Brown ve Wu 1977 de Triasulfuron gibi sulfonylurea grubu ilaçlarından biri olan Chlorpropamide in in vitro V79 Çin hamster hücrelerinde KKD sayısını

1 1.GİRİŞ Günümüzde hızlı endüştrileşmeye bağlı olarak çevre kirliliğinin giderek artması canlıların daha fazla fiziksel ve kimyasal etmene maruz kalmasına neden olmaktadır. Fiziksel ve kimyasal etmenlerin canlılar üzerindeki zararlı etkileri araştırmacıların son derece ilgisini çekmektedir. Toksik, mutajenik, kanserojenik veya teratojenik etkili olabilen bu etmenlerin zararlarını tespit etmek ve önlemler almak gerekmektedir. Bu amaçla çeşitli testler geliştirilmiştir. 1970 ten beri dünya genelinde yaklaşık 28 milyon kg pestisit etken maddesi piyasaya sunulmuştur. Bu da 900 aktif içerik ve 50000 ticari pestisit formülasyonunu kapsamaktadır (Pan American Health Organization, 2002). Zararlıları ve otları kontrol etmek amacı ile tarımsal alanlarda pestisitlerin kullanılmasının amacı; ürün verimini arttırarak, hasatta kayıpları düşürmektir. Zirai uygulamalarla beraber pestisitlerin halk sağlığında, temizlik işlemlerinde, kağıt yapımında, boyalarda ve yüzme havuzu sularında kimyasal karışımlar olarak kullanıldığı bilinmektedir (Al-Saleh 1994). Bu bileşiklerin birçok alanda, yüksek miktarda kullanılması çevre kirliliğine yol açmaktadır. Yoğun kullanımları sonucu pestisitlerin artıklarına ve metabolitlerine içme suları ve besinlerde rastlanmıştır (Al-Saleh 1994). Bu da kimyasalların insan vücuduna girip sağlığını etkileyeceği, genetik materyalde potansiyel tehlike oluşturacağı endişesini arttırmıştır (Ribas vd 1996). Tarımda pestisitlerin yüksek miktarda kullanılması, bu bileşiklerin farklı test sistemleri ile genotoksik açıdan değerlendirilmesini gerekli kılmaktadır. Birçok araştırıcı modern tarımda bitki zararlılarını kontrol etmek amacı ile kullanılan pestisitlerin mitotik ve mayotik hücre bölünmelerini etkilediği, insanlarda, hayvanlarda ve ekonomik önemi olan bitkilerde genetik hasara neden olduğunu bildirmişlerdir (Ribas vd. 1996, Agrawal vd. 1996, Chauhan vd. 1998, Cicchetti vd. 1999, Soloneski vd. 2002, Zeljezij ve Garaj-Vrhovac 2004, D Souza vd. 2005, Chauhan ve Gupta 2005). Saflas vd. 1987 de ve Brown vd. 1990 da yaptıkları çalışmalara göre; insanların tarımsal kimyasallarla karşı karşıya kalması ile kanser sıklığındaki artış arasında bir ilişki bulunmaktadır (Ribas vd. 1996).

2 Brown ve Wu 1977 de Triasulfuron gibi sulfonylurea grubu ilaçlarından biri olan Chlorpropamide in in vitro V79 Çin hamster hücrelerinde KKD sayısını arttırdığını (Renner ve Münzner, 1980), Watson vd. (1976) Chlorpropamide in insan lenfositlerinde kromozom aberasyonlarına sebep olduğunu saptamışlardır. Renner ve Münzner 1980 de Çin hamster ve farede Chlorpropamide ve tolbutamide in KKD leri doza bağlı olarak arttırdığını aynı zamanda Chlorpropamide in MN oluşumunu indüklediğini, fakat KA testinde yüksek konsantrasyonlarda bile negatif sonuç gösterdiğini saptamışlardır. Nokta mutasyonlarını gösteren Ames testinde Chlorpropamide ve Tolbutamide in mutajenik olmadığı bildirilmiştir (Renner ve Münzner, 1980). Urea grubu herbisitlerinin birçoğu genotoksisite testlerinde negatif etki göstermesine rağmen bazıları pozitif etki göstermiştir. Seiler 1978 de Fluometuron un fare kemik iliğinde MN oluşumunu indüklediğini saptamıştır (Behera ve Bhunya, 1990). Isoproturon un in vivo KA, MN ve sperm şekli anormallikleri testlerinde konsantrasyona bağlı mutajenik etkili olduğu, Diuron un fare kemik iliğinde MN oluşumunu indüklediği (Agrawal vd. 1996), Linuron un insan lenfosit kültüründe MN sıklığını doza bağlı arttırdığı ve klastojenik olduğu bildirilmiştir (Papapaulou vd. 2001). Fiziksel ve kimyasal maddelerin DNA üzerindeki etkilerini görmek için in vivo ve in vitro testler kullanılır (Natarajan ve Obe,1982; Carrano ve Natarajan, 1988). Genotoksik ajanların canlılar üzerindeki sitogenetik etkilerinin anlaşılması için en önemli kriterler, bir maddenin kromozom aberasyonları (KA), kardeş kromatid değişimleri (KKD) ve mikronukleus (MN) oluşturabilme özelliğidir. KA ları insanların genotoksik ajanlara maruz kalmasından sonra ortaya çıkan önemli biyolojik sonuçlardan birisidir (Obe vd. 2002). Bonassi vd. 1995 te, Hagmar vd. 1998 de yaptıkları epidemiyolojik çalışmalara göre; periferik kan hücrelerinde yüksek KA frekansı olan insanlarda yüksek oranda kanser gelişim riski bulunmaktadır (Obe vd. 2002). Özelliği bilinmeyen kimyasal maddelerin KA larını indükleyebilmeleri açısından test edilmesinin mutajenik/kanserojenik maddelerin stratejik açıdan taranmasında önemi olduğu bildirilmiştir (Kirkland, 1998). Latt vd. 1981 de, Littlefield vd. 1982 de, Takehisa 1982 de yaptıkları çalışmalara göre; kardeş kromatid değişimleri (KKD) testi, mutajenik kanserojenleri belirlemek üzere kabul edilen hassas bir metottur (Morimoto vd. 1985). WHO 1993 te kardeş kromatid değişimlerinin, replikasyon sırasında kardeş kromatidlerin homolog

3 lokusları arasında resiprokal (karşılıklı) DNA değiş-tokuşlarından orijinlendiğini, tüm hücrelerde kendiliğinden ve belli oranda oluşmalarına rağmen, bazı kimyasal ve fiziksel ajanların DNA da hasar oluşturarak KKD frekansında artışa sebep olduğunu bildirmiştir (Laffon vd. 2001). MN lar hücre bölünmesi sırasında ana nukleuslara dahil olmayan tam bir kromozom veya asentrik kromozom fragmentlerinden oluşur. Sitokinezi-blok MN yöntemi; hücrelerin kimyasal ile etkilenmesinden sonraki sadece birinci bölünmede, yeni meydana gelen hücrelerin iki nukleuslu görünümleri ile MN ların tanınmasını (Fenech ve Morley, 1985), MN tekniği sonunda elde edilen hücrelerin sayım kolaylığı; binlerce hücrenin sayılmasını, kimyasal muamele görmüş hücreler ile kontrol hücreleri arasında küçük farklılıkların belirlenmesini sağlar. Bundan dolayı Elhajouji vd. 1995 yılı çalışmalarına göre; MN testi ile çeşitli pestisitlerin ve ilaçların genotoksisite testlerinde klastojenik ve aneugenik etkili olabilecek seviyeleri tespit edilebilmektedir (Natarajan, 2002). Pestisitlerin en büyük grubunu oluşturan herbisitler istenmeyen bitkileri yok etmek amacı ile yaygın olarak kullanılan kimyasallardır. Modern tarımda çok önemli rol oynarlar ve büyük miktarlarda kullanılırlar. Triasulfuron, yıllık veya çok senelik geniş yapraklı veya otsu zararlıların kontrolü için herbisit olarak kullanımına izin verilen sulfonylurea bileşiğidir. Triasulfuron un düşük akut toksisite gösterdiği ve genotoksisite çalışmalarında bu herbisitin klastojenik ve mutajenik olmadığı bildirilmiştir (EPA, 1998a). Triasulfuron un Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae ve fare lenfoma hücrelerinde nokta mutasyonlarını, Çin hamsterlerinde MN testinde KA larını, insan fibroblastları ve fare hepatositlerinde program dışı DNA sentezini (UDS) indüklemediği saptanmıştır (EPA, 1998a). 1000 ppm konsantrasyonlarında köpek (Ciba-Giegy, 1986a), tavşan (Ciba-Giegy, 1986b) ve sıçanda (Ciba-Giegy, 1985) toksik olduğu bildirilmiş, bu maddenin insan için kanserojenik potansiyeli olduğu konusunda tamamlanmış ve belirlenmiş bir çalışmaya rastlanmamıştır. Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae, fare lenfoma, Çin hamsterleri ve insan fibroblastlarında Triasulfuron un genotoksik etkisine bakılmış olmasına rağmen, kültürü yapılan insan lenfositlerinde KA, KKD, MN indüksiyonuna etkisi üzerine bir bilgi bulunmamaktadır. Tarımda otsu zararlılarla mücadelede kullanılan Urea lar ile yapılan toksisite çalışmalarından çelişkili sonuçlar alınmış ve literatür çalışmalarında urea grubuna ait

