MİKROORGANİZMALARIN ÜRETİLDİĞİ ORTAMLAR
Mikroorganizmaların uygun çevre koşulları sağlanarak çoğaltılmaları işlemine üretme diyoruz. Mikroorganizmaların üretilmeleri için gerekli maddeleri içeren hazırlanmış ortamlar BESİYERİ olarak adlandırılır.
Besiyerleri, mikroorganizmaların üretilebilmeleri dışında, benzerlerinden ayırt edilebilmelerinde ve özelliklerinin belirlenmelerinde kullanılır. Mikroorganizmaların canlı ortamlarda üretilebilmeleri için, deney hayvanlarından ve doku kültürlerinden yararlanılır.
Bazı mikroorganizmalar basit inorganik maddelerle beslenirler. Organik maddelere ihtiyaç göstermeyen bu mikroorganizmalara OTOTROF mikroorganizmalar adı verilir. Eğer mikroorganizma gerekli enerjiyi inorganik maddelerden oksidasyon yoluyla elde ederse bunlara KEMO OTOTROF mikroorganizmalar adı verilir.
Ototrof mikroorganizmalar enerjilerini güneş ışığından sağlarlarsa bunlara da FOTO OTOTROF mikroorganizmalar adı verilir. Beslenmeleri için en az bir organik maddeye ihtiyaç gösteren maddelere HETEROTROF mikroorganizmalar denir.
Mikroorganizmaların üremeleri, insan sağlığı açısından tanımsal amaç taşır. Hastalık yapıcı etkenlerin ilgili vücut bölgelerinden üretilmeleri sonucunda hastalığın adının belirlenmesi imkanı doğar. Takiben patojen mikroorganizmaların yine besiyerlerinde antimikrobik maddelere duyarlılıkları saptanabilir. Sağlıklı tedavi yaklaşımları gerçekleşir. Ayrıca tedaviye cevap alınıp alınmadığı testlerle belirlenebilir.
Çevremizde bulunan ve insan sağlığına etkili su, süt, çeşitli yiyecek maddeleri, bazı ortam, araç ve gereçlerin mikroorganizma taşımaları açısından zaman zaman kontrol edilmeleri toplum ve çevre sağlığı açısından önem taşır. Mikroorganizmalardan aşı, antiserum, antijen gibi gerekli maddelerin elde edilmeleri ve bilimsel araştırma amaçlı olarak üretilmeleri gerekir.
MİKROORGANİZMALARIN BESLENME VE ÜREMELERİ İÇİN GEREKLİ MADDELER
Su Bakteri hücresinin %70-90'ını su oluşturur. Suyun yeterli olmadığı ortamda bakterilerin üremesi düşünülemez. Metabolizma için gerekli çoğu maddeler suda çözünmüş olmalıdır.
Karbon Kaynağı Bakteri hücresinin yapı taşlarının sentezi için gereklidir. Polisakkarit, lipid ve proteinlerin yapısında gerekli karbonlar için; CO2, karbonatlar ve organik kaynaklar kullanılır.
Azot Kaynağı Bakterilerin protein yapısına girer ve ayrıca nükleik asitlerin bununla ilgili purin, primidin ve çeşitli enzimlerin yapısında bulunur. Azot kaynağı olarak, amonyum tuzları, nitrit, nitrat ve aminoasitlerden yararlanılır.
Mineraller Mikroorganizmaların ve enzimlerinin yapılarında çeşitli mineraller bulunur. Mikroorganizmalar için gerekli en önemli mineraller, kükürt, fosfor, magnezyum, kalsiyum, demir, potasyumdur.
Hidrojen Verici ve Hidrojen Alıcı Maddeler Bütün mikroorganizmalar hidrojen verici nitelikteki enerji kaynağı maddelere ihtiyaç gösterirler. Bu nedenle okside olabilen maddeler gerekir. Hidrojen alıcı maddeler ise, aeroplar için oksijen, anaeroplar için inorganik veya organik bileşiklerdir.
Gelişme Faktörleri ve Vitaminler Bazı bakteriler bu maddeleri kendileri sentez edebildikleri halde bazı bakteriler 30-40 temel maddeye gereksinim duyabilirler. Mikroorganizmaların gerek duydukları gelişme faktörlerinden bazıları biotin, riboflavin, piridoksin, nikotinik asit... gibi maddelerdir.
Oksijen Bakterilerin bir grubu üremeleri için mutlak oksijen varlığına ihtiyaç duyarken, bir kısmı için ortamda hiç oksijen bulunmaması gereklidir. Bazı bakteriler ise ortamda oksijen bulunsun veya bulunmasın rahatlıkla üreyebilirler. Bir grup bakteri ise düşük miktardaki oksijen varlığında üreyebilir.
Karbondioksit Ototrof ve heterotrof bakteriler için karbondioksit hayati önem taşır. Bazı tıbbi önemi olan bakterilerin % 5-10 CO2'li ortamda üremeleri daha kolay olur.
MİKROORGANİZMALARIN ÜREMELERİNE ETKİLİ ÇEVRE FAKTÖRLERİ
Isı Her bakterinin üreyebildiği bir minimum bir de maksimum ısı derecesi bulunmakla birlikte, en iyi üreyebildiği optimal ısı derecesi vardır. Isı değişikliğinden en çok bakteriyel enzimler etkilenir.
Bakteriler üreyebildikleri ısılara göre üç guruba ayrılırlar.
Psikrofil bakteriler Bu grupta daha çok su ve toprakta yaşayabilen saprofit bakteriler yer alır. Genellikle -8 ile 15 C arasında üreyebilirler.
Mezofil bakteriler İnsanlarda ve hayvanlarda hastalık yapan bakterilerin büyük bir kısmı bu grupta yer alır ve 20 ile 45 C arasındaki ısılarda üreyebililer. Bu bakteriler vücut ısısı olan 37 C'de üretilirler.
Termofil bakteriler Isıyı seven bakterilerdir. Termofil bakteriler 50 C'nin üzerindeki ısılarda üreyebilirler. Özel protein yapısı ve enzime sahip olduklarından yüksek ısılarda denatüre olmazlar
Hidrojen İyon Yoğunluğu Ortamın hidrojen iyon konsantrasyonu (ph) başka bir deyişle ortamın asit veya alkali olması mikroorganizmaların üremesini etkiler. Her bakterinin üreyebildiği minimum ve maksimum ph değerleri vardır. Genelde bakteriler ph 6-8 arasında iyi üremekle birlikte en iyi ph 7,2-7,4 de ürerler.
