MARMARA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DERGİSİ

MARMARA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DERGİSİ VOLUME CİLT: 28 ISSUE SAYI: 1 JANUARY OCAK 2015 ONLINE ISSN: 1309-9469 PRINT ISSN: 1019-1941

Marmara Medical Journal Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi DERGİ HAKKINDA Marmara Medical Journal, Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından yayınlanan multidisipliner ulusal ve uluslararası tüm tıbbi kurum ve personele ulaşmayı hedefleyen bilimsel bir dergidir. Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, tıbbın her alanını içeren klinik ve deneysel çalışmaları, ilginç olgu bildirimlerini, derlemeleri, davet edilmiş derlemeleri, Editöre mektupları, toplantı, haber ve duyuruları, klinik haberleri ve ilginç araştırmaların özetlerini, ayırıcı tanı, tanınız nedir başlıklı olgu sunumlarını, soru-cevaplar, tıp gündemini belirleyen güncel konuları ve özellikle Halk Sağlığı ve Tıp Eğitimi ile ilgili çalışmaları ve tıp öğrencilerinin yaptıkları çalışmaları yayınlar. Periyodu: Yılda 3 sayı olarak Ocak, Mayıs ve Ekim aylarında yayınlanmaktadır. Yayına başlama tarihi: 1988 e-yayına başlama tarihi: 2004 (2004 yılından 2011 yılına kadar sadece elektronik ortamda yayınlanmıştır.) Yayın Dili : İngilizce ve Türkçe ISSN: 1019-1941 eissn: 1309-9469 Temel Hedef Kitlesi: Tıp alanında tüm branşlardaki hekimler, uzman ve öğretim üyeleri, tıp öğrencileri İndekslendiği dizinler: EBSCO, SCOPUS, EMBASEExcerpta Medica, DOAJ (Directory of Open Access Journals), Cross Ref, ULRICH s Database, Google Scholar, British Library, ULAKBİM Tıp Veri Tabanı (Türk Tıp Dizini), Türkiye Atif Dizini, Türk Medline (Ulusal Atif İndeksi), Türkiye Klinikleri Tıp Veri Tabanı, Milli Kütüphane-Türkiye Makaleler Bibliyografyası Makalelerin ortalama değerlendirme süresi: 2 haftadır Yayın Hakları: Marmara Medical Journal in basılı ve web ortamında yayınlanan yazı, resim, şekil, tablo ve uygulamalar yazılı izin alınmadan kısmen veya tamamen herhangi bir vasıtayla basılamaz. Bilimsel amaçlarla kaynak göstermek kaydıyla özetleme ve alıntı yapılabilir. Makale takibi - İletişim Seza Arbay Marmara Medical Journal (Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi) Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dekanlığı, Temel Tıp Bilimleri Binası, 3. Kat, Başıbüyük Mahallesi, Başıbüyük, Maltepe, İstanbul, Türkiye Tel: +90 216 4144734 Faks: +90 216 4144731 E-posta: mmj@marmara.edu.tr Yayınevi Marmara Üniversitesi Yayınevi Göztepe Kampüsü, Kadıköy 34722 İstanbul Tel. +90 216 348 4379, Faks +90 216 348 4379 E-posta: yayinevi@marmara.edu.tr Baskı Tarihi: Haziran 2015 Dergi asitsiz kağıda basılmaktadır. Baskı Kültür Sanat Basımevi Litros Yolu 2. Matbaacılar Sitesi ZB7-ZB11 Topkapı / Zeytinburnu / İstanbul Tel: 0212 674 00 21-29 - 46 Faks: 0212 674 00 61 ABOUT JOURNAL The Marmara Medical Journal is a multidisciplinary, academic publication of Marmara University, School of Medicine. It is an open access, double blind peer-reviewed journal. The journal aims to publish papers of general interest relating to advances in medical practice and novel treatments that will be of interest to general practitioners, medical students, and senior practitioners and specialists. We especially welcome papers on Public Health and Medical Education. MMJ also aims to publish all types of research conducted by medical students. It includes original research papers, case reports, reviews, articles about clinical and practical applications and editorials, short reports, letters to the editor and occcasionally a photo-quiz. Frequency: Three times a year ( January, May, October) Year of first print issue: 1988 Year of first online issue: 2004 (Between 2004 and 2011 the Journal