Dr.Hüseyin TUTKAK Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İmmünoloji ve Allerji Hastalıkları BD
GENETİK YATKINLIK NORMAL İMMÜNİTE BENİGN OTOİMMÜNİTE PATOJENİK OTOİMMÜNİTE HASTALIK ÇEVRESEL FAKTÖRLER 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 2
Doğal IgG, IgM, IgA Polireaktif Düşük affinite Düşük titre Eşey hücre öncülleri (germ line) kaynaklı Patojenik Başlıca IgG Sınırlı reaktivite Yüksek affinite Yüksek titre Somatik mutasyon 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 3
ANTİKOR TİTRESİ ve AVİDİTE KLİNİK ÖNEM EŞİK DEĞERİ 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 4
ANTİKOR TİTRESİ ve AVİDİTE KLİNİK ÖNEM EŞİK DEĞERİ 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 5
ANTİKOR TİTRESİ ve AVİDİTE KLİNİK ÖNEM EŞİK DEĞERİ 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 6
29.11.2012 Dr.H.Tutkak 7
29.11.2012 Dr.H.Tutkak 8
İndirekt immünfloresans test Primat (fare, sıçan, maymun) karaciğer, böbrek, mide dokuları) substrat Hep-2 cell (epitelyal kültür hücreleri, insan larenks karsinoma hücreleri, Amerikan doku kolleksiyonu CCL-23) Hep 20-10 cell Hep 2000 cell Hücre fiksasyonu? (etanol, aseton) 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 9
615 protein 29 protein 23 protein 271 protein 136 protein 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 10
29.11.2012 Dr.H.Tutkak 11
Image contributed by F. Britz, C. Lohr, J. Schmidt and J.W. Deitmer, University of Kaiserslautern, Germany. 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 12
Otoimmün Hastalık Otoantikorun oluştuğu yapı HÜCRE YÜZEYİNE BAĞLANMA ve Otoimmün hemolitik anemi, SLE Eritrosit Sonuçları LİZİS Eritrositlerin lizisi ve yıkımı, anemi Trombositopenik purpura Trombosit Trombositlerin lizisi ve yıkımı, morartı ve kanama Miyastenia Gravis HÜCRE YÜZEY RESEPTÖRLERİYLE ETKİLEŞİM Asetil kolin reseptörü Kolinerjik reseptörün bloke edilmesi, kas zayıflığı Pemphigus vulgaris Desmoglein 3 Epidermis hücreleri arasındaki bağlantının ayrışması, deride su dolu kabarcık, kızarıklık Graves hastalığı TSH Tiroid hormon sekresyonunun stimülasyonu, hipertiroidizm Pernisiyöz anemi İntrinsik faktör B12 vitamin absorbsiyonunun bloke edilmesi, anemi 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 13
Otoimmün Hastalık Otoantikorun oluştuğu yapı İMMÜN KOMPLEKS ARACILIKLI Miks esansiyel kryoglobulinemi IgG kompleksleri Sonuçları HASAR Dolaşan immün komplekslerin damar ve glomerüllerde depolanması, sistemik vaskülit, glomerülonefrit Romatoid artrit Romatoid faktör IgG kompleksleri İmmün komplekslerin eklemlerde presipitasyonu, artrit OTOANTİKORLARIN PLASENTAYA GEÇMESİ Neonatal lupus SSA (60, 52), SSB Konjenital kardiak blok ve/veya fotosensitif kızarıklık Miyastenia Gravis Asetil kolin reseptörü Kolinerjik reseptörün bloke edilmesi, kas zayıflığı Pemphigus vulgaris Desmoglein 3 Epidermis hücreleri arasındaki bağlantının ayrışması, deride su dolu kabarcık, kızarıklık Graves hastalığı TSH Tiroid hormon sekresyonunun stimülasyonu, hipertiroidizm 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 14
Hasta pozitif test TANI 100 50 0-5 0 5 YILLAR 29.11.2012 Dr.H.Tutkak ANA Anti-Ro (SSA) Anti-La (SSB) APL ds DNA Sm Anti-RNP 15
Hasta pozitif test SLE ilk bulguları 100 50 ANA Anti-Ro (SSA) Anti-La (SSB) APL ds DNA Sm Anti-RNP 0-5 0 5 YILLAR 16 Dr.H.Tutkak 29.11.2012
29.11.2012 Dr.H.Tutkak 17
Hastalık ANA pozitiflik oranı % TANI İÇİN ANA TESTİNİN ÇOK YARARLI OLDUĞU HASTALIKLAR SLE 95-100 Sistemik sikleroz (sikleroderma) 60-80 TANI İÇİN ANA TESTİNİN BAZEN YARARLI OLDUĞU DURUMLAR Sjögren sendromu 40-70 Dermotomiyozit/Polimiyozit 30-80 HASTALIĞIN TAKİBİ VE PROGNOZUNDA ANA TESTİNİN YARARLI OLDUĞU DURUMLAR Üveyitle birlikte olan juvenil kronik oligoartiküler artrit 20-50 Raynaud fenomeni 20-60 POZİTİF ANA TEST SONUCUNUN TANI KRİTERLERİNDEN BİRİ OLDUĞU DURUMLAR İlaça bağlı SLE ~100 Otoimmün karaciğer hastalığı ~100 Yumuşak bağ dokusu hastalığı ~100 18 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 18