Osmotik Basınç Bakterilerin sitoplazmasında 5-10 atmosferi bulan osmotik basınç vardır. Mikroorganizmalar belirli bir mekanizma ile hücre içindeki osmotik basıncı dengede tutarlar. Bu durum potasyum (K+) iyonunun aktif olarak hücre içerisine alınması ve pozitif yüklü bir organik madde olan putrescine'nin dışarı atılması ile sağlanır. Bazı mikroorganizmalar ise beslenip üreyebilmek için yüksek osmotik basınçlı ortamlara ihtiyaç duyarlar. Bunlara halofil mikroorganizmalar denir.
Oksidasyon Redüksiyon Potansiyeli Ortamda oksidan yani elektron verebilme gücündeki maddelerle elektron alabilme yeteneğindeki redüktan maddeler bulunur. Oksidan maddelerin fazlalığında oksidasyon-redüksiyon potansiyeli yüksek, redüktan maddelerin fazlalığında ise düşük olur. Bazı bakteri grupları düşük oksidasyon redüksiyon potansiyelinde üreyebilirken, bazıları da yüksek potansiyelde üreyebilirler. Bir ortamda elektron verici (oksidan) veya alıcı (redüktan) güç (oksidasyon redüksiyon potansiyeli) milivolt cinsinden ölçülmekte ve (Eh) simgesi ile ifade edilmektedir. Anaerop mikroorganizmaların üreyebilmesi için besiyerinin Eh derecesi 0.2 milivolt olmalıdır.
BAZI BESİYERLERİNİN TANITILMASI
İnsan ve hayvanlarda çeşitli mikroorganizmalar hastalık oluştururlar. Bu mikroorganizmaların izolasyonu, tanımlanması ve üretilmesinde besiyerleri kullanılır.
Besiyerleri canlı ve cansız ortamlar olarak ikiye ayrılırlar. Canlı ortamlar olarak sıklıkla hücre kültürleri, embriyonlu yumurta ve deney hayvanlarından yararlanılmaktadır. Cansız ortamlar, genellikle bakterileri izole etme, üretme, çeşitli testleri uygulamak suretiyle ayırıcı tanı yapabilmede kullanılan sıvı veya katı besiyerleridir.
Klinik örneklerden ekim yapılırken üretilmesi düşünülen mikroorganizmanın özelliklerine göre uygun olan besiyeri veya besiyerleri seçilmelidir. Besiyerleri kullanım amacı içeriklerine göre gruplara ayrılmaktadır. Besiyerleri aşağıdaki başlıklar altında toplanarak, kısaca anlatılacaktır.
Genel Kullanım Besiyerleri Günlük (= rutin) laboratuvar çalışmalarında kullanılan, insan ve hayvanların normal flora üyeleri ile bir çok hastalık etkeni olan mikroorganizmanın üreyebildiği besiyerleridir. Üreticilik özelliklerine göre temel ya da basit maddeler ile zenginliştirilerek hazırlanmış olmak üzere iki çeşit genel kullanım besiyeri bulunmaktadır.
Temel (basit) besiyerleri; et suyu, pepton, tuz gibi maddelerden hazırlanmaktadır. En sık kullanılan sıvı besiyerine buyyon denir. Buyyona agar eklenmek suretiyle elde edilen basit besiyerine ise jeloz denir. Zenginliştirilmiş besiyerleri, temel besiyerlerine kan, serum, glikoz, yumurta gibi maddelerin ilavesi ile hazırlanır. Basit besiyerlerinde üretilemeyen bazı mikroorganizmalar bu ortamlarda üretilebilirler.
Özel Besiyerleri Üremeleri güçlük gösteren bazı mikroorganizmaların üretilmeleri için hazırlanan besiyerleridir. Bu tür besiyerleri çalışma amacına göre hazırlanarak kullanılır ve daha kompleks yapıdadırlar.
Seçici (selektif) besiyerleri: Bu tür besiyerlerinin içinde üretilmesi istenen mikroorganizmayı baskılamayan ancak, normal flora gibi diğer mikroorganizmaların üremesini inhibe eden seçici antmikrobik maddeler yer almaktadır. Örneğin, kolistin nalidiksik asit agar (CNA) besiyeri; Gram negatif mikroorganizmaların üremesini inhibe ederken, Streptokokların üremesini etkilememektedir.
Ayırtıcı besiyerleri: Bu besiyerlerine katılan çeşitli indikatörler ve kimyasal maddeler yardımıyla, üreyen kolonilerin aldıkları renge göre mikroorganizmaları tanımlamak mümkündür. Buna örnek olarak, laktoza etkili barsak bakterilerini, birlikte bulundukları laktoza etkisiz olanların oluşturdukları farklı kolonileri ile ayırt etmede kullanılan Endo agar ve Mac Concey gibi besiyerlerini, ayrıca kanlı agarda hemoliz yapan ve yapmayan mikroorganizma kolonilerinin ayrılabildiklerini verebiliriz.
Özgül besiyerleri: Yalnız tek veya sınırlı sayıda mikroorganizmanın üretilmesi amacıyla kullanılan besiyerleridir. Örnek olarak Mycobacterium tuberculosis için kullanılan Löweinstein Jensen besiyerini, Corynbacterium diptheriae için, Löffler besiyerini verebiliriz.
Ayıraçlı besiyerleri: Sıvı ve katı olarak hazırlanan bu besiyerlerinin bileşimine çeşitli indikatörler (bromtimol mavisi, fenol red,..) ve kimyasal maddeler (karbonhidrat, sitrat, üre...) katılır. Bu maddeler yardımıyla mikroorganizmaların çeşitli biyokimyasal karakterleri belirlenmektedir.
Besiyerlerinin Hazırlanmasında Kullanılan Başlıca Maddeler
Su: İdeal olanı saf sentetik besiyerlerinin hazırlanmasında çifte damıtılmış su kullanılmasıdır. Bununla beraber gerektiğinde sert olmayan çeşme suları da sentetik besiyeri hazırlamada kullanılabilir.
