Kullanım Kılavuzu Giriş

Transkript

1 Kullanım Kılavuzu Giriş 1.Kullanım Amacı 2 2. Klinik Uygulamalar ve Test prensibi 2 3. Kit İçeriği 2 4. Saklama ve Raf Ömrü 3 5. Kullanım önerileri 4 6. Numune toplama, hazırlama ve saklama 4 7. Test prosedürü 5 8. Sorun giderme 7 9. Test prosedür şeması Yorumlama Ek 13

2 1.Kullanım Amacı AESKUSLIDES ANA-HEp-2 insan serumunda sitoplazmik ve/yada nükleer otoantikorların tespitine yönelik bir indirekt immunofloresans testidir. Test dermatomiyozit, polimiyozit, Sjögren sendromu, skleroderma, miks bağ dokusu hastalığı (MCTD) ve sistemik lupus eritematozus (SLE) gibi sistemik romatizmal hastalıkların ayırıcı teşhisinde bir araçtır. 2. Klinik Uygulama ve Test prensibi Anti-nükleer antikorlar (ANA), sistemik romatizmal hastalıklarda yüksek sıklıkta nükleer ve sitoplazmik antijenlerin çeşitlerine karşı meydana gelir ve böylece ayırıcı teşhis için önemli bir araçtır. Örneğin, SS-A (Ro) ve SS-B (La) antikorlar Sjögren s sendromuyla (SS) ve antidsdna, anti-sm, anti-histon ve anti-nucleosomes ise SLE(Sistemik Lupus Eritematozus) ile ilişkilidir. Anti-RNP antikorlarıyla miks bağ dokusu hastalığı (MCTD) ve SLE, anti-scl-70 antikorlarıyla skleroderma (progressive systemic sclerosis [PSS]), anti-jo-1 antikorlarıyla polimiyozit ve dermatomiyozit ve ayrıca anti-sentromer antikorlarıyla CREST sendromu ilişkilidir (Detaylı bilgi için sayfa e bakınız). İndirekt immunofloresans testi (IFT) örneğin ökaryotik hücreler üzerinde yapılır. HEp2, ANAs ın tespiti için kurulan bir metottur. IFT hassas bir test olmasına rağmen, çok sayıda hasta numuneleri test edildiğinde fluoresan mikroskop değişikliğinden ve insan yorumundan gelen hatalara bağlı olduğunda sorun yaratabilir. Tek antikor özellikleri, ANAs'in basit ve güvenilir bir ayrımı için spesifik hedef antijenlerini kullanan daha özel bir test olan ELISAs kullanılarak belirlenmek zorundadır. Antijen Karakterizasyonu: HEp-2 hücreler Çapraz-reaktivite Çapraz-reaksiyon oluşmaz. Antikorun tespiti indirekt immunofloresans test (IIFA) prensibi üzerine kurulmuştur. Cam mikroskop slaytları, doku kısımları veya hücreleri (HEp-2-cells (ANA), Granulocytes (ANCA) veya Crithidia luciliae (ndna)) ile kaplıdır. Eğer hastanın serumu spesifik antikorlar içerirse, antikorlar ilk inkübasyon sırasında bağlanırlar. Yıkama sırasında bağlanmayan materyallerin uzaklaştırılmasından sonra, bağlı antikorlar fluoresans konjuge anti-insan immünoglobulinlar tarafından ikinci inkübasyon sırasında tespit edilir. Antijen-antikor-kompleksin spesifik bir yeşil fluoresan boyaması, bir fluoresan mikroskobu yardımıyla görüntülenebilir. 3. Kit İçeriği Hazırlanacaklar: 50xyıkama buffer Konsantre yıkama buffer 1:50 distile suda dilüsyon edilir (örneğin: 20 ml ml ) İçerik: PBS, sodyum azit(koruyucu)

