TÜKETİCİ GÜVENLİĞİ LABORATUVARLARI DAİRE BAŞKANLIĞI BİYOSİDAL ÜRÜNLER MİKROBİYOLOJİK ETKİNLİK TEST LABORATUVARI Biyolog Nalan BUDAK 1
KURULUŞ AMAÇ İÇERİK FİZİKİ YAPI VE DONANIM NUMUNE GRUBU KULLANILAN ALANLAR VE UYGULANAN STANDARTLAR METOTLARIN PRENSİPLERİ VE TANIMLARI HEDEFİMİZ 2
KURULUŞ: Laboratuvarımız ilk olarak REFİK SAYDAM HIFZISIHHA MERKEZ BAŞKANLIĞI bünyesinde 2009 yılında Dezenfektan Mikrobiyolojik Etkinlik Laboratuvarı olarak kurulmuş ve faaliyetlerini sürdürmeye başlamıştır. 663 sayılı Sağlık Bakanlığı ve bağlı kuruluşlarının teşkilat ve görevleri hakkındaki Kanun Hükmünde Kararname gereğince 2012 yılında TÜRKİYE HALK SAĞLIĞI KURUMU NUN kuruluş amaçları doğrultusunda Tüketici Güvenliği Laboratuvarları Daire Başkanlığı kurulmuştur.bu tarih itibari ile de Laboratuvarımız Biyosidal Ürünler Mikrobiyolojik Etkinlik Test Laboratuvarı adı ile çalışmalarına devam etmektedir. 3
AMAÇ: Dezenfektanların; kullanım alanlarına uygun olarak zorunlu mikroorganizmalara etkili olup olmadığının ulusal ve uluslararası geçerliliği olan standart test metotları ile yapılabilmesini sağlamak, Uygulama konsantrasyonlarının ve sürelerinin doğru olarak belirlenebilmesi, direnç gelişiminin ve hastane enfeksiyonlarının önlenebilmesine yardımcı olunmasının sağlanması, Sonuç olarak İnsan sağlığı, halk sağlığı, hayvan sağlığı ve çevre sağlığının korunması için piyasaya güvenilir ve kaliteli ürünlerin sunulmasına yardımcı olmak. 4
Fiziki Yapı; -21m 2 çalışma değerlendirme alanı, -15m 2 besiyeri hazırlama ünitesi, -10m 2 kirli dekontaminasyon alanı mevcut olup -Biyogüvenlik Düzeyi 2 seviyesindedir. -Havalandırma sistemine sahip olup camları açılmamaktadır. -Isı ve kimyasallardan etkilenmeyen çalışma yüzeylerine sahipdir. Personel Yapısı 3 biyolog arkadaş çalışıyoruz, Ayrıca besiyeri ünitemizde 2 teknisyen arkadaşımız, Kirli dekontaminasyon alanında 2 yardımcı hizmetli arkadaşımız görev yapmaktadır. 5
BGD2 - İnsanda hastalık yapan mikroorganizmalarla çalışma yapılabilen, - Giriş sınırlaması, biyotehlike işareti, kesici-delici önlemleri, ve biyogüvenlik el kitabı bulunması zorunluluğu olan, - Saçılmaya yol açan veya aerosol üreten işlemlerde biyogüvenlik kabini (BGK Class 2) kullanılan, - laboratuvar önlüğü, eldiven ve yüz koruyucu önlemleri alınan, - Kontamine atıkların otoklavlanması.geri dönüşümsüz atıklar otaklav poşetleri içinde otaklavlanır ve tıbbi atık ünitelerine gönderilir,geri dönüşümlü olan cam malzemeler önce otaklavlanır,daha sonra yıkama ve kurutma işlemleri yapılır. 6
Mevcut Cihaz ve Ekipmanlar Biyogüvenlik kabini Class 2 İnkübatör Soğutmalı inkübatör Buzdolabı Spektrofotometre Santrifüj Vorteks Derin dondurucu Otoklav Isıtıcılı Magnetik Karıştırıcı Pipetleme Cihazı Otomatik Pipet seti Kronometreler İç-dış sıcaklık ölçer, Dataloger ph metre Steril disposable değişik ebatlı Tüpler,Pipetler,Pipet uçları Enjektör,Enjektör Ucu Filtreler Özeler,Petriler, Burgu Kapaklı Cam Tüpler, Şişeler,Beherler Erlenmayerler Kesici Delici Atık Kutuları Otoklav Sepetleri,Kovaları ve Poşetleri Tüp Sporları 7
