanılan dedektörlerden biridir. Maddelerin çoğu UV -görünür bölgede çeşitli dalga boylarında absorbansa sahiptirler. Kantitatif ölçümlerin esası Lambert-Beer yasasına dayanır. Absorbans dedektörleri, akış hücrelerinden geçen sıvının -sabit ya da istenilen değere ayarlanabilir dalga boyundaki- ışığı absorpsiyonunu ölçerler. 5 6 1
Radyasyon kaynağı UV bölgede (200-400 nm) döteryum lambası, görünür bölgede (400-700) ise tungsten lambadır. Dalga boyu seçicisi olarak monokromatörler kullanılır Ayrıca çift ışın yollu cihazlar bulunmaktadır (Diyot dizinli dedektör- Diode array detector-dad) DAD da ışın kaynağı olarak tungten ve döteryum lambalar kullanılmakta ve 195-950 nm arasında çalışılabilmektedir. Birden fazla dalga boyunda kromatogramlar izlenebilmektedir. 200-800 nm UV ve görünür bölgeyi kapsayan yüksek duyarlılığa sahip dedektörler bulunmaktadır. 7 8 Floresan dedektörler Floresans dedektörler, belli bir dalga boyunda ışığı absorpladıktan sonra başka bir dalga boyunda ışın yayan yani florasans özellik gösteren maddelerin yaydığı ışık şiddetini ölçerler. Dedektörde hücreden mobil faz içerisinde çözünmüş halde bileşikler geçerken üzerine uygun dalga boyunda monokromatik ışın gönderilir. Bileşik tarafından absorbe edilen bu ışın daha sonra başka dalga boyunda geri verilir. Floresans ölçümde bu emisyon analiz için değerlendirilir. 9 Floresan Dedektörler, en duyarlı dedektörlerden biridir. Bu nedenle iz miktardaki maddelerin analizinde kullanılır. Aflatoksinler, bazı vitaminler ve türevlendirilmiş aminoasitlerin analizinde kullanılır. Dalga boyu seçicileri filtreler veya monokromatörler olabilir. 10 Elektrokimyasal dedektörler Elektokimyasal yöntemler bir elektrot yüzeyinde oksidasyon ve redüksiyona maruz kalabilen hem inorganik hem de organik maddelerin analizi için büyük oranda kullanılır. Elektrokimyasal dedektörler sadece mobil faz iletken olduğu zaman çalışabilir. Bu yüzden mobil faz bir miktar su ve bir elektrolit içermelidir. Pratikte ilgilenilen komponenti okside etmeye veya indirgemeye uygun bir potansiyel kullanılır. Madde elektrokimyasal hücreden geçerken bir reaksiyon oluşur. Böylece akım yükselir. Gözlenen akım maddenin konsantrasyonuna bağlı olacaktır. Bu dedektörler fenoller, aromatik aminler ve nitrozobileşikleri gibi elektroaktif bileşiklerin analizinde kullanılır. 11 12 2
İletkenlik dedektörü İyonik bileşiklerin tayininde kullanılır. Kolondan çıkan mobil faz bileşenlerinin iletkenliği ölçülür İki inert elektrot yardımıyla ölçüm yapılır. Refraktif index dedektör Bileşenlerin kırılma indekslerinin ölçümüne dayanır. Dedektörde bir kuvartz membranla bölünmüş iki parçalı akış hücresi bulunmaktadır. Dedektör her iki yarı hücredeki mobil fazdan ışık geçirilerek sıfırlanır. Kolondan ayrılan bileşikler yarı hücrenin birisinden geçirilir. Refraktif indeks (RI) teki değişiklik, başlangıç sıfırlama şartlarında bir değişikliğe yol açar. Bu dedektörün cevabıdır. Kolondan gelen 20-40 ug a kadar maddeye duyarlıdır. 13 14 RID sıcaklık ve basınç değişmelerine, darbeye ve mobil fazdaki çözünmüş havaya karşı aşırı duyarlık gösterir. Bu nedenle deney sırasında bu faktörlere özel dikkat göstermek gerekir. Bu dedektörler dereceli elüsyon kullanılmaz Özellikle şeker ve lipit analizlerinde kullanılmaktadır. 