4 Triasulfuron herbisitinin insan lenfositlerine etkisi üzerine bilgiye rastlanmamıştır. Bu nedenle çalışmamızda kültüre edilen insan periferik kan hücreleri Triasulfuron un farklı konsantrasyonları ile muamele edilerek, KA, KKD, MN test sistemlerinde bu bileşiğin farklı genetik hasarların meydana gelmesi üzerindeki etkisinin araştırılması ve kimyasalın genotoksik aktivitesinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu çalışmanın sonucunda; Triasulfuron un farklı konsantrasyonlarının insan periferik kan lenfosit kültüründe muamelesi ile bu konudaki bilgi eksikliği giderilmiş aynı zamanda konsantrasyona bağlı etkisi gözlenerek hangi konsantrasyonlarda toksik veya genotoksik olabileceği saptanmış olacaktır. Dolayısı ile farklı test sistemlerinde, genetik aktivite profili ortaya çıkarılarak en düşük etkili konsantrasyonları hakkında bilgi edinilmiş olacaktır. Bu bilginin besinlerde kabul edilebilir kalıntı konsantrasyonlarını ve profesyonel kullanımda tehdit sınırlarını belirlemede yararlı olabileceğini umuyoruz.

5 2. GENEL BİLGİLER Her canlı türünün kendine özgü genetik bilgisinde gen rekombinasyonundan başka sebeplerle ve ani olarak meydana gelen kalıtsal değişmelere mutasyon denir. Mutasyonlar doğada kendiliğinden meydana geldiği gibi mutagen adı verilen fiziksel ve kimyasal etkenler tarafından da meydana getirilebilirler. Mutagenler DNA molekülünde çeşitli hasarlar oluştururlar. Bu hasarlar hücrede DNA onarım mekanizmaları tarafından onarılmaya çalışılır. Meydana gelen hasarların çoğu onarılmaktadır. Bazen hücrenin ölümden kurtulabilmesi için DNA da meydana gelen hasar mecburen yanlış olarak onarılır. Ya da onarım mekanizmalarının çalışmasını kontrol eden genlerin mutasyona uğraması ile veya beslenme, ısı ve yaş gibi çevre şartlarının etkisiyle DNA da meydana gelen hasar onarılmadan kalabilir. Bu durumda o hücrede mutasyon, buna bağlı olarak kanser oluşumu hatta hücre ölümü meydana gelebilir. Mutasyonlar bazen canlıda üstün bir karakterin ortaya çıkmasına neden olduğu halde genellikle canlılar için dezavantaj olan özellikleri ortaya çıkarmaktadır. Canlıların DNA larında meydana gelen hasarlar; Ames testi, in vivo memeli fare kemik iliği kromozom aberasyon testi, in vivo memeli eritrosit mikronukleus testi, in vitro memeli hücre gen mutasyon testi, bakteri kullanarak yapılan geri mutasyon testleri ile belirlenmektedir. In vitro memeli kromozom aberasyon testi, kardeş kromatid değişimleri testi ve mikronukleus testi, DNA da meydana gelen hasarın ve genotoksik etkilerin sitogenetik açıdan araştırılmasında kullanılan test yöntemleridir. 2.1. Kromozom Aberasyonları Kromozomların sayısı ve yapısındaki değişimlere kromozom aberasyonları (KA) denir. Kromatid kırık, kromozom kırığı, fragment, disentrik kromozom, halka kromozom, kardeş kromatid birleşmesi, translokasyon, inversiyon, izokromozomlar yapısal kromozom aberasyonlarıdır. Bazı araştırıcılar tarafından KA olarak kabul

6 edilmeyen ancak yine de bir anormallik sonucu oluşan yapısal bozukluklar ise gap, spiral çözülmesi, kromozom kontraksiyonudur. İlk defa 1918 yılında de Vries Oenothera da translokasyon tipi anormalliklerin varlığını saptayarak, kromozom yapısında değişikliklerin meydana gelebildiğini göstermiştir. Morgan 1922 de ve Bridges 1923 te Drosophila da translokasyon ve inversiyon tipi anormalliklerin olduğunu gözlemişlerdir. Delesyon, duplikasyon, inversiyon, translokasyon gibi kararlı aberasyonların Drosophila tükrük bezi kromozomlarında ve mısır pakiten kromozomlarında kendiliğinden oluştuğu gösterilmiştir. Disentrik ve halka oluşumu gibi kararsız aberasyonların McClintock un 1942 de mısırda yaptığı çalışmalar sonucunda, genetik materyalin kırılması, birleşmesi, köprü oluşumu sonucu meydana geldiği saptanmıştır. KA ları organizmaların evriminde rol oynamaktadır (Natarajan, 2002). Kromozomlar sentez fazı (S fazı) sırasında replike olurlar. Replikasyon sırasında tüm DNA molekülleri açılmaktadır. Bu DNA molekülleri metafaz kromozomları ile karşılaştırıldığında veya interfaz kromatinin fibrilli yapısı ile karşılaştırıldığında çok büyüktürler. Örneğin Du Praw ın (1970) yaptığı hesaplamalara göre insanın 1. kromozomu 7.5 cm uzunluğunda DNA molekülü içerir. Bu DNA molekülü interfazda 1350 µm fibriller yapısına paketlenir ve metafazda yaklaşık 10 µm uzunluğundadır. Dolayısı ile DNA molekülleri, hem interfaz hem de S evrelerinde çok büyük boyutları nedeni ile mutasyonlara neden olan fiziksel ve kimyasal ajanların açık hedefleridir. Oluşacak olan DNA hasarı sonucunda mikroskopta görülebilen yapısal KA ları oluşur (Obe vd. 2002). Yapısal kromozom aberasyonları, aberasyonun kromozomun bir kromatidinde veya her iki kromatidinde görülmesine bağlı olarak iki gruba ayrılır. Eğer aberasyon tek bir kromatidde görülüyorsa buna kromatid tip, her iki kromatidinde de görülüyorsa kromozom tip aberasyon denir. Bu aberasyon tipleri mutajen uygulamasının yapıldığı hücre siklusu safhasına ve kullanılan mutajenik ajanın tipine bağlıdır. İyonize ışınlar gibi ajanlar hücre G 1 safhasında iken etki ederse kromozom tip aberasyonlar meydana gelir, eğer hücre G 2 safhasında iken etki ederse kromatid tip aberasyonlar ve iyonize ışınlar, S safhasında iken etki ederse her 2 tip aberasyonlar meydana gelebilir (Natarajan ve Obe, 1982). Şekil 2.1.1. ve 2.1.2. de sırasıyla G 1 ve G 2 fazında yapılan ışınlama sonucu oluşan KA ları görülmektedir (Özalpan, 2001). Şekil 2.1.1. de görülen terminal