Besiyeri Hazırlama Ünitesi 15m² kulanım alanına sahiptir Otoklav Hassas Terazi 2
Çeker ocak /Cam Malzeme Kurutma Etüvü 9
Cam Malzeme Dolabı 10
Listeli Besiyeri Dolabı 11
2 adet Buzdolabı 12
-70 C Derin Dondurucu / Soğutmalı inkübatörler 13
Kirli Dekontaminasyon Alanı; 10m² kullanım alanı 14
Şifreli /Güvenli Laboratuvar Girişi 15
21m² Çalışma, Değerlendirme Alanı Biyogüvenlik kabini, Buzdolabı, Soğutmalı inkübatör 16
İnkübatörler ve Sıcaklık Kontrolleri 17
Çalışma Masası, Vortex, Spektrofotometre 18
Santrifüj,Su banyosu, Isıtıcılı Magnetik Karıştırıcı 19
Membran Filtrasyon Cihazı 20
NUMUNE GRUBUMUZ Laboratuvarımızda numune kabul kriterlerimize uygun olarak kabul edilen, Biyosidal Ürünler Yönetmeliği 1.Ana Grup içinde yer alan dezenfektanlar ve antiseptiklerin (ürün tipi 1,2,3,4) kullanıldıkları alanlara uygun şekilde mikrobiyolojik etkinlik testleri bakterisidal, fungisidal ve sporisidal olarak TS EN Standart Metotlarına göre çalışılmaktadır. Raporlandırma işlemide çalışılan standartların gerektirdiği şekilde ve sonuç değerlendirme kısmında etkin etkin değildir ifadeleri ile belirtilir. 21
TANIMLAR BİYOSİDAL ; Latince kökenli bir kelime olup biyo - canlı ve sidal - öldürmek kelimelerinden oluşmuş ve kısaca canlı öldüren anlamındadır. Kullanım amacına göre dezenfektan, antiseptik, antiviral, insektisit, rodentisit, antibakteriyel gibi isimler almaktadır. DEZENFEKTAN; Cansız yüzeylerdeki patojen mikroorganizmaları elimine ederek, dezenfeksiyonu sağlayan kimyasal ajanlardır. ANTİSEPTİK Canlı yüzeylerdeki patojen mikroorganizmaları elimine ederek, antisepsiyi sağlayan kimyasal ajanlardır. 22
Ürün Tipi T.C. Sağlık Bakanlığı Kullanım Alanı Standart Dezenfektan Türü 1 Medikal Alan TS EN 13727 Hijyenik el yıkama ürünü 1 Medikal Alan TS EN 13727 Durulama gerektirmeyen cilt dezenfektanı 1 Medikal Alan TS EN 13727 Cerrahi el dezenfektanı Kullanılacak Mikroorganizmalar S.aureus ATCC 6538 P.aeruginosa ATCC 15442 E.coli K12 NCTC 10538 E.hirae ATCC 10541 S.aureus ATCC 6538 P.aeruginosa ATCC 15442 E.coli K12 NCTC 10538 E.hirae ATCC 10541 S.aureus ATCC 6538 P.aeruginosa ATCC 15442 E.coli K12 NCTC 10538 E.hirae ATCC 10541 1 Medikal Alan TS EN 13727 Yüzey dezenfektanı S.aureus ATCC 6538 P.aeruginosa ATCC 15442 E.hirae ATCC 10541 1 Genel kişisel hijyen Bakterisidal Etkinlik TS EN 1276 El dezenfektanı S.aureus ATCC 6538 P.aeruginosa ATCC 15442 E.coli ATCC 10536 E.hirae ATCC 10541 Zorunlu Şart 20 C, 1 dakika Kirli şartlar 20 C, 1 dakika 20 C, 5 dakika Kirli şartlar 20 C, 5 dakika 20 C, 1 dakika Olması gereken azalma(log) 3 log 5 log Yıkanan: 3 log Yıkanmayan: 5 log 5 log 5 log 23
