MOLEKÜLER 2014-2015 BİYOLOJİ LABORATUVARI GÜZ DÖNEMİ MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARI 2.HAFTA DERS NOTLARI GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ Sayfa 1 / 10
I. MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARINDA KULLANILAN CİHAZLAR 1. Çeker Ocak: Solunması tehlikeli, çabuk buharlaşan kimyasal maddelerin zararlı etkilerinden korunmak için içerisinde çalışılan cihazdır. 2. Steril kabin: Moleküler biyolojik çalışmaların birçoğunda (PCR, hücre kültürü çalışmaları gibi) steril bir ortamda çalışmak gerekir. Hem deneyi hem de çevresini koruyan HEPA filtreleri içeren steril ortam sağlayan cihazlardır. 3. Terazi: Maddelerin doğru ve hassas tartımlarının yapılması için gereklidir. 4. ph Metre: Çözeltilerin uygun ph da ayarlanması için kullanılır. 5. Vorteks: Pek çok deney yönteminin önemli bir aşaması reaksiyon tüplerindeki bileşenlerin doğru bir şekilde karıştırılmasıdır. Karıştırmada kullanılan en etkili yöntem vorteks gibi masaüstü karıştırıcı kullanılmasıdır ki bu da sıvı üzerinde girdap hareketi oluşturur ve çözeltilerin homojen bir şekilde karışmasını sağlar. 6. Distile Su Cihazı: Çözeltilerin hazırlanması için gerekli olan distile suyu yapmaya yarar. 7. Evaporatör: Çözücünün kaynatılarak uzaklaştırılması yolu ile çözeltinin derişikleştirilmesi işlemini yapan alettir. Özellikle bitki özütü hazırlanırken çözücünün buharlaştırılıp özütten uzaklaştırılmasını sağlar. 8. Agaroz Jel Elektroforez Sistemi: Bir güç kaynağı ve tanktan oluşur. Jelin döküleceği bir tabağı vardır. Tabağın yanlarına destek konularak jel buraya dökülür ve oda sıcaklığında polimerize olması sağlanır. Güç kaynağı aracılığı ile (+) ve (-) kutuplar oluşturulur ve bu elektrik akımı altında, uygun tampon içerisinde DNA, (-) kutuptan (+) kutba doğru moleküler ağırlığa bağlı olarak hareket eder. DNA nın analizi için kullanılır. Agaroz ile hazırlanan jel, etidyum bromür ile boyanarak DNA nın UV ışığı altında bantlar halinde görülmesi sağlanır. 9. Poliakrilamid Jel Elektroforez Sistemi: Poliakrilamid jel elektroforez, protein ve 1kb ın altındaki DNA fragmentlerinin ayrımında kullanılabilen elektroforez tekniğidir. 10. Transillüminatör: Ultra-viyole ışık yayarak etidyum bromürle boyanmış agaroz jelde DNA yı görmemizi sağlar. 11. Güç kaynağı: Bir sistem ya da düzeneğin gereksinimi olan enerjiyi sağlamak için kullanılan birimlerdir. 12. Sonikatör (ultrasonik homojenizatör): 50-100 MHz lik dalga boylarında ses dalgaları çıkartarak ultrasonik homojenizasyon sağlayan cihazlardır. 13. Mikrosantrifüj: 1,5 μl lik mikrofüj tüpleri kullanılarak özellikle DNA ve plasmid izolasyonlarında kullanılan yaklaşık 15 000 rpm e kadar çıkabilen bir tip santrifüjdür. Sayfa 2 / 10
14. Ultrasantrifüj: Çok yüksek devirlerde, belli bir yoğunluk gradienti uygulayarak saf DNA, plasmid DNA elde etmede kullanılan bir tip santrifüjdür. 15. Otoklav: Laboratuarda kullanılan çözelti, pipet ucu, tüp, şişe gibi malzemelerin basınçlı buhar ile sterilizasyonu için kullanılır. Otoklavın çalışma prensibi 121 C de 1,5 atm basınçla 15 dakika sterilizasyondur. 16. Pastör fırını: Laboratuarda kullanılan cam, metal gibi yüksek ısıya dayanıklı malzemelerin sterilizasyonunda kullanılan cihazdır. Kuru sıcaklık ile malzemelerin sterilizasyonunu sağlar. 