7 delesyon, kromozomun tek bir kolunda kırılma olması ile oluşmuştur. Kırılan parça ilk mitozda asentrik fragment şeklinde görülür. Asimetrik parça değişimi, aynı kromozomun iki kolunda kırılma olması ve kromozomun kırılan iki kolunun birbirine, kırılan iki parçanın da birbirine yapışması ile oluşur ve mitozda halka kromozom ve fragment şeklinde görülür. Şekil 2.1.1. G 1 fazında yapılan ışınlamalar sonucu meydana gelebilecek kromozom tipi aberasyonlar ile bunların çeşitli yapışma olasılıkları ve S fazını izleyen mitozda saptanan görüntüleri. (Özalpan, 2001) a)terminal delesyon, b)aynı kromozomda simetrik parça değişikliği, c)aynı kromozomda asimetrik parça değişikliği, d)farklı kromozomlar arasında simetrik parça değişikliği, e)farklı kromozomlar arasında asimetrik parça değişikliği. Homolog olmayan kromozomlar arasında olan karşılıklı parça değişimine translokasyon denmektedir. Farklı kromozomlar arasında simetrik parça değişiminde sonraki mitozda görülebilir bir değişiklik olmazken, asimetrik parça değişiminde sonraki mitozda bir disentrik kromozom ve iki asentrik fragment görülür. Şekil 2.1.2. de G 2 safhasında; ışınlama sonucu meydana gelen, kromatid aberasyonlar, terminal delesyon, izokromatid delesyon, aynı veya farklı kromozomlar arasında simetrik ve asimetrik parça değişiklikleri ve triradialler görülmektedir.

8 Şekil 2.1.2. Kromozom eşleşmesi tamamlandıktan sonra, G 2 fazında yapılan ışınlamalar sonucunda meydana gelebilecek kromatid tipi aberasyonlar ile bunların çeşitli yapışma olasılıkları ve sonraki mitozda saptanan görüntüleri. (Özalpan, 2001) a)terminal delesyon, b)izokromatid delesyon c)aynı kromozomda simetrik parça değişikliği, d)aynı kromozomda asimetrik parça değişikliği, e)farklı kromozomlar arasında simetrik parça değişikliği, f)farklı kromozomlar arasında asimetrik parça değişikliği, g)triradial aberasyon. Şekildeki terminal delesyon, sonraki mitozda terminal kromatid delesyon ve asentrik fragment şeklinde görülür. İzokromatid delesyonlar, bir kromozomun iki kardeş kromatidinde aynı hizada kırılma meydana gelmesi sonucu oluşmaktadır. Bunun sonucunda mitoz anafazında köprü ve asentrik fragment oluşabilir. Diğer bir olasılıkta ise sadece fragmentler birbirine yapışır, metafazda bir fragment şeklinde görülür. 3.

9 olasılıkta, kırılan kromozomun iki kromatidinin sadece uçları yapışır ve kırılan parçalar yapışmaz. 4. olasılıkta, hiçbir yapışmanın olmaması durumu ile karşılaşılabilir. Simetrik parça değişikliği bir kromozomun aynı kromatidinde kırılma meydana gelmesi ve kırılan parçaların karşılıklı yer değiştirmesi ile oluşur. Mitozda görülebilir bir değişiklik olmaz. Eğer kromatidlerin kırık uçları birbirine, kırılan iki asentrik parça da birbirine yapışırsa asimetrik parça değişikliği gerçekleşir. Bunu izleyen mitozda kardeş kromatidlerden birisi normal diğeri halka kromozom ile asentrik fragment şeklinde görülür. Farklı kromozomlar arasında simetrik ve asimetrik parça değişiklikleri görülmektedir. Simetrik değişiklikte, iki ayrı kromozomun birer kromatidinden kopan parçalar karşılıklı yer değiştirirler (Şekil 2.1.2. e). Mitozda görülebilir bir değişiklik olmaz. Eğer kırılan parçalar birbirlerine ve kromatidlerin de kırılan uçları birbirlerine yapışırsa (Şekil 2.1.2. f), takip eden mitozda bu durum bir disentrik kromozom ve asentrik fragment şeklinde görülür. Triradial aberasyonlar, bir kromozomun tek kromatidinde, diğer kromozomun iki kromatidinde (izokromaid) kırılma meydana gelmesi ve izokromatid kırılma sonucu meydana gelen asentrik parçaların, tek kromatid kırılması ile oluşan kırık uçlara yapışmasıyla meydana gelir. Mitozda 3 kollu bir kromozom ile izokromatid delesyon şeklinde izlenir. Bunlardan başka oluşan kromozom aberasyonlarından biri olan inversiyonlar, bir kromozomun kopan bir parçasının 180º dönüp tekrar aynı kromozoma yapışmasıyla oluşur. İzokromozomlar ise kromozomun sentromer bölgesinden kromozom tipi enine bir kopmanın olması sonucu oluşur. Her iki kromatidinin genetik bilgileri aynı olan yeni bir kromozom meydana gelir. Gap, kromozomda kromatid kalınlığına eşit ya da ondan daha dar boyanmamış (akromatik) bölgelere verilen isimdir. Kromozomdaki boyanmamış bölge kromatid kalınlığından fazla ise kromatid kırık olarak kabul edilmektedir (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 1995). Gaplar da kırıklarda olduğu gibi izokromatid veya kromatid gap şeklinde olabilir. Her iki kromatidde de gap varsa izokromatid gap, tek bir kromatidde gap varsa kromatid gap denir. Elektron mikroskopu çalışmalarında, gap bölgelerinde (akromatik bölgelerde) bağlantının olduğu saptanmıştır. Özellikle DNA sentezini inhibe eden bazı kimyasallar, yüksek sıklıkla gaplara neden olurlar (Natarajan ve Obe, 1982). Spiral çözülmesi, kromozomda soluk boyanan bölgelerdir. Gap a göre daha geniş bir alanı kapsar. Kromozomların kontrole göre boylarının çok kısalması ve

10 kalınlığının artmasına kromozom kontraksiyonu denir. Bu olay kimyasal maddenin histon proteinlerine etki ettiğini göstermektedir. (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 1995) 2.1.1. KA testleri Mutajenik ajanlara maruz kalan insan populasyonlarını izlemek için periferik kan lenfositlerinde, KA ve MN lar kullanılır. Hagmar vd. 1998 de insan populasyonlarında kendiliğinden oluşan KA ları ile sonradan oluşan kanser sıklığı arasında pozitif bir ilişkinin olduğunu belirlemişlerdir (Natarajan, 2002). Boveri 1914 yılı bildirisinde; kararlı kromozomal değişiklikler ile farklı kanser tipleri arasında ilişki olduğunu ileri sürmüştür (Natarajan, 2002). Son yıllarda, kromozomları gözlemek üzere geliştirilen tekniklerle, kromozom araştırması alanında büyük gelişme gösterilmiştir. Bunlar memeli hücrelerine hipotonik muamelesi, E.M., kromozom bantlama, en son olarak FISH gibi tekniklerdir. Natarajan (2002) bundan sonra kromozom aberasyonları alanında yapılacak araştırmaların, içerdikleri mekanizmalar üzerinde odaklanacağı düşüncesindedir. 2.2. Mikronukleus (MN) Kimyasal ajanların mikronukleus oluşturması açısından değerlendirilmesi, bu kimyasalların genotoksisitelerinin tespit edilmesinde kullanılan diğer bir kriterdir. MN lar hücrenin mitoz bölünmesi sırasında ortaya çıkan, esas çekirdeğe dahil olmayan, tam kromozom veya asentrik kromozom fragmentlerindan köken alan oluşumlardır. Bu durumda bu parça mikronukleus adını alır ve interfazda kolayca görülebilir. MN sayısındaki artış, çeşitli ajanların hücrelerde oluşturduğu sayısal ve yapısal kromozom düzensizliklerinin indirekt göstergesi olarak değerlendirilmektedir. MN lar ya