Agar: Agar agar (kısaca agar) Hindistan ve Japon denizlerinde daha bol bulunan bir deniz yosunudur. Agarın yapısında, temelde, d-galaktopiranoz ünitelerinden yapılmış uzun zincirli polisakkaritler bulunmaktadır. Ayrıca inorganik tuzlar, çok az miktarda protein benzeri maddeler de yapısında yer almaktadır. Agar, parçalayabilen az sayıdaki bakterinin dışında, mikroorganizmaların büyük çoğunluğu tarafından ayrıştırılamaz.
Agarın, yalnızca bazı deniz bakterileri tarafından parçalanabildiği bilinmektedir. Mikrobiyolojide kullanılacak iyi bir agarın; sıvıların içerisinde ısıtılınca 95 C de erimesi, sonra soğumaya bırakıldığında 42-45 C de katılaşma özelliğinde olması gerekir. Agar, sıvı ortamları katılaştırmak amacıyla %1.5-3, yarı katı besiyeri elde etmek için %0.3-0.5, yarı sıvı besiyeri için %0.05-0.2 oranında eklenerek kullanılır. Agar, mikrobiyolojide besiyerlerinin hazırlanmasında en çok kullanılan bir maddedir. Agar, genellikle nötral olduğundan besiyerinin ph'nı etkilemez. Besiyerinin kendi ph'ı düşük olursa agarın katılaşması güçleşir.
Pepton: Çeşitli kaynaklı proteinlerin pepsis, tripsin, papain gibi enzimlerle hidrolize edilmeleri sonucu suda kolayca eriyebilen ve ısıtıldığında yeniden koagule olmayan, polipeptid, dipeptid ve aminoasit gibi maddelerin karışımını içeren ortamlardır. Bakteriler tarafından azot kaynağı olarak kullanılır. Et, kazein, soya küspesi gibi proteinli maddelerin enzimlerle sindirilmeleri yolu ile elde edilir.
Et ekstratı: Yağsız etten hazırlanan ham et suyunun su kısmının uçurulması ile elde edilen koyu renkte macun gibi bir maddedir. Bileşiminde, aminoasitler, jelatin, albumoz, vitaminler, minareller gibi maddeler bulunur. Et ekstratından bir litre suya 10 gram kadar katılır. Et ekstratı günümüzde toz halinde ticari olarak satılmaktadır.
Kan: Kullanım amacına göre çeşitli hayvanlardan elde edilerek besiyerlerine katılan kanların steril ve pıhtılaşması önlenmiş olmalıdır. Aseptik koşullarda hayvan ve insanlardan alınan kanların fibrinsizleştirilmesi için en iyi yöntem cam boncuklarının bulunduğu steril balonları kullanmaktır. Defibrine kan besiyerlerine %5-10 oranında olacak şekilde eklenir. En sık kanlı agar yapımı için kullanılır.
Serum: Koyun, at, tavşan gibi ya da insanlardan steril koşullarda alınıp ayrıştırılan serum besiyerlerine %510 oranında eklenerek kullanılır. Serum yerine değişik vücud sıvılarıda steril olarak eklenebilir.
Maya özütü: Ekmek veya bira mayasından kendi kendini sindirmesi ile, asit veya proteolitik enzimlerle hidrolizasyon sağlanarak elde edilir. İçeriğinde aminoasitler, üretme faktörleri, inorganik maddeler ve %10 oranında karbonhidratlar bulunur. Besiyerlerine %0.5-1 oranında katılır.
Sodyum klorür: Besiyerlerine osmotik basıncı ayarlamak için %0.5 oranında katılır.
Kanlı agar besiyeri : Jeloz besiyeri ortamına %5-10 oranında kan ilavesi ile hazırlanır. Amaca göre koyun, tavşan, at, insan kanı kullanılabilir. Fibrini parçalanan koyun kanı, hemoliz tipini belirlemede üstündür.
Çukulata agar besiyeri : Jeloz (adi agar) besiyerinde üreyemeyen bazı mikroorganizmalar çukulata besiyerinde üreyebilir. Çukulata besiyeri kanlı besiyerinin ısıtılması ile elde edilir. Bu besiyerinin görünümü kaynamış kandan dolayı çukulata rengindedir. Çukulata agar aynı zamanda bazı üreme faktörleri taşır. Neisseriae ve hemofil bakterilerin üretilmesinde kullanılır.
Thiyoglikolat sıvı besiyeri : Redüktan bir madde olan sodyum thiyoglikolat taşıyan anaerop bakterilerin de üreyebildiği bir ortamdır. Oksidasyon düzeyi için ortama indikatör olarak metilen mavisi eklenir. Oda ısısında ve karanlıkta saklanır. Yara örnekleri için ve anaerop üreme istendiğinde kullanılır.
Beyin kalp infüzyonu : BHİ olarak kısaltılarak kullanılır. Sıvı ya da agar katılmış katı şekli vardır. Mikroorganizmaların çoğunu üretebilecek zenginliktedir. Bu nedenle kan kültürleri ile az bakteri içerdiği düşünülen klinik örneklerin ekimleri için kullanılır.
EMB Agar : Eozin metilen blue agar, barsak bakterilerinin üreyebildikleri, aynı zamanda laktozu fermante eden ve etmeyenlerin ayırt edilebildiği bir besiyeridir.
Bu besiyeri, gram pozitif bakterilerin gelişimini baskılar. Yaygın olarak E.coli ayırımında kullanılır. E.coli menekşe ve metalik görünür. Enterobakter pembe ortası koyu görünür. Salmonella ve shigella ise renksiz, şeffaf görünür. Çünkü salmonella ve shigella laktoz negatiftir. E.coli
Selenit F Besiyeri : Koliform basillerin 18-24 saat süre ile üremelerini engelleyen selenyum tuzları içerir. Bu sayede barsak patojen bakterileri daha iyi ürerler ve üretilme şansları artar. Selenit F besiyerine ekilen dışkı örneklerinin belirli bir süre inkubasyondan sonra EMB veya MacConkey agara pasajları yapılır.