3 10xnumune buffer Konsantre numune buffer 1:10 distile suda dilüsyon edilir (örneğin: 20 ml ml) İçerik: PBS, BSA sodyum azit(koruyucu) Kullanıma hazır: Cam mikroskob slaytları 10 x 12 kuyular, HEp-2 hücrelerle kaplı Pozitif kontrol İçerik: İnsan serumu (diluent), sodium azide (koruyucu) 0.5 ml Negatif kontrol İçerik: İnsan serumu (diluent), sodium azide (koruyucu) 0.5 ml Floresein (FITC) konjuge anti-insan IgG (H+L Chain) 3.5 ml Evans Mavisi 2% 3.0 ml Örtücü sıvı (Mounting Medium) 12 ml Gerekli fakat sağlanmayan malzemeler: - Distile su, - Numune diluent için test tüpleri, - Ölçme flaksı, - Volumetrik pipet, - Saat, - FITC sistemiyle fluoresan mikroskop, (490 nm eksitasyon filtre, 510 nm bariyer filtre) - İnkübatör tepsi, - Boyama küveti, - Pipet uçları, - Kapak slipler (24x60 mm). 4. Saklama ve Raf Ömrü 2 C - 8 C / F de tüm reaktifleri şiddetli ışıktan koruyarak saklayınız. Her bir komponentin son kullanım tarihi kendi şişe etiketi üzerinde gösterilir. Son kullanım tarihi dışında reaktifleri kullanmayınız. Orijinal kaplarında 2-8 C/35-46 F da tüm reaktif ve slaytları saklayınız. Hazırlanan solüsyonlar 4 C/39 F de bir ay için uygundur ve en az bir defa hazırlanır. Reaktifler ve slaytlar sadece her bir komponentde belirtilen son kullanım tarihi içinde kullanılmalıdır.

4 5. Kullanım önlemleri 5.1 Sağlık tehlike datası Bu ürün sadece in vitro diagnostik kullanım içindir. Bu nedenle, sadece in vitro diagnostiklerin eğitimli personel ve özel olarak önerilen metotlarında uygulanmalıdır. Bu ürün, normal kullanımda toksik ya da zaralı olmamasına rağmen aşağıdaki maksimum güvenlik önlemlerini yapmanız önerilir: Öneriler ve önlemler Bu kit potansiyel zararlı komponentler içerir. Kit reaktifleri gözler ve deri için tahriş edici olmamasına rağmen, göz ve deri ile temasından kaçınmanızı ve eldiven kullanmanızı öneririz. Bu kitteki bazı reaktifler (kontroller, standardlar gibi) için kullanılan tüm insan kaynaklı materyaller kabul görmüş metodlar ile test edilmiş ve HbsAg, Hepatit C ve HIV 1 için negatif bulunmuşlardır. Buna rağmen, hiçbir test materyallerde tamamen viral ajanların yok olduğunu garanti edemez. Bu nedenle, kit kontrolleri, standartlar ve hasta örnekleri sanki enfeksiyon ajanı taşıyormuş gibi ve uluslararası gerekliliklere göre kullanılmalıdır. 5.2 Kullanım için genel talimatlar 1. Ağızla pipeti çekmeyiniz. Test çalışması sırasında yemek yemeyiniz, içki ve sigara içmeyiniz. 2. Farklı lot numarasındaki reaktiflerin yerini değiştirmeyiniz veya karıştırmayınız. Bu durum sonuçlarda değişmelere yol açabilir. 3. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için kullandıktan sonra tüm şişeleri kapalı tutunuz. 4. Her zaman yeni steril pipet ipuçlarıyla tüm solüsyonları çekiniz. 5. Asla 37 C/ 98.6 F 'den daha yüksek sıcaklığa bileşenleri maruz bırakmayınız. 6. Tüm prosedür uygulanırken slayt kuyularının kurumasına asla izin vermeyiniz. 7. Asla slaytları dondurmayınız. Kendi uyguladığı prosedürlere göre her laboratuvar kendi tekniklerini, kontrollerini, ekipmanını ve hasta nüfusunu kendi kontrolleri üzerinden uygulamalıdır. Kesin klinik tanı sadece bu test performansına dayanmamalıdır, doktor tarafından tüm klinik ve laboratuar bulguları araştırıldıktan sonra konulmalıdır. 6. Numune toplama, ambalajlama ve depolama Numunelerin hazırlanması Tercihen taze toplanmış serum örnekleri kullanın. Ulusal gerekliliklere göre kan toplanmalıdır.