11 klastojenlerin neden olduğu kromozom kırığı sonucu asentrik kromozom fragmentlerinden, ya da aneujenlerin neden olduğu sentromer bölünme hataları ve iğ ipliği fonksiyon bozukluğu sonucu anafaz sırasında geri kalan tam bir kromozomdan oluşurlar (Fenech ve Morley, 1985). Mikronukleus analizi için mutajen muamelesi görmüş hücrelere sitokalasin B uygulanarak sitoplazma bölünmesi engellenir ve bu yolla 2 yavru nukleusun birlikte bulunduğu iki nukleuslu hücreler ve bu hücrelerin sitoplazmaları içinde yer alan mikronukleuslar değerlendirilirler. 2.2.1. MN tekniğinin gelişimi MN lar ilk kez 1 yy kadar önce Howell tarafından eritrosit sitoplazmasında görülmüş ve bu yapılara nukleer materyal fragmenti denmiştir. Bunlar 1900 lü yılların başlarında Jolly terminolojisinde intraglobuler korpuskuller olarak tanımlanmıştır. Bu yapılar Howell-Jolly cisimcikleri olarak bilinir. Benzer yapılar 1937 de Brenneke tarafından fare, sıçan embriyolarında ve 1951 de Thoday tarafından Vicia faba da da görülmüştür (Kirsch-Volders vd. 2003). Bunlara fragment nukleuslar veya mikronukleuslar denmiştir. Evans vd. 1959 da Vicia faba kök uçlarında MN ları radyasyona maruz kalan hücrelerde gördüklerini, asentrik fragmentlerden orjinlendiklerini ve mitozun son safhasında iki yavru nukleustan ayrılarak oluştuklarını bildirmişlerdir. Vicia faba kök uçlarında nötron ve gamma ışınlarının etkisini karşılaştırdıkları çalışmada, sitogenetik hasarın belirteci olarak MN ların kullanılabilirliğini tespit etmişlerdir (Kirsch-Volders vd. 2003). İlk kez MN test yöntemini öneren Boller ve Schmid 1970 te ve Heddle 1973 te ajanların genotoksik potansiyellerini ölçmek için kemik iliği eritrositlerinde MN u test yöntemi olarak kullanmışlardır (Kirsch-Volders vd. 2003). Daha sonra 1980 de MacGregor vd. tarafından bu metod periferik kanda dolaşan polikromatik eritrositlerde denenmiş ve en az kemik iliği metodundaki kadar hassas olduğu gözlenmiştir. Bu metod hayvanları öldürmeden fazla sayıda örnek alınmasına olanak verdiği için daha avantajlı sayılmıştır (Almassy vd. 1987). Countryman ve Heddle 1976 yılında yaptıkları

12 çalışmada, lenfositlerde MN oluşumunu belirleyerek, kromozom hasarının meydana çıkarılmasında diğer bir uygulanabilir hücresel sistem ileri sürmüşlerdir (Kirsch- Volders vd. 2003). Von Ledebur ve Schmid 1973 te, Högstedt ve Karlsson 1985 te geliştirdikleri modifiye metodlarla, aneuploidiye yol açan ajanlar ile klastojenleri birbirinden ayırmada, MN büyüklük farkından yararlanmışlar; klastojenlerce uyarılan MN ların asentrik kromozom fragmentleri içeren küçük, aneujenlerce uyarılan MN ların tam kromozomlar içerdiğini ve daha büyük ebatlı olduğunu göstermişlerdir (Demirel ve Zamani, 2002). Daha sonraları 1985 ve 1986 yıllarında Fenech ve Morley tarafından Sitokinezi-Blok (Cytokinesis-Block) Metodu geliştirilmiştir (Demirel ve Zamani, 2002). MN araştırmalarında in situ hibridizasyon (ISH) tekniği, ilk defa kromozomların sentromerini tanımlamak için Norppa vd. tarafından 1993 te uygulanmıştır (Demirel ve Zamani, 2002). Daha sonra Richard vd. 1994 te floresan in situ hibridizasyon (FISH) tekniği ile MN oluşturan kromozomların her birinin kimliğini belirleyebilecek teknolojik gelişmeler sağlamışlardır (Demirel ve Zamani, 2002). Sentromerik problu floresan in situ hibridizasyon metodu, aneuploidiyi indükleyen bileşiklerin değerlendirilmesinde kullanılmaktadır (Papapaulou vd. 2001). 2.2.2. MN test yöntemi ve uygulama amacı MN yönteminin geliştirilmesinde en önemli adım; MN oluşumuna izin veren, bir çekirdek bölünmesini tamamlamış hücrelerin sayılmasının esas alınmasıdır (Fenech vd. 1999). Sitokinezi-blok mikronukleus metodunu geliştiren Fenech ve Morley 1986 da, hücre kültürüne mitoz sırasında sitoplazma bölünmesini durduran aktin inhibitörü cytochalasin-b (Cyt-B) ilave ederek çekirdek bölünmesini tamamlamış, ancak sitoplazmik bölünmesini gerçekleştirememiş çift çekirdekli hücreler elde etmişlerdir (Fenech vd. 1999, Kirsch-Volders vd. 2003). İncelenen alanda kültür süresi içinde ikinci bölünmesini tamamlamış 4 çekirdekli hücrelere de rastlanmaktadır; ancak MN sayımında Heddle ve Countryman in (1976) kriterleri kullanıldığından bu hücrelerde

13 görülen MN lar değerlendirme dışı bırakılmaktadır (Demirel ve Zamani, 2002). Heddle ve Countryman in (1976) kriterlerine göre: 1- MN esas nukleus ile aynı yapıda olmalıdır. 2- MN esas nukleustan küçük olmalıdır. 3- MN esas nukleustan ayrı, yuvarlak veya yaklaşık yuvarlak şekilli olmalıdır. 4- Nukleer olmayan partiküllerden farklı olarak ışığı yansıtmamalıdır. 5- MN feulgen pozitif veya diğer DNA ya özel reaksiyonlarda pozitif reaksiyon göstermelidir. 6- MN lar sitoplazması iyi gözlenen hücrelerde sayılmalıdır. 7- MN oluşumu doza bağlı olmalıdır (Almassy vd. 1987). Sitokinezi-blok Mikronukleus (CBMN) tekniği in vitro genotoksisite testleri, insan populasyon taramasında kolayca uygulanabilecek bir tekniktir (Fenech vd. 1999). MN tekniği, en çok çeşitli kimyasallara ve fiziksel ajanlara maruz kalmış bireylerin taranması amacı ile, bireyler arasında genetik hasarın temel seviyesini anlamak (Fenech vd. 1999) ve çeşitli ajanların klastojenik ve aneujenik potansiyellerini değerlendirmek amacı ile insan lenfositlerini de içeren farklı tip hücrelerde geniş çapta kullanılmaktadır (Fenech ve Morley, 1985). 2.2.3. MN testi avantajları MN test yöntemini sitogenetik anormallikleri belirlemede etkili bir metod yapan; farklı hücre tiplerinde in vitro şartlarda yaygın uygulanabilirliği ve sayım kolaylığıdır. Ayrıca elde edilen verilerin çok sayıda olması istatistiksel dayanağının güçlü olmasını sağlar (Fenech vd. 1999). Fenech 1997 de, Kirsch-Volders 1997 de, Eastmond ve Tucker 1989 de MN test yönteminde kinetekor veya sentromeri belirleyen metodlar kullanarak; kromozom kırığı nedenli MN ile kromozom geri kalması nedenli MN ları birbirinden ayırmanın kolay olduğunu belirtmişlerdir (Fenech vd. 1999). İmmünokimyasal işaretleme metodları ile CBMN test yöntemi, MN oluşumundan sorumlu esas mekanizmanın anlaşılmasını sağlar. Çift iplik DNA kırıkları, asentrik