Hastalık ANA pozitiflik oranı % TANI İÇİN ANA TESTİNİN YARARLI OLMADIĞI HASTALIKLAR Romatoid Artrit 30-50 Mültiple sikleroz 25 İdyopatik trombositopenik purpura 10-30 Tiroid hastalıkları 30-50 Diskoid lupus 5-25 İnfeksiyon hastalıkları Maligniteler Değişken Değişken Silikon meme implantlı hastalar 15-25 Fibromiyalji 15-25 Sağlıklı insanlar ANA titresi 1:40 20-30 1:80 10-12 1:160 5 1:320 3 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 19
ANA (IFA) BOYANMA HASTALIK Homojen /Diffüz SLE, ilaça bağlı lupus, sistemik sikleroz, neonatal lupus sendromu Periferal/rim Benekli Nükleolar Sentromer SLE, anti fosfolipid sendromu, otoimmün hepatit SLE, sistemik sikleroz, Sjögren sendromu, MCTD, neonatal lupus Diffüz kutenöz sistemik sikleroz, SLE, Polimiyozit, Raynoud fen. Raynoud fen., Lim. kutenöz sistemik sikleroz PCNA SLE PCNA Sitoplazmik PM, DM, SLE, Sjögren, Primer biliyer siroz, Sistemik sikleroz HEDEF ORGANEL VEYA ANTİJEN dsdna, kromatin, histon, Nükleer zar (Laminler) Sm, RNP, SSA, SSB, PCNA, RNA polimeraz II, III, U1 RNP, Topo1, Ku, Mi-2 PM/Scl(75-100), Fibrillarin (U3 RNP), RNA polimeraz, NOR 90 CENP-A, B, C Organeller; ribozom, mitokondri, lisosom, golgi, GW cisimleri, Jo- 1, trna sentetaz, PL-7, PL-12, Rib. P proteinleri, Po, P1, P2, SRP 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 20
Colglazier, CL et al. Southern Medical Journal.2005 Antigen Condition Sensitivity Specificity + LR - LR Anti-dsDNA Ab SLE 57% 97% 16.3 0.49 Anti-Sm Ab SLE 25-30% high * * Anti-Ro/SSA Ab Anti-La/SSB Ab Sjogren s, SCLE Sjogren s, SCLE 8-70% 87% * * 16-40% 94% * * Scl-70 Scleroderma 20% 100% >25 0.8 Anticentromer CREST 65% 99.9% 650 0.4 Anti-U-3 RNP Scleroderma 12% 96% 3 0.92 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 21
dsdna RNP SM SS-A SS-B CENTROMERE SLE 60% 30% 30% 30% 15% Rare RA (-) (-) (-) Rare Rare (-) MCTD (-) >95% (-) Rare Rare Rare Scleroderma (-) Low titer (-) Rare Rare 10-15% CREST (-) (-) (-) (-) (-) 60-90% Sjogren s (-) Rare (-) 70% 60% (-) Hobbs, K. in West, S Rheumatology Secrets. 2002. 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 22
SLE veya diğer bağ dokusu hastalıklarını dışlamaz! SSA/Ro, Jo-1 veya Scl-70, Hep-2 hücre substratında negatif olabilir! Pozitif sitoplazmik patternlerden sıklıkla ANA NEGATİF olarak bahsedilir! 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 23
Homojen Benekli Nükleolar Sentromer 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 24
NÜKLEUS Homojen Periferal Homojen Benek Metafaz kromatini POZİTİF Metafaz kromatini POZİTİF Metafaz kromatini NEGATİF Metafaz kromatini NEGATİF Metafaz kromatini POZİTİF ds DNA, ssdna, Histon, Nükleozom ds DNA, ssdna, Histon, Nükleozom Nükleer membran proteini (laminler) laminler (A,B1,B2,C), gp210 nrnp, Sm, SS-A, SS-B, Ku, Cyclin I,II DFS-70 LEDGF 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 25
RC nükleusu kuvvetli boyanmış DC kromatini kuvvetli pozitif Hep-2, 40x Objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 26
Hep-2 Karaciğer Böbrek Mide 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 27
Rim, Peripheral (Lineer) + Homojen DC kromatini kuvvetli pozitif RC nükleusunda periferde artan yoğunlukta boyanma Hep-2, 40x Objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 28
1 ANA HOMOJEN LİNEER 2 ds-dna (Crithidia luciliae) POZİTİF 1 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 29 2