5 İkterik, lipemik, hemolizli ya da bakteriyolojik kontaminasyonlu örnekleri kullanmayın. Partiküllü serumlar düşük hızlı santrifüj (<1000 x g) ile temizlenmelidir. Kan örnekleri temiz, kuru ve boş tüplere alınmalıdır. Ayırdıktan sonra serum örnekleri hemen kullanılmalıdır, 2-8 C/35-46 F de 3 güne kadar ya da -20 C/-4 F de dondurularak daha uzun süre saklanabilir. 7. Test prosedürü 7.1 Pipetlemeden önce hazırlıklar Kullanımdan önce oda sıcaklığına (20-26 C / 64-78,8 F) ulaşana kadar tüm bileşenlere bekletin, testin optimum bir performansı için önerilen inkübasyon şemasını takip edin ve iyi karıştırın. 1. Numune bufferı ve yıkama bufferı hazırlığı: Konsantre numune bufferını distile su ile 1:10 oranında ve yıkama bufferinı distile su ile1:50 oranında dilüe edin. 2. Numunelerin seyreltilmesi: Hasta serumunu hazırlanan numune bufferıyla 1/1 oranında (tarama titre için paragraf 10 a bakın) dilüe edin. Kontroller kullanıma hazırdır! 3. Bir protokol hazırlama: 14. sayfada verilen test protokolünün kullanılmasını öneririz. 7.2 Test prosedürü 1. Gerekli miktarda slaytı(ları) paketten çıkartın ve işaretleyin. Kuyulara dokunmayın. Slaytların kurumasına izin vermeyin. 2. İlk inkübasyon Uygun kuyu içine seyreltilen her serumu ve kontrolleri uygun bir hacimde pipetleyin, slayt yüzeyiyle pipetin direkt temasından kaçının. Her kuyunun serum ile tamamen kaplı olduğundan emin olun. Test materyalinin kuyuyu kaplayacak miktarda kullanılması önemlidir. Ama kuyudan kuyuya geçmesinden kaçının, çünkü bu, yanlış sonuçlara sebep olabilir. Slayt(lar) nemli bir inkübatör tepsisinde oda sıcaklığında 30 dakika inkube edilir. 3. Yıkama Inkübasyondan sonra inkübatör tepsisinden slaytları çıkarın ve bir pipet kullanarak yıkama bufferıyla iyice durulamayın. Kuyulara doğrudan bufferı fışkırtmayın. NOT: Slayt üzerinde çapraz kontaminasyonu önlemek için, slaydın orta çizgisi boyunca doğrudan yıkama bufferını akıtın. Bir slayt boyama küvetinde yıkama bufferıyla 15 dakika slayt(lar)yıkayın. Optimal sonuçlar elde etmek için üç kere 5 dakika yıkadıktan sonra buffer solüsyonunun değişmesi gereklidir. Slaytı yıkama küvetinden çıkartın ve slayt da kalan fazla yıkama bufferını dikkatli şekilde uzaklaştırın.

6 NOT: Prosedür esnasında kuyuların kurumaması veya substrata zarar gelmemesi önemlidir. Lütfen lekelemeyin veya herhangi bir biçimde slaytı kurutmayın veya birkaç saniyeden daha uzun süre için flüoresan antikor reaktifi olmadan slaytı bekletmeyin. 4. İkinci inkübasyon Yıkama prosedüründen hemen sonra slaytı inkübatör tepsisine koyun ve her kuyuyu 30 µl FITC-konjuge ile kapatın. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika slaytı(ları) inkübe edin. 5. Yıkama Inkübasyondan sonra inkübatör tepsisinden slaytları çıkarın ve bir pipet kullanarak yıkama bufferıyla iyice durulamayın. Kuyulara doğrudan bufferı fışkırtmayın. Bir slayt boyama küvetinde yıkama bufferıyla 10 dakika slaytı(ları)yıkayın. Optimal sonuçlar için iki kere 5 dakikalık yıkamadan sonra buffer solüsyonunun değişmesi gereklidir. 6. Opsiyonlu counterstain: Yıkama bufferında 1:3000 counterstainla (Evans Blue) diluent edin ve iyice karıştırın. Boyama küvetinde counterstain eğin ve onun içinde 30 sn-1:30 dakika için slaytları inkübe edin. Evans mavisi, özel olmayan arka plan flüoresansını kapatır. Mak. 2 dakika sonra slayti(ları) çıkarın ve yıkama bufferıyla kısa süre içinde durulayın. Fazla yıkama bufferı çıkarın. Lütfen herhangi bir şekilde slaytı kurutmayın ya da lekelemeyin. 