Bakterisidal Etkinlik Ürün Tipi Kullanım Alanı Standart Dezenfektan Türü Kullanılacak Mikroorganizmalar Zorunlu Şart Olması gereken azalma(log) 2 Umumi alanlar EN 1276 Ekipman ve yüzey dezenfektanı S.aureus ATCC 6538 P.aeruginosa ATCC 15442 E.coli ATCC 10536 E.hirae ATCC 10541 20 C, 5 dakika 5 log 3 Veterinerlik EN 1656 Yüzey ve Ekipman dezenfektanı S.aureus ATCC 6538 P.aeruginosa ATCC 15442 P.vulgaris ATCC 13315 E.hirae ATCC 10541 10 C, 30 dakika 5 log 4 Gıda ve Yem EN 1276 Yüzey ve Ekipman dezenfektanı S.aureus ATCC 6538 P.aeruginosa ATCC 15442 E.coli ATCC 10536 E.hirae ATCC 10541 20 C, 5 dakika 5 log 24
Fungisidal Etkinlik Ürün Tipi Kullanım Alanı Standart Dezenfektan Türü Kullanılacak Mikroorganizmalar Zorunlu Şart Olması gereken azalma(log) 1 Medikal alan TS EN 1650 El Dezenfektanı C.albicans ATCC 10231 A.niger ATCC 16404 20 C, 15 dakika 4 log 1 Umumi alanlar TS EN 1650 El Dezenfektanı C.albicans ATCC 10231 A.niger ATCC 16404 20 C, 15 dakika 4 log 2 Umumi alanlar TS EN 1650 Ekipman Dezenfektanı C.albicans ATCC 10231 A.niger ATCC 16404 20 C, 15 dakika 4 log 3 Veterinerlik TS EN 1657 Yüzey ve Ekipman Dezenfektanı C.albicans ATCC 10231 A.niger ATCC 16404 10 C, 30 dakika 4 log 4 Gıda ve Yem TS EN 1650 Yüzey ve Ekipman Dezenfektanı C.albicans ATCC 10231 A.niger ATCC 16404 20 C, 15 dakika 4 log 25
Sporisidal Etkinlik Ürün Tipi Kullanım Alanı Standart Dezenfektan Türü Kullanılacak Mikroorganizmalar Zorunlu Şart Olması gereken azalma(log) 2 Umumi alanlar TS EN 13704 Ekipman dezenfektanı B. subtilis ATCC 6633 20 C, 60 dakika 3 log 4 Gıda ve Yem TS EN 13704 Yüzey ve Ekipman dezenfektanı B. subtilis ATCC 6633 20 C, 60 dakika 3 log 26
Bu standartlar 2 temel prensipten oluşmaktadır. 1- Seyreltme nötralizasyon veya seyreltme membran filtrasyon yöntemi (dezenfektanın nötralize edilemediği durumlarda) ile belirli sayıdaki logaritmik canlı mikroorganizma miktarının (N ve N 0 ) engelleyici madde (bovine albumin) ile birlikte dezenfektanla direk veya sert su ile sulandırılarak zorunlu test sıcaklığında belirli temas süresine maruz bırakılması ve temas süresi sonucunda dezenfektanın etkisinin durdurulması - nötralize edilmesi ile kalan canlı sayısının (Na) bulunması ve başlangıçtaki canlı sayısından logaritmik bazda istenilen düşüşün(logr) gerçekleşip gerçekleşmediğinin belirlenmesi esasıdır. Kısaca formülize edersek; logr=logn 0 - logna şeklindedir. Engelleyici madde oranı ürünün temiz yada kirli şart zorunluluğuna göre değişir. Temiz şartlar için; 0,3 g/l bovine albumin Kirli şartlar için; 3g/l bovine albumin 27
2-Doğrulama testlerinin diğer bir anlamda İç kalite kontrollerinin yapılmasıdır.bu iç kalite kontrollerinin yapılmasında Nv onaylama süspansiyonu kullanılır. A:Deneysel şartların Kontrolü; Seçilmiş deneysel şartların onaylanması ve/veya test şartlarında herhangi ölümcül bir etkinin bulunmadığının doğrulanması. B:Nötralizan Kontrolü; Nötralizerin canlı mikroorganizma üzerinde toksisitesinin bulunmadığının doğrulanması C:Metod onaylaması; Dilüsyon-Nötralizasyon onaylama.dezenfektanın mikroorganizma ile temas süresi sonunda etkinliğinin durdurulup durdurulamadığının doğrulanması A,B ve C doğrulama parametrelerindeki canlı mikroorganizma sayısı: 0,5 x Nv 0 olma kuralının geçerliliğini sağlamalıdır Aksi durumda testin tamamı tekrar edilir. 28