was published solely in an electronic format.) Language : English and Turkish Print ISSN: 1019-1941 eissn: 1309-9469 The articles published in the Marmara Medical Journal are indexed and abstracted in: EBSCO, SCOPUS, EMBASE / Excerpta Medica, DOAJ (Directory of Open Access Journals), Cross Ref, ULRICH S Database, Google Scholar, The British Library, Turkish Academic Network and Information Center (ULAKBİM)-Turkish Medical Database, TURK MEDLINE - Türk Sağlık Bilimleri İndeksi (Index of Turkish Health Sciences), Türkiye Makaleler Bibliyografyası (Bibliography of Articles in Turkish Periodicals), Türkiye Klinikleri Tıp Dizini (Turkish Citation Index) We aim to reach a decision on all manuscripts within two weeks of submission. Permission Request: Manuscripts, tables, graphics, figures and pictures published in the Marmara Medical Journal cannot be reproduced, archieved in a system, used in advertisement materials, without a written permision. Citations can be included only in scientific articles with referral. Correspondence and communications Seza Arbay Marmara Medical Journal (Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi) Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dekanlığı, Temel Tıp Bilimleri Binası, 3. Kat, Başıbüyük Mahallesi, Başıbüyük, Maltepe, İstanbul, Turkey Tel: +90 216 4144734 Faks: +90 216 4144731 E-mail: mmj@marmara.edu.tr Publisher Marmara University Press Göztepe Kampüsü, Kadıköy 34722 İstanbul, Turkey Tel. +90 216 348 4379, Faks +90 216 348 4379 E-mail: yayinevi@marmara.edu.tr Printing Date: June 2015 The Journal is printed on acid-free paper. Printing Press Kültür Sanat Basımevi Litros Yolu 2. Matbaacılar Sitesi ZB7-ZB11 Topkapı / Zeytinburnu / İstanbul Tel: 0212 674 00 21-29 - 46 Faks: 0212 674 00 61 In the name of Deanship of Marmara University, School of Medicine Dean Ömer Günal, M.D. Editor-in-Chief M. Pamir Atagündüz, M.D. Associate Editors Arzu Denizbaşı Altınok, M.D. İsmail Cinel, M.D. Beste Atasoy, M.D. Arzu Akşit İlki, M.D. Deniz Duman, M.D. Ümit Uğurlu, M.D. Ozan Kocakaya, M.D. Statistics Editor Nural Bekiroğlu, Ph.D. Coordinators Seza Arbay, MS Vera Bulgurlu, cand. mag., Ph.D. International Editorial Board Adnan Dağçınar, M.D. Istanbul, Turkey Athanasios Fassas, M.D. Arkansas, USA Ayşegül Atmaca, M.D. Samsun, Turkey Cem Ergon, M.D. Izmir, Turkey Christoph Grüber, M.D. Frankfurt, Germany Christos Mantzoros, M.D. Boston, USA Devrim Dündar, M.D. Kocaeli, Turkey Dilek Seçkin, M.D. Istanbul, Turkey Emin Kansu, M.D. Ankara, Turkey Esen Akpek, M.D. Baltimore, USA Evren Yaşar, M.D. Ankara, Turkey Feray Cinevre Soyupak, M.D. Isparta, Turkey George Velmahos, M.D. Boston, USA Hakkı Arıkan, M.D. Istanbul, Turkey İbrahim Şahin, M.D. Malatya, Turkey İhsan Nuri Akpınar, M.D. Istanbul, Turkey Isac I Schnirer, M.D. Tel Aviv, Israel Jan Lotvall, M.D. Gothenburg, Sweden Kaan Boztuğ, M.D. Vienna, Austria Kayıhan Uluç, M.D. Istanbul, Turkey Kazunori Okabe, M.D. Ube, Japan Lydia Ioannido Mouzaka, M.D. Athens, Greece Muzaffer Metintaş, M.D. Eskisehir, Turkey Neşe Perdahlı Fiş, M.D. Istanbul, Turkey Neşe Tuncer Elmacı, M.D. Istanbul, Turkey Nima Rezaei, M.D. Tehran, Iran Oğuzhan Deyneli, M.D. Istanbul, Turkey Olcay Yeğin, M.D. Antalya, Turkey Önder Ergönül, M.D. Istanbul, Turkey Özge Ecmel Onur, M.D. Istanbul, Turkey Özlem Yenice, M.D. Istanbul, Turkey Rainer W Guillery, M.D. Oxford, England R Lucian Chirieac, M.D. Boston, USA Robert W Mahley, M.D. San Francisco, USA Scott J Swanson, M.D. Boston, USA Seval Güneşer, M.D. Adana, Turkey Todor A Popov, M.D. Sofia, Bulgaria Toni Lerut, Leuven, M.D. Leuven, Belgium Yoshifumi Naka, M.D. New York, USA Yusuf Yazıcı, M.D. New York, USA Tevfik Yoldemir, M.D. Istanbul, Turkey Ziya Salihoğlu, M.D. Istanbul, Turkey

