Laboratuvar Tekniği Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 4. Hafta (07.03.2014) 1
4. Haftanın Ders İçeriği Biyoteknoloji de Moleküller ph kavramı ve ölçümü 2
Moleküller 4 ana kategori altında toplayacağımız hücresel molekül mevcuttur. Karbonhidratlar Yağlar Proteinler Nükleik asitler Bu ana dört hücresel molekülün biyolojik ve kimyasal özelliği mevcuttur. Deney sırasında çalıştığınız molekülün türünü bilmeniz size her zaman yardımcı olacaktır. 3
Karbonhidratlar Karbonhidratlar şekerler olarak da adlandırılır. -Karbonhidrat monomerleri monosakkaritler olarak da adlandırılır. Mono: 1; sakkarit: şeker Monosakkaritler, disakkaritleri (2 monomer); polisakkaritler (3+ monomer) oluşturmak için bir araya gelirler Di: 2; poly: çok; sakkarit: şeker 4
Karbonhidratlar Karbonhidratların fonksiyonları (işlevleri) Canlı organizmaların temel enerji kaynağıdır Yapısal molekül olarak özellikle bitkilerde, birçok mantarda ve eklem bacaklılarda görev alırlar. (örneğin selüloz ve kitin) Depo enerji molekülleri olarak görev alırlar (örneğin nişasta ve glikojen) 5
Karbonhidratlar Monosakkaritler Monosakkaritler: bir momomer Genellikle CH 2 0 nun çoklu katları şeklinde moleküler formülleri vardır Örneğin: C 6 H 12 O 6 (Glukoz ve fruktoz un formülü) 6
Karbonhidratlar Disakkaritler: iki monomer Kimyasal olarak iki monomerin bağlanması ile oluşur. Disakkaritlere örnek sofra şekeri olarak bilinen sukroz ve süt şekeri laktoz verilebilir. 7
Karbonhidratlar Polisakkaritler Polisakkaritler 2 den fazla monomerin kimyasal olarak bağlanması sonucu oluşur. Temel polisakkaritlere örnek; Nişasta: Bitkiler için depo şeker formudur Glikojen: Hayvanlar için depo şeker formudur Selüloz: Bitkilerdeki yapısal moleküldür Kitin: Birçok omurgasız hayvanın dış-iskeletini oluştururlar (çoğunlukla eklem bacaklılar) 8
Karbonhidratlar Polisakkaritler Polisakkaritler 2 den fazla monomerin kimyasal olarak bağlanması sonucu oluşur. 9
Yağlar Yağların fonksiyonları Depo enerji molekülleridir. Hücre membranlarının ana bileşenleridir (fosfolipidler) Yüzey koruyucu madde olarak ve yalıtım işlevi görürler. Birçok hormonun yapısına katılırlar (düzenleyici kimyasal görevi). 10
Yağlar Trigliseritler Hidrojen ve karbon atomlarından oluşurlar. Bu durum lipitleri hidrofobik yapar (su ve yağın durumunu düşünün) 11
Yağlar Trigliseritler Farklı tiplerdeki yağ asitleri Çift bağ yapılarının bulunup bulunmamasına bağlıdır. Doymuş un anlamı hidrojen bağlarının varlığını gösterir. 12
Yağlar Trigliseritler Yağların yapısında doymuşluk oranı arttığında katı yapı oluşumu artar, doymamış yağ asitleri yapısının daha çok olması durumunda ise sıvı yapı oluşumu artar. 13
Yağlar 14
Yağlar Trigliseritler Bitkilerin yapısında bulunan trigliserit (mısır yağı, zeytin yağı) yapıları doymamış yapılıdır. Bu durum bahsi geçen yağ yapılarının oda sıcaklığında sıvı halde bulunmalarını sağlar. Bu durumun istisnası tropikal bitkilerin trigliserit yapılarıdır) Birçok hayvansal kaynaklı trigliserit (tereyağ) doymuş yağ asitlerine sahiptir dolayısıyla oda sıcaklığında katı halde bulunurlar. 15