Löweistein - Jensen besiyeri : Mycobacterium tuberculosis ve diğer mikobakterileri üretmede, antibiyotik duyarlılık deneylerinin yapılmasında kullanılan bir çok organik madde içeren bir besiyeridir. Üreme maddeleri dışında özellikle Gram (+) bakterilerin üremelerini inhibe eden boya, antibiyotikler ve diğer maddeler içeren değiştirilmiş şekilleri vardır.
TSI (Üç şekerli demirli besiyeri) agar, triptofanlı besiyeri, üreli agar, sitrat agar, v.b. ile barsak bakterilerinin farklı enzimatik aktivite ve diğer özelliklerini belirleyen testler vardır. Ayrıca bakterilerin hareketliliklerini gösteren besiyerleri de kullanılmaktadır.
MİKROBİYOLOJİDE KULLANILAN BOYALAR VE BOYAMA YÖNTEMLERİ
Mikroskobik Preparatların Hazırlanması Mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla hem boyamadan direkt mikroskopta hem de boyanarak incelenmeleri gerekir. Bu yöntemlerle mikroorganizmaların, spor, kapsül, boyanma varlığı ve şekli gibi özellikleri araştırılır. Bu amaçla kültürlerden veya hastalık örneklerinden kurallara uygun preparatlar alınarak hazırlanır ve incelenir.
Boyanma ve Boyalar Boyama, mikrobiyolojik tanıda yardımcı bir yöntemdir. Boyanma, kimyasal bir olaydır. Boyalar genellikle tuz yapısındadırlar ve ph'larına göre asidik, bazik, nötral olabilirler. Mikrobiyolojide, daha çok bazik ve nötral boyalar kullanılır.
Bazik boyalar, renkli katyon ve renksiz anyon içerirler. Bazik boyalara, metilen blue+ chloride ve kristal viyole (Hexamethylprosanaline+chloride ) örnek olarak verilebilir. Bu iki örnek boyanın renkli katyon kısımları, pozitif yüklü metilen mavisi ve rosanaline'dir. Bakteri hücresi, nükleik asitten zengin fosfat grupları nedeniyle negatif yüklüdür. Bu nedenle bakteri hücreleri bazik boyalar ile iyi boyanırlar.
Asidik boyalar renksiz katyon içerirler ve bakterileri boyamazlar. Zemin boyamada ya da asit ph'lı ortamlarda kullanılırlar. Nötral boyalara örnek, Giemsa ve Wright verilebilir. Bu boyalar, özellikle kan ve doku preparatlarının boyanmasında, kanın şekilli elemanları, hücreler ve bazı parazitlerin daha etraflıca gözlenmelerinde üstündür.
Boyama işlemlerinde tek bir bazik boya kullanılmışsa, basit boyamadan söz edilir. Metilen mavisi, en çok kullanılan basit boyama yöntemidir. Birden fazla bazik boya kullanılarak, çeşitli mikroorganizmalar, farklı renkte boyanırlar. Birleşik boyama yöntemlerine örnek olarak Gram ve Aside-Alkole Rezistan Boyama (ARB veya AARB) verilebilir.
Gram Boyama Yöntemi 1884 yılında Danimarkalı Bakteriyolog Christian Gram tarafından tarif edilmiştir. Gram boyası ile mor renk alan bakteriler Gram pozitif (+) veya Gram olumlu, kırmızı renkte boyanan bakteriler ise, Gram negatif ( ) ya da Gram olumsuz olarak adlandırılırlar.
Basillerin yaklaşık yarısı, kokların büyük kısmı ve mantarlar, Gram olumludurlar. Spiral şekilli bakteriler ise Gram negatiftirler.
Gram (+) pozitif veya Gram ( ) negatif olsun kristal viyolet boyası ile tüm bakteriler mor renge boyanırlar. Ortama eklenen lugol solusyonu ile Gram (+) bakterilerin oluşturdukları yapı, daha sonra ortama eklenen alkol ile giderilemez. Oysa Gram ( ) bakterilerin kristal viyole + lugol karışımları alkol ile giderilebilir.
Bir başka deyişle, boya, bakteri hücresinden dışarıya salınır (dekolorizasyon). Gram ( ) negatif bakterilerin, alkolle renkleri gittiğinden, ortama daha sonra eklenen sulu füksin ile boyanır. Böylece Gram (+) bakteriler mor renkte (kristal viyole rengi), Gram ( ) bakteriler kırmızı - pembe renkte (sulu fuksin) boyanırlar. Gram boyanma özelliği bakteri duvar yapısı ile ilgilidir.
A: Gram (+) bakteri hücre duvar yapısı Kalın bir peptidoglikan (= mürein) tabaka taşırlar. Peptidoglikan zincirleri çapraz bağlı bir dev moleküldür. Peptidoglikan tabakaya ve membran glikolipidine bağlı teikoik asit ile polisakkaritler yeralır.
B : Gram (-) bakteri hücre duvar yapısı Peptidoglikan tabaka Gram (+) bakterilere göre çok incedir. Peptidoglikanın dışında, lipoprotein, dış membran, lipopolisakkarit ve periplazmik aralık bulunur.
Tüberküloz basili ve benzer özellikteki bakteriler bazik boyalar ile diğer bakteriler gibi kolayca boyanmazlar. Bakteri duvar yapısının özelliği nedeniyle bazik boyalar ısıtılarak ve daha uzun süre bekletilerek hücre içine alınabilirler.
Boyayı aldıktan sonra, ortama eklenen alkol ve asit karışımı ile renkleri giderilemez. Oysa diğer bakterilerin asit + alkol karışımında renkleri gider ve zemin boyamak için kullanılan boyanın rengini alırlar. Bu nedenle, bazı bakterilerin mikroskobik incelemelerinde asit ve alkole dirençli boyama yöntemlerine başvurulur.