Canlı mikroorganizma sayısının belirlenmesi; - Kültür kolleksiyonlarından temin edilen standart saf liyofilize ATCC suşları suş açma prosedürüne (TS EN 12353) uygun olarak açılır,uygun besiyerlerine ekim yapılarak saf olup olmadığı kontrolü yapılır -Kontrolden sonra skimmilk besiyeri ile (1-2ml lik) steril croviyal tüplerde -70 C lik derin dondurucuda stoklanır. 2 ayda bir yatık besiyerine geçiş yapılarak çalışma stok kültürü yenilenir. Stok kültürlerden her çalışma için 24sa+24sa lik subkültürler yapılır. - Suşların herbiri için subkültürlerden spektrofotometrede 620nm dalga boyunda, kullanılan seyreltciye (TPS; tuzlu peptonlu su) karşılık okuma yapılır. Bu değerler her suş için ayrı olarak yapılır. İstenilen sayılar elde edilinceye kadar devam edilir. - İstenilen canlı sayısına ulaşıldığında her bir mikroorganizma için absorbans değer sabitlenir ve daha sonra her çalışmada bu değer elde edilerek canlı sayısının bu aralıklarda olduğu belirlenmiş olur.her testte canlı sayısı N(Test süspansiyonu) ve Nv(onaylama süspansiyonu) değerleri hesaplanır. 29
Bakterisidal etkinlikte canlı mikroorganizma sayısı N= 1.5x10 8-5x10 8 cfu/ml N 0 = N/10 Onaylama Süspansiyonu Nv= 3x10 2-1.6x10 3 cfu/ml Nv 0 = Nv/10 N değeri ; 10-7 ve 10-6 dilüsyonlardan, Nv değeride tabloda görüldüğü şekliyle 10-5 den (1+3ml) olarak ve Nv 10-1 lik dilüsyondan parelel ikili 1 er ml.lik dökme plak tekniği ile TSA besiyerine ekim yapılır,24sa.ve 48 sa. sayımları alınır. Seyreltme oranı ile birlikte hesaplanır. Standartta belirtilen aralıkta olup olmadığı kontrol edilir. N ve Nv tüpü hariç bütün tüpler 4.5ml seyreltici (TPS) içerir Nv tüpü 3ml.TPS içerir. 30
Fungisidal etkinlikte canlı mikroorganizma sayısı N= 1.5x10 7-5x10 7 cfu/ml N 0 = N/10 Nv=4.5x10 2-1.8x10 3 cfu/ml Nv 0 = N/10 N değeri ; 10-6 ve 10-5 dilüsyonlardan, Nv değeride tabloda görüldüğü şekliyle 10-4 den (1+3ml)olarak ve Nv 10-1 lik dilüsyondan parelel ikili 1 er ml.lik dökme plak tekniği ile Malt besiyerine ekim yapılır,24sa.ve 48 sa. sayımları alınır. Seyreltme oranı ile birlikte hesaplanır. Standartta belirtilen aralıkta olup olmadığı kontrol edilir. N ve Nv tüpü hariç bütün tüpler 4.5ml seyreltici (TPS) içerir Nv tüpü 3ml TPS içerir. 31
Sporisidal etkinlikde canlı mikroorganizma sayısı N= 1.5x10 6-5x10 6 cfu/ml N 0 = N/10 Nv= 6x10 2-3x10 3 cfu/ml Nv 0 = N/10 N değeri ; 10-5 ve 10-4 dilüsyonlardan, Nv değeride tabloda görüldüğü şekliyle 10-3 den (1+3ml)olarak ve Nv 10-1 lik dilüsyondan parelel ikili 1 er ml.lik dökme plak tekniği ile GYA (glikoz yeast ekstrakt) besiyerine ekim yapılır,24sa.ve 48 sa.lik sayımları alınır. Seyreltme oranı ile birlikte hesaplanır. Standartta belirtilen aralıkta olup olmadığı kontrol edilir. N ve Nv tüpü hariç bütün tüpler 4.5ml seyreltici (TPS) içerir Nv tüpü 3ml TPS içerir 32
