DNA nın REPLİKASYONU ve REKOMBİNASYONU Prof.Dr. Sacide PEHLİVAN
REPLİKASYON (DNA nın Eşlenmesi-Hangi DNA ) nükleer-mitokondrial Nerede? Ne zaman? Neden?
DNA Replikasyon Mekanizmasının Özellikleri Özgül replikasyon başlama bölgeleri (Specific origin) bulunur Yarı muhafazakardır (Semiconservative) İki yönlü (Bidirectional) ya da tek yönlüdür (unidirectional) Semidiscontinuous (Bir iplikte kesintili sentez) Kısa RNA primerlerine ihtiyaç duyar
Replikasyon başlama bölgeleri Her kromozom üzerinde DNA sentezinin başladığı tek bir bölge bulunur (prokaryotik hücrede). Çok sayıda kısa tekrar bölgeleri içerir Çok sayıda protein tarafından tanınan ve bu proteinlerin bağlanabildiği bölgedir A-T zengin 13 baz çiftlik tekar bölgelerdir E. coli: ori C Yeast: ARS (autonomously replicating sequence)
Yarı Muhafazakar (Semiconservative) Replikasyon sonrası oluşan her DNA molekülün bir zinciri atasal iken diğer zincir yeni sentezlenmiştir.
İki yönlü sentez (Bidirectional) DNA molekülünde sentez 5 3 yönünde olduğuna göre anti-paralel iki zincirden oluşan DNA molekülünde replikasyon nasıl olmaktadır? mtdna???????
Semidiscontinuous DNA sentezi 5 3 Çift heliks anti-paralel Replikasyon zincirlerden birinde, lider zincirde (leading strand) sentez kesintisiz devam ederken diğer zincirde (lagging strand) kısa nükleotid zincirleri halinde devam eder.
Okazaki parçaçıkları (fragments) Sentezi eklenerek devam eden zincir (lagging strand) de görülür RNA primeri gerektirir Prokaryotlarda okazaki parçalarının uzunluğu 1000-2000 nükleotid iken, ökaryotlarda 100-200 nükleotid uzunluğundadır. NEDEN?
Primer??? DNA polimeraz enzimleri yeni bir zincirin sentezini kendi kendilerine yapamazlar (başlatamazlar). 3 -OH ucu serbest olan ve kalıp zincire komplementer olan kısa nükleotid zincirine ihtiyaç duyarlar.
DNA Replikasyonunda Primerler Kalıp DNA üzerinden RNA primeri sentezlenir DNA sentezi başlar RNA kısmı yok edilir Arada kalan boşluklar DNA ile doldurulur ve nükleotitler birbirine bağlanır.
DNA replikasyonu Replikasyon başlama bölgesine bağlanan proteinler Helikaz Tek zincire bağlanan proteinler (SSBs) Primazlar DNA polimerazlar Telomeraz??????
Replikon; DNA üzerindeki replikasyon üniteleridir. Replizom; multiprotein replikasyon kompleksidir DNA pol. Helikaz Primaz SSB protein Ligaz
Polimeraz Enzimleri DNA sentezi (replikasyon) DNA polimerazlar tarafından katalizlenir. RNA sentezi (transkripsiyon) RNA polimerazlar tarafından katalizlenir.
Replikasyon başlama bölgesine bağlanan proteinler (Origin-binding proteins) DNA replikasyonun başlaması için özgül proteinlerin replikasyon başlama dizilerini tanıması ve bağlanması gerekmektedir. Ökaryotlardan mayalarda Orijin tanıma kompleksi (ORC) ARS (autonomously replicating sequence) dizilerine bağlanır. Prokaryotlardan E. coli de DnaA proteini ori C bölgesine bağlanır. SV40 (monkey virus: model replication system for eukaryotes) orijininet antigen bağlanır.
Replikasyonun OriC de başlaması DnaA bağlanır ve çift heliks açılmaya başlar Helikaz (DnaB) diğer zincire bağlanır.
Helikaz DNA çift zincirini açar Enerjiye ihtiyaç duyar (ATP)
Replikasyon sırasında tek zincirli DNA ya bağlanan proteinlere (SSB= Single-strand DNA-binding protein) neden ihtiyaç var?
Tek zincirli DNA yı korumak için Çift sarmalın yeniden oluşumunu önlemek için tek zincirli DNA molekülüne bağlanabilen proteinlere (SSBP) proteinlere ihtiyaç vardır.
Primaz RNA primerlerinin sentezini yapar Her bir okazaki parçasının sentezi için gereklidir.