Ehrlich Ziehl-Neelsen metodu, ARB yöntemlerinden en sık kullanılanıdır. Tüberküloz, lepra basili, nokardialar ve diğer mikobakteriler ARB ile boyanırlar. Tüberküloz hastalığının tanımlanmasında, özellikle balgam başta olmak üzere çeşitli vücut ve sıvı örneklerinden, basil aranmasında değerli bir boyama yöntemidir
ARB ler (Asit-Alkole Dirençli Basil ler), EZN yöntemi ile boyanmıs yaymalarda; mavi zeminde pembe-kırmızı renkte, 1-10 μm uzunlugunda ve tipik olarak ince, çubuk biçiminde düz ya da egilmis-bükülmüs çomaklar seklinde görülürler. Tek tek ya da paralel yerlesimli basiller ya da küme yapmıs basil grupları seklinde izlenirler. Bazen kokoid form ya da boncuk dizisi olarak adlandırılan yogun boyalı bölgeler veya bandlı görünüm olusturan aralıklı boyanma bölgeleri gösterebilirler. Lam üzerinde bulunan çizikler boyanmıs preparatlarda ARB ye benzer görüntüler (artefakt) olusturabilirler. Fakat bunlar mikrovida ile odaklama yapıldıgında kolaylıkla ayırt edilebilirler. Klinik örneklerdeki hücrelere göre odaklama yapıldıgında artefakt görüntüler kaybolurlar.
Mantar Boyaları Maya ve maya benzeri mantarlar, bakteri boyalarıyla (özellikle Gram yöntemi) kolayca boyanabilirler. Küf biçiminde üreyen mantarların tanımlanmasında ise bazı özel boyalar kullanılır.
Bu boya ve maddeler şunlardır: Laktofenol pamuk mavisi : Laktik asit, fenol, gliserin ve pamuk mavisinin distile sudaki karışımıdır. Hif yapılarının ve sporların daha iyi görülmesini sağlar. KOH : %4-10-30'luk sulandırımları kullanılır. Dokudan hazırlanan direkt preparatlarda kitin ve mukus dokusunun parçalanmasını sağladığından mantar elemanlarının daha kolay bir biçimde açığa çıkmasını sağlar. Özellikle deri, saç ve tırnağın mantar infeksiyonlarının tanımlanmasında kullanılır.
Virus Boyaları Viruslar ancak elektron mikroskobu ile görülebilecek boyutlardadır. Elektron mikroskobik incelemeler için preparat hazırlanması özel teknikleri ve bu konuda deneyimli personeli gerektirir. Virusların üremeleri sonucunda hücre içerisinde oluşturdukları inklüzyon cisimcikleri ışık mikroskobunda özel boyalarla boyandığında gözlenebilir. Bu amaçla en çok kullanılan boyalar Giemsa ve Wright'dir.
Kuduz virusunun beyinde oluşturduğu ve Negri cisimciği olarak anılan yapılar, Seller metodu ile boyanır. Bu boyama ile Negri cisimcikleri parlak vişne renginde, çekirdek maddeleri koyu mavi, sinir hücreleri mavimsi renktedir. Viruslar ayrıca hücre kültürlerinde üretilerek, gerek hücrelerde oluşturdukları değişiklikler gerekse oluşturdukları inklüzyon cisimleri çeşitli boyalar kullanılarak incelenebilir.
Parazit Boyaları Dışkının parazitolojik açıdan mikroskobik olarak incelenmesi boyalı ve boyasız olarak yapılır. Boyasız preparatların hazırlanmasında serum fizyolojik kullanılır. Ayrıca biyokimyasal incelemeler için çeşitli boya ya da kimyasal maddelerden yararlanılır.
Serum fizyolojik ile inceleme: Lam üzerine bir damla serum fizyolojik konur. Temiz bir tahta çöp yardımı ile bir parça dışkı alınarak serum fizyolojik ile karıştırılıp, süspansiyon haline gelmesi sağlanır. Daha sonra üzerine lamel ile kapatılarak ışık mikroskobunun önce 10'luk, daha sonra 40'lık objektifleriyle incelenir. Bu yöntemde boya kullanılmadığından protozoonların insanlarda hastalık yapan hareketli trofozoit şekillerini görmek mümkün olur.
Boyalı inceleme: Bu amaçla kullanılan başlıca boyalar eozin ve lugol'dür. Bu metodlar ile dışkıda parazit yumurtaları, kistleri ve larvalarının ince yapılarının görülmesi mümkündür.
Eozin boyası: Eozinin serum fizyolojik içindeki %0,1'lik sulandırımından bir kaç damla taze dışkı üzerine eklenir. Lamel ile kapatılır. Zemin kırmızı, parazit yumurtaları ise soluk pembe boyanır.
Lugol: Potasyum iyodür ile iyot karışımı olan lugol solusyonu taze dışkı preparatı üzerine 1 damla damlatılır ve lamel ile kapatılır. Parazit yumurtaları sarıkahverengi olarak boyanırlar. Dışkının parazitolojik incelenmesinde santrifüj ve diğer yöntemlerle yoğunlaştırma işlemi yapılarak parazit elemanlarının görülme oranı arttırılabilir
Giemsa Boyama Yöntemi Kanın şekilli elemanlarının değerlendirilmesinde ve kan parazitlerinin tanısında yararlanılan bir boyadır. Giemsa boyamada kullanılacak lamın temizliği önemlidir. Bu amaçla alkoleter karışımı veya asetondan yararlanılır.
İnce yayma preparat hazırlamak için; Hastanın sol elinin yüzük parmağının ucu iyot-alkol karışımı ile dezenfekte edildikten sonra, steril lanset ile delinir. Parmak daha geriden yavaşça sıkılarak ilk damlanın dışarı atılması sağlanır. İkinci damla temizlenmiş lamın üzerine ve kısa kenarına yakın kısmına değdirilerek alınır. Daha sonra ikinci bir lam veya lamel yardımı ile birinci lamla arasında 45 açı olacak şekilde kan damlasına doğru yaklaştırılır, kan, lamın kenarına yayıldıktan sonra ileri doğru çekilip ince yayma tamamlanır. İnce yaymada tüm hücreleri incelemek mümkündür.
İnce yayma preparatının hazırlanışı; Üstteki lam önce küçük ok çizgisinde itilir, daha sonra büyük ok istikametinde çekilir. İşlemler 1-2 - 3 sırasına göre tamamlanır.
Kalın damla preparat hazırlamak için, Aynı şeklide parmak ucundan kan alınarak lam üzerine konur. Bu kez diğer lamın sivri ucu kullanılarak 1,5 cm2'lik bir alanı geçmeyecek şekilde karıştırılarak kanın pıhtılaşmadan kuruması sağlanır. Bu durumda eritrositler parçalanarak parazitler açığa çıkacak, az bir alana daha yoğun parazit düşmesi sağlanacaktır.
A-Kalın damla preparatın hazırlanışı B-Kalın damla ve ince yayma aynı lamda bir hasta için hazırlanmıştır.
Giemsa boyası kullanılarak kanda aranan başlıca parazitler; sıtma, kala-azar, filiariazis etkenleridir.
Sıtma hastalığı etkenleri plazmodyum'lardır. Plazmodyumlar insanlara sivrisineklerle bulaşır. Parazitler öncelikle karaciğer hücrelerine daha sonra eritrositler içine yerleşirler. Eritrositler içerisinde başlangıçta tipik taşlı yüzük görünümleri vardır. Yüzüğün taşlı kısmını çekirdek oluşturur ve pembe kırmızı renktedir. Sitoplazma, yüzüğün halkasına benzer ve mavi renktedir. Sıtma parazitlerine ait diğer elemanlar bu yöntemle incelenirler ve etkenin tanımlanması gerçekleştirilir.
İnce yayma preparatta sıtma plazmodyumlarının görülmesi (A-Nukleus B- Sitoplazma)
İMMÜNOLOJİYE GİRİŞ VE ANTİJEN
İmmünoloji tıp biliminin genç bir dalıdır. İmmünolojideki birçok önemli keşif, içinde bulunduğumuz yüzyıl içinde yapılmıştır.
İmmünolojinin tanımı Immünoloji genel anlamda kendi kalıtsal yapısına yabancılık özelliği taşıyan özel maddeleri (=antijenleri) ayırt edebilme yeteneğindeki canlıların, bu özel maddelere karşı gösterdiği reaksiyonların tümünü inceleyen bir bilim dalıdır.
Türkçe'ye "Bağışıklık Bilimi" olarak çevrilebilir. İmmüne terimi eski Yunanca'da askerlik ve vergi gibi bazı halk görevlerinden muaf tutulan (bağışlanan) kişiler için kullanılan İmmünitas sözcüğünden gelmektedir.
Canlıların kendi kalıtsal yapısına yabancı olan maddelere (= antijenlere) karşı gösterdiği reaksiyonlara bağışık yanıt = immün cevap adı verilir.
. ANTİJENLER Organizmaya girdiğinde, kendisine karşı bir bağışık yanıt oluşmasına yol açan ve bu cevap sonucunda oluşan ürün ile özgül olarak birleşebilen maddelere antijen denir.
Antijenler Ag" şeklinde gösterilirler. İmmünojen sözcüğü de antijen ile eş anlamlı olarak kullanılır.
Antijen Olabilme Özellikleri Bir maddenin antijen niteliği gösterebilmesi için bazı özelliklere sahip olması gerekir. Şimdi bu özellikleri ayrı ayrı inceleyelim.
Yabancılık Bir madde, girdiği organizmanın yapısına yabancı ise antijenik özellik gösterebilir. Kimyasal bir bileşiğin yabancılığından söz edilirken, molekülün üç boyutlu yapısı kastedilmektedir. Çünkü her canlı yaşamını ve neslini sürdürebilmek için kendi vücut maddelerini sentezler ve bu maddeler hemen her canlıda protein, yağ, karbonhidrat, nükleik asit dediğimiz aynı temel maddelerden oluşmuştur.
Bu temel maddelerin ince yapısı ise her canlıda aynıdır. Örneğin protein her canlıda aminoasit dizilerinden oluşur, lipidler yağ asitleri zincirlerinden oluşur. Ancak bu temel maddelerin üç boyutlu molekül yapıları canlı türleri arasında önemli farklılıklar gösterir.
Bunu bir örnekle açıklayalım: Kobay ve tavşanda çeşitli proteinler sentezlenir. Her ikisi de protein olmasına rağmen, kobay proteini tavşan için yabancı bir maddedir ve tavşana verilecek olursa kobay proteinine karşı özgül bir bağışık yanıt meydana gelir. Burada iki türe ait proteinler arasındaki fark, proteinleri oluşturan amino-asitlerin dizilişleri, üç boyutlu olarak duruşları ve elektron yükleri bakımından gösterdikleri farklılıktan ileri gelmektedir.
Tabiidir ki bu farklılıklar canlıların ayrı genetik yapılarda olmasına dayanmaktadır. Diğer bir örnek olarak hemoglobin molekülünü verebiliriz. Hemoglobin bir proteindir ve tüm memelilerde işlevi aynıdır. Fakat aminoasit dizilişindeki farklılık nedeniyle bir türe ait hemoglobin başka bir tür canlı için yabancıdır ve antijenik özellik göstermektedir.
İki canlı evrimsel akrabalık yönünden birbirinden ne kadar uzaksa, yapı maddeleri birbirine o kadar yabancıdır ve o kadar iyi antijen özelliği gösterirler. Akrabalık ne kadar yakınsa antijen özelliği o kadar zayıflar ve hatta kaybolabilir. Ancak bağışıklık mekanizması bozulursa canlıda kendine karşı da bağışık yanıt oluşur, ama hastalıkla sonuçlanır (= otoimmün hastalıklar).
Molekül Büyüklüğü Bir maddenin iyi bir antijen olabilmesi için molekül ağırlığının büyük olması gerekir. Genellikle molekül ağırlığı 10.000 ve daha büyük olan maddeler iyi antijendirler.
En kuvvetli antijenite gösteren maddeler ise, molekül ağırlığı 100.000 den fazla olan protein molekülleri dir. Ancak bu kurala uymayan maddeler de vardır. Örneğin; glukagon isimli bir kimyasal madde 3600 molekül ağırlığında olmasına rağmen oldukça iyi bir antijenite gösterir. Diğer taraftan molekül ağırlığı 51.000 olan dextran iyi antijen özelliği göstermez.
Kompleks Kimyasal Yapı Bir molekül ne kadar karışık yapı gösterirse antijenitesi o kadar artar. Örneğin, tek bir çeşit aminoasitten sentezlettirilen sentetik polipeptid zincirleri, molekül ağırlıkları büyük de olsa iyi antijen değildirler. Eğer iki veya üç çeşit amino asitten oluşturulmuşsa biraz daha aktif olabilirler. Doğal protein yapısı ise oldukça karmaşıktır.