Yağlar Fosfolipidler Hücre membranlarının temel yapı taşlarıdır. Amfipatik: hidrofilik baş kısmı ve hidrofobik kuyruk kısmı vardır. Bu durum onları hücre membran yapısı için ideal bir konuma getirir. amfipatik anlamı İng. amphipathic (Yun. amphi: her iki; pathos: duygu) Bir molekülün yapısında hem hidrofobik hem de hidrofilik grubun bulunması. Protein ve lipitler de amfipatik özellik gösterebilir. 16
Yağlar: Fosfolipidler 17
Proteinler Proteinler 20 amino asit monomerinin birleşiminden bir araya gelmiş oldukça büyük polimer yapılı moleküllerdir. 18
Proteinler 19
Proteinler Amino asitler 20 farklı R grubu (değişken) amino asitlerin değişken kısmıdır ve proteinlerin spesifik yapısını tayin eder. Bazı R grupları hidrofobiktir. Bazı R grupları ise hidrofiliktir. Bazı R grupları asidik ve bazıları ise baziktir. 20
Proteinler Amino asitler 21
Proteinler 4 farklı protein yapısı mevcuttur. Birincil / primer yapısı : amino asit sırası (Polipeptit) İkincil / sekonder yapı: polipeptitlerin katlanma motifleri Tersiyer yapı: proteinin 3-D yapısı Quarterner yapı: birden fazla protein altbiriminin birleşmiş hali Primer yapı yukarıdaki yapılardan en stabil olanıdır. Bunun nedeni amino asitleri birbirine bağlaya kovalent bağ yapısıdır (kimyasal bağların en güçlü olanıdır) 22
Proteinler Primer yapı yukarıdaki yapılardan en stabil olanıdır. Bunun nedeni amino asitleri birbirine bağlaya kovalent bağ yapısıdır (kimyasal bağların en güçlü olanıdır) 23
Proteinler 24
Proteinler 25
Proteinler Protein yapıları Her bir proteininin işlevsel olabilmesi için eşsiz bir yapısı mevcuttur. Proteinler yapıtaşları olan amino asitlerin uzun zincir şeklinde biraraya gelmesiyle oluşan polipeptit yapılarından oluşur. Fonksiyonel olabilmeleri için halka ya da katlanmış eşsiz yapıda olmaları gereklidir. 26
Proteinler Her bir proteinin 3 boyutlu yapısı onun fonksiyonunu belirler Tek bir hücre >10.000 fazla farklı protein içerebilir Canlı organizmaların her bir hücresinin fonksiyonel olabilmesi protein yapıları olmazsa olmazdır. 27
Proteinler Proteinlerin bazı fonksiyonları Yapı/destek: Derideki kollajen yapısı, ligamentler ve tendonlar Emzimler: hücrelerdeki kimyasal reaksiyonların hızını arttırır (kataliz). Örneğin Amilaz enzimi nişastayı şekerlere parçalar. Savunma: İmmun sistemdeki antibodiler Transport: Hemoglobin kanda oksijen (O 2 )taşır. Hareket: Aktin kasların kasılması için kontraktil proteini önemlidir. Regülasyon: Hücre için mesajcı molekül olarak hormonlar. Örneğin inüsilin 28
Proteinler Denatürasyon: protein katlanmadığı zaman eşsiz yapısını kaybeder ve denatüre olur. Denatüre olan proteinler fonksiyonlarını/işlevlerini kaybeder. Denatürasyon sıcaklık, ph ve tuz konsatrasyonunun değişiminde olabilir. 29
Nükleik Asitler Bilgi yüklü polimerlerdir. Protein yapıları için kod-bilgi taşırlar. Nükleik asitler nükleotit denilen monomer alt birimlerden oluşmuşlardır. 2 tür nükleik asit vardır DNA (Deoksiribonükleik asit) ve RNA (Ribonükleik asit) Genler: Proteinlerin amino asit dizi bilgisini içeren özel DNA bölgeleridir. 30
Nükleik Asitler 31
Nükleik Asitler 32
Nükleik Asitler 33
Nükleik Asitler 34
Nükleik Asitler DNA Çift iplikli (Hidrojen bağlarıyla iplikler birbirine bağlanır). Şeker-fosfat yapılı ana omurgaya sahiptir. 4 farklı tip nükleotit; adenin, guanin, timin ve sitozin (A,G,T,C) Ana omurga yapısında kovalent bağlar yer alır. H-bağları bazlar arasında yer alır Adenin-Timin ile eşleşir Guanin-Sitozi ile eşleşir. 35