DNA polimerazlar Kalıba bağlı olarak DNA sentezini yaparlar Gerekenler:, Kalıp DNA dntps Primer Zincir uzaması sırasındaki fosfodiester bağlarını katalizler
Prokaryotlarda DNA polimerazlar E. coli de 3 tip DNA polimeraz (en az ) bulunur. DNA polimeraz I: RNA primerleri ayrıldıktan sonra oluşan boşlukları doldurmak ve sentez yönündeki hataların tamir edilmesinde görevlidir. DNA polimeraz II: DNA tamirinde görevli. SOS cevabına karşılık replikasyon çatalının açılmasını durdurur. UV gibi dış etkenler sonucu oluşan DNA hasarını onarır DNA polimeraz III: 5 3 yönünde polimeraz aktivitesi ile her iki zincirde de sentez yapar. 3 5 ekzonükleaz aktivitesi ile yanlış eşleşen bazları çıkarır
Replikasyon orijini, oric
DNA Replikasyon Çatalı İki DNA polimeraz molekülü replikasyon çatalında aktif pozisyonda (panel a). Bunlardan biri lider zincirden yapılan sentezi katalizlerken, diğeri okazaki DNA parçacıklarının sentezini katalizler. Her iki polimeraz enzimi de aksesuar proteinlerle birlikte kalıp zincirlere tutunarak bu işi yaparlar.
DNA Pol III & RNA Primaz Fonksiyonu
DNA Pol I ve primerin zincirden çıkarılması 3-5 Ekzonükleaz 5-3 Polimeraz
DNA ligaz fonksiyonu
Topoizomerazların rolü
Replikasyon sırasındaki hataların düzeltilmesi (Proofreading) DNA polimerazların çoğu 3 5 ekzoonükleaz aktivitesine sahiptir. (reverse of polymerase activity) Sentez sırasında diziye giren yanlış nükleotidler bu mekanizma ile düzeltilir ve böylece mutasyon önlenir. Bu replikasyon sadakati olarak anılır, sentez sırasında 10 9 nükleotidde bir rastlanan hatadır.
Replikasyon Sadakati 5 3 polimerizasyon; hata olasılığı 1/10 5 3 5 ekzonükleaz proofreading: hata olasılığı 1/10 2 Zincir hedefleyerek yanlış eşleşme tamiri: Hata olasılığı: 1/10 2 Toplam; 1/10 9
DNA hataları baz değişimleri ile sınırlı değildir Helix geometrisinde değişimler olabilir Bazların nadir formları olan tautomerik formları oluşabilir. 1/10 4-1/10 5 Ör; sitozinin tautomerik formu, adenin ile eşleşmeye neden olur *Tautomerik form: moleküler formül aynı atomlar arası bağ konfigürasyonu farklı A ve C; amino ve imino formlar T ve G; Keto ve enol formlar
DNA molekülünün replikasyonu 3 türlü olur Teta (θ)şeklinde replikasyon Sigma (ρ) şeklinde replikasyon Doğrusal (linear) replikasyon
Teta şeklinde replikasyon
Sigma şeklinde replikasyon
Doğrusal replikasyon
Doğrusal replikasyon
DNA ligaz
Prokaryotlarda replikasyonun sonlanması Terminasyon bölgesine tus proteininin bağlanması ile sonlanır. Replikasyon enzimleri, tus ile etkileşince sentez sonlanır.
Özetle Replikasyon orijininin tanınması Sarmalın açılması ve öyle (sabit-tek zincir halinde) kalması Primer sentezi Sentezin başlaması Üstün kıvrımların gevşemesi Hata onarımı Serbest uçların birleştirilmesi bir seri protein molekülü ile gerçekleşmektedir
Ökaryotik DNA replikasyonu Genel mekanizma olarak prokaryotlara benzer; Yarı muhafazakar (Semiconservative) İki yönlü (Bidirectional) Zincirlerden biri kesintisiz sentezlenirken diğeri parçalar halinde sentezlenir (Semidiscontinuous) Primer gereksinimi var
Ökaryotik DNA replikasyonu Farklılık: Birden fazla replikasyon başlama bölgesi mevcuttur. daha fazla DNA var Ökaryotik DNA polimerazların hızı prokaryotlardan 20 kat yavaş Nükleozom yapısı ile ilişki var. Okazaki parçaçıkları daha kısadır. Sonlanma problemi var Doğrusal DNA
Ökaryotlarda DNA polimeraz 1.DNA polimeraz alfa ailesi; 3 e ayrılır Pol-alfa; primaz aktivitesi vardır, hem lider hem de kesikli zincir için RNA primeri sentezler. Pol-delta; lider zinciri uzatan polimerazdır. Pol-epsilon; kesikli zinciri uzatan polimerazdır. 2.DNA Polimeraz Beta; DNA polimeraz I gibi işlev görür, primeri çıkarıp bu bölgeyi tamamlar. 3.DNA polimeraz gama; mitokondriyal DNA nın replikasyonunu gerçekleştiren enzimdir. *Beta, epsilon ve deltanın 3 5 ekzonükleaz aktivitesi bulunmaktadır
Ökaryotik DNA replikasyonunda sonlanma -Telomeraz -Telomerler -sonlanma problemi -telomeraz yapısı ve fonksiyonu
Telomerler DNA moleküllerinin uç kısımlarıdır. Kromozomun 3 ana kısmından biridir (Sentromer ve iki uçta telomerler) Replikasyon sırasında özel bir durum yaratır GT zengin tekrar dizilerinden oluşur. Sentezleri telomeraz enzimi ile katalizlenir. Yaşlılıkla birlikte telomer zincirlerinde kısalma olur.