7. Örtücü sıvı eklenmesi Örtücü sıvının(mounting medium) yeterli bir miktarını her slaydın orta çizgisi boyunca ekleyin. Dikkatlice hava baloncuklarından kaçınacak şekilde slaydın kapağını yerleştirin. 8. Floresan mikroskobuyla x toplam büyültmede slaytı(ları) hemen okuyun (490 nm eksitasyon filtre, 510 nm bariyer filtre). 7.3 İş akışı Test prosedürü için paragraf 9 a bakınız. Uygun kuyuların içine kontrolleri ve dilüe edilmiş her serumu pipetleyin. Distile veya deionize suyun küçük bir miktarını bir inkübatör tepsisine yerleştirin ve slaytı(lar) inkübatör tepsisine uygun şekilde yerleştirin. Oda sıcaklığında (20-26 C / 64-78,8 F) 30 dakika slaytı(ları) inkübe edin. İnkübatör tepsisinden slaytları çıkarın ve pipet kullanarak yıkama bufferıyla iyice durulayın. Boyama küvetinde üç kez 5 dakika slaytları yıkayın. İnkübatör tepsisi içinde 30µl FITC konjugat ile her kuyuyu kapatın. Oda sıcaklığında (20-26 C / 64-78,8 F) 30 dakika karanlıkta slaytı(ları) inkübe edin.

7 İnkübatör tepsisinden slaytları çıkarın ve pipet kullanarak yıkama bufferı ile iyice durulayın. Boyama küvetinde iki kez 5 dakika slaytları yıkayın. Yıkama bufferında counterstain (Evans mavisi) 1:3000 diluent edin. 0:30-1:30 dakika seyreltilmiş counterstain ile slaytları inkübe edin. Max. 2 dakika sonra slaytları çıkarın ve yıkama bufferıyla iyice durulayın. Her slaytın orta çizgisi boyunca örtücü sıvı (mounting medium) ekleyin. Fluoresan mikroskobuyla x toplam büyültmeyle hemen slaytı(ları) okuyun. (490 nm uyarı filtre, 510 nm bariyer filtre). 8. Sorun Giderme HATA OLASI NEDENLER SOLÜSYON Düşük hücre yoğunluğu - Deionize su ile uzun süreli temasından sonra hücre eriyip yok olabilir - Kuyu içinde substrat üzerine doğrudan buffer fışkırtılmış olabilir -Proteolitk enzimler substrate bağlanabilir Arızalı floresans - Kenarda daha güçlü olan floresans, serumu kuyuda kurutmuş olabilir -Serum test kuyusunda kapatılmış olabilir -Kuyular arasında çaprazreaksiyon olabilir -Slayt üzerinde bir filmi gösteren mum kalemiyle slayt işaretlenebilir -Yıkama prosedürünü takip edin - Serumu inaktiv edin - Her zaman nemli ortamda inkübe edin - Test materyalin hacmini eşit şekilde ayırarak kullanın -İlk inkübasyon döneminde kuyular arasındaki süreklilikten kaçının - Bir kurşun kalem kullanın -Mikroskop yanlış ayarlanmış olabilir - Mikroskopun ayarlarını kontrol edin - UV-lambasının servis ömrünü kontrol edin Dağılmış resim - Slayt kapak olmadan buzdolabında inkübe edilmiş olabilir - I.F. Mikroskop kirlidir. Lensin üzeri çizilmiş olabilir. Az ya da hiç olmayan floresans - Konjugat ve slaytlar erimiş ve tekrar donmuş olabilir - Seyreltik kontroller olabilir - Serum veya konjugatun - Parafin mumu veya tırnak cilasıyla slaytı kapatın -Talimatlara göre mikroskobu temizleyin - 2 C - 8 C / F de konjugat ve slaytları saklayın - Talimatları kontrol edin, kullanılan kit kontrolleri kullanıma hazırlayın - Şartları kontrol edin