14 fragmentli MN oluşumuna ve mitotik apereydeki hata, tam kromozomlu MN oluşumuna neden olmaktadır (Kirsch-Volders vd. 2003). Kirsch-Volders vd. 1997 de, Fenech vd. 1997 de yaptıkları çalışmaların sonuçlarına göre; bu yöntem klastojenik ve aneujenik etkileri birbirinden ayırabilmekte ve Elhajouiji vd. nin 1997 yılı çalışma sonuçlarına göre ayrıca; doz-cevap eğrisi, tam kromozom ve kromozom ayrılmaması sonuçlarına uygulanabilmektedir (Kirsch-Volders vd. 2003). Bundan dolayı in vitro MN test yöntemi bilimsel olarak yeterli ve güçlü kabul edilmektedir (Kirsch-Volders vd 2003). 2.2.4. MN ve kanser ilişkisi MN frekansı ile kanser gelişimi arasındaki direk ilişki birçok bulgu ile desteklenmektedir. Cheng vd. 1996 da, Duffaud vd. 1997 de yaptıkları çalışmalara göre; kanser hastalarında periferik lenfositlerde olduğu gibi hedef dokuda da MN frekansı artmaktadır (Fenech vd. 1999). Rudd vd. 1988 te, Rosin ve German 1985 teki bildirilerine göre; Bloom sendromu veya ataxia telangiectasia gibi hastalıklardan etkilenen bireyler, yüksek MN frekansı ve kanser riski taşımaktadırlar (Fenech vd. 1999). Sorsa vd. 1992 yılında yaptıkları araştırmaya göre; bazı ajanlar insan ve hayvanlarda MN frekansını arttırabilmekte, kanserojenite ve genotoksisite arasında bir ilişki bulunmaktadır ve bu ajanlar; iyonize radyasyon, benzen, sigaradır (Fenech vd. 1999). Fenech ve Rinaldi 1995 te, Fenech vd. 1997 de, Blount vd. 1997 de, Fenech vd. 1998 de, MN un kandaki vitamin ve folate konsantrasyonu ile çok kuvvetli ilişkisi bulunduğunu, bunların azlığı bazı kanser tiplerinde artışa neden olduğunu bildirmişlerdir (Fenech vd. 1999). Bu bulgular açıkça MN ve kanser arasında bağ olduğunu göstermektedir. KA ile kanser sıklığı arasında anlamlı ilişki vardır. Ancak bu ilişki KKD de bulunmamıştır. MN için henüz veriler yeterli sayıda değildir (Fenech vd. 1999).

15 2.3. Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) 2.3.1. Kardeş kromatid değişim mekanizması Kimyasal ve fiziksel ajanların mutajenite ve karnserojenitesinin test edilmesinde değerlendirilen diğer kriter, kardeş kromatid değişim (KKD) leridir. Latt vd. 1981 de KKD lerin tek bir kromozomun iki kromatidi üzerinde homolog bölgelerdeki kırılma ve yeniden birleşme ile oluşan DNA replikasyon ürünlerinin sitolojik göstergesi olduğunu, Tucker vd. 1993 te KKD lerin hassas genotoksik aktivite indikatörleri olarak geniş alanda kullanıldığını bildirmişlerdir (Villarini vd. 1998). KKD ler, tek bir kromozomun iki kromatidi arasında gerçekleşen karşılıklı değişimlerdir. Bu değişimler hücre siklusunun metafaz safhası sırasında görülebilirler ve KKD lerin meydana gelmesi için enzimatik kesim, translokasyon ve en az iki DNA heliksinin kaynaşması gerekir. Pommier vd. (1985) araştırmalarında; KKD lerin meydana gelişinde Topoizomeraz II enziminin etkili olduğunu ileri sürmüşlerdir. Topoizomeraz II enzimi DNA ya bağlanarak bir kompleks oluşturur. DNA ya etki eden ajanlar bu kompleksin oluşumunu engellemektedirler. Enzim iki alt birimden oluşur (dimer). Bu dimer DNA ya iki şekilde bağlanabilir; ya bir kovalent bağ içerir, bu bağ enzim molekülü ile DNA çift ipliğinden bir tanesinin 5 ucu arasındadır ve bu enzim aracılığı ile DNA ipliğinden biri koparılır, ya da aynı şekilde karşılıklı kovalent bağ içerir. Bu durumda topoizomeraz II:DNA kompleksi iki DNA:protein bağı ve bir çift iplik kırığı (DSB) içerir (Şekil 2.3.1.1.). Her iki durumda da DNA ya etki eden ajanlar tarafından topoizomeraz II:DNA kompleksi bozulur ve normal enzim fonksiyonu inhibe edilmiş olur. İleri sürülen hipotez KKD lerin S fazına bağlı bir olay olması, yeni replike olmuş DNA ipliklerinin DNA çift iplik kırık bölgelerinde değiş tokuşu sonucu oluşmasıdır. Çünkü bu enzim yeni replike olmuş DNA ipliklerini tekrar organize ederken, DNA da çift iplik kırıkları oluşturur ve bunları tekrar birleştirir. DNA ya etkili ilaçlar topoizomeraz II kompleksini etkileyerek, kırılan DNA çift ipliğinin tekrar

16 birleşmesini önler. Bu kırıklar kardeş kromatidlerin değiş tokuşuna neden olur (Pommier vd. 1985). DNA replikasyonundan sonra DNA topoizomeraz II homodimerleri, yeni replike olmuş DNA ipliklerine, DNA yapısını tekrar organize etmek için bağlanırlar. DNA ya etki eden ajanlar (intercalator); her bir DNA çift ipliği üzerinde iki DNA topoizomeraz II homodimerlerinin birbirinden ayrılmasına (moleküllerin dimerlerinin ayrılması) ve 2 homolog enzim molekülünün karşılıklı olarak değiş tokuşuna neden olabilirler (Şekil 2.3.2.). Alt üniteler karşılıklı yer değiştirmekte, buna bağlı olarak A' ve B' DNA çift iplikleri de yer değiştirmektedir. Yer değiştirmiş A' ve B' DNA çift iplikleri, sırasıyla B ve A DNA çift iplikleri ile bağlanmakta ve bunun sonucunda KKD meydana gelmektedir (Pommier vd. 1985). KKD ler doza bağlı olarak genotoksik bileşiklere cevap verirler, ve açıkça DNA hasarı olduğunu gösterirler (Perry ve Evans, 1975). KKD tam DNA çiftsarmalı değiş tokuşunu izleyen her iki DNA ipliğinin kırılmasını içerdiğinden dolayı KKD, DNA kırılmasının sitolojik göstergesidir. Birçok çalışmada FPG tekniği kullanılarak, kimyasalların KKD leri indüklemesi açısından değerlendirilmeleri sağlanmıştır. Klasik KA sayımına göre KKD sayımı tercih edilir. Çünkü KKD sayımı, KA sayımına göre daha kolaydır. Ayrıca KA sayımı, farklı sınıflardaki aberasyonları tanımada deneyim gerektirir ve en az 100 metafaz hücresinin sayılması gerekir. Ancak KKD belirlemede 20-25 hücre yeterli olmaktadır. Diğer taraftan şu açıktır ki bir kimyasalın mutajenitesini test etmek için KKD sayımı, KA sayımının yerini tutamaz. Direkt DNA iplik kırıklarını indükleyen ajanlar (ör: iyonize radyasyon, bleomisin ve streptonygrin), KA larını indükledikleri oranda KKD frekansını arttırmazlar. Bu nedenle sitogenetik çalışmalarda hem KA, hem de KKD lere bakılması, o maddenin etkinliğinin anlaşılması açısından önemlidir (Natarajan ve Obe, 1982).

17 Şekil 2.3.1.1. Memeli topoizomeraz II:DNA kompleksinin olası durumları., kırık bölgelerinde topoizomeraz II ile DNA nın 5 terminal ucu arasında kovalent bağ (Pommier vd. 1985). Şekil 2.3.1.2. KKD lere neden olan DNA ya etkili ajanların etki mekanizması modeli (Pommier vd. 1985).

18 2.3.2. KKD indükleyen ajanlar Kendiliğinden oluşan KKD frekansı, hücrenin DNA içeriği ile ilişkilidir. Örneğin Uggla ve Natarajan (1982) KKD frekansının Vicia faba da hücre başına 62 olacak kadar yüksek (DNA 54 pg/hücre) ve Drosophila melanogaster de hücre başına 0.14 olacak kadar düşük (DNA 0.54 pg/hücre) olabildiğini bildirmişlerdir (Natarajan, 2002). KKD, S fazında meydana geldiğinden dolayı, DNA replikasyonu sırasında etkili olan ve DNA hasarı oluşturan kimyasallar KKD leri indükler. Bu kimyasallar KA larına göre daha düşük konsantrasyonlarda KKD lere neden olurlar. S fazına bağlı ajanların (ör: UV ve alkilleyici ajanlar), KKD lerinin potansiyel indükleyicileri olduğu buna karşın S fazına bağlı olmayan ajanların (ör: X-ışınları ve Bleomisin) KKD lerin zayıf indükleyicileri oldukları saptanmıştır. KKD lerin, nokta mutasyonları, gen amplifikasyonları ve sitotoksisiteye neden olabilecekleri bildirilmiştir (Perry and Evans, 1975). 2.4. Urea Herbisitleri Urea herbisitleri tarım alanlarında geniş yapraklı ve diğer otsu zararlıların kontrolünde kullanılırlar. Bitki kökleri tarafından alınarak hızla bitkinin üst kısımlarına iletilir ve genellikle yapraklarda gözlenen fitotoksik semptomlar oluştururlar. Herbisit sınıflandırmasında urea herbisitleri; fenylurea herbisitleri, sulfonylurea herbisitleri, thiadiazolylurea herbisitleri olmak üzere 3 sınıfa ayrılırlar. Sulfonylurea herbisitleri kendi içinde pyrimidinylsulfonylurea ve triazinylsulfonylurea herbisitleri olmak üzere 2 sınıfa daha ayrılmaktadır (Classification of herbicides, 2005). Triasulfuron, triazinylsulfonylurea sınıfına ait bir herbisittir. Hay 1990 da Sulfonylurea ların (SU) herbisidal aktivitesinin ilk kez 1966 da fark edildiğini bildirmiştir (Cox, 1993). SU lar herbisitlerin gelişen sınıfıdır. Bunlar ilk

19 olarak 1970 lerin ortalarında üretilmiştir. İnsanlar ve hayvanlara zararlı olmadığı için SU lar güvenli herbisitler olarak piyasaya sunulmuştur. SU herbisitleri DuPond Crop Protection tarafından 1982 de üretilmiştir. Tarım alanlarında 100 g/ha oranında uygulanırlar. Memeli toksisitesi düşüktür ve uygulamadan sonra zararsız bileşiklere bozulur. Geniş yapraklı zararlıların, tahıl ve saf ürünlerde otların ve endüstriyel zararlıların kontrolünde kullanılmaktadır. Yaklaşık 25 SU herbisitine tarım alanlarında kullanım izni verilmiştir. 2 heterosiklik halka arasında SU köprüsü varlığı ile karakterizedirler. SU lar kimyasal ve termal olarak kararsızdırlar. Asidik solüsyonlarda, hidrolitik kırılma ile sulfonylurea köprüsü oluşur; nötralden hafif alkali solüsyonlara doğru birçok sulfonylurea kararlılık gösterir ve bir urea hidrojen atomunu kaybederek aniyonik formda kalır. Bu bileşikler genellikle organik çözücülerde kararlıdır ve hidrokarbonlardan başka temel organik çözücülerde 1 mg/100 ml den daha yüksek seviyelerde çözünürler (Powley, 2003). Kimyasal aktivite ile bitkileri öldürmekten ziyade, SU herbisitleri asetolaktat sentaz (ALS) enzimini inhibe ederek amino asit zincirinde temel dalların sentezini bloke ederler (lösin, izolösin, valin). Bu nedenden dolayı, bu kimyasallar SU/ALS veya nadiren ALS herbisitleri olarak refere edilirler. ALS enzimleri, hayvanlarda bulunmadığı için SU herbisit üreten firmalar onların ürünlerinin hayvanlar ve insanlar için güvenilir olduğunu iddia ederler (Flogel, 1998). Aşağıda bazı urea grubu herbisitlerinin toksikolojik ve mutajenik çalışmalarına yer verilmiştir. Tribenuron methyl (triazinylsulfonylurea) Salmonella typhimurium ve Çin hamster over (CHO) hücrelerinde in vitro gen mutasyonları negatif sonuç vermiştir. Sıçanlarda sitogenetik testler, farede MN testini içeren yapısal kromozom hasar testleri negatif sonuçlanmıştır. In vitro sıçan hepatositlerinde program dışı DNA sentez (UDS) testi negatiftir (EPA, 1989). FAO (2002), tribenuron methyl in mutajenite profil bildirisinde; bu kimyasalın Salmonella thphimurium in vitro bakteri gen mutasyon testinde S9 metabolik aktivasyon varlığında ve yokluğunda negatif mutajenik aktivitesi olduğunu, insan lenfositleri in vitro periferik kan kültüründe S9 varlığında ve yokluğunda yapısal KA larını indüklemediğini, CHO hücreleri in vitro memeli gen mutasyon testinde S9

20 metabolik aktivasyon varlığında ve yokluğunda CHO/HGRPT (hipoksantin guanin fosforibozil transferaz) gen mutasyonlarını indüklemediğini, sıçan primer hepatositlerinde in vitro UDS testinde negatif olduğunu, dişi ve erkek sıçanda KA için in vivo kemik iliği testinde UDS oluşturmadığını, dişi ve erkek farede in vivo kemik iliği MN testinde negatif olduğunu bildirmiştir. Triflusulfuron methyl (triazinylsulfonylurea) Ames testinde, memeli (CHO) gen mutasyonları testinde, fare kemik iliği MN testinde 5000 mg/kg a kadar negatif sonuç vermiştir. Kültüre edilen sıçan hepatositlerinde UDS negatiftir (EPA, 1996). Ancak insan lenfositlerinde metabolik aktivasyon varlığında 1500 µg/ml den yüksek dozlar içini pozitif sonuçlar gözlenmiştir. İnsan lenfositlerinde aktivasyonsuz şartlarda KA çalışmaları yetersizdir (EPA, 2001). DPX-66037 (Triflusulfuron methyl) metabolik aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda 62.5,125,250,500,1000 µg/petri konsantrasyonlarında Salmonella typhimurium TA98,100,1535,1537,1538 suşlarında Ames testinde, 2000 µg/ml ye kadar CHO/HGPRT gen mutasyon testinde mutajenik değildir. İnsan lenfositlerinde 50, 100, 200 µg/ml DPX 66037-59 aktivasyonsuz şartlarda, 100,200,400 µg/ml aktivasyonlu şartlarda denenmiş ve klastojenik olmadığı saptanmıştır. Sonuçlar güvenilir bulunmadığından dolayı bu test değerlendirilmeye alınmamıştır. Ayrıca insan lenfositleri sitogenetik testi ile 0.5, 1.5, 1.7, 1.85, 2.00 mg/ml DPX 66037-59 konsantrasyonları aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda denenmiş ve 1.85 mg/ml konsantrasyonda kontrolden daha düşük MI oranı tespit edilerek sitotoksik etki gözlenmiştir. Triflusulfuron methyl in metabolik aktivasyon ile 2 mg/ml de klastojenik olduğu tespit edilmiştir (PMRA, 1999). Metsulfuron methyl (triazinylsulfonylurea) Ames testi, memeli gen mutasyon (CHO/HGPRT) testi, UDS, in vivo kemik iliği sitogenetik testleri, in vivo fare MN testi negatif sonuç vermiştir. Methsulfuron methyl sadece 1000 mg/l den yüksek konsantrasyonlarda CHO hücrelerinde in vitro KA larını indüklemiştir fakat in vivo sıçan kemik iliğinde KA larını indüklememiştir. Fare kemik iliği eritrositlerinde MN oluşumunu indüklememiştir. Metsulfuron methyl ne genotoksik ne de mutajeniktir (EPA, 1998b).

