DNA HİBRİDİZASYONU. HAZIRLAYANLAR: Beyhan KORKMAZ ( ) Prof. Dr. Figen ERKOÇ GAZİ EĞİTİM FAKÜLTESİ

Transkript

1 DNA HİBRİDİZASYONU HAZIRLAYANLAR: Beyhan KORKMAZ ( ) Prof. Dr. Figen ERKOÇ GAZİ EĞİTİM FAKÜLTESİ

2 DNA hibritleşmesi; birbirine komplementer iki tek zincir nükleik asit sekansının çift zincirli tek bir yapı haline gelmesi işlemidir.

3 Sentetik olarak çoğaltılmış ve DNA probları olarak hazırlanmış spesifik DNA parçalarının, sekansı araştırılacak olan hedef DNA molekülü ile birleştirilmesi işlemine "hibridizasyon" denir.

4 Nükleotidlerin, normal şartlar altında komplementer bağlanma özellikleri vardır. DNA'da Guanin ile Sitozin ve Adenin ile Timin birbirine komplementerdir. Bu yüzden birbirine tamamen komplementer iki tek zincir nükleik asit dizisi kolaylıkla birbirine tanır; eşleşir ve yeniden çift zincir oluşturur. Buna "yapışma" adı verilir.

5 İki zincirden birinde bulunan tek nükleotid farklılığı bile yapışmayı zorlaştırır. Bu işlemin tersine "denatürasyon" ya da "erime" adı verilir. Çift zincirli bir DNA molekülü sıcaklık veya ph ile denatüre edilebilir. Bu durumda çift zincir açılıp tek zincir haline gelir. DNA'nın hibritleşme ve denatüre olma özelliğinden birçok moleküler teknikte yararlanılmaktadır.

6 Hibridizasyon, genellikle, iki tür arasındaki genetik uzaklığın bulunmasında kullanılır. Bu tekniği ilk geliştiren Charles Sibley ve Jon Alqhuist, DNA- DNA hibridizasyonunu, kuşlar ve primatlar arasındaki filogenetik akrabalıkları sınıflandırmada kullanmışlardır. DNA sekans analizi ve hibridizasyon deneyleri günümüzde mikrobiyolojide bakterilerin tanımlanmasında kullanılmaktadır.

7 Metodun Kısa Özeti Örnek DNA nın eritilip, tekrar kendini eşlemesi ve bu şekilde çoğaltılmasına dayanan bir tekniktir. İki türün DNA'sı izole edilir. Parçalar küçük baz çiftlerine kesilir. Parçalar izole edilir. İzole edilen parçalar karşılaştırılır.

8 İnfeksiyonların erken, kesin ve güvenilir teşhislerinde son 5-10 yıl içinde pratiğe konan biyoteknolojik yöntemler oldukça yararlı olmuş ve konvansiyonel tekniklerin boşluklarını doldurmaya ve gidermeye başlamıştır. Bu metotlar başlıca 2 grup altında toplanabilirler. Bunlardan ilki etkenlerin genetik materyallerinin saptanması (hibridizasyon yöntemleri) dir.

9 Hibridizasyon Metodları Hibridizasyon metodları, genellikle, incelenen materyalde (doku, organ, hücre kültürü, ekstrakt, sekresyon sıvısı vs.) bulunan hastalık edici etkenlerin veya bu dokulara ait hücre DNA larındaki spesifik genlerin işaretli problarla ortaya konulmasını amaçlar. Son yıllarda hibridizasyon tekniklerinde bazı gelişmeler yapıldığından testler daha kolay, hızlı, etkin ve güvenilir hale getirilmiştir. Bunlar arasında en fazla kullanılanlardan bazılarının dayandığı prensipler aşağıda kısaca verilmektedir.

10 1. Southern Blot Hibridizasyonu Bu tekniğin basamakları, sırasıyla: 1) Genomik DNA nın izolasyonu: Patolojik materyalden izole edilen mikroorganizma (bakteri, virus, parazit vs.), saf kültür halinde üretilir ve DNA ları ekstrakte edilir.

11 Eğer, bakteri DNA sı kullanılacak ise, önce mikroorganizmanın hücre duvarı ve dış membranları lizozim ve diğer enzimler kullanılarak patlatılır (lizis). Ayrıca, ekstraksiyon çözeltisine SDS (sodyum dodesil sülfat), proteinaz K ve RNase lar da katılarak, DNA dışındaki bütün komponentler uzaklaştırılır. DNA nın endojen nükleazlardan korunması için, enzim aktivatörü olan Mg iyonlarını bağlayarak bir çok enzimin inhibe edebilen, EDTA eklenir.

12 Eukaryotlarda, ekstraksiyon tamponuna fenol veya kloroform da ilave edilerek DNA nın suda çözünen proteinlerden ayrılması sağlanır. Polisakkaridleri uzaklaştırmak için de sezyum klorür dansite gradiyenti santrifüjlemesi yapılır. Plasmid, faj ve virüslere ait genetik materyalin (DNA) elde edilmesinde ve izolasyonunda özel, modifiye metodlar kullanılmaktadır.