180 C de 1 saat sterilizasyon için yeterli bir süredir. 17. Etüv: Belli sıcaklıklarda mikroorganizmaların üremesi için gerekli olan uygun sıcaklığı sağlayan inkübatörlerdir. 18. Buzdolabı: Çeşitli çözeltilerin, kimyasal maddelerin, besiyerlerinin ve mikrorganizmaların bozulmadan kalması amacıyla, +4 0 C de saklanması için gereklidir. 19. Derindondurucu: Sıcaklığın etkisiyle çok çabuk bozulabilecek yapıda olan DNA, enzim, tampon ve PCR ürünlerinin saklanması için gereklidir. -20 C veya -80 C sıcaklıkta olan tipleri mevcuttur. 20. İklim Dolabı: Moleküler biyoloji ve bitki biyoteknolojisi laboratuarlarında çimlendirme, bitki büyütme ve yapay iklim şartlarına dayanıklılık testlerinde kullanılan cihazdır. Homojen bir sıcaklık ve nem dağılımı oluşturur. 21. Mikro Pipetler: 0,1-5000µl arasında hacimdeki sıvıları çekmek ve aktarmak için kullanılan otomatik pipetlerdir. 22. Hibridizasyon Fırını: Hibridizasyon teknikleri, membrana bağlanmış moleküllerin geri kazanımı için pek çok laboratuarda kullanılmaktadır. Bunların arasında Northern (RNA), Southern (DNA) ve Western (protein) blot teknikleri de bulunmaktadır. Bunlar, jelden aktarılmış moleküller olabileceği gibi dot blotlar (membran üzerine pipetle yerleştirilir) veya koloni/plak yapıştırması da olabilir. Bu işlem için özel hibridizasyon fırınları ve tüpleri kullanılır. 23. Liyofilizatör: Donmuş durumdaki bir çözücünün (örn. Su) vakum altında doğrudan gaz haline geçmesini (buharlaşmasını) sağlayan süblimasyon temeline dayalı bir tekniktir. Genellikle yüksek ısıya duyarlı materyallerin kurutulması ya da konsantre edilmesi için en etkin yöntemlerden birisidir. 24. Spektrofotometre: Çözelti içeriğindeki maddenin miktarının bulunmasında kullanılır. Temel mantığı, hazırlanan çözeltiden belirli spektrumlarda ışık geçirilmesi ve bu ışının ne kadarının çözelti tarafından absorblandığını bulması esasına dayanır. Çözeltinin içerdiği madde miktarı ne kadar fazla ise daha fazla ışın, çözelti tarafından soğurulur. Sayfa 3 / 10
Spektrofotometre, çözeltinin içinden geçebilen -çözelti tarafından absorblanmayan- ışığın yoğunluğu tespit ederek çözelti içeriğindeki aranan maddenin miktarı hakkında kantitatif bilgi verir. 25. HPLC (Yüksek performans sıvı kromotografi): Çeşitli bileşiklerin birbirinden ayrılması, saflaştırılması, tanımlanması ve miktarlarının belirlenmesinde kullanılan çok popüler bir cihazdır. Diğer kromotografilerden. daha kolay, daha iyi ve daha ucuz ayırım sağlaması bakımından önemlidir. Amino asitleri, nükleotidleri, proteinleri, ilaçlar ve onların metabolitleri gibi polipeptidleri analiz etmek için kullanılır. 26. Thermal Cycler (Sıcaklık döngü cihazı, PCR cihazı): Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) nu gerçekleştiren cihazdır. PZR, herhangi bir organizmaya ait genomik DNA daki dizisi bilinen herhangi bir bölgenin çoğaltılmasını (amplifikasyonunu) sağlayan in vitro DNA sentezi (DNA çoğaltılması) yöntemidir. Sayfa 4 / 10
