LAB #1 ASEPTİK TEKNİKLER VE MİKROORGANİZMALARIN TRANSFERİ Giriş Mikroroganizmalar, genellikle doğal ortamlarında karışık popülasyonlar halinde yaşamlarını sürdürürler. Bizler bu mikroorganizmalar ile çalışmak istiyorsak, mikroorganizmaların tanımlanması, karakterize edilmesi ve saf kültür olarak çoğaltılması gerekmektedir. Saf kültürler, mikroorganizmaların çoğalması için steril şartlarda ve ihtiyaç duyulan nutrientleri içerecek şekilde hazırlanmaktadır. Steril besiyeri tüm canlı hücrelerden arındırılmıştır. Besiyeri sterilize edilirken belli sıcaklığa kadar ısıtılır ki bu şartlarda kontaminsayona sebep olan mikroorganizmalar bozulmuş olur. Mikroorganizmalar ile çalışırken steril besiyerinde büyüyen saf kültürleri (inokulum olarak adlandırılır) istenmeyen dış kontaminantlardan arındırılmış olarak transfer edeceğimiz metotlara ihtiyaç vardır. Bu metotlar ile üremesi istenmeyen mikroorganizmalar önlenir ki bu tekniklere aseptik teknikler denir. Diğer bir değişle steril şartlarda çoğaltılan mikroorganizma bozulmamış ve enfekte olmamıştır. Aseptik teknik, ilk olarak İngiliz cerrah Joseph Lister tarafından 18. Yüzyılda tanımlanmıştır. Lister, ilk olarak yaraların enfeksiyondan korunması ve medikal aletlerde mikropların azaltılması gerektiği konusuna odaklanmıştır. Onun aseptik anlayışı günümüz lab ortamında uygulananlara göre oldukça sınırlıdır. Temelde, amelyattan önce ellerin dezenfeksiyonuna ve havanın güçlü aseptik kimyasallarla (fenol vb. gibi) dezenfeksiyonundan oluşmaktadır. Bu teknik ve uygulamalar, ısı sterilizasyonunu da kapsamaktadır. Günümüzde mikrobiyal kontrolün temelinde hala bu fiziksel ve kimyasal metotlar kullanılmaktadır.
ASEPTİK TEKNİKLER Aseptik teknikler, saf kültürlerin ve lab ekipmanlarının kontaminasyondan korunması için alınan tedbirlerdir. Aslında asıl amaç sadece patojenlerin azaltılmasıdır ve sterilizasyon ile elimine edilmeleri gerekmez. Aseptik tekniklerin birkaçı aşağıda listelenmiştir: Sorular: Patojen potansiyeli olan tüm organizmaların temizlenmesi gerekmektedir. Birçok organizma oportünistik kabiliyettedir ve enfeksiyona sebep olabilmektedir. Lab. öncesi ve lab. sonrası ellerin yıkanması gerekmektedir. İnsan deri florası zengindir ve çeşitlidir. Herhangi bir objenin (kalem gibi) ağıza almasından ve tezgah yüzeyine konulmasından kaçınılmalıdır. Mikroorganizmalar, lab atmosferinde bulunabilmektedir ve tezgah üzerine de bulaşabilirler. Bu sebeple lab. öncesi ve sonrası tezgahların üzeri sürekli olarak temizlenmelidir. Sprey şişe ile %70 etanol yada %10 çamaşır suyu tezgah yüzeyine spreylenir ve 1 dak. bekletildikten sonra kağıt havlu ile temizlenmelidir. Petri kutularının kapakları mümkün olduğu kadar kapalı tutulmalıdır. Petri kapağı tezgah yüzeyine konulmamalıdır. Bu uygulama kontaminasyon riskini ve sahte pozitif sonuç elde edilmesini önler. Steril pipetler (serolojik pipet), her numune için ayrı kullanılıp atılmadılır. Çünkü bir kez kullanılan pipet ya da pipet ucu artık steril