Nükleik Asitler Kromozomlar ve plazmidler Kromozomlar: uzun sarmal yapılı DNA parçalarıdır. Yapılarında kalıtımın birimleri olan genleri içerirler. Farklı organizmaların farklı sayıda kromozomları vardır. Bakteriler halkasal yapılı bir kromozoma İnsanlar 46 adet lineer kromozoma sahiptir. Plazmid DNA sı: Kromozomlardan farklı küçük, halkasal DNA parçalarıdır. Plazmidler proteinlerin tıbbı/tedavi amaçlı yada farklı maksatlar için üretiminde kullanılabilir. 36
Nükleik Asitler 37
Biyoteknoloji Laboratuvarındaki Hücresel Makromoleküller Karbonhidratlar: Suda çözünmeleri kolaydır. Bu duruma istisna: Selüloz olarak verilebilir; Suda çözünmez Bakteriler, mayalar için gıda olabilirler Proteinler Orta derecede suda çözünürler; topaklanmadan dolayı suda çözünmeleri zorlaşabilir. Proteinler kolayca yapısal hasara uğramaları ve denatüre olmaları nedeniyle laboratuvarda deneyin başından sonuna hassasiyetle çalışmayı gerektirir. Proteinler ısıl işleme ve vortekslemeye karşı hassas olduklarından bu konuda hassasiyet gösterilmelidir. Nükleik asitler DNA: Uygun şekilde saklandıklarında yapısını sabit şekilde yıllarca koruyabilir. Lipidler: Genelde suda çözünmezler. 38
ph kavramı ve ölçümü ph nın tanımı ph bir çözeltideki hidrojen iyonlarının (H + yada protonların) konsantrasyonunun ölçümüdür. Sayısal olarak ph hidrojen iyonlarının litre başına mol sayısının (Molar) negatif logaritması olarak tanımlanır. ph= -log [H + ] 39
ph kavramı ve ölçümü Çözeltilerin ph sının ölçülmesi Çözeltinin ph sı biyolojik ve kimyasal özellikler yönünden oldukça kritik öneme sahiptir. Biyoteknoloji laboratuvarında ph ayarlaması DNA, protein, nükleik asitler ve diğer hücresel moleküllerin çözeltilerini hazırlarken gereklidir. 40
ph kavramı ve ölçümü Saf su kendiliğinden iyonlarına ayrıldığında 10-7 M lık bir H + (ve OH - ) konsantrasyonu içerir. Burada negatif logaritma 7 dir. Buda bize saf suyun ph değerinin 7 olduğunu gösterir. Çözelti saf sudan yüksek H + konsantrasyonuna sahip olduğunda değer 7 den aşağıya düşer ve buna asidik denir. 41
ph kavramı ve ölçümü Çözeltinin içerdiği H + iyonları ya da molekülleri konsantrasyonu saf suyun altına düştüğünde ise ph değeri 7 nin üzerine çıkar ve buda bazik yada alkali olarak adlandırılır. ph ölçeğinin logaritmik olması, ph nın bir birimini H + iyonu konsantrasyonundaki 10-kat değişim şeklinde ifade edilir. 42
ph kavramı ve ölçümü Biyoloji de ph neden önemlidir? Proteinler, nükleik asitler, karbohidratlar ve yağları içine alan birçok biyolojik molekül ph değişimlerine karşı oldukça duyarlıdır. ph da ani değişimler olduğu takdirde bu moleküller işlevlerini yerine getiremez hale gelirler. Birçok canlı organizma için ph değeri 6.5 ila 8.2 arasındadır. 43
ph kavramı ve ölçümü ph nın önemli olduğunu gösteren örneklere bakacak olursak; İçme suyu arıtması işlemi doğru ph ile doğrudan ilişkilidir. Şeker endüstrisinde ph nın yanlış ayarlanması istemeyen asitlerin oluşmasına ve çok az miktarda şeker elde edilmesiyle sonuçlanır. Atıksuyun arıtımı sonrası deşarj edilecek suyun ph sı çok önemlidir. Burada kanalizasyona neden aşırı asidik yada bazik kirleticilerin atılmaması gerektiğinin önemi bir kez daha ortaya çıkar. 44