Marmara Medical Journal Instructions to Authors Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi The Marmara Medical Journal publishes original scientific research, case reports, reviews and letters. Manuscripts submitted under multiple authorship are reviewed on the assumption that all listed authors concur with the submission and that a copy of the final manuscript has been approved by all authors and tacitly or explicitly by the responsible authorities in the laboratories where the work was carried out. Manuscripts are accepted for review with the understanding that no substantial portion of the study has been published or is under consideration for publication elsewhere. Regular articles should be approximately 20-25 pages doublespaced, including references, with margins of 2.5 cm. Review articles should be similar in length to a regular article with approximately 50 references. Manuscript files must be prepared in Word, WordPerfect, EPS, LaTeX, text, Postscript, or RTF format. Figures/Images should be embedded in the Manuscript file or sent as external files in TIFF, JPG, BMP, Postscript, or EPS format. The Marmara Medical Journal is in compliance with the Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals created by International Committee for Medical Editors. Preparation of Manuscript a. The Title page should contain the article title, authors names and academic or professional affiliations, and the address for manuscript correspondence (including e-mail address and telephone and fax numbers). Pages should be numbered consecutively and organized as follows: (1) two structured abstracts (Turkish and English) of not more than 200 words each must be included. The abstracts should be divided into the following sections: Objective, Methods, Results and Conclusion, (2) Keywords (3-6 keywords, in Turkish and English should be taken from Medical Subject Headings (MeSH) from Index Medicus), (3) Introduction, (4) Materials and Methods, (5) Results, (6) Discussion and (7) References. b. Introduction. State why the investigation was carried out, note any relevant published work, and delineate the objective of the investigation. c. Methods. New methods or significant improvements of methods or changes in old methods must be described. Details regarding animal housing conditions should be given. All clinical studies must contain: 1) a statement that all experimental protocols have been approved by the Ethical Committee of the Institution prior to the commencement of the studies, 2) a statement that all participants gave informed consent. d. Results. Duplication between the text of this section and material presented in tables and figures should be avoided. Tabular presentation of masses of negative data must be avoided and replaced with a statement in the text whenever possible. The results must be presented clearly, concisely and without comment. e. Discussion. This section must relate the significance of the work to existing knowledge in the field and indicate the importance of the contribution of this study. Unsupported hypotheses and speculation should be omitted. f. References. The style of references is that of the Index Medicus. List all authors when there are six or fewer, when there are seven or more list the first three, then add et al.. Unpublished results or personal communications should be cited as such in the text. Please note the following examples: 1. Yazici D, Taş S, Emir H, Sunar H. Comparison of premeal mixed insulin three times daily and basal-bolus insulin therapy started post-operatively on patients having coronary artery bypass graft surgery. Marmara Med J 2011; 25:16-9. doi: 10.5472/ MMJ.2011.02134.1 2. Walker M, Hull A. Preterm labor and birth. In: Taeusch HW, Ballard RA, eds. Avery s Diseases of the Newborn. Philadelphia: WB Saunders, 1998: 144,153. 