Homojen zeminde benekli boyanma Bölünen hücre kromatininde yoğun homojen boyanma Hep-2, 40x Objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 30
Miks patternleri daha kolay tanımlayabilmek için; 1. Örneğin ileri dilüsyonlarda tekrar çalışılması 2. Daha ileri büyütme ile inceleme (örn. 100x) 3. Diğer yöntemler Hep-2, 40x Objektif Hep-2, 100x Objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 31
DC kromatini NEGATİF RC nükleusu uniform boyanmış ve homojene benzeyen bir görüntü Hep-2, 40x Objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 32
Homojen DC kromatini POZİTİF Nükleer Membran DC kromatini NEGATİF 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 33
7855 ANA (IFA testi) (4 ay, %87,5 K, %12,5 E) ANA pozitif (%15,7) Dense fine speckled (DFS-70, 75 kda), LEDGF (lens epitelyum growth faktör) Benek (%33,2), Homojen (%21,3), Nükleolar (%10,5), DFS-70 (%5,8), Sentromer (%3,8), Stoplazmik (%2,6) Nükleer lamin (%1,8).. 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 35
Kromatinler belirgin benekli tarzda boyanır 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 36
TÜRKIYE CUMHURIYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SİSTEMİK OTOİMMÜN HASTALIKLARDA VE SAĞLIKLI BİREYLERDE DFS-70 OTOANTİKORU DUYGU KAYASÜ Danışman Prof.Dr.Hüseyin TUTKAK 2010-ANKARA Toplam 536 kontrol (264 K, 272 E) DFS-70 pozitifliği %1.9 (kadın %2.3, erkek%1.8) 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 37
NÜKLEUS Benek Büyük benek (nükleer matriks) Kaba benek İnce benek Yoğun ince benekli DFS-70 Çok biçimli benekli (PCNA) Metafaz kromatini NEGATİF Metafaz kromatini NEGATİF Metafaz kromatini NEGATİF Metafaz kromatini POZİTİF Metafaz kromatini NEGATİF hnrnp-a1,a2,b2 hnrnp-c1,c2 ve I Sm, U1snRNP SSA (Ro), SSB (La), RNA polimeraz II ve III, Ku, Ki ve Mi-2 LEDGF Proliferating Cell Nuclear Antigen Mitoza hazırlanan hücrelerde (1/3) %30-60 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 38
Çoğu benekli boyanmada DC kromatini boyanmaz. Ancak az sayıda örnekte RC de benekli boyanma ile birlikte DC kromatin bölgeleri zayıf boyanabilir. DC kromatini RC nükleusuna benzer şekilde boyanmış ama stoplazmadan kesin hatlarla ayrılmamış Hep-2, 40x Objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 39
Benekli patternde birçok farklı antikor nükleusun değişik büyüklükte benekli boyanmasına neden olur. Hep-2, 40x Objektif Benekli boyama kaba, ince ve görülemeyecek kadar çok ince olabilir. 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 40
İnce benekli boyanma nerdeyse homojen gibi görünüyor. Hücre bölünmesinden sonra kardeş hücre nükleusları mitotik hücre kromatinine benzer. Bu boyamalar kromatin POZİTİF olarak düşünülmemelidir. DC kromatini negatif. Bu özellik homojen değil ince benekli olduğunu gösteriyor. Hep-2, 40x Objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 41
29.11.2012 Dr.H.Tutkak 42
Otoantikor : DNA polimeraz delta oksileri protein PCNA hücre siklus bağımlıdır. Antikor sadece mitoza hazırlanan hücrelerde (hücrelerin yaklaşık 1/3-1/2) görülür. Diğer hücreler negatifdir. Pozitif RC de boyanmalar kabadan ince benekliye değişken. DC kromatini NEGATİF 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 43
NÜKLEUS Noktalı Metafaz kromatini POZİTİF Metafaz kromatini NEGATİF Sentromer (40-60) CENP-B,A,C,D) Nükleer noktalı ort. 10 nokta, en fazla 20 Sp100, promyelocytic leukemia proteini (PML) ve NDP53 Az nükleer noktalı (2-3) ortalama 6 p80 -coilin 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 44
CENP- B,A,C,D 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 45
Marvin J. Fritzler et all. Faculty of Medicine, University of Calgary, Calgary, Alberta, Canada Autoimmunity Reviews, Accepted 29 September 2010