Ürün aktif maddelerine göre; Kullanılan Nötralizer Maddeler Aktif Madde Nötralizan maddeler Kulanım Bileşenleri oranı Quaternary ammonium bileşenleri Biguanide ve benzer bileşenler Chlorine, iodine, hydrogen peroxide, peracetic acid, hypochlorites Aldehyde Phenol ve orthophenylphen ol phenoxyethanol, triclosan vb Lecithin, Saponin, Polysorbate 80, Sodium dodecyl sulphate, Lecithin, Saponin, Polysorbate 80 Sodium thiosulphate Catalase L histidine Glycine Lecithin Polysorbate 80 Ethylene oxide Polysorbate 80, 30 g/l + saponin, 30 g/l + lecithin, 3 g/l. Polysorbate 80, 30 g/l + sodium dodecyl sulphate, 4 g/l + lecithin, 3 g/l. Polysorbate 80, 30 g/l + saponin, 30 g/l+ lecithin, 3 g/l. Sodium thiosulphate, 3 g/l,+ 20 g/l polysorbate 80, + lecithin, 3 g/l. Polysorbate 80, 50 g/l + catalase 0,25 g/l + lecithin 10 g/l. Polysorbate 80, 30 g/l + lecithin, 3 g/l + L-histidine, 1 g/l (veya + glycine,1 g/l). Polysorbate 80, 30 g/l + saponin, 30 g/l + L-histidine, 1 g/l (veya + glycine, 1 g/l). Polysorbate 80, 30 g/l + lecithin, 3 g/l. Ethylene oxide 7 g/l + lecithin, 20 g/l, + polysorbate 80, 4 g/l. Alkol Lecithin, Saponin, Polysorbate 80 Polysorbate 80, 30 g/l + saponin, 30 g/l + lecithin, 3 g/l. 33
İncelenen Mikrobiyolojik Parametreler Metot Plak Sayım yöntemi (kullanılan plak sayısı) Test sıcaklığı İnkübasyon sıcaklığı Engelleyici Madde Test Organizması Kullanılan Nötralizer Mikrobiyolojik Parametreler (Zorunlu şartlar) Dezenfektan Bakterisidal etkinlik testi EN 13727 Seyreltme- Nötralizasy on Dökme Plak (2x1 ml) 20 C 36 C Bovin albümin (0,3 g/l) P. aeruginosa S. aureus E. hirae E.coli Tween 80 %3 Saponin %3 Na-tiyosülfat %0.5 L-Histidin%0.1 Test Organizması: Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) Analiz Sonuçları Doğrulama ve Kontroller Test Süspansiyonu ve Test x Onaylama süspansiyonu x Deneysel şartların Nötralizer kontrolü (B) Metot doğrulaması (C) (Nv 0 ) x kontrolü (A) x Ürün konsantrasyon: %80 x x Vc 67 73 Vc 58 55 Vc 71 78 Vc 62 70 79 52 88 79 30 160? A nın 0,5 x Nv 0? B nın 0,5x Nv 0? C nin 0,5x Nv 0? Evet Hayır Evet Hayır Evet Hayır Evet Hayır Test-süspansiyonu (N ve No): Vc wm = 2.7 x10 8 logn=8.43 10-6 254 272 No = N/10; logno = 7.43 10 7 28 37 7,17 logno 7,70? Evet Hayır % (v/v) ürün konsantrasyonu Vc Na (= x10) log Na log R Temas süresi (sn) 80 <14 <14 <140 <2.15 >5.28 30 Değerlendirme: Mikrobiyolojik etkinlik test sonuçlarına göre ürün; TS EN.. metodunun zorunlu şartları ve temiz şartlar altında uygulanan temas süresinde istenilen. log luk düşüşü göstermiş - göstermemiş olup. yönden etkin olarak değerlendirilmiştir değerlendirilmemiştir. 34
Analiz Verilerinin Değerlendirilmesi 2013 yılında gelen numunelerin %86 sı üretim izni,%14 ü şikayet olarak gelmiştir 35
Şikayet numunelerinin %50 si uygun,%50 si uygunsuz olarak değerlendirilmiştir. 36
Üretim izni numunelerinin %84 ü uygun, %16 sı uygunsuz olarak değerlendirilmiştir 37
HEDEFİMİZ TS EN ISO/IEC 17025 Deney ve kalibrasyon Laboratuvarlarının yeterliliği kapsamında dökümantasyon bazında hazırlıklarımızı tamamlayarak akredite laboratuvar olmak 38
TEŞEKKÜRLER 39