değildir. Steril pipet, paketten çıkartılırken üst kısmından paket açılır ve el ile dokunmadan, hiç bir yüzeye deydirmeden kullanılacak hale getirilmelidir. Pipete istenilen hacimden fazla numune çekildiğinde başka hiçbir obje ile temas ettirilmediğinden emin olunur. Bu iki nedenle önemlidir: 1. İstenmeyen organizmalar ile numunenin kontaminasyonunu engellemek 2. Çalışma yüzeyinin kontaminasyonunu engellemek Öze yi kullanmadan önce alev ile sterilize etmeli, soğutmak için 20 sn beklenmeli ve ardından kullanılmalıdır. Alev ile steril ettiğin öze ye dokunmamalı ve steril halde korunmalıdır. Lab materyallerinin tek kullanımlık olanlarına dikkat edilmelidir. Numune toplamak veya depolamak için kullanacağın herhangi bir şey, kullanmadan önce mutlaka otoklavlanmalıdır (ısı sterilizasyonu). Kullanılan numune atılacaksa kesinlikle atılmadan önce otoklavlanmalıdır. Kullanılmış herhangi bir pipet, pipet ucu atılmadan önce yine otoklavlanması zorunludur. 1. Aseptik ve steril teknikleri karşılaştırınız. Her ikisi için de birer örnek veriniz. (3 puan) 2. Atıksuların kimyasal analizinde aseptik tekniklerin kullanılmasına ihtiyaç varmıdır? açıklayınız. (2 puan) 3. Petri kutularının kapakları mümkün olduğu kadar kapalı tutulmalıdır. Petri kapağı bu kontaminasyon riskini ve sahte pozitif sonuç elde edilmesini önler. Sahte pozitif sonuç un ne anlama geldiğini örnek vererek açıklayınız. (3 puan) 4. Eğer belirli bir bakteri (saf kültür) stokunuz varsa, neden aseptik tekniklere ihtiyacınız vardır? açıklayınız. (2 puan)
ÇİZGİ EKİM METODU KULLANILARAK MİKROORGANİZMALARIN İZOLASYONU Giriş Mikroorganizma sayılarını sistematik olarak azaltarak tek koloni oluşturmak için çizgi ekim metodu kullanılmaktadır. Bu yöntemdeki amaç, mikroorganizma identifikasyonundan çok mikroorganizma izolasyonudur. Prosedür 1. Öze yi steril hale getiriniz. a. Öze nin steril hale gelmesi için öze ucunu kor hale gelene kadar alev altında tutunuz. Bu öze deki tüm kontaminantları yok eder. b. 20 sn özenin soğumasının bekleyiniz. İnokulumu öldürmekten kaçınınız. Asla özeyi bir yere yatay vaziyette bırakarak kontamine olmasına sebep olmayınız. 2. Özenin ucunu numuneyi alacak kadar numuneye deydiriniz. 3. Petrinin bir ucundan başlayarak agar besiyerinin yüzeyini yavaşça bir uçtan bir uca kadar öze ile çiziniz. Her zaman besiyerine 12:00 pozisyonunda ekim yapmaya başlayınız. Farklı bölmelere geçerken her zaman özeyi steril ederek ve soğutarak kullanınız. 4. Petri kutusunun kapağını kapatınız. 5. Öze yi steril ediniz. Sorular: 5. Çizgi ekim tekniğinin ana amacı nedir? açıklayınız. (1 puan) 6. Çizgi ekimi uygularken kullandığınız iki aseptik teknik nedir? açıklayınız. (2 puan)