Sentromer Kromatin benekli boyanmış Benekli Kromatin negatif Hep-2, 40x Benekli ve sentromer patternleri birbirine benzer Bölünen hücre kromatini sentromer patterninde benekli boyanırken benekli patterninde kromatinde boyanma gözlenmez. Hep-2, 40x 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 47
NN? / Sentromer? 4-15 nokta (MND) Bölünen hücre kromatini negatif! Bu örnekte zayıf ince granüler (fine speckled) boyanma da var Hep-2, 40x Objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 48
Sp100, promyelocytic leukemia proteini (PML) ve NDP53 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 49
1-4 nokta Bu örnekte zayıf ince benekli (fine speckled) boyanma da var Bölünen hücre kromatini negatif Hep-2, 40x Objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 50
p80 -coilin 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 51
NÜKLEUS Nükleolar Metafaz kromatini negatif, pozitif veya az sayıda benekli boyanma Nükleolar homojen PM- Scl, Th/To Nükleolar benekli RNA polimeraz I (RNAP I) Nükleolar küme Küçük nükleolar ribonükleoproteinin 34 kda luk protein alt ünitesi (snornp) 29.11.2012 Dr.H.Tutkak
Benekli tarzda nükleolar boyanma x100 objektifte daha kolay görülebilir DC kromatin bölgesinde kısmen daha zayıf boyanmış ve az sayıda daha parlak benek farkedilebiliyor Hep-2, x100 objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 53
Nükleolar boyanma şekli HOMOJEN Zayıf ince granüler boyanma da var DC kromatini NEGATİF 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 54
Az sayıda daha küçük noktalarda boyanabilir DC kromatini pozitif olabilir RC de sıklıkla büyüklüğü ve şekli değişken bu nükleolar boyanma CLUMPY (küme) olarak bilinir Hep-2, x40 objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 55
RC de benekli nükleolar boyanma RC nükleusu aynı zamanda İNCE BENEKLİ boyanmış DC kromatini zayıf pozitif Hep-2, x40 objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 56
DAPI FITC Alexa 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 57
İnterfaz nükleus; ince benekli (zayıf ve değişken) Nükleolus Stoplazma; perinükleer alandan sitoplazma membranına doğru zayıf boyanma Mitotik hücrelerdeki kromozomlar; yoğun boyanma gösterirler, metafaz kromozomları; yoğun boyanma Kromozomlarda NOR (Nucleolar Organizing Region) domenlerinde farkedilebilir benek 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 58
NÜKLEUS Sentriol Midbody Spindle (İğcik şekilli fibril) NuMA-1 CENP-F /p330d Heat shock protein glycolytic spesifik enolas (48 kda, gg isoform), PCM-1 (228 kda), Pericentrin (220 kda) MSA-2 antikorları Nuclear Mitotic Apparatus, MSA-1 Mitotic Spindle Apparatus antikorları centrophilin, 240 kda İstirahat halindeki hücrelerde değişik yoğunlukta ince benekli, metafazda kromatinler benekli, telefazda kromatinler boyanmaz 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 59
RC nükleusu ince benekli Spindle poles boyanmış Hücre bölünmesinden sonra oluşan kardeş hücrelerin nükleus periferinde boyanma Hep-2, 40x Objektif DC kromatini NEGATİF 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 60
DC telefazda zayıf midbody boyanmış, yoğun stoplazmik boyanma, kromatin NEGATİF DC metafazda kromatinler benekli boyanmış RC ince benekli değişik yoğunluklarda boyanmış Bu pattern hücre siklusuna bağlı olup sadece bazı hücrelerde görülür. 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 61
Sentriol + ince benekli boyanma İnterfazdaki hücrelerde, stoplazmada 1-2 nokta boyanır Zayıf ince benekli boyanma Hep-2, 40x Objektif Bölünen hücrede sentriol boyanması (Spindle poles nokta şeklinde) 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 62