15 16 Türevlendirme Birçok bileşiğin analiz edilmesi kimyasal türevlendirmeyle mümkündür. Özellikle UV absorpsiyonu önemli olmayan ve teşhisi zor bileşikler için önemlidir. Türevlendirme sadece maddenin teşhiş edilebilirliğini etkilemez Aynı zamanda kromatografik özelliğini de değiştirir. Türevlendirmeyle daha hidrofobik türler oluşur. Örn: polar aminoasitlerin phthaloyl türevlerinin oluşumu Oluşan bileşikler daha sonra zıt-faz bir kolonda ayrılabilir. HPLC de türevlendirme iki şekilde olabilir: Kolon öncesi (pre-column derivatization): Enjeksiyon öncesinde örnek, türevlendirme kimyasalı ile reaksiyona sokularak türevlendirme yapılır. Oda sıcaklığında hızlı bir reaksiyon istenir. 17 18 3
Kolon sonrası türevlendirme Bileşikler kolonda ayrıldıktan sonra kolon elüentine bir türevlendirme ajanının verilmesiyle gerçekleşir. Böylece kromatografi bundan etkilenmemiş olur. Bununla birlikte örnek dedektöre varmadan reaksiyonun hızla gerçekleşmesi önemlidir. Elüsyon sistemleri 1)isokratik elüsyon 2) dereceli (gradient) elüsyon 1) isokratik elüsyon: hareketli faz sabit bir akış hızında verilir. 19 20 2) Dereceli (gradient) elüsyon Polariteleri oldukça farklı bileşikleri içeren kompleks örneklerin uygun bir sürede rezolüsyonunu gerçekleştirmek her zaman mümkün olmayabilir Dereceli elüsyonda daha zayıf çözücü ile elüsyona başlanarak kromatogramın başındaki rezolüsyon iyileştirilir. Daha sonra gelen pikler elüte oluncaya kadar sürekli olarak solvent konsantrasyonu arttırılır. Böylece bütün bileşenlerin pikleri analiz edilebilecek şekilde elde edilir. Bu durumda pikler birbirlerinden ayrılmayabilirler, alıkonma süreleri uzun olabilir, ve pikler yayvan olabilir Dereceli elüsyon bu sorunların çözümünde kullanılır 21 22 Bir dereceli elüsyon sistemi Dereceli elüsyon bazı kompleks karışımların analizinde örneğin protein hidrolizatlarında aminoasitlerin analizinde zorunludur. Dereceli elüsyonda alıkonma zamanları değişir ve her analizden önce kolonun tekrar dengeye gelmesi için gerekli zaman dikkate alınmalıdır. 23 24 4
Kalitatif ve kantitatif analiz HPLC de Kalitatif, kantitatf analiz, kromatografik hesaplamalar, standart hazırlama (iç standart dış standart) GC de olduğu gibidir. HPLC için örnek hazırlama HPLC pekçok gıda komponentinin analizde kullanılabilir. Gıda bileşenleri çok farklı sınıflarında olduğu için genel analitik bir analiz yöntemi vermek zordur. 25 26 Analiz basamakları genel olarak A) örnek hazırlama 1) örnekleme 2) su içeriğinin bilinmesi 3) ekstraktsiyon en etkili çözücü ile 4) temizleme a) sıvı-sıvı partisyon kromatografisi b) kolon kromatografisi c) ince tabaka kromatografisi d) katı faz extraksiyon kartuşları B) kromatografi 5) HPLC parametrelerinin seçimi, optimizasyonu analiz a) enjeksiyon b) kromatografik seperasyon c) teşhis d) kalibrasyon grafiği Kantitatif sonuç ve rapor Analizlerde ilk basamak analitik örneğin seçimidir. Fungal kontaminasyonla oluşan mikotoksinlerin tayininde bu durum özellikle önemlidir Aynı esaslara dayandıkları rapor edilmedikçe örnekler arasında yapılacak kıyaslamalar bir anlam taşımaz. Eğer su miktarı değişken ise analizden önce kurutmak veya su miktarı tayini yapılarak değerleri kuru madde üzerinden vermek gerekir. 27 28 Pek çok durumda ilgilenilen komponentin ekstraksiyonunu yapmak gerekir Yumuşak içecekler ve yağlar gibi bazı örnekler basit bir seyreltme ile cihaza enjekte edilebilir. Ekstrakt doğrudan HPLC ye vermek için uygun olmalıdır. Bunun için genellikle temizleme gerekir. Temizleme amacıyla kartuşlar kullanılmaktadır. Ekstraksiyonun iyi yapılması gerekir. Tamamlanmamış ekstraksiyon nedeniyle pekçok hata oluşur. Bunun için tekrar ekstraksiyon ve analiz gerekir. 29 30 5