ph kavramı ve ölçümü Süt ün ph sı 6 olduğunda acılaşır. İyi kalite bir sütün ph sı kontrol edilmelidir. Klasik yöntemle jöle yapımında ph 4 den küçük olmalıdır aksi takdirde jelleşme meydana gelmez. Araba parçalarının krom kaplaması doğrudan kaplama çözeltisinin ph sı ile doğrudan ilgilidir. Özetleyecek olursak, üretim süreçlerindeki en basit kimyasal reaksiyonlar bile ph ile ilişkilidir. Üretimin iyi kalitede olması optimum ph değerine bağlıdır. Kalite standartlarını sabit hale getirmemiz ve ürünlerin düzgün yapılı olması ph nın sürekli kontrol edilmesi ile ilgilidir. 45
ph kavramı ve ölçümü ph yı ölçme prosedürü Ph metre ve ph belirteci kağıtlar. ph belirteç kağıtları hızlı ölçüm yapar ancak ölçüm hassasiyeti ph metreye göre daha azdır. Örneğin 6,8 olan bir çözeltinin ph sını ph metre 6,8 olarak ölçerken ph belirteç kağıtları 7 olarak ölçebilir. 46
ph kavramı ve ölçümü ph belirteç kağıtları Bu kağıtlar dar aralıklı yada geniş aralıklı olabilir. Geniş aralıklı ölçüm yapanlar 0-14 arasında değerleri gösterir. ph değişimi renk teki değişim ile belirlenir. ph sı ölçülecek olan çözeltinin içine daldırılan belirteç hızlıca çıkarılır. Belirteçte oluşan renk referans renk ile karşılaştırılarak ph değeri tayin edilir. 47
ph kavramı ve ölçümü ph metre ph metre, elektrodlar vasıtasıyla [H + ] miktarını hassas bir şekilde ölçerek ph değerini ölçer. ph metrenin doğru ölçümü verebilmesi için belirli aralıklarda standart tamponlarla kalibre edilmelidir. 48
ph kavramı ve ölçümü ph metre ph metrenin cam elektrodunun kırılmaması için dikkatli olunmalıdır. ph metre farklı çözeltiler ile kontamine olmaması için her kullanımdan önce ve kullanım sonrası saf su ile yıkanmalıdır. Bu işlemi piset ile gerçekleştirebilirsiniz. 49
Tampon çözeltiler Tampon un anlamı çözeltinin ph sının değişimine karşı koyan anlamındadır. Bu şu anlama gelir; Tampon içeren bir çözeltiye asit yada baz ilave edildiğinde ph çok fazla değişmez. Çözeltide tamponun bulunmadığı aksi durumda ortama azıcık asit yada baz ilavesi çözeltinin ph sının ani değişimine neden olur. Biyoloji de çokça kullanılan tamponlar Tris tamponu ve fosfat (PO 4 ) temelli tamponlardır. 50
Tampon çözeltiler Tampon çözelti ne demektir? Bir çözeltiye belli miktarlara kadar asit veya baz eklendiğinde, çözeltinin ph değerinin değişmesini engeller yönde tepkime verebilen özel çözeltilere tampon çözelti denir. Örneğin 0.01 mol hidroklorik asit, 1 litre saf suya eklenirse; çözeltinin ph ı 7 den 2 ye düşer. Ancak aynı miktarda hidroklorik asidi, 1 litre tampon çözeltiye eklersek, ph derişimi sadece 0.1 birim civarında olur. 51
Tampon çözeltiler Tampon çözelti ne demektir? Vücudumuzdaki kan, bir çeşit tampon çözeltidir. Kan ve benzeri biyolojik sıvıların işlevlerini yerine getirebilmeleri için, ortamın ph değeri belirli olmalı ve ani değişiklikleri engellemelidir. Kanın oksijen taşıyabilmesi için ortamın ph değeri 7.4 olmalıdır. Eğer ph değeri 0.1 birim kadar bile değişseydi, kan oksijen taşıma özelliğini kaybederdi. Kanımızdaki tampon çözeltide karbonik asit (H 2 CO 3 ) ve bikarbonat (HCO 3- ) konjuge asit baz çifti yanında, başka konjuge asit baz çiftleri de vardır. 52
Tampon çözeltiler Belirli ph larda tampon çözeltiler hazırlama Belirli biyolojik moleküller optimum fonksiyon gösterebilmeleri için belirli ph larda farklı çözeltiler hazırlanmalıdır. 53
Never Stop Thinking! 54