Telomerlerin fonksiyonu Replikasyon sırasında doğrusal kromozomal DNA molekülünün son kısmının tamamlanmasında rol oynar Kromozomları rekombinasyon, yıkım, ve füzyona karşı korur. Kromozomların bütünlüğünü ve stabilitesini sağlar Kromozomların nükleus zarına tutunarak belirli bir pozisyonu korumasını sağlar.
Replikasyonun sonlanmasında neden problem var?
Telomer Kısalması Semidiscontinuous DNA replikasyonu RNA primerine ihtiyaç var RNA primeri geri çıkarılır Kesintili sentezlenen zincirin (lagging strand) sonunda 5 uçta bir boşluk oluşur.
Telomeraz RNA ve ona bağlanan protein moleküllerinden oluşur (enzim + RNA kompleksi). Kesintili sentezlenen zincir (lagging strands) in replikasyon sırasında kısalmasını önler Telomer sentezini katalizler RNA alt üniteleri telomer zinciri için kalıp görevi görür. Telomeraz aktivitesi insnlarda birçok somatik doku hücrelerinde görülmez. Genellikle replikasyon kapasitesi yüksek olan dokularda görülür.
Telomeraz mekanizması
Replikasyon Zamanı Hücre döngüsünün sentez (S) fazında gerçekleşir. Tüm hücrelerde aktif olan genler S fazının çok erken evrelerinde replike olur. Yalnızca bazı hücrelerde aktif olan genler (dokuya özgül olarak) S fazının geç dönemlerinde replike olur. Geç replike olan kısımlar A-T ce zengindir, erken replike olan kısımlar G-C den zengin dizilerdir.
Telomer tekrarlarının kısalmasına bağlı olarak hastalık gelişebilmekte Dyskeratozis Congenita Telomeraz enzimleri doğuştan defektli olan bireylerdir. Akciğer, karaciğer tırnak, saç deri gibi dokularda hasarlar olur Kemik iliği hücrelerinin ölümünden dolayı
REKOMBİNASYON
Önemli oranda dizi homolojisi (benzerliği) içeren iki kromozom boyunca, eşdeğer pozisyondaki genetik değiştokuşa, genel yada homolog rekombinasyon denir. Rekombinasyon, homolog kromozomlar arasında Mayoz bölünme sırasında gerçekleşir. Rekombinasyon sırasında DNA molekülü kırılır, parçalar değişir ve yeniden birleşir. Rekombinasyon DNA boyunca herhangi bir yerde olabilir. Cis (aynı DNA zinciri üzerinde) formunda DNA, rekombinasyon sıklığına bakılarak genlerin birbirlerinden uzaklığı, yani genlerin dizilişi saptanabilir. Birbirine yakın olan genlerin rekombinasyon olasılığı, uzak olan genlere göre daha düşüktür.
(iplik değişimi ve birleşme) Endonükleaz kesimi Genetik Rekombinasyonun Holliday Modeli (a) İki homolog DNA molekülü (kardeş olmayan kromatitler) mayoz sırasında yanyana uzanır. Birleşme ilerlemesi (b) Her iki DNA nın bir ipliği kesilir. (c) Kesik iplikler çapraz olarak homolog ipliğe katılır. Holliday yapısı (veya Holliday junction) oluşur. (d) Dallanma noktasında göç ile Heteroduplex bölge oluşur. (e) Holliday yapısının çözülmesi. DNA iplikleri ya dikey yada yatay olarak kesilebilir. (f) Dikey kesim f-f' ve F-F' bölgelerinde kros-over meydana getirir. (g) Yatay kesim gen dönüşümüne neden olur.
Teşekkürler