Temizlenmiş ekstrakt daha sonra HPLC cihazına enjekte edilir ve örneğe ait kromatogram alınır. Aynı şartlar altında saf standartlarda enjekte edilerek kromatogramlar elde edilir. HPLC nin kullanım alanları HPLC günümüzde en yaygın kullanılan ve popüler analiz tekniklerinden birisidir. Çünkü bu sistem, diğer kromatografi tekniklerinin temel ayırma prensiplerini kullanarak, her türlü bileşiğe duyarlı, çok hızlı, hassas ve güvenilir sonuçlar vermektedir. HPLC nin GC ye göre en büyük avantajı ısıya dayanıklı olmayan ve uçucu olamayan bileşikleri de analiz edebilmesidir 31 HPLC; gıda, kimya, tıp-adli tıp, eczacılık, çevre mühendisliği ve polimer endüstrisi gibi pek çok sahada geniş kullanım alanı bulmaktadır. 32 HPLC de analiz edilecek karışımda kimyasal olarak birbirine benzer bileşikler arasında iyi bir rezolüsyona sahiptir. Örn vitaminler, amino asitler. HPLC de uygun şartlar sağlandığında analiz süresi genellikle kısadır. Modern HPLC cihazlarının fiyatları çok yüksektir. Basit izokratik bir sistem ucuz olmakla birlikte dereceli elüsyon yapabilen ve çeşitli dedektörlere sahip bir sistem oldukça pahalıdır (yaklaşık 40.000 $) HPLC oldukça duyarlı bir tekniktir. örn: 750 fentogram (1 fg=10-15 g) aflatoksin veya 20 μg şeker kolona yüklendiğinde duyarlılık tespit edilmiştir. HPLC kolonları da pahalıdır. 33 34 Gıda Analizlerinde HPLC uygulamaları İnsan beslenmesine artan ilgi bir çok gıda komponentlerinin analiz gereksinimini de arttırmıştır. Makrokomponentlerin analizi basit olmasına karşın, vitaminler gibi mikrokomponentlerin analizi oldukça zor yapılmaktadır. İşlenmiş gıdaların günlük diyetteki oranlarının giderek artmasıyla hızlı analiz yöntemlerine olan gereksinim de artmaktadır. Üretimde de her basamağın etkisinin hızlı tayini için hızlı ve güvenilir yöntemlere gerek vardır. Gıdalarda bulunabilen düşük düzeydeki mikotoksin, nitrozamin ve pestisit kalıntılarının ve sentetik gıda katkı maddelerinin analizinde 1 ppb seviyeye inmek gerekmektedir. Bu nedenle kromatografik teknikler vazgeçilmez duruma gelmiştir. 35 36 6
Gıda ürünlerinin detaylı duyusal değerlendirilmesi zaman alıcı ve pahalı olmaktadır. Önemli duyusal karakteristiklerle objektif enstrümental verilerin korelasyonu kaçınılmazdır. İşlenmiş gıdaların besin içeriğinin etiketlenmesi de giderek artmaktadır. Bu nütrientlerin birçok örnekte hızlı bir şekilde otomatik olarak tayin edilme zorunluluğu kromatografik yöntemlere olan gerekliliği ortaya koymaktadır Karbonhidrat analizleri HPLC son 20-30 yıldır karbonhidratların kalitatif ve kantitatif analizlerinde kullanılan en önemli ayırma tekniğidir. Burada uygun bir kolon (iyon değiştirici, reçine, jel filtrasyon, biojel, sephadex vb), dedektör (RID) ve solvent (asetonitril+su) kullanılarakher türlü gıda maddesi içerisindeki karbonhidratlar ayrılıp analiz edilebilmektedir. Ancak, HPLC de iyi bir çalışma programı hazırlanmalı ve karşılaşılabilecek güçlüklere karşı alternatif çözüm yolları geliştirilmelidir. Örneğin, hangi gıda maddesinde nasıl bir ekstraksiyon yapılacak, analiz edilecek şekerin çözünürlüğü, molekül ağırlığı ve bunların yaklaşık oranı gibi faktörlerin dikkate alınarak uygun kolon, dedektör ve solvent seçiminin yapılması gerekir. 