II. PLASMİD DNA İZOLASYONU DNA genetik bilgiyi taşıdığı nükleotidlerin sekansında şifrelenmiş olarak saklayan, fosforik asit ve deoksiriboz ünitelerinin oluşturduğu iki paralel zincirin, pürin ve pirimidin bazlarınca çapraz olarak bağlanması ile ortaya çıkan sağ yönlü sarmal yapıya sahip bir moleküldür. DNA nın genetik materyal olarak tanımlanmasını sağlayan önemli özellikleri kendini eşleme (replikasyon), bilgiyi depolama, bu bilgiyi ifade etme ve mutasyonla çeşitlenme (varyasyon) dir. DNA nın bir zincirine bakıldığında birbirine fosfodiester bağları ile bağlanmış nükleotidlerden oluştuğu görülmektedir. Bu nükleotidlerin yapısında ise bir azotlu baz (Adenin-A-, Timin-T-, Guanin-G-, Sitozin-C-) (Şekil 1), bir pentoz şekeri (deoksiriboz) ve bir fosfat grubu bulunmaktadır (Şekil 2). Watson ve Crick in 1953 te keşfettikleri DNA modelinin (Şekil 3) özellikleri aşağıdaki gibidir: 1. İki uzun polinükleotid zinciri, bir merkez eksen etrafında kıvrılarak, sağ-el ikili sarmal yapısını oluşturur. 2. İki zincir birbirine antiparaleldir; yani iki zincirin C-5' ucundan C-3' ucuna doğru olan yönleri birbirine göre terstir. 3. Her iki zincirin bazları düzlemsel yapıdadır ve düzlemsel eksene diktir; bazlar aralarında 3,4 Å (0,34 nm) mesafe olacak şekilde birbiri ardına istiflenir ve sarmalın içinde yer alır. 4. Karşı zincirlerdeki azotlu bazlar hidrojen bağları ile bağlanarak birbirleri ile eşleşirler; DNA da sadece A=T ve C G eşleşmesi mümkündür. 5. Sarmalın tam bir dönüşü 34 Å (3,4 nm) dir; böylece her bir dönüşte 10 baz yer alır. 6. Molekülün herhangi bir bölümünde; eksen üzerinde sıra ile daha geniş olan büyük oluklar ve daha dar olan küçük oluklar yer alır. 7. Sarmalın çapı 20 Å (2 nm) dur. Sayfa 5 / 10
Şekil 1. DNA nın yapısında bulunan azotlu bazların yapısı Şekil 2. Bir nükleotidin genel yapısı Sayfa 6 / 10
Şekil 3. DNA nın Watson-Crick modeli DNA nın Özellikleri 1. Negatif yüklüdür. 2. Suda çözünebilir. 3. Yüksek asidik veya bazik ortamda bileşenlerine parçalanır. 4. Sıcaklıkla denatüre olur. 5. Yüksek vizkositeye sahiptir. 6. Saflığı; A260/A280=1,8 Sayfa 7 / 10
PLASMİD DNA Plasmid DNA; bakteride ve diğer bazı organizmalarda bulunan ve bağımsız olarak varlığını sürdürebilen, çift zincirli, küçük halkasal ekstrakromozomal DNA parçalarıdır. Büyüklükleri 1kb ile 250 kb arasında değişmektedir. Birçok bakteri türünde bulunmaktadırlar. En az bir replikasyon orjini bulundurmaları sebebiyle bakteri kromozomundan bağımsız bir şekilde replike olur ve dölden döle geçerler. Plasmid DNA Tipleri 1. Fertilite (F) Plasmidleri: tra geni taşırlar ve plazmitlerin konjugual transferini sağlarlar. E.coli deki F Plasmidleri. 2. Resistance (R) Plasmidleri: Bazı antibiyotiklere dayanıklılık geni taşırlar. Örneğin ampisilin, kanamisin vb. Klinik mikrobiyolojide çok önemlidirler. Ayrıca bu özellikleri deneylerde seçici markır olarak kullanılmalarını sağlar. Pseudomonas taki RP4p plazmiti gibi. 3. Bakteriyosin Plasmidleri: Bakteriyosinler, bazı bakteriler tarafından sentezlenen dar spektrumlu ve letal etkili proteinlerdir. Bakteriyosinlerin bir kısmı kromozomal olmasına karşın, bazıları da plasmid orijinlidirler. Bakteriyosinler, ancak, kendini sentezleyen türden veya konakçısına çok yakın olan mikroorganizmalara etkilidirler. Örn., E. coli tarafından sentezlenen (col plasmidi sayesinde) colicin (kolisin, bakteriyosin), bunu sentezleyemeyen E. coli'ler ile S. sonnei için letaldir. 4. Metabolik Plasmidler: Konak bakterinin toluen, salisiklik asit gibi bazı molekülleri metabolize etmesini sağlar. Pseudomonas putida daki Tol plazmitleri gibi. 5. Virulans Plasmidler: Konak bakteriye patojenlik özelliği verir. Dikotiledon bitkilerde tümör oluşturan Agrobacterium tumefaciens bakterisindeki Ti plazmiti gibi. Sayfa 8 / 10