8 bakterial bulaşması olabilir - Mikroskop ayarlanmamış olabilir - Yıkama bufferının ph-değeri çok düşük olabilir (ph-değeri 7.4 ± 0.2) - FITC konjugat ışığa maruz kalmış olabilir -Işıktan konjugatı koruyarak saklayın Floresans arka planı - Hatalı yıkama, - Kurumuş slayt, - Lipemik, hemolitik serum, - Mikroskop hatası olabilir. - Yıkama talimatlarını kontrol edin - Slaytların kurumasına izin vermeyin - Sadece taze serum kullanın - Doğru filtre veya nesne mi kullanılmış kontrol edin. 9. Test prosedür Şeması Numune materyali: Numune hacmi: Toplam inkübasyon zamanı: Saklama: Tespit sayısı: serum Numunenin 10 µl si 1:101 lik 1x numune bufferıyla dilüsyon edildi C/ F da 90 dakika 2-8 C/35-46 F da sadece orjinal ampüller kullanın 96 test 10. Yorumlama Yetişkinler için önerilen tarama titre1:80 Çocuklar için önerilen tarama titre1:40 HEp-2 gırtlak kanseri görülen bir hastanın dokusundan üremiş bir insan epitel doku hücresidir. Substrate, ekstra hücresel olmayan eksipienti ve bir homojen hücre büyümesini sağlar. Mitotik hücre numunelerinin değerlendirmesi için, nükleer paternlerin tam olarak tanımlanması büyük önem taşır. Basit pozitif bir flüoresans gösteren hasta serumu uygun son titerdir. Bu değerlendirme her zaman pozitif ve negatif kontrolle yapılmalıdır. 1:80 (Erişkinler) ve 1:40(Çocuklar) arasında titreler hücre çekirdeğinin zayıf flüoresansı veya belirsizlik klinik sonuçlarla ilgili kontroller yoluyla kontrol edilmelidir. Bu durumda numuneler, yaklaşık olarak her 6 haftada bir toplanmalı ve benzer bir yolla test edilmelidir. 1. Membranöz nücleer patternler 1.1 Düzgün membranöz nucleer patterni Düzgün bir homojen, interfaz hücrelerinde nükleer zarın halka-benzeri flüoresansıdır.

9 Güçlü antikorlarla bazı numuneler, tüm nükleer boyanma etkilerini verebilir. Benzer bir pattern, telofaz hücrelerinde görülür. Metafaz hücrelerinde flüoresans sitoplazmada yayılarak lokalize olur ve kromozomal materyalde boyanma görülmez. 1.2 Benekli membranöz nucleer paterni Nükleer zar boyunca sürekli olmayan bir benekli floresansdır. Benekli boyanma nükleus boyunca ayarlanarak tüm nükleus yüzeyinde görülebilir. Benzer bir pattern, telofaz hücrelerinde görülür. Metafazda flüoresans yayılarak sitoplazma boyunca lokalize olur. Güçlü antikorlarla bazı numuneler, tüm nükleer boyanmanın etkilerini verebilir. 2. Nükleoplazmik patternler 2.1 Homojen nükleer patterni Nükleer periferde bazen şiddetlenen ve tüm çekirdek plazmasını kaplayan aynı diffuz bir floresans çoğunlukla kromozom bileşenlerine yönelik olan farklı antikorlarla ilişkili olabilir (DNA,histones a.o.). Bazı durumlarda çekirdeğin iç kenarında daha yoğun bir boyanma görülebilir (Nükleer çerçeve). Bazı numunelerde periferik nükleolar boyanma ek bir görünümü gösterebilir. Nükleolar boyanma değişkendir. Metafazda homojen veya periferik bir kromatin boyanma görülür. Farklı boyama patternleri kısaca ikiye ayrılabilir: - Homojen nükleolar boyama ile homojen nükleer pattern. - Negatif nükleoli ile homojen nükleer pattern. 2.2 Benekli nükleer patternler Birçok farklı benekli nükleer patternler bulunabilir, ancak ayırt etmek zor olabilir. Yedi patern uygun doğrulukta ayırt edilebilir. Metafaz kromozomlarda altısı da negatif, sentromer patternde ise pozitiftir Büyük benekli nükleer pattern (nükleer matriks) (SC35) Daha önce "Nükleer matriks" boyanması olarak adlandırılan nükleoplazma boyunca değişken büyük benekler, interkromatin granüllerin boyanmasıyla büyük olasılıkla oluşurlar. Nükleoli negatiftir. Metafaz ve telofaz sitoplazma yayılarak yerelleştirilmiş benekleri ve negatif kromatin plakaları gösterir Kaba benekli nükleer patern Genellikle daha büyük beneklerle ilişkili çeşitli benek boyutları nükleoplazma hücrelerinin interfazı boyunca yoğun olarak dağıtılır. Nükleoli negatiftir. Metafaz ve telofaz sitoplazma, kendisi negatif olan kromatin plakalarının etrafındaki yoğunlaşmayla benekleri gösterir. Bu patern spliceosomesın boyanmasıyla genellikle ilgilidir İnce benekli nükleer patern Homojen bir patern elde edilsin diye bazen çok yoğun olan düzenli bir dağılmayla ince benekli boyanmadır. Nükleoli pozitif(anti-ssb/la antikorlarıyla özellikle) ya da negatif olabilir. Metafazın sitoplazma hücrelerini, kendisi negatif olan kromatin plakalarının etrafındaki yoğunlaşma ve ince benekleri gösterir. Telofaz hücrelerinin nükleolisi pozitif olabilir ve bazen intefaz hücrelerinden daha kuvvetli boyanabilir.

10 2.2.4 Damarlı Scl-70-benzer patern Pozitif nucleoliyle çoğunlukla vurgulanan metafaz ve telofaz hücrelerinin kromozomal alanlarının ve nücleoplazmanın düzenli ince bir damarının boyanmasıdır. Boyamada daha düşük büyütmelerde homojene bakılabilir. Bu boyama sadece anti-scl-70 pozitif serum ile görülmez Pleomorfik benekli nükleer patern Çoğalan (S-faz) hücrelerin çekirdekleri nükleoplazmanın çok kaba düzensiz beneğine karşı inceden gelen beneklerin bir türünü gösterir(hücre hazırlanmasına bağlı olarak hücrelerin 10-50%). Bazı hücrelerde nucleoli de boyanır. Hareketsiz (G-faz) ve metafaz hücreler negatiftir. "Anti-PCNA" paterni (antiproliferating hücresi nükleer antijen ) olarak da bilinen bu patern, genellikle diğer paternlerle birlikte görülür Sentromer patern Tercihen düzenli ayrık benekler tüm çekirdek boyunca yer almaktadır (çekirdek başına benek). Metafaz ve telofaz hücreleri her zaman yoğun kromozomal malzemesinde bu benekleri gösterir. Bu patern birkaç sentromer proteinlerini tanıyabilen kromozomların kinetochorları için antikorlar tarafından üretilmektedir(cenp-a,b,c,d,e) Çoklu nükleer noktalar (NSp-1) Çoğunlukla PML (ProMyelocytic Leukemia de belirgin ifadelerinden dolayı) vücutları olarakta adlandırılan nükleer sub yapılarının çekirdek başına 5-10 noktada boyanmasıdır ve metafaz ve telofaz hücrelerinin kromozomları negatiftir Kıvrılmış vücut patern (az nükleer noktalar) Çekirdek başına 2-6 nokta nükleoplazmada çoğunlukla nucleoliye yakın civarında saptanır. Metafaz veya telofaz kromatin plakalarında hiçbir boyanma yoktur. 3. Nükleolar paternler 3.1 Homojen nükleolar patern Bu patern tüm nucleolusun flüoresansı gösterir ve bölünen hücrelerde nükleolar organize bölgeleri veya kromozomlar hiçbir boyanma yoktur. 3.2 Küme nükleolar patern Kıvrılmış vücutlara ek olarak nükleolinin fibrillar merkezlerinin dekorasyonuyla ilgili olan daha büyük granüller parlak bir şekilde kümelenmiştir. Mitotik hücrelerinde metafaz ve telofaz plaka floresan düzensiz bir " fan-benzer" kenarı gibi görünür. 3.3 Benekli nükleolar patern Çoğunlukla nucleolinin merkezinde küçük ayrı tanelerdir. Metafaz hücrelerinde 2-5 ayrı benekler, nükleolar organize bölgeleriyle ilgili olan kromatin vücudunun içinde görülür.