3. Lawton J, Ahmad N, Hallowell N, Hanna L, Douglas M. Perceptions and experiences of taking oral hypoglycaemic agents among people of Pakistani and Indian origin: qualitative study. BMJ 2005;30:1247-51. doi:10.1136/bmj.38460.642789. EO 4. WONCA Ad Hoc Task Force on Tobacco Cessation. http:// globalfamilydoctor.com/publications/ new/ november/09.htm. g. Figures. Diagrams and illustrations should be given Arabic numerals. All figure legends should be grouped and written on a separate page. Each Figure

Marmara Medical Journal Instructions to Authors Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi should be in one of the following preferred formats: Tiff, JPEG, PDF, and EPS. h. Tables. Tables should be numbered consecutively with Roman numerals in order of appearance in the text. Type each table double-spaced on a separate page with a short descriptive title directly above and with essential footnotes below. Units will be in general accordance with the International System (SI) as adopted by the 11th General Conference on Weights and Measures. Compliance with the principles of Declaration of Helsinki is accepted as a policy by Marmara Medical Journal. Manuscripts which do not properly consider ethical issues for humans or animals will not be accepted for publication. a) Marmara Medical Journal requires that investigations performed on human subjects have the prior approval of the institutional Committee on Human Experimentation. Authors are required to submit a signed statement as to the date and details of the appropriate review. b) When studies involve the use of experimental animals, manuscripts should briefly describe the procedures employed for animal care and handling. Where drugs are used at particular concentrations in intact animal systems, the author should indicate some rationale for selection of the particular concentration. Role of the Funding Source. All sources of funding should be declared as an acknowledgment at the end of the text. Conflict of Interest: All authors are required to disclose all potential conflicts of interests, including financial interests and relationships and affiliations (other than those listed in the title page of the manuscript) relevant to the subject of the manuscript. Also editors, all participants in the peer-review and publication process must disclose all relationships that could be viewed as potential conflicts of interests. Authorship: Marmara Medical Journal asks the corresponding author to attest that the authors: a) had access to all the study data b) took responsibility for the accuracy of the analysis c) had the authority over manuscript preparation and the decision to submit the manuscript for publication. All manuscripts are examined by the editorial board and refereed critically by two or more reviewers, at least one from another institution. The editor reserves the right to reject or to return the manuscript to the author(s) for additional changes. A copyright release form will be sent automatically by e-mail once your article is received by the Editor. Correspondence and communications regarding manuscripts and editorial material should be sent to: Seza Arbay Marmara Medical Journal Marmara University School of Medicine Temel Tıp Bilimleri Binası, 3. Kat, Başıbüyük Mahallesi, Başıbüyük, Maltepe, İstanbul, Turkey Phone: +90 216 4144734 Fax: +90 216 4144731 E-mail: mmj@marmara.edu.tr