YAYMA METODU KULLANILARAK MİKRORGANİZMALARIN SAYIMI Giriş Genellikle doğrudan sayım yapılabilmesi için numunelerdeki bakteri sayısı oldukça yoğundur. Fakat eğer canlı hücreler seri olarak seyreltilip, agar besiyerine ekilirse numunelerdeki bakteriler sayılabilmektedir. Bakteri örneklerinin seyreltme faktörü 10 dur. Numuneler seyreltildikten sonra nutrient agara ekilirler. Seyreltilmiş numuneler, inkübe edildikten sonra oluşan koloniler sayılmaktadır. İstatiksel olarak petri kutusunda üreyen kolonilerin 30-300 koloni arasında olması anlamlıdır. Eğer petride <30 koloniden az sayıda koloni sayılmışsa bu seyreltme hatası olarak düşünülür veya bazı kontaminantların final koloni sayısını azalttığı düşünülür. Petri koloni sayısı >300 koloniden fazla ise zayıf izolasyon olarak değerlendirilir. İzolasyonun iyi yapılamamasına yol açarak bazı kolonilerin birlikte büyümesine sebep olacağı düşünülür. Genellikle bakteri sayıları, koloni oluşturan birim (KOB) olarak raporlanır (KOB/mL). 30-300 koloni saydığımız petri kutusu, numuneyi ne kadar seyrelterek hazırladıysak o sayı ile çarparak hesaplarız. Örneğin, petride 150 koloni saydıysak ve seyreltme faktörü 10-6 ise dilüsyon faktörü ile çarparak sonucu 150x10 6 KOB/ml (1.50x10 8 KOB/mL) olarak rapor ederiz. Sonuçların doğruluğu için tavsiye edilen, her seyreltmenin 2x ya da 3x tekrarlı yapılması ve KOB/mL hesaplanırken ortalamalarının alınmasıdır. Prosedür 1. Seyreltme tüpleri kullanılarak seyreltme serileri oluşturunuz (her bir tüpe 9.0 ml steril tuzlu tampon ve aseptik olarak 1 ml E.coli numunesi alınıp inoküle edilir). a. 1 ml steril pipeti paketinden çıkararak, el ile dokunmadan ve pipeti yatay olarak tezgah yüzeyine koymadan kullanıma hazırlayınız. b. Numunenin kapağını açarak tüpü alevden geçiriniz. Pipeti tüpün dibine kadar daldırarak 1 ml numuneyi serolojik pipete yavaşca çekiniz. Numunenin pipetin filtresine gelmemesine dikkat ediniz. Numunenin olduğu tüpün ağızını tekrar alevden geçirerek kapak ile kapatınız. c. İlk dilüsyon tüpünü alevden geçiriniz. Pipetteki örneği seyreltme tüpüne boşaltarak ve birkaç kez pipetaj yaparak numune iyice karışması sağlayınız. Tekrar alevden geçirerek tüpün kapağını kapatınız. d. Numuneyi tek el kullanarak yavaşça karıştırınız veya vorteksleyiniz. Bakterinin seyreltme çözeltisi içinde iyice dağıldığından emin olunuz. e. İlk dilüsyon kapağını açarak ve alevden geçirniz. 1 ml numunede aseptik şartlarda alınarak ikinci dilüsyon tüpüne aktarılır. C şıkkındaki anlatıldığı gibi yapılacakları tekrarlanır. Hazırlanan seyreltme tüpleri için ekime devam edilir. Kullanılan atık pipetler, biyolojik atık konteynarına atılır.
2. Yayma yöntemiyle ekim a. 1 ml lik steril serolojik pipet ile son seyreltilmiş tüpten 0.1 ml numune alınarak agar plate yüzeyine aseptik olarak aktarınız. Not: Eğer seyreltilmiş numuneden 0.1 ml numuneyi petri kutusuna ekersek, bakteri petride (1/10) oranında seyrelmiş olur. b. Drigalski spatülünü alkole daldırınız ve bek alevinden geçirdikten sonra soğutuz. c. Transfer edilen numunenin agar besiyerinde drigalski spatülü ile dağıtılarak emilimi sağlanır ve petri kapağı kapatılır. d. Drigalski spatülünü steril ediniz. e. Kullanılmış pipetleri ve pipet uçlarını biyoatık konteynarına atınız. f. Numuneleri 37 0 C de 24 saat inkübe ediniz.
7. Yayma yöntemi ile ekimde neden seyreltme serileri 10 kat olarak hazırlanır? (2 puan) 8. Yukarıdaki diyagramda E.coli numunesinin seyreltme aşamaları ve yayma yöntemi ile ekim sonuçları yer almakatdır. Bu verilerden yola çıkarak orjinal numunede ne kadar koloni olduğunu KOB/mL olarak hesaplayınız. Bu sonuca nasıl ulaştığınızı açıklayınız (3 puan) 9. Çizgi ve yayma metot arasında 1 zıtlık-karşıtlık bulun ve bunu açıklayınız (2 puan)
GRAM BOYAMA Giriş Gram boyama, bakteriyolojide en yaygın kullanılan boyama prosedürlerindendir. Gram-pozitif ve gram-negatif bakterileri ayırt etmek için kullanılır. Bu teknik ile mor boyanan bakteriler gram-pozitif, pembe boyanan bakteriler ise gram-negatif tir. Pozitif ve negatif terimlerinin herhangi bir elektrik şarjı ile ilişkisi yoktur. Basitçe iki farklı morfolojik yapıya sahip bakterileri ayırt etmek için kullanılır. Gram-pozitif ve gram-negatif bakteriler, hc. duvarı yapısındaki temel farklılıklardan dolayı ayırt edilirler. Bakteri hc. duvarı, bakteriye şekil verir ve osmotik lizis ten korur. Elektron mikroskobu altında gram-pozitif hc. duvarı 20-80 nm kalınlığında ve çok sayıda iç bağlantıları olan peptidoglikan dan meydana geldiği gözlenmektedir ki bu yapı bakteriye rijitlik sağlar. Gram pozitif hücrelerin hc. duvarı %60-90 peptidoglikandan ve iç içe geçmiş teyikoik asit moleküllerinden oluşmaktadır. Teyikoik asit, hc. duvarı arasından uzanır ve gliserol fosfat, şeker alkol ribitol gibi molekülleri taşıyan yapıları oluşturur. Bazılarına yağ eklenir (lipoteyikoik asit). Çeşitli bakteri ve suşlarda peptidoglikan dış yüzeyi çeşitli tipte proteinler içerir. Gram-negatiflerde ise hc. duvarı, 2-3 tabaka peptidoglikandan oluşmaktadır. Membranın dışı, fosfolipit, lipopolisakkarit, lipoprotein ve diğer proteinlerden oluşur. Gram-negatif hc. duvarının sadece %10-20 si peptidoglikan dan oluşur. Fosfolipitler başlıca dış membranın içinde yer alır, lipoproteinler dış membrane ve peptidoglikan tabakasını bağlar. Lipopolisakkaritler dış membranın yüzeyinde gömülü olarak yağ yapıdan oluşurlar (lipit A). LPS ler bakteriyal yüzeyden dışarı doğru uzanırlar. Dış membran farklı çeşitte proteinler içerir ki bu bakteri türleri ve suşları arasında farklılık gösterir. Arka plan Gram boyama tekniği birkaç basit adımdan oluşur; 1. Bakteriler ilk olarak kristal viyole ile boyanır. Bu aşamada gram-pozitif ve gram-negatif bakteri gruplarının her ikisi de mor boyanır. 2. Bakteriler, iyodin çözeltisi ile boyanır. Bu aşamada suda çözünmeyen Kristal viyole-iyodin kompleksi oluşur. Bu aşamada her iki grupta da mor renk kalıcı hale gelir. 3. Renk giderici olarak etil alkol-aseton karışımı ilave edilir. Bu aşamada gram-pozitif olan hc. ler Kristal viyole iyodin kompleksinden dolayı mor boyandığından zıt boyamadan etkilenmezler fakat gram-negatif ler ise renksiz hale gelirler. 4. Son olarak zıt boya olan safranin ile boyanırlar. Gram-pozitif olanlar mor boyandığından zıt boyadan etkilenmezler fakat renklerini kaybetmiş olan gram-negatifler pembe boyanırlar. Kristal viyole-iyodin kompleksi büyük moleküler yapıdadır ve gram pozitif hc. duvarı dışında çökerek birikir. Alkol/aseton karışımı çoklu peptidoglikan yapısının dehidre olmasına ve moleküllerin
mesafelerinin azalmasına neden olarak hc. duvarındaki kristal viyole iyodin kompleksinin hc. içerisine girmesine neden olur. Gram-negatiflerde, alkol/aseton karışımı yağ yapılarını çözerek hc. duvarının dış membran yapısının çözülmesine sebeptir (ayrıca muhtemelen peptidoglikan yapının eklendiği sitoplazmik membran da bozulmaktadır). Bu tek ve ince peptidoglikan tabakasında kristal viyole-iyodin kompleksi tutunamadığı için hc. renksiz hale gelir). Gram-pozitif bakterilerin çeşitli suşlarında, mor renkteki kristal viyole-iyodin kompleksi nin boyama sı değişken olabiliyor ve gram-negatif bakteri gibi pembe boyanmasına sebep olabiliyor. Bunun sebebi; 1. Bu teknik kullanılırken oluşabilecek problemlerden biri de fiksasyon aşamasında lam I fazla ısıya ve alkole maruz bırakmak ve sonucunda kristal viyole-iyodin kompleksinin kaybolmasına neden olmak. 2. Kültür yaşının eski olması; 24 saatten büyük kültürlerde hc. duvarında kristal viyole-iyodin kalıntısı meydana gelmeyebilir. 3. Organizmanın kendisi, bazı gram-pozitif hc. lerde kristal viyole-iyodin kompleksi hc. duvarında iyi tutunamaz. Bu gibi sebeplerden dolayı prosedür uygulanırken tam olarak uygulanmalı ve sonuçlar dikkate edilerek yorumlanmalıdır. Prosedür 1) Escherichia coli (küçük, gram-negatif basil) ve Staphylococcus epidermidis (gram-pozitif kok yapıda, genelde üzüm salkımı şeklinde) in ısı ile fiksasyonu: a. Temiz bir lam üzerine steril distile su, steril damlalıkla 1 damla olarak damlatılır. b. Agar yüzeyinden steril öze ile numune aseptik olarak alınır ve su damlası içerisinde dağıtılır, ince biyofilm halide yayılır. c. Bu süspansiyonun tamamen kurumasını bekle. d. Lamı alev üzerinden 3-4 defa hızlıca kaydırarak geçir. 2) Kristal viyole ile 1 dak. bekle, yavaşca su ile yıka. Lam üstündeki fazla suyu akıt. 3) İyodin çözeltisi ile 1 dak. muamele et ve nazikçe su ile yıka. 4) Damla damla alkolu lam üzerine damlat, mor renk akmamasına özen göstererek hızlıca bu işlemi bitir. Hemen su ile durula. 5) Safranin ile 1 dak. boya ve durula. 6) Lamı kurut ve immersiyon yağı kullanarak mikroskopta incele. Sorular: 1. Gram boyamaya neden ayırt edici boyama tekniği denildiğini belirtiniz (3 puan) 2. Gram-pozitif ve gram negatif hc. duvarı arasındaki farkı tanımlayınız (2 puan) 3. Gram-pozitif bakterilerde kristal viyole-iyodin kompleksinin hc.de neden kaldığı, gram negatifte kalmadığının teorisi nedir (3 puan) 4. Gram-pozitif hücrelerin gram-negatif gibi pembe boyanmasının sebepleri nedir (5 puan)