11 4. Spindle cihaz patternler 4.1 Sentriyol (sentrozom) spindle patern Metaphase spindl birbirlerine dik uzanan spindl kutuplarının her birinde ayrı flüoresan bir spotu gösterir. Çekirdek yakınında bitişik bir veya iki parlak spot, interfaz hücrelerinin sitoplazmasında görülmektedir. 4.2 Spindle kutup pattern (NuMA) Metaphase hücrelerinde Spindlin kutup alanı sadece boyanır (Üçgensel veya muz-şekilli patern). Spindl lifleri, telofaz hücrelerinde daha lineer bir patternle negatiftir. Negatif nükleoliyle ince benekli nükleer bir pattern çoğunlukla hareketsiz ve telofaz hücrelerinde görülür ama bunlar negatif de olabilir. 4.3 Spindl lifli pattern Metafaz hücrelerinde kromatin plakası karşı kutupdan tüm spindl lif cihazı boyanır. Hareketsiz veya bölenen hücrelerde kromozomların hiçbir boyanması yoktur. 4.4 Midbody pattern(msa-2) Profaz ve metefaz hücrelerinde flüoresans, metafaz plakasının kenarı için ince dikey çizgiler olarak chromosomal bölgese yerelleştirilir. Telofazda boyanma, sitokinezi tamamlanan hücrelerin arasındaki dar bağlantı midbodysi ve karışık yarılma için sınırlıdır. S ve G2 faz hücreleri, ayrı veya düzensiz nükleer beneklerle lekelenir. Pattern, MSA-2 antijene karşı antikorlardan kaynaklanır(mitatik Spindl Antijen 2). 4.5 C-F pattern En karakteristik özelliği, metafaz hücrelerinde görülür ve bu hücrelerde pattern genellikle bir fermuara benzeyen bir kavrama olarak kromozomal metafaz plakasını çevreleyen yoğun büyük granüllerin iki seti ile oluşturulmaktadır. Bu granüller sentromerlerin bir parçasıdır. Çevrelenen sitoplazma yayılarak boyanır. Profaz hücrelerinde kromozomların yoğun bir benekli dekorasyonu görülür. Çok ince yoğun nükleer benekli bir pattern birkaç interfaz hücresinde görülebilir. Pattern sentromer proteinine özdeş olabilen MSA-3 (Mitotik Spindl Antijen3) antijene karşı antikorlardan kaynaklanır(cenp-f). 5.Sitoplazmik flüoresans patternler 5.1 İnce Benekli stoplazmik pattern Bazen bir yıldız tozu-benzeri görünüşle üretilen ve hücrenin periferine doğru daha açık olan ince granüller stoplazma boyunca dağılmıştır. Çekirdekler veya çekirdekçiklerin hiçbir boyanması yoktur. Bu pattern, trna sentetazesa karşı antikorların karakteristiğidir. Metafaz hücrelerinde kromozomal malzemesi negatifdir. 5.2 Diffuz stoplazmik pattern Tüm stoplazma veya bulutlu patterni kaplayan parça veya homojen boyanma için çok ince yoğun bir granüldür. Çekirdeğin hiçbir boyanması yoktur, ama çekirdekçikte homojen bir şekilde boyanma olabilir, eğer antikorlar ribozomal RNA proteinlerine yöneltilirse, prekursör olan çekirdekçikte bulunur. Metafaz hücrelerinde kromozomal malzeme negatiftir.