SİTOPLAZMA ince benek büyük benek kaba benek, ipliksi (AMA) Aminoaçil t RNA senetazlar Jo-1, PL7, PL12 Lisosom, endosom organeller AMA-M2 homojen Ribozomal P fosfoproteinleri, Po,P1, P2 golgi golgin-67, golgin-95 (GM130), golgin 97, golgin-160, golgin-245(p230) ve macrogolgin/ giantin sitosikeleton AKTİN VINCULIN 29.11.2012 Dr.H.Tutkak
Mitokondriye karşı antikorlar Hep-2 hücre stoplazmasında boyanmaya neden olur Bölünen hücre kromatini NEGATİF ancak yoğun stoplazmik boyanma gözlenir 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 64
Stoplazmada birçok farklı türde cytoskeletal fibers vardır. Bunlar 3 grup halinde sınıflandırılabilir; mikrotübüller, intermediate filamentler ve mikrofilamentler. Mikrotübüllere karşı antikorlar (resim 1) İntermediate filamentlere karşı antikorlar (resim 2) Mikrofilamentlere karşı antikorlar (resim 3 ve 4) 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 65
golgin-67, golgin-95 (GM130), golgin 97, golgin-160, golgin- 245(p230) ve macrogolgin/ giantin 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 66
Stoplazmada düzensiz dağılmış ve değişen büyüklükte benekli boyanmalar. Bu şekilde boyanma lisosoma karşı veya diğer stoplazmik veziküllere karşı antikorlar bulunduğunda gözlenir. Hep-2, 40x Objektif Veziküller membran etrafındaki küçük stoplazmik organellerdir. Lisosomlar, endosomlar ve peroksisomlar gibi birçok farklı tipte veziküller vardır. 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 67
29.11.2012 Dr.H.Tutkak 68
29.11.2012 Dr.H.Tutkak 69
Golgi Kompleksi Golgin-67, -97, 95/gm130, golgin-160, 245, giantin Endosomes Early endosome antijen 1 (EEA1), sitoplazmik linker protein (CLIP170),Lisobifosfatidik asit (LBPA), GRASP-1 GW cisimleri GW proteinleri (GW182, GW2, GW3), hago2, Ge-1/Hedis, RAP55/LSm15, LSm4 Sentrosom Pericentrin, PCM-1, ninein, mob-1 Proteasome A-3HC-9, Ki-p28g Asemblyosome-SMN kompleksi Sm, RNA helicase (Gu), fibrillarin, p80 coilin İntrasellüler exosome PM/Scl-75, -100, hcs14, hrrp4, 40,41,42 Ekstrasellüler exosomes 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 70
Farklı nadir stoplazmik antikorlar Nükleus DAPI ile maviye boyanmış A. Endosom/lysosome antijenlerine karşı antikorlar B. GW182 ve GW ye karşı antikorlar (glisin, triptofan) (Sjögren, Nörolojik hast. SLE) C. CLIP-170 e (endosom antijeni) karşı antikorlar (SLE) D. Early endosom antijen 1 e karşı antikorlar (Nörolojik hastalıklar) E. Golgin 160 a karşı antikorlar (Sjögren, SLE) F. Centrosomdaki pericentrine karşı antikorlar 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 71
29.11.2012 Dr.H.Tutkak 72
p ANCA c ANCA Etanol fikse nötrofil Etanol fikse nötrofil Maymun karaciğer doku kesiti Maymun karaciğer doku kesiti 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 73
Mitokondrial antikorlar Mide parietel hücreleri Mide dokusu (mouse) Renal tübül hücreleri Böbrek (mouse) MSK, 40x Objektif 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 74
Böbrek Hep-2 Karaciğer Mide Hep-2 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 75
ASMA AMA LKM Sıçan mide k. Sıçan böbrek k. Sıçan böbrek k RETİKÜLİN APCA EMA Sıçan mide k. Maymun mide k. Maymun karaciğer k. 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 76
Anti skin ab Adacık hücre ab GBM Maymun özfagus k. Maymun pankreas k. Maymun böbrek k. 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 77
29.11.2012 Dr.H.Tutkak 78
ANKARA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ 16 mart 2011 İbn-i Sina Hastanesi Merkez Laboratuvarları
16 mart 2011 ANKARA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ
ANKARA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ İBN-İ SİNA HASTANESİ Semahat Akbay TEŞEKKÜR Dilek Aslan Mustafa Özdemir Füsun Alpan Berat Şahinbaş İmmünoloji Laboratuvarı 29.11.2012 Dr.H.Tutkak 81