21 Donovan ın 1984 yılında yaptığı çalışmaya göre, Salmonella typhimurium da in vitro Ames mutajenite testinde 0-10 µg/ml konsantrasyonlarında; Fitzpatrick in 1982 de yaptığı çalışmaya göre, CHO hücrelerinde CHO/HPRT mutajenite testinde 0-2670 mg/l konsantrasyonlarında; Vincent in 1983 teki araştırmasına göre, sıçan primer hepatositlerinde UDS testinde 0-38 mg/l konsantrasyonlarında, Bentley in 1990 yılında yaptığı araştırmaya göre sıçan primer hepatositlerinde UDS testinde 0-3000 µg/ml konsantrasyonlarında; Cortina nın 1983 teki araştırma sonuçlarına göre, sıçan kemik iliğinde in vivo KA indüksiyonu testinde 0-5000 mg/kg konsantrasyonlarında; Vlachos un 1984 yılında yaptığı çalışmaya göre, fare kemik iliğinde MN indüksiyonu testinde 0-5000 mg/kg konsantrasyonlarında negatif sonuç göstermiştir (DAR, 2004). Ancak Vlachos un 1983 te 0-3000 mg/l Metsulfuron methyl konsantrasyonlarını CHO hücrelerinde denediği çalışmada KA testinde 1 mg/ml nin üzerindeki konsantrasyonlarda metsulfuron methyl in pozitif etki gösterdiğini saptamıştır (DAR, 2004). Chlorsulfuron (triazinylsulfonylurea) Chlorsulfuron in vitro mutajenitesinin çalışıldığı Ames ve CHO/HPRT testlerinde, in vitro sitogenetik testinde, in vitro DNA onarım testinde, in vitro UDS testinde negatif sonuç vererek genotoksik ve mutajenik etki göstermemiştir (EPA, 2002). Ethametsulfuron methyl (triazinylsulfonylurea) Mutajenik ve genotoksik etkilerini gözlemek amacı ile yapılan testler sonucunda ethamethsulfuron methyl genotoksik ve mutajenik değildir. Bu testler; bakterilerde Ames, CHO hücrelerinde mutajenite testleri, sıçanlarda izole edilen kemik iliği hücrelerinde KA testi, fare kemik iliğinde MN testi ve kültüre edilen sıçan karaciğer hücrelerinde DNA hasarı ölçüm testidir (EPA, 1997a). Sulfosulfuron (pyrimidinylsulfonylurea) In vitro Ames /Salmonella mutajenite testinde EPA (1997b) kullanılan 5 temel suşta negatif mutajenite olduğunu bildirmiş, Pest management Regulatory Agency metabolik aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda 1500 µg/petri dozlarında

22 sulfosulfuron un sitotoksik olduğunu, toksik olmayan dozlarda sulfosulfuron un mutajenik etki göstermediğini bildirmiştir (PMRA, 1998). Sulfosulfuron nokta mutasyonları için mutajenik değildir (PMRA, 1998). In vitro memeli hücresi gen mutasyon testinde CHO/HGPRT negatif sonuç vermiştir (PMRA 1998, EPA 1997b). Sulfosulfuron un mutajenik olmadığı, nokta mutasyonlarına, çerçeve kayması mutasyonlarına ve delesyonlara neden olmadığı bildirilmiştir (PMRA, 1998). In vitro sitogenetik testinde kültüre edilen insan lenfositlerinde hem metabolik aktivasyonlu hem de aktivasyonsuz şartlarda, 100, 250, 500, 750, 1000 µg/ml konsantrasyonlarda etkisi incelenmiştir. Mitotik indekste %14,9 dan %66,7 ye kadar bir azalma gözlenmiştir. Bununla beraber KA lu hücre sayısında veya poliploid hücre sayısında artış gözlenmemiştir. Elde edilen sonuçlara göre sulfosulfuron metabolik aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda insan lenfosit kültüründe klastojenik değildir (PMRA 1998, EPA 1997b ). Çin hamster fibroblastlarında in vitro metodunda 2000 µg/ml ve daha yüksek dozlarda, metabolik aktivasyonsuz şartlarda, kromozom yapı aberasyonlu hücre sayısında artış gözlenmiştir. Bu şartlarda klastojenik olduğu bildirilmiştir (PMRA, 1998). In vivo memeli MN testinde farelerde klastojenik olmadığı bildirilmiştir (PMRA 1998, EPA 1997b). EEC (2000), Çin hamsterlerinde in vitro şartlarda uygulanan konsantrasyonların, in vivo şartlarda sitotoksik etkisinden dolayı uygulanamayacağını, dolayısı ile in vitro ve in vivo grupların karşılaştırılmayacağını bildirmiştir. In vitro CHO/HGPRT gen mutasyon testinde, kültüre edilen memeli hücrelerinde KA testinde, insan lenfositlerinde in vitro KA testinde, farede in vivo kemik iliği MN testinde negatif sonuçlar elde edildiğinden dolayı sulfosulfuron genotoksik veya mutajenik etki göstermemektedir (EPA, 1997b). Sulfosulfuron un akut toksisitesi düşük olduğu için genotoksik olmadığı, üreme, gelişim ve sinir sisteminde toksik olmadığından dolayı insan sağlığını tehdit etmediği kabul edilmektedir (Healy vd. 2004). Rimsulfuron DPX-E9636 (piridisulfonylurea) Piridilsulfonylurea herbisidi olan Rimsulfuron un ticari formülasyonu DPX- E9636 in in vitro sığır lenfosit kültüründe aberasyon sayısında ve aberasyonlu hücre yüzdesinde anlamlı artışa neden olduğu ve KKD leri doza bağlı olarak anlamlı

23 indüklediği ve bu herbisidin in vitro sığır lenfosit kültüründe genotoksik olduğu bildirilmiştir (Lioi vd. 1998a). DPX-E9636 nın insan lenfosit kültüründe yapılan çalışmasında da benzer sonuçlar elde edilmiştir. Bu kimyasalın doza bağlı olarak aberasyonlu hücre yüzdesini ve hücre başına düşen KKD sayısını arttırdığı bildirilmiş mitotik indeksi düşürdüğü tespit edilmiştir (Lioi vd. 1998b). Sulfometuron methyl (pyrimidinylsulfonylurea) DuPont (1979) (1981a) (1981b) Sulfonylurea methyl in Salmonella da ve CHO hücrelerinde mutajenik olmadığını, DuPont (1984) ve (1987) sıçan ve farede kanserojenik etki gözlenmediğini bildirmiştir. DuPont a göre Sulfometuron methyl in kanserojenik etkisi yoktur ve genetik hasar oluşturmaz (Cox, 1993). Primisulfuron methyl (pyrimidinylsulfonylurea) Primisulfuron methyl Ames mutajenite testinde Salmonella TA98 suşunda 1024 µg/petri konsantrasyonuna kadar metabolik aktivasyonlu ve aktivasyonsuz şartlarda pozitif etki göstermemiştir. Çin hamsterlerinde 5000 mg/kg a kadar MN oluşumunu indüklemediği ve toksik olmadığı gözlenmiştir. Sıçan karaciğer hücreleri (hepatositler) UDS testi 400 µg/ml ye kadar negatif, insan lenfositleri ile UDS 1000 µg/ml ye kadar aktivasyonsuz şartlarda negatif sonuç vermiştir (EPA, 1990). Tebuthiuron (thiadiazolylurea) Tebuthiuron un Ames mutajenite testinde, fare MN analizi yapılarak yapısal KA testinde negatif sonuç gösterdiği, mutajenik ve kanserojenik olmadığı bildirilmiştir (EXTOXNET, 1996a) Diazolidinyl urea (imidazolidinylurea) Dimethylol urea teskstil endüstrisinde katkı maddesi olarak, diazolidinylurea (DZU) ise kozmetik alanında kullanılan urea bileşikleridir. DZU nın Salmonella typhimurium mutajenite testinde mutajenik olmadığı (Liebert, 1990), fare kemik iliği in vivo MN testinde MN oranında artışa neden olmadığı görülmüştür. Ancak daha sonra Pfuhler ve Wolf (2002) DZU ve DMU nun Salmonella typhimurium mutajenite testinde