DNA İzolasyonu Organizmaların hücre yapılarında bulunan hücre duvarı, hücre zarı gibi yapıların bazı kimyasal maddeler ve enzimler yardımıyla yıkılıp hücre içerisindeki diğer moleküllerin uzaklaştırılmasıyla DNA nın elde edilmesine DNA izolasyonu denilmektedir. DNA izolasyon yöntemleri temelde iki aşamadan oluşmaktadır: 1. Hücre içeriğinin açığa çıkması (lizis) ve DNA nın çözülmesi 2. Enzimatik ya da kimyasal yöntemlerle proteinlerin, RNA ve makromoleküllerin uzaklaştırılması. DNA izolasyonun temel aşamaları aşağıdaki gibidir: 1. Hücresel organellerin açığa çıkması için hücre duvarının kırılması: Bitki hücrelerinde hücre duvarının kırılması için genellikle dondurup çözme tekniği kullanılırken (sıvı azot yardımıyla); bakteri için bazı kimyasallar (Tris-HCl gibi) kullanılmaktadır. 2. Hücre zarının parçalanması: CTAB veya SDS gibi deterjan özelliğindeki kimyasallar kullanılarak hücre zarı parçalanır ve DNA serbest kalmış olur. 3. DNA nın nükleazlardan korunması ve proteinlerden uzaklaştırılması: Bu aşamada EDTA maddesi nükleazların kofaktörü olan Mg iyonlarına bağlanır ve bu sayede nükleazlar inaktif hale gelmesiyle DNA korunmuş olur. Proteinlerin uzaklaştırılması için fenol-kloroform, amonyum sülfat, sodyum sülfat gibi bazı kimyasallar kullanılmaktadır. 4. DNA nın diğer moleküllerden ayrılması: DNA ortamdaki diğer moleküllerden fiziksel ve kimyasal bazı yöntemlerle ayrılmaktadır. Etanol veya isopropanol gibi alkoller DNA molekülleri bir araya getirip çöktürürken santrifüjleme işlemi bu olayı hızlandırmaktadır. 5. DNA nın tekrar çözülmesi: İzole edilen DNA saf su veya Tris-EDTA (TE) tamponu gibi çözücülerde çözülerek saklanabilir. Sayfa 9 / 10
Kaynatma Yöntemi İle Bakterilerden Plasmid Dna İzolasyonu 1. Bakteriler 24 saat 37 C de inkübe edilir. 2. İnkübasyondan sonra bakteri kültürü 1,5 ml lik ependorf tüplerinde santrifüj edilir. 3. Süpernatant kısmı dökülür ve bakteri pelleti üzerine içinde 10 µl lizozim bulunan 200 µl STET çözeltisi (%8 sükroz, %0,5 Triton X-100, 0,05 M EDTA, 0,05 M Tris-HCl, ph 8) eklenir 4. 100 C de 45-55 saniye kaynatılır ve soğutulur. 5. 5 dakika santrifüjlenir, süpernatant ayrı bir tüpe alınıp üzerine 480 µl IS karışımı (400 µl isopropanol, 80 µl 5 M amonyum asetat) eklenir. 6. Oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edilir. 7. 5 dakika santrifüjlenir, DNA pelleti iki kez %70 lik soğuk etanol ile yıkanır. 8. Etanol uçurulur ve pellet 20 µl Tris-EDTA (TE) tamponu veya steril distile su ile çözülerek +4 C de saklanır. Yöntemde Kullanılan Kimyasalların Kullanım Amaçları Lizozim: Bakteri hücrelerini parçalamak için kullanılır. Sükroz: Osmotik basıncı artırarak hücrelerin daha kolay parçalanmasını sağlar. Tris-HCl: Bakteri hücre duvarını parçalamak için kullanılır. EDTA: Mg iyonlarına bağlanarak nükleazları inaktif hale getirir ve DNA nın parçalanmasını engeller. Triton X-100: Hücre zarının parçalanması için kullanılır. İsopropanol: DNA nın çöktürülmesinde kullanılır. Amonyum asetat: Proteinlerin parçalanması için kullanılır. Etanol: DNA nın çöktürülmesinde kullanılır. Tris-EDTA (TE) tamponu: İzole edilen DNA nın çözünmesinde kullanılır. Sayfa 10 / 10