. Molekülün Yapısal Sertliği Bir maddenin lenfositler tarafından antijen olarak tanınabilmesi için değişmez bir yapı göstermesi gerekir. Lipid, jelatin gibi belirli bir sertliği olmayan moleküller bu nedenle iyi antijenite gösteremezler.
Çözünebilirlik ve Metabolize Edilebilme Antijenik maddenin, girdiği organizmada çözünebilmesi ve metabolize edilebilmesi antijenik gücünü etkiler. Örneğin, keratin gibi hidrolitik enzimlere dayanıklı olup metabolize edilemeyen, parçalanamayan maddeler antijenik değildirler.
Benzer şekilde naylon, teflon, polistren, poliakrilamid gibi maddeler makromolekül olmasına karşın metabolize edilemezler ve antijenite göstermezler. Bunlara karşı bağışık yanıt oluşmaz. Bu nedenle doku içine yerleştirilen protezlerin çoğu bu maddelerden yapılmıştır.
Emilim ve Atılım Hızı Antijenik maddenin immün sistemi uyarabilecek bir süre organizmada kalabilmesi antijenitesini etkiler. Genellikle yavaş emilen ve organizmadan yavaş atılan maddelerin immün sistemle etkileşimi daha iyi olduğundan antijeniteleri de daha güçlüdür. Hızlı emilip, hızla vücuttan atılanlar iyi antijen değildir.
Elektrik Yükü İyi bir antijenik madde elektrik yükü taşımalıdır. Molekülün tümü yerine epitopun mikro çevresindeki elektrik yükü daha önemlidir. Çünkü elektrik yüklü gruplar moleküle, sulu ortamda eriyebilirlik kazandırarak çevre ile daha iyi temas etmelerini, dolayısıyla immün sistem hücrelerine daha kolay girmelerini sağlayan hidrofilik nitelik kazandırırlar. Ancak çok kuvvetli (+) veya (-) yüklü olanlar başka bileşikler tarafından hızla tutulup örtüldüğünden iyi antijen değildirler.
Diğer Özellikler Genetik yapı, tür, yaş,...; Antijenin verildiği canlıya ait olan bu özellikler maddenin antijenitesini etkiler. Örneğin, saf polisakkarit insan ve farede antijenik iken, tavşan ve kobayda antijenik değildir. Hatta aynı türün tek tek bireylerinde bile aynı antijene karşı oluşan bağışık yanıt gücü farklı olabilmektedir. Bir salgında kişilerin hastalığı hafif veya ağır geçirmeleri de bağışık yanıtın gücü ile, bu da genetik yapı, yaş vb. ile yakından ilgilidir.
Antijen miktarı (Dozu): Antijenik maddenin miktarı antijeniteyi, dolayısıyla bağışık yanıtın gücünü etkiler. Genel olarak bağışık yanıtın gücü antijenin artan dozuna paralel olarak artış gösterir. Ancak miktar çok az olursa immün sistem uyarılamaz ve bağışık yanıt oluşmaz, miktar çok fazla olursa yine immün sistem felç olur ve iyi bir bağışık yanıt oluşamaz.
Antijenin organizmaya giriş veya veriliş yolu; antijeniteyi etkiler. Parenteral (enjeksiyon ile) giriş antijeniteyi arttırır. Fakat ağız yoluyla veya deri mukoza yolu ile girerek iyi antijenite gösteren maddeler de vardır. Giriş veya veriliş yolu bağışık yanıtın gücünü ve çeşidini etkiler. İyi bir bağışık yanıt almak istediğimizde antijenin uygun dozda, uygun yolla ve uygun zaman aralıkları ile verilmesi gerekir. Bu konu, aşı uygulamalarında çok önemlidir.
ANTİJENLERİN YAPILARI Antijeni tanımlarken, girdiği organizmada bağışık yanıt oluşturduğunu ve bu yanıt sonucunda oluşan antikorlar ile özgül olarak (yani sadece bu antikorla) birleşebildiğini söylemiştik. Antijen ile antikorun birleşmesi kimyasal bir temele dayanır, ancak antijen molekülünün tümü bu birleşmeye katılmaz.
Antijen molekülünün yüzeyinde, antikor sentezinde rol oynayan ve sentezlenen özgül antikor ile birleşmeyi sağlayan, molekülün çıkıntısı şeklinde, basit kimyasal yapılar bulunur. Antijen molekülünün yüzeyinde bulunan ve kendi özgül antikorları ile birleşmeyi sağlayan, böylece antijenin özgüllüğünü belirleyen bu kimyasal uç yapılara belirten grup = determinant grup veya kısaca epitop adı verilir.
Epitop tüm antijen molekülüne oranla oldukça küçüktür. Bir antijen molekülünde aynı veya farklı kimyasal yapıda birçok epitop bulunabilir. Epitop sayısı antijenin molekül büyüklüğü ve kompleksliği ile yakından ilgilidir. Böylece bir antijen molekülü, birden fazla sayıda antijen özgüllüğü gösterebilir ve farklı yapıdaki her epitop, kendine karşı oluşan özgül antikorlarla ayrı ayrı birleşebilir.
Antijenler multivalandır, yani bir antijen molekülü çok sayıda antikorla birleşebilir. Antijen epitopu ile özgül antikorun antijen bağlama yeri arasındaki bu birleşme bir anahtarkilit uyumuna benzetilebilir
Birleşmenin gücü uygunluk derecesine bağlıdır. Uyum ne kadar fazla ise antijen-antikor birleşmesi o kadar sağlam olur. Çünkü antijen-antikor birleşmesi çok özgül olmasına rağmen kuvvetli bir kimyasal bağlanma değildir. Bu birleşmede düşük enerjili, zayıf bağlar rol oynar. Ancak iki molekül (Ag ve Ab) birbirine ne kadar yaklaşırsa (ki bağlanma yerlerinin yapısı birbirine ne kadar uygunsa yakınlaşma o kadar fazla olur) aradaki bağların gücü de o ölçüde artmaktadır ve bağlanma daha sağlam olmaktadır.
ANTİJEN ÇEŞİTLERİ VE HAPTEN HAPTEN Tek başına antijenik olmayan ancak bir taşıyıcı proteinle bağlandıklarında immün yanıt oluşturan maddelerdir.