12 5.3 Mitokondrial gibi pattern Retiküler bir şebekede stoplazma boyunca çekirdekten uzanan daha büyük düzensiz granüllerdir. Asıl tanınan antijen küme M2 dört büyük mitokondrial iç membran proteinlerini oluşturmaktadır. Çekirdek ve çekirdekçik negatiftir, ama güçlü pozitif serumlar, benekli nükleer boyanmanın bir etkisini verebilir. 5.4 Lizozomal gibi pattern Sitoplazma boyunca dağıtılan büyük organeller için düzensiz ara madde, lizozomlar veya perokisomlar gibi organellere yöneltilen antikorlardan dolayı olabilir. Çekirdek veya çekirdekçiğin hiçbir boyanması yoktur, ama bölünen hücrelerin sitoplazmasına yayılmış boyanmadır. 5.5 Golgi gibi pattern Çekirdeğe bitişik polar bir organel boyanır ve düzensiz büyük granüller oluşur Çekirdek ve çekirdekçik negatiftir. Kromozomal malzeme etrafında vurgulanmasıyla bölünen hücrelerin sitoplazma boyanması yayılmıştır. 5.6 Aktin gibi pattern Plazma zarının hemen altında basit bir odak düzlemde uzanan stres lifleri boyanır. Çekirdek, çekirdekçik ve metafaz kromozomlar negatiftir. Aktin kablolar plazma zarına yakın hücrenin tüm boyunu uzatır. Hücre zarında dendrit-gibi uzatmalar da görülebilir. 5.7 Vimentin gibi pattern Tüm sitoplazma boyunca uzanan bol ince lifler kıvrılmış olan bir formda çekirdekçiğin etrafında toplanan kümelere ek olarak radyal bir lif ağında boyanır. Çekirdek ve çekirdekçik negatiftir. 6.Negatif 6.1 Negatif (örnek 1) Çekirdekçiğin veya sitoplazmanın hiçbir yeşil flüoresansı neredeyse görülemez. Birikmiş konjugatı olan alanda tek ve genellikle düzensiz yeşil spotlar gözükür. Özellikle eski slayt hazırlığında veya anti-solan agentlarla saklanmada hücresel yapılar kahverengi görünebilir (örneğin nucleoli). Hücre atıkları artefaktual yeşilimsi flüoresan spotlarına neden olabilir. 6.2 Negatif (örnek 2) Her zayıf pozitif bir numune aşağıda bir yoğunluğa ulaşır veya sitoplazmanın ve çekirdekçiğin flüoresansı çok soluk yeşilimsidir. Eğer zayıf pozitif bir ANA serumu, kesin bir ANA-pozitif kontrol serumuna ek olarak boşaltılmış bir ANA-negatif kontrol serumuyla beraber çalışarak her günlük dönemde bir hassasiyetin kontrolü olarak bulunursa bu en iyi karar olabilir. 7. Belirlenemez Herhangi bir boyanma patterni, bu sınıflandırma taksonomisinde dahil edilmemiş subcellular organellerle veya yapılarla ilişkilidir.

13 11. Ek Laboratuarlar, pleomorfik benekli nükleer patterni, sentromer patterni, çoklu nükleer noktalar, nükleer noktaların olduğu kıvrılmış vücut, bazı nükleolar patternler ve en çok stoplazmik patternler gibi ANA substratta genellikle flüoresans patternleri kaçırdığı için hayvansal dokuların kriyostat kısımlarını yani kemirgen böbrek veya karaciğeri kullanın. Spindl cihazıyla ilişkili olan patternler benzer şekilde görülmez. Mitokondrial-gibi pattern kaba benekli bir pattern olarak birçok dokuda görülebilir ve önceden hayvansal böbrek kısımlarında tespit edilmiştir. Düzgün nükleer zar patterni çoğunlukla çok açık bir şekilde sıçan karaciğerinde görülür. Pozitif bir ANA veya Hep-2 hücreleri için genellikle cut-off değeri 1:100'in yukarısına ayarlanmıştır, oysa doku kısımlarında genellikle daha düşük bir seyreltme ayarlanır. Belli boyama patternleri tek bir serumda yani çoklu nükleer noktalar mitokondrial-gibi patternle (birincil biliary sirozunun her iki karakteristiği) beraber ve benekli nükleer pleomorfik, homojen nükleer, kaba veya ince benekli nükleer patternle (Sistemle ilgili lupus eritermatozusun her iki karakteristiği) beraber genellikle birlikte tanınır. Sentromer patterni de mitokondrial-gibi patternle beraber genellikle görülür. Bazı laboratuvar ve kitlerde kullanılan bütün Ig sınıflarına yönelik FITC-konjugatları hatırlanmalıdır. Mevcut sözlük bir IgG-spesifik konjugat ile bulgulara dayanmaktadır. Allan Wiik et al, Rheumatology International