13 2) Özgül restriksiyon endonükleazlarıyla (RE) sindirme: Hedef DNA saf olarak elde edildikten sonra, çok az miktarda (0.5-5 µg, bu miktar kullanılan hedef DNA nın türüne göre değişebilir) alınarak ependorf tüpüne konur. Bunun üzerine, sindirimde kullanılacak RE enziminden, tam bir sindirim sağlayabilecek miktarda ilâve edilir ve bir süre (genellikle, 37 C de 4-6 saat kadar) inkübasyona bırakılır. Örnek RE enzimler: EcoRl, Hind III, BamHI.

14 3) Parçaların (fragman) elektroforezi: Parçalanan DNA, çözelti halinde agarose jele (PAGE'de olabilir) uygulanarak uygun bir süre, bazen bir gece volt altında elektroforeze tabi tutulur. Bu separasyon sırasında fragmentler büyükten küçüğe doğru bir sıralama ile bantlar oluşturur. Büyükler başlangıç yerinde, küçük segmentler de karşı uçta lokalize olur.

15 Bu safhada jel üzerinde oluşan bantlar etidyum bromür ile boyanarak UV-ışını altında görüntülenebilir ve bantlar, standard bantla karşılaştırılarak değerlendirilir.

16 4) Bantların membran üzerine transferi (Southern transfer): Agarose jel (veya PAGE) üzerinde bulunan bantların naylon veya nitroselüloz membran üzerine transferleri yapılır.

17 5) Denatürasyon ve fiksasyon: Naylon üzerine transfer edilen DNA bantları kurutulur ve 0.5 N NaOH ile muamele edilerek denatüre edilir (çift zincirli DNA, bazlar arası bağlar koparak tek zincir haline gelir). Bu aşamadan sonra naylon membran, 80 C ye kadar ısıtılarak, tek zincirlerin membran üzerine sabitlenmesi (fiksasyon) sağlanır.

18 6) Hibridizasyon: Naylon membran önce, prehibridizasyon çözeltisi içinde C de 2-4 saat kadar tutulur; sonra yıkanır. Bu aşamadan sonra, membran üzerine işaretli DNA prob (veya RNA prob) ilâve edilir.

19 Problar 32 P (veya biyotinle) işaretli olabilir. Membran üzerine konulan tek zincirli ve işâretli prob, kendine komplementer olan tek zincirli hedef DNA segmenti ile non-kovalent bağlarla karşılıklı olarak birleşir ve çift zincirli DNA x DNA dubleksi (eğer RNA prob kullanılırsa DNA x RNA dubleksi) oluşur. Hibridizasyon gerçekleşir.

20 Bu işlem bir gece kadar sürdükten sonra, membran yıkanarak, birleşmemiş olan tek zincir hedef DNA sekansları ve bağlanmamış olan tek zincir problar uzaklaştırılır ve böylece membran üzerinde sadece çift zincirli sekanslar kalır.

21 7) Otoradyografi: Naylon membran üzerine, X- ışınlarına duyarlı bir film (Kodak XAR-2) kapatılarak - 70 C de bir gece tutulur ve radyoaktivitenin filmi etkilemesi sağlanır. Bu sürenin sonunda film banyo edilir. Bu film üzerinde, işaretli problarla birleşmiş hedef DNA sekanslarının bulunduğu bölgeler siyah renkte görülürler. Bu bölgeler, aranılan etkene ait spesifik genin lokalize olduğu yerleri ifade eder. Böylece, aranılan hedef gen bulunur ve teşhis konulur.

22 Eğer probları işâretlemede biotin kullanılmış ise, avidin, peroksidaz ve kromojen madde yardımı ile oluşan renk değişikliği, aranılan hedef DNA segmentinin bulunduğu yerleri gösterir.

23 2. Northern Blot Hibridizasyon Bu teknik genelde, Southern blotting yöntemine benzer. Ancak, DNA yerine mrna, viral RNA veya total RNA kullanılır. Buna göre, RNA nın agarose jel üzerinde ayrılması, filtreye transferi, spesifik probla (RNA veya DNA) hibridizasyonu ve otoradyografisi, Northern Blot Hibridizasyonu olarak adlandırılır. Bu teknik, genlerin transkripsiyon düzeyinde iken analizlerini yapmada, doku veya organlardaki mrna seviyesini belirlemede ve viral RNA lar arasındaki farkın tespitinde kullanılır.

24 Southern blottinge benzeyen bu teknikte RNA ların restriksiyon enzimleri ile kesimi işlemi yoktur. Bu aşama atlanıldığı için zamandan ve maliyetten önemli tasarruf sağlanmaktadır.

25 Northern blot hibridizasyonunun başlıca safhaları özetle: 1) RNA nın izolasyonu (total hücresel RNA, mrna, viral RNA, vs.). 2) RNA nın elektroforezde ayrılması. 3) RNA ların naylon membrana transferi (Northern transfer). 4) İşâretli DNA veya RNA problarıyla hibridizasyon. 5) Otoradiografı ile görüntüleme ve değerlendirme.