24 TA98, 100, 102 suşlarında pozitif sonuç gösterdiğini saptamışlardır. Aynı araştırıcılar in vitro MN testinde de V79 Çin hamster hücrelerinde MN oluşumunu indükleyerek genotoksik etki gösterdiklerini bildirmişlerdir. Fluometuron (phenylurea) Weed Science Society of America 1994 te, fluometuron un, Ames mutajenite testi, KA ları için hücre kültürü testi, insan fibroblast hücreleri ve sıçan karaciğer hücrelerinde DNA onarım inhibisyon testleri gibi mutajenite ve genotoksisite testlerinde aktivite göstermediğini bildirmiştir (EXTOXNET, 1996b). EPA nın 1988 de Fluometuron ile yaptığı bir çalışmaya göre; fareye verilen 2000 mg/kg lık yüksek doz sonrası DNA sentezi ile etkileşim gözlendiğini saptamıştır (EXTOXNET, 1996b). Bu çalışmalara dayanarak Fluometuron un mutajenik olmadığı görülmektedir. Weed Science Society of America 1994 te Fluometuron un kanserojenik etkisini araştırmak amacı ile 2 yıl boyunca farelere 87 mg/kg/gün verilen çalışma sonucunda; karaciğer tümörü, lösemi, beyaz kan hücresi sayısında kontrolsüz büyüme gözlenmiştir (EXTOXNET, 1996b). Diğer bir çalışmada, National library of medicine ın 1995 te ve EPA nın 1988 deki bildirilerine göre; erkek farede karaciğer hücre tümörü sıklığında artış gözlenmiş, fakat dişi fare ve sıçanlarda her iki eşeyde de kanserojenik etki gözlenmemiştir (EXTOXNET, 1996b). Seiler 1978 de fare kemik iliğinde yaptığı çalışmada, fluometuron un MN oluşumuna neden olduğunu göstermiştir (Behera ve Bhunya, 1990). Isoproturon (phenylurea) Isoproturon un genotoksik etkilerinin in vivo KA, MN ve sperm şekli anormallikleri test yöntemleri ile araştırıldığı çalışmada bu herbisidin KA ve sperm şekli anormallikleri testlerinde doza bağlı olarak pozitif sonuç verdiği, MN testinde yüksek dozda (200 mg/kg) etkili olduğu saptanmış ve sonuçta memeli in vivo test sisteminde isoproturon un genotoksik özelliği olduğu bildirilmiştir (Behera ve Bhunya, 1990). CHOK1 hücrelerinde SCGE testinde DNA hasarı oluşturmadığı ve anlamlı KA larına neden olmadığı bildirilmiştir (Vigreux vd. 1998).

25 Isoproturon un bitkiler üzerindeki sitogenetik etkileri araştırıldığında; Badr ve Elkington (1982) Isoproturon un Allium cepa ve Hordeum vulgare de mitotik aktiviteyi düşürdüğünü, iğ ipliği aygıtında bozulmaya sebep olduğunu, C-metafaz, kromozom sayısının ikiye katlanması, kalgın kromozomlar, multipolar anafaz ve telofaz oluşumunu arttırdığını, bu sonuçlara göre bitki test sisteminde sitotoksik ve klastojenik olduğunu, Chauhan vd. (2001) Isoproturon un farklı konsantrasyonlarının (35-280 ppm) Allium sativum kök meristem hücrelerinde MI i doza bağlı anlamlı olarak inhibe ettiğini, kromozom kırıkları/mitotik aberasyonlara neden olduğunu, Isoproturon un genotoksik olduğunu, Chauhan ve Gupta (2005) Isoproturon un Deltamethrin (insektisid) ile kombine kullanımının Allium cepa kök meristem hücrelerinde kromozom kırıkları, yapışıklık, multipolar anafaz, kromozom köprüleri, kalgın kromozomlar, kromozomların dengesiz ayrılması, iki ve çok nukleuslu hücrelere neden olduğunu, kombine muamelelerin organellerde ultrastrukturel değişimlere neden olduğunu ve bitki hücrelerinde geri dönüşümsüz hasarlar meydana getirdiğini bildirmişlerdir. Diuron (phenylurea) Diuron Allium cepa kök ucu hücrelerinde hücre bölünmesini doza bağlı olarak inhibe etmiş ve kromozom kırıkları, C-metafaz, kromozom yapışıklığı, kalgın kromozomlar, multipolar düzensizlikler, anafaz köprüleri gibi çeşitli mitotik anormalliklere ve kök uçlarında morfolojik değişikliklere neden olmuştur (Chauhan vd. 1998). Daha sonra Saxena vd. (2004), Diuron un Allium sativum kök ucu hücrelerinde sitogenetik etkilerini araştırmak üzere yaptıkları çalışmada, mitotik anormallikler ve KA larında doza bağlı anlamlı artışın olduğunu ve Diuron ile DNA molekülü arasında muhtemel bir etkileşim olduğunu ileri sürmüşlerdir. Diuron un insan spermatozoa hücreleri üzerinde etkisini görmek için yapılan bir başka çalışmada bu urea herbisidinin spermatozoa üzerinde yapısal ve fonksiyonel etkileri olduğu, spermatozaların canlılık ve hareket kabiliyetini azalttığı bildirilmiştir (Malpuech-Brugere vd. 2001). Diuron un fare kemik iliğinde MN oluşumuna neden olduğu (Agrawal vd. 1996), Swiss albino farelerde dominant letal test sisteminde mutajenik olduğu (Agrawal ve Mehrotra, 1997), sıçanlarda maternal toksisiteyi ve anormal fetus sıklığını arttırdığı gösterilmiştir (Khera vd. 1979).

26 Fenilurea herbisitlerinin sıçanlarda hematoksik etkilerinin araştırıldığı çalışmada Monuron, Diuron ve Fenuron ile dişi fareler muamele edilmiş; monuron ve diuron muameleli sıçanlarda dalak ağırlığında doza bağlı artış dışında, organ ağırlıklarında doza bağlı etkinin görülmediği, eritrosit morfolojisinde değişiklikler meydana geldiği, histolojik açıdan lezyonlar oluştuğu ve hemolitik anemi ve methemoglobinomeni ye bağlı olarak dalakta pigmentasyon artışı görüldüğü, dolayısı ile dalakta toksik olduğu bildirilmiştir (Wang vd. 1993). Diuron un albino sıçanlarda kronik muamelesi sonucu yüksek oranda mortalite ve ağırlık kaybına sebebiyet vererek sıçan karaciğerinde anlamlı histolojik değişikliklere neden olduğu hepatotoksik etkisi olduğu gözlenmiştir (Agrawal ve Kumar, 1999). Linuron (phenylurea) EPA 1988 de akut memeli toksisite çalışmalarında Linuron un düşük aktivite gösterdiğini ve CHO hücrelerinde ve Salmonella typhimurium da gen mutasyon testi, UDS testi ve in vivo sıçan kemik iliği gibi birçok in vitro ve in vivo yöntemde genotoksisite göstermediğini bildirmiştir (Papapaulou vd. 2001). Sıçanlarda in vivo kemik iliği kromozom çalışmasında, aberasyon frekansında artış gözlenmemiş, in vitro sıçan hepatositlerinde UDS negatif sonuç vermiştir (DPR, 1987). Atrazine ve Linuron herbisitlerinin ayrı ayrı ve kombine şekilde insan lenfositlerinde test edildiği çalışmada, bu kimyasalların ayrı ayrı verilen dozlarda çok az kromozom hasarına neden olduğu, kombine verilen dozlarda anlamlı kromozom hasarını indüklediği saptanmıştır. Aynı çalışmada faredeki etkilerini gözlemek üzere aynı şekilde verilen kimyasallar kemik iliği hücrelerinde tüm gruplarda kromozom hasarını indüklemediklerini fakat kültüre edilen dalak hücrelerinde tüm gruplarda hasar gözlendiğini bildirmişlerdir (Roloff vd. 1992). Scassellati-Sforzolini vd. (1997) in vivo şartlarda linuron un saf bileşik ve ticari formülasyonunun genotoksisitesini araştırdıkları çalışmalarında mikronukleuslu polikromatik eritrosit sayısında artış olmadığını, bununla beraber linuron un hepotosit canlılığını etkilediğini bildirmişlerdir. Bu sitotoksisitenin karaciğerde DNA tek iplik kırıklarına neden olduğunu ileri sürmüşlerdir. Sıçan testis hücrelerinde sitotoksik olduğunu göstermişlerdir (Scassellati-Sforzolini vd. 1997).