37 38 Lipit analizleri Amino asit, peptit ve protein analizleri Her türlü lipitlerin, izolasyon identifikasyon ve analizlerinde HPLC kullanılabilir. Ancak burada iyi bir ön temizleme ve ekstraksiyon işleminin yapılması gerekir. Bu amaçla, apolar ve nispeten polar çözücüler kullanılarak bazı kromatografi tekniklerinden de yararlanılabilir. Bazen türevlendirme yapılarak veya yapılmaksızın, uygun bir kolon materyali ile UV, RID, gibi dedektörler kullanılarak her türlü lipit bileşeni analiz edilebilir. aa analizi için ilgili protein veya gıda maddesi, asit hidrolizi (6 M HCI ile 110 C, 24h) veya enzim hidrolizine tabii tutulur, filtre edilir ve yabancı maddeler çöktürülür. Daha sonra seyreltilir ve gerekiyorsa türevlendirme yapılarak örnek analize hazırlanır. İyon değiştirici reçine ve adsorban içeren bir kolonda, normal veya zıt faz sistemi ile dereceli elüsyon tekniği ve UV, floresan gibi dedektörler ile çok çeşitli gıda maddelerinin amino asit içeriği belirlenebilir. 39 40 Vitamin analizleri Vitaminlerin gıdalar içerisinde çok az miktarda bulunmaları ve ısı, ışık, oksijen gibi faktörlerden kolay etkilenmeleri nedeniyle ortaya çıkan kararsız yapıları, bunların analizini güçleştirmektedir. Çok iyi örnek hazırlama, eksraksiyon ve saflaştırma yapıldığı takdirde, normal vitamin analizlerinde karşılaşılan olumsuzluklar, HPLC de görülmez dolayısıyla bu yöntem en iyi vitamin analiz metotlarından biri olarak kabul edilir. Örneğin yağda çözünen vitaminler için analiz öncesi örnek içerisindeki diğer bileşen ve lipitlerin sabunlaştırma, eksraksiyon, hidroliz enzimatik parçalama vb metodlarla uzaklaştırılması gerekir. Daha sonra analiz edilecek vitaminin özelliğine uygun bir yöntemle ekstrakte edilir, saflaştırılır ve gerekirse konsantre edilerek HPLC de analize hazır hale getirilir. Suda çözünen vitaminler için de benzer işlemler yapılır. 41 Organik asitler Organik asitler gıdalarda biyokimyasal proses sonucunda, bazı mikroorganizmaların aktiviteleri sonucu veya koruyucu amaçlı olarak ilave edilmesi şeklinde bulunur. Gıdaların duyusal özellikleri ve gıdanın sindiriminde önemli rolleri olan organik asitlerden sitrik ve malik asitler pek çok meyvede yaygın bir şekilde bulunurlar. Bunun dışında, tartarik, okzalik, laktik, süksinik asitler çeşitli gıdalarda değişen oranlarda bulunmaktadır. Organik asitlerin analizinde volumetrik, elektrokimyasal ve enzimatik yöntemler kullanılmış olsa da kromatografik yöntemler özellikle de HPLC bu bileşenlerin eş zamanlı olarak belirlenebilmesi için en uygun yöntemdir. Türevlendirmeye gereksinim olmadan 206-220 nm arasında UV dedektör ve zıt fa kolonlar ile analiz yapılabilmektedir. 42 7
Fenolik bileşikler Fenolik bileşikler pek çok meyve, sebze ve içecekte bulunan, bunların duyusal özellikleri ile renkleri üzerine etkili olan bileşenlerdir. Ortak özellikleri en az bir fenol grubu içermeleridir. Şu ana kadar bitkisel kaynaklardan 8000 çeşit fenolik bileşik tanımlanmıştır. Mikotoksinler Analiz edilecek materyal önce çeşitli solventlerle (metanol, kloroform, aseton, hekzan, asetonitril, su vb) ekstrakte edilerek filtre edilir. Silika ve polimer bazlı kolonlar kullanılarak Floresan dedektörlerle analiz yapılmaktadır. Yapılarında bir ya da daha fazla fenol halka içerdiklerinde UV bölgede absorpsiyon yaparlar. UV veya DAD dedektörler kullanılabilir. 43 44 8