26 3. Dot Blot Hibridizasyonu Bu yöntemde, genomik DNA segmentleri hibridizasyondan önce elektroforetik bir ayrılmaya tabi tutulmaz. Patolojik materyalden izole edilen nükleik asit ekstrakte edilir ve konsantre edilir. Bu aşamadan sonra örnekler iki veya 5 defa sulandırılır. Her örneğe ait dilüsyonlardan naylon veya nitroselüloz membran üzerine birer damla damlatılır.

27 Burada denatürasyona tabi tutularak membran üzerine fikse edilirler. Üzerlerine 32 P işâretli spesifik tek zincir problar ilave edilir. Bu aşamadan sonraki işlemlere aynen Southern blotting de olduğu gibi devam edilir. Film üzerinde oluşan koyu lekeler hibridizasyon bölgelerini ve dolayısıyla de aranan DNA sekanslarını veya mikroorganizmaya ait spesifik bazları gösterir.

28

29 4. İn situ Hibridizasyon Bu teste infekte doku kültürleri, biyopsi materyalleri, doku süspansiyonları, periferal kan ve benzeri numunelerden bir damla lam üzerine konur. Denatürasyondan sonra işâretli ( 32 P, biotin-avidin, vs.) cdna prob ilâve edilerek hibridizasyon sağlanır. Mikroorganizmaların DNA larının bulunduğu yerler kolayca belirlenir.

30 Bu test doku kesitleri ile de yapılabilir. Örnek, infekte akciğer dokusu nötral formalinli tampon içinde fikse edilir, parafinlenir ve ince kesitler (5 µm lik) alınır. Kesitler parafinleri giderildikten ve dehidrate edildikten sonra temiz bir lam üzerine alınır ve üzerine biotinle işaretli cdna prob konur ve her ikisi birden denatürasyona tabi tutulur (90 C de 5 dakika).

31 Karışım 37 C de saat tutularak hibridizasyon sağlanır. Sonra ortama avidin-biotin peroksidaz kompleksi katılır. Renk değişimi olan bölgeler aranan mikroorganizma DNA segmentlerinin bulunduğu yerlerdir.

32

33

34 Genomik hibridizasyon. Referans DNA yeşil bir florokrom ile (şekilde açık mavi) boyanır. Teste tabi tutulan DNA şekilde koyu mavidir. Her iki DNA örneği karıştırılır ve insan DNA sekanslarıyla ya soldaki gibi metafaz kromozomları üzerinde veya sağdaki gibi cam mikroarray lamında hibritleştirilir. Test DNA sında delesyonlar yeşil görülür (şekilde açık mavi verilmiştir) ve duplikasyonlar da kırmızı hibridizasyonlar olarak verilmiştir (şekilde koyu mavi).

35 Hedef DNA nın DNA SAM probu ile hibridizasyonu. DNA SAM probunda tek ve çift zincirli kısımlar bulunmaktadır.

36 Nükleik asit hibridizasyonu. (A) Eğer DNA sarmalı iki zincire ayrılırsa, uygun iyonik şartlar ve sürede zincirler tekrar birleşir (anneal). (B) Benzer olarak, eğer DNA iki zincirine ayrıldıysa, RNA kodlanan ilgili genlere bağlanabilmelidir.

37 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) DNA da yer alan, sekansı bilinen iki segment arasındaki belirli bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan reaksiyonlara verilen ortak bir isimdir. Metod basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun şartlarda çoğaltılması esasına dayanır.

38 94 C-98 C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon 37 C-65 C aralığında sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA'ya bağlanması hibridizasyonu 72 C de gerçekleştirilen zincirin uzaması polimerizasyonu (çift zincirli DNA ların sentezi) ve bu siklusların belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır.

39 Metodun temeli Çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerini tamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer (18-20 baz uzunluğunda) kullanılarak; bu zincirin uzamasını (polimerizasyonu) (çift zincirli DNA ların sentezi) iki primer ile sınırlandırılan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır.

40 PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya imkân sağlamaktadır. PCR tekniği ile laboratuvar teşhisinde çok büyük bir hız ve kesinlik kazanılmış; bir çok durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz hale gelmiştir.

41 PCR KULLANIM ALANLARI 1. Kalıtsal hastaliklarda taşıyıcının ve hastanın teşhisi. 2. Perinatal teşhisde. 3. Klinik numunelerde patojen organizmaların teşhisinde. 4. Adlî tıp uygulamalrında. 5. Kanser araştırmalarında. 6. Probe'ların oluşturulmasında/klonlamada/gen ekspresyonu araştırmalarında.

42 7. DNA sekans analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında. 8. Bilinmeyen sekansların tayininde. 9. Geçmiş DNA'nin incelenmesi ve moleküler filogeninin aydınlatılmasında. 10. Restriksiyon Fragment Length Polimorfizm RFLP) analizinde.

43 11. İn vitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılmasi ve sonra implantasyon gerçekleştirilmesi ile bebeğin normal doğmunun sağlanması. 12. DNA-protein etkileşmesinin araştırılmasında (footprinting) kullanilabilir.

44 PCR CİHAZI

45 KAYNAKLAR &fig=Fig

46