Kimyasal Bileşiklerin Antijenik Özellikleri Proteinler: En iyi antijen özelliği gösteren kimyasal bileşiklerdir. Karbonhidratlar: Büyük molekül ağırlığı olan bazı karbonhidrat molekülleri (polisakkaritler) antijen özelliğindedir. Saf polisakkarit antijenlere karşı İgM sınıfı antikorlar sentezlenir. Mono ve disakkarit gibi küçük moleküller antijenik değildir, ancak hapten özelliği gösterirler.
Yağlar: Saf halde iken antijenik özellikleri yoktur. Ancak protein ve polisakkaritlerle birleştiklerinde (lipoprotein ve lipopolisakkarit halinde) antijen özelliği kazanabilirler. Nükleik asitler: Bunlar da iyi antijen özelliği göstermezler. Ancak parçalandıklarında veya proteinlerle birleştiklerinde (= nükleoprotein) antijenik özellik kazanabilirler.
İlaçlar ve çeşitli kimyasal bileşikler: Küçük molekül ağırlıklı ve basit kimyasal yapıda olmalarına rağmen pekçok ilaç ve kimyasal maddeye karşı bağışık yanıt oluşabilmektedir. Çünkü bu maddeler, girdikleri canlının proteinleri veya bazı kan hücrelerinin yüzeyine yapışarak antijenite kazanabilirler. İlaçlara karşı allerjik reaksiyonların çoğu da bu mekanizmayla gelişmektedir.
Çapraz reaksiyon: Bir antijen molekülünde çok sayıda epitop bulunduğunu söylemiştik. Bu epitopların bazıları başka bir antijen yüzeyindeki epitoplara benzeyebilir ve bir antijene karşı oluşmuş antikorlar başka antijen epitopları ile de bağlanabilirler. Ancak bu bağlanma antikorun özgül antijeni ile olan bağlanma kadar güçlü değildir. Bu birleşmeye "Çapraz Reaksiyon" diyoruz. Evrimsel gelişme yönünden yakınlık gösteren ve akraba olan türlerin benzer antijenleri arasında çapraz reaksiyonlar olabilir.
ÇEŞİTLİ ANTİJEN ÖRNEKLERİ Mikrop Antijenleri Tüm canlılarda olduğu gibi mikroplarda da birçok antijenik yapı bulunur. Mikroplar organizmaya girdiklerinde tüm bu antijenik maddelerine karşı bağışık yanıt meydana gelir. Oluşan bağışık yanıt sonucunda da organizma mikrobu etkisiz hale getirerek hastalıktan korunmuş olur. Ayrıca laboratuvarlarda mikropları tanımak için veya mikrobun yaptığı hastalığın tanısını koymak için mikrop antijenleri ve bunlara karşı oluşan özgül antikorlardan yararlanılır. Yine aşı hazırlanması yönüyle de mikrop antijenlerinin bilinmesi önemlidir.
Mikropların antijenik yapılarından bazıları şunlardır: Viruslarda, zarf ve kılıf antijenleri Bakterilerde, kapsül maddesi, hücre duvarı maddeleri, kirpik antijeni, salgılanan enzim ve toksinler
Kan Grubu Antijenleri İnsanların eritrositlerinin yüzeyinde bulunan antijenlerdir ve kişilere göre farklılık gösterebilirler. Pratikte önem taşıyan kan grubu antijenleri ABO ve Rh sistemleridir. Daha farklı, fakat sadece araştırmalarda kullanılan başka kan grubu antijen sistemleri de vardır.
ABO kan grubu sisteminde eritrosit yüzeylerinde A ve B olmak üzere iki tip antijen, serumda ise bu antijenlere karşı antikorlar bulunur. Bunlara da anti-a, anti-b denir.
ABO kan grubu antijenlerinin ve bunların serumdaki antikorlarının bulunma şekillerine göre insanda A, B, AB, O olmak üzere dört kan grubu vardır.
Rh sisteminde ise eritrosit yüzeyinde Rh antijeninin varlığı söz konusudur. Kişi Rh antijeni taşıyorsa Rh (+) pozitif, taşımıyorsa Rh(-) negatif olarak ifade edilir.
Bir kişinin kan grubu söylenirken ABO ve Rh sistemleri birlikte belirtilir. Örneğin, A, Rh (-) (Okunuşu: A grubu er-aş negatif) O, Rh (+) (Okunuşu: O grubu er-aş pozitif) gibi Kan gruplarının saptanması, kan transfüzyonlarında çok önemlidir. Ayrıca adli tıpta, babalık tayininde, doku ve organ aktarımlarında ve birçok bilimsel araştırmada kullanılmaktadır.
Doku Uygunluk Antijenleri. Deney hayvanlarında yapılan doku ve organ nakli araştırmalarında, aynı türün bireyleri arasında dahi farklı doku antijenleri olduğu gösterilmiştir. Nakledilen doku ve organların reddine (= atılmasına) neden olan bu antijenlere doku uygunluk veya transplantasyon (=doku-organ nakli) antijenleri adı verilmiştir.
Doku antijenleri vücudun tüm hücrelerinde bulunur, sadece eritrosit ve yağ dokusu hücrelerinde bulunmaz. Bu antijenlerin yapımı genetik kontrol altındadır. İnsanda 6. kromozomda bulunan bu gen bölgesine "Büyük doku uygunluk kompleksi gen bölgesi = Major Histocompatibility Complex = MHC" adı verilir.
Doku uygunluk antijenlerine MHC antijenleri veya ilk kez Lökositlerde gösterildiği için "İnsan Lökosit Antijenleri = Human Leucocyte Antigens = HLA" adı da verilmektedir. İnsanda; HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ olmak üzere yedi ana grup vardır. Ayrıca her grupta çok sayıda alt tip bulunur.
Doku ve organ nakillerinde HLA antijenlerine bakılarak aynı veya birbirine benzerlik gösterenler tercih edilir. Bu antijenler Mendel kurallarına göre soydan soya geçiş gösterirler. Akrabalık derecesi ne kadar yakınsa HLA antijenleri de o derece birbirine benzerdir. Tek yumurta ikizlerinde HLA antijenleri özdeştir (tamamen aynıdır).