Marmara Medical Journal Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi Contents / İçindekiler Volume / Cilt 28 Issue / Sayı 1 January / Ocak 2015 DERLEMELER / REVIEWS 1 Anksiyete araştırmalarında kullanılan sıçan davranış modelleri Models of rat behavior used for studies of anxiety Aslı AYKAÇ, Kaya SÜER, Cahit TAŞKIRAN 8 Glokom, Parkinson hastalığı ve nörodejenerasyon Glaucoma, Parkinson s disease and neurodegeneration Sevcan Yildiz BALCI, Muhsin ERASLAN, Ahmet TEMEL ÖZGÜN ARAŞTIRMALAR / ORIGINAL ARTICLES 13 Prepubertal testis hücre süspansiyonun dondurulmasında seeding etkisi The effects of a seeding process on the cryopreservation of cellular suspensions of prepubertal testis Gülnaz KERVANCIOĞLU, Şule ÇETİNEL, Elif KERVANCIOĞLU DEMİRCİ, Gülçin EKTER KANTER, M. Ertan KERVANCIOĞLU 21 Akciğer kanserinde sağkalımı etkileyen klinikopatolojik özellikler Clinicopathological factors related to survival in lung cancer Umut KEFELİ, Bala Başak ÖVEN USTAALİOĞLU, Mahmut Emre YILDIRIM, Burçak ERKOL, Dinçer AYDIN, Nur ŞENER, Alper SONKAYA, Özgür AÇIKGÖZ 27 Minör kafa travmalarında anormal kranial bilgisayarlı tomografi saptamada yüksek risk faktörlerinin belirlenmesi Determination of high risk factors for detection of abnormal cranial computed tomography in minor head injury Erkan ÇOBAN, Gözde ŞİMŞEK ŞEN, Özlem GÜNEYSEL 32 Laparoskopik kolesistektomi uygulanan olgularda safra kesesinin histopatolojik profili Histopathological profile of the gallbladder in cases who have undergone laparoscopic cholecystectomy Ahliman AMİRASLANOV, Kenan YUSİF-ZADE, Jamal MUSAYEV 38 Tinnitusu olan bireylerde müzik terapisinin yaşam kalitesi üzerine etkisi Effect of music therapy on quality of life in individuals with tinnitus Banu MÜJDECİ, Sabri KÖSEOĞLU, İbrahim ÖZCAN, Hüseyin DERE OLGU SUNUMLARI / CASE REPORTS 45 Laparoskopik low anterior rezeksiyon sonrası oluşan anastomoz darlığında balon dilatasyon uygulaması: İki olgu sunumu Endoscopic balloon dilatation of colorectal anastomotic stricture after low anterior resection: Two case reports Sezgin YILMAZ, Ahmet BAL, Ziya Taner ÖZKEÇECİ, Rüçhan Bahadır CELEP, Mustafa ÖZSOY, Ogün ERŞEN, Nazan OKUR, Yüksel ARIKAN 50 Kriptojenik organize pnömoni tanısında tru-cut biyopsi Tru-cut biopsy in cryptogenic organizing pneumonia Baran BALCAN, Şehnaz OLGUN, Seda Beyhan SAĞMEN, Berrin BAĞCI CEYHAN 54 Superior vena kava obstrüksiyonu olan iki hastada geçici hepatik kontrastlanma farklılığı: Bilgisayarlı tomografi bulguları Transient hepatic attenuation differences in two patients with superior vena cava obstruction: Computed tomography findings Ozdil BASKAN, Yusuf SAHİNGOZ TANINIZ NEDİR? 58 Saçlı deride lokalize şişlik ile acil polikliniğine başvuran kız hasta Çisem AKSU LİMON, Ayşe Deniz YÜCELTEN, Burak TEKİN, Neslihan BARANOĞLU HİM, Güniz YAŞÖZ, Nilgün ERKEK 60 Yirmi yaşında erkek hastada çok sayıda asemptomatik skrotal nodüller Yasemin YUYUCU KARABULUT, Engin ŞENEL, Asım USLU

Marmara Medical Journal 2015; 28: 1-7 DOI: 10.5472/MMJ.2015.03661.1 DERLEME / REVIEW Anksiyete araştırmalarında kullanılan sıçan davranış modelleri Models of rat behavior used for studies of anxiety Aslı AYKAÇ, Kaya SÜER, Cahit TAŞKIRAN ÖZET Klinik öncesi çalışmalar kapsamında oluşturulan hayvan modelleri ile yeni ilaçların anksiyolitik etkileri araştırılmaktadır. Bu modellerde en sık kullanılan hayvanlar sıçanlar ve farelerdir. Anksiyete oluşturulan hayvanlarda; çevreyi araştırma ve tanıma davranışlarındaki değişiklikleri inceleyerek, ilaca verilen yanıta bu davranışlardaki değişimlerin saptanması araştırmaların temelini oluşturmaktadır. İnsanlarda görülen anksiyete davranışlarını tam olarak karşılamamakla birlikte hayvan modellerinde sıçanlardaki bu davranışlar modelin esasını oluşturmaktadır. Stres yaratan etken olarak; elektrik şoku, kafeslere eğim verilmesi, olfaktor bulbektomi, ortamın yükseltilmesi, aydınlatmanın değiştirilmesi, sosyal izolasyon, sualtı travmaları, saldırgan hayvanın kendisