ÜN TE 4
Genler üzerinde yapılan çalışmalara bağlı olarak istenilen ürünlerin elde edilmesidir. Klonlama: İstenilen özellikte gen taşıyan DN parçasının çoğaltılmasına denir. Klonlamada İzlenen Yollar: 1. 2. stenilen özellikte geni içeren hücrenin özüt haline getirilmesi. DN nın saf eldesi. Özüt haline getirilmiş deney tüpüne protein sindirici, RN sindirici gibi enzimler eklenerek DN deney tüpünden özel yöntemle çıkarılır. 3. 4. 5. 6. 7. DN dan ilgili parçanın kesilmesi. DN yı parçalara ayırma işleminde Restriksiyon endonükleaz enzimi kullanılır. İstenilen gen parçasının taşıyıcı DN sına aktarımı. Parça birleşiminde, DN ligaz enzimi kullanılır. Elde edilen rekombinant DN nın taşıyıcı hücreye aktarımı. Seleksiyon (Eleme). Uygulama. DN RN RN sindirici enzim Protein sindirici enzim Özüt Protein Restriksiyon enzim DN ligaz enzimi Rekombinand DN Ta y c hücre Plazmid DN akteri Ta y c hücre Seleksiyon Uygulama 203
Hücrelerelere gen transferinde etkili olan yöntemler: 1. 2. 3. 4. Kimyasal teknikler. Fiziksel teknikler. iyolistik yöntem Mikroenjeksiyon yöntemi Elektroporasyon yöntemi Füsyon teknikleri; Gen parçalar n baz özel tafl y c lara ba layarak istenilen hücreye aktarma ki hücre DN's n n birlefltirilmesi Viral teknikler. Örnek : Kopyalanacak canl Ta y c anne 1 2 Kültürdeki kök hücrelerinin hücre döngüsü durdurulur. Ovaryumdan al nan yumurta 3 Hücreler kayna t r l r Çekirdek aktar m ; iyolistik Mikroenjeksiyon Elektroporasyon yöntemleri ile yap l r. Çekirdek uzakla t r l yor Meme nden al nan çekirdek Erken embriyo 4 Ta y c annenin rahmine yerle tirilir Ta y c anne 5 Embriyonik geli me C Yavru Genetiksel olarak ya benzer Sitoplazmik kal t m olarak ye benzer Mitokondriyal kal t m olarak ye benzer 204
Örnek : Kopyalanacak canl Yumurta verici di i aslan Kültürdeki kök hücrelerinin hücre döngüsü durdurulur. 1 2 Ovaryumdan al nan yumurta 3 Hücreler kayna t r l r Çekirdek aktar m ; iyolistik Mikroenjeksiyon Elektroporasyon yöntemleri ile yap l r. Çekirdek uzakla t r l yor Meme nden al nan çekirdek Erken embriyo 4 Ta y c annenin rahmine yerle tirilir C Ta y c anne 5 Embriyonik geli me D Yavru Genetiksel olarak ya benzer Sitoplazmik kal t m olarak ye benzer Mitokondriyal kal t m olarak ye benzer Örnek : Kültürdeki kök hücrelerinin hücre döngüsü durdurulur. 1 Kopyalanacak di i kaplan 2 Ovaryumdan al nan yumurta 3 Hücreler kayna t r l r Çekirdek aktar m ; iyolistik Mikroenjeksiyon Elektroporasyon yöntemleri ile yap l r. Meme nden al nan çekirdek Erken embriyo Çekirdek uzakla t r l yor 4 di i kaplan n n rahmine yerle tirilir Di i kaplan 5 Embriyonik geli me Yavru kaplan Genetiksel olarak ya benzer Sitoplazmik kal t m olarak ya benzer Mitokondriyal kal t m olarak ya benzer 205
çıklama: iyoteknolojik çalışmalarda kök hücrelerdende yararlanılmaktadır. Kök hücrelerin iki önemli özelliği vardır. azı temel özelliklerin dışındaki genler pasif haldedir. Uygun koşullarda çoğalma özelliğine sahiptir, verilen dokuya göre özelleşirler. lastula evresindeki erken insan embriyosu Karaci er Embriyonik kök hücreler Kültüre al nm kök hücreler Sinir Farkl kültür ko ullar Kas iyoteknolojik çalışmalarda istenilen özellikte ürün elde edilirken istenmeyen genlerin aktivitesi azaltılabilir ya da durdurulabilir. iyoteknolojik çalışmalarda plazmid DN kullanılmasının temel nedenleri; Hücre çoğalmasa bile kendi kendine çoğalabilme özelliğinin olması İçerdiği direnç genleri ile seleksiyona imkan tanıması iyoteknolojik çalışmalarda transpozonlarda önemli rol oynar. Transpozon: ir bakteri içinde gerçek DN ile ya da plazmid DN ya bağlanmış olarak, ya da genetik materyalin üzerinde ve aynı zamanda karşılıklı olarak yer değiştirebilen, çeşitli antibiyotiklere ve ilaçlara karşı dirençlilikte önemli fonksiyonları olan özel genler taşıyan, DN karakterinde çift iplikli halkasal genetik elemanlard r. Transpozonların akterilere Kazandırdığı vantajlar: Konakç ya yeni genler aktarabilir ve karakter kazandırabilirler. Genleri inaktive edebilirler. Mutasyon meydana getirebilirler. Genleri aktive edebilirler. Gen taşıyıcılığı yapabilirler. Plazmid DN larla birleşebilirler ya da iki plazmidi birbirine bağlayabilirler. iyoteknolojik çalışmalarda RN dan gen edilebilir. RN içeren virüsler kullanılarak yapılır. iyolojik çal mlarla a lar elde edilir. Rekombinant DN a lar Sentetik peptit a lar ntikor a lar Rekombinant bakteriyel a lar Rekombinant viral a lar Rekombinant parazit a lar Sentetik bakteriyel a lar Sentetik viral a lar Sentetik paraziter a lar akteriyel antikor a lar Viral antikor a lar Paraziter antikor a lar Mutant a lar 206
iyoteknolojik çalışmalarla hazırlanan çok kısa zincirli tamamlayıcı özellikte şifresel zincir oluşturulur. (Prob) u sayede mikroorganizmaların genetik materyalleri, proteinleri tespit edilir. Hastalıkların teşhisi yapılabilir. DN problarının dezavantajları: Hazırlanmasının uzun sürmesi, deneyimli personellere ihtiyaç duyulması, yarı ömürlerinin kısa olması ve dayanıksız olmalarıdır. iyoteknolojik çal flmalarla hayvanlara embriyo döneminde aktarılan genler sayesinde et verimi, süt verimi, yumurta verimi artırılmaktadır. iyoteknolojik çal flmalarla hayvanlarda büyümenin artırılması, laktozsuz süt eldesi, yapağı veriminin artırılması da yapılmaktadır. iyoteknolojik çalışmalarla cinsiyet tayini yapılmaktadır. iyoteknolojik çalışmalarla tek yumurta ikizi oluşturulabilir. iyoteknolojik çalışmalarla embriyo transferi yapılmaktadır. iyoteknolojik çalışmalarla gebelik önlenebilir. iyoteknolojik çalışmalarla hormon eldesi yapılmaktadır. ¾ nsanda insülin üreten gen akteri nsülin üretimi. iyoteknolojik çalışmalarla sulardaki ağır metal iyonları temizlenebilir. iyoteknolojik çalışmalarla ekolojik mücadelede kullanılan özel böcekler üretilebilir. iyoteknolojik çalışmalar adli tıpta kullanılarak birçok karanlık olaylar aydınlatılabilir. iyoteknolojik çalışmalarla genetik bozukluklar saptanabilir ve tedavi edilebilir. itkilerde Klonlama : Ti plazmit grobacterium tumefaciens bakterisinin genetik materyalini bitki hücrelerini enfekte edip bir tümör (taç uru) oluşturmasını ve genetik materyalini bitki hücrelerine aktarmasını sağlayan dairesel bir plazmittir. grobacterium plazmitlerinden birine ( plazmiti) rekombinant DN tekniğiyle direnç geni aktarılır. itki yaprağı kesilerek yaralanma bölgesine agrobacterium bulaştırılır.yaralanan bitki hücrelerinden salgılanan özel bir madde bakterideki diğer plazmiti ( plazmiti) aktif hale geçirir. plazmiti rekombinant plazmitinin bitki ne geçmesini sağlar. grobacterium ile enfekte bitkilerde tümör oluştuğu görülür. akterinin bitkide tümör oluşturabilmesi için bitkiye bir yapı aktarması gerekmektedir. akterinin bitkiye aktardığı yapı Ti plazmidi üzerinde bulunan T-DN bölgesidir. u gen bölgesi bitki kromozomuna entegre olur ve burada ifade olmaya başlar. Öyleyse bir bitkiye gen aktarılmak istendiğinde vektör olarak bu yapı kullanılabilir. Sol S n r Oksin Virülans ölge Sitokinin T-DN ölgesi Ti Plazmit Opin Replikasyon Orijini (ORI) Sa s n r Opin Katabolizmas Öncelikle bakteriden plazmidi izole edilir. Plazmidin kesim noktası T-DN içindedir. Restriksiyon endonükleazla plazmid kesilir. ynı restriksiyon endonükleazla kesilmiş klonlanacak gen plazmidle aynı ortama konur ve ortama DN ligaz ilave edilir. Oluşan rekombinant Ti plazmidleri kültürdeki bitki hücrelerine verildiğinde üzerine klonlanacak geni taşıyan T DN bitki hücre kromozumuna entegre olur. itki nin bölünerek yeni bir bitki oluşturmasına izin verilir. Oluşan bitkinin her aynı zamanda klonlanan gen bölgesini içerir. u yöntemle zararlılara karşı dirençli bitki varyeteleri oluşturulabileceği gibi büyüme hormonu ve grip aşısı içeren bitkiler de üretilebilir. Plazmit, 195 protein kodlayan 196 gene sahiptir. Ti plazmid yapısal RN bulundurmaz. u plazmidin değiştirilmesi transgenik bitki üretilmesinde çok önemlidir fakat bu sadece dikotiledon bitkilerde gerçekleştirilebilir. 207
Ti plazmit genel olarak bitki genomuna entegre olan bir ya da daha fazla T-DN bölgesi, bir vir bölgesi, bir replikasyon merkezi, konjugatif transferin gerçekleşmesini sağlayan bir bölge ve opin katabolizması için gerekli olan genleri içerirler. Herhangi bir Ti plazmitinin T-DN bölgesi sağ ve sol sınır dizilerinin varlığıyla tanımlanır. u sınır dizileri 24 bazlık rastgele tekrarlardır. Sınır dizileri arasında kalan herhangi bir DN, konak bitki genomuna transfer edilecektir. Ti plazmitlerinin nopalin ırkları yaklaşık 20kb büyüklüğünde bir T-DN bölgesine sahipken, oktopin ırkları 2 T-DN bölgesi, TL (14kb) ve TR (7kb) içerirler. Sadece TL bölgesi tümör oluşturur, TR bölgesi opin biyosentezi için gerekli genleri taşır. Nopalin Ti plazmitlerinin T-DN sı 13 açık okuma bölgesine (ORF) sahipken, oktopin plazmitlerinin TL T-DN sı 8 açık okuma bölgesi içerir. Nopalin T-DNsı ve oktopin TL T-DN sı merkez bölge olarak bilinen bölgede çok yoğun benzerlik gösterirler. u bölge hormon biyosentezinde görevli proteinleri, opin sentezinde görevli proteinleri ve tümör büyüklüğünü belirleyen proteinleri kodlar. T-DN bölgesi yaklaşık 12-24 kb büyüklüğündedir. Oksin ve sitokinin sentezinde görevli enzimleri kodlayan genleri, ayrıca opin ve agropin olarak bilinen bitki metabolitlerinin sentezinden sorumlu enzimleri kodlayan genleri içerir. Oksin ve sitokinin hormonları, bitki nde büyüme ve gelişmeyi düzenledikleri gibi fazla salgılandıklarında da bitkide tümöre benzeyen oluşumlara sebep olurlar. Opin ve agropinler taç uru içinde sentezlenir ve hücre dışına salgılanır. akteri bunları bazen karbon bazen azot kaynağı olarak kullanır. Ti plazmit üzerinde bulunan opin katabolizması genleri, bakteriye opin alınımı ve parçalanmasında görev alırlar. u genler T-DN bölgesinde bulunmaz, dolayısıyla bitki genomuna aktarılmaz. Ti plazmit üzerinde bulunan vir (virulans) genlerinin ürünleri T-DN bölgesinin bitki genomuna transferi ve entegrasyonu için mutlaka gereklidir. En az 9 vir-gen operonu bulunmaktadır. Ori bölgesi ise, plazmitin grobacterium içinde çoğalması (replikasyonu) için gereklidir. iyoteknolojik çalışmaların bitkilere etkisi: Virüslere dirençli bitkiler. öceklere dirençli bitkiler. Uzun ömürlü bitkiler. Tatlı bitkiler. (fieker düzeyi düşük) Herbisidlere toleranslı bitkiler. esleyici bitkiler. Soğuğa dayanıklı bitkiler elde edilebilir. Herbisid: Yabani otları öldüren kimyasal ilaçlar. iyoteknolojik çalışmaların gıda alanında uygulandığı konular : Süt ve süt ürünleri sanayinde lkol ve alkollü içecekler sanayinde Meyve sularının eldesinde Et ve et ürünleri sanayinde Gıda mikrobiyolojisinde Gıda atıklarınının değerlendirilmesinde Tek hücre proteini üretiminde Hayvanların beslenmesinde yapılan biyoteknolojik çalışmalar: Yem kalitesinin yükseltilmesi Sindirim sistemindeki mikroorganizmaların düzeltilmesi itkide istenmeyen genlerin çıkarılması Sentetik enzimlerle, gıdaların reaksiyona girdirilmesi Hastalıklara dirençli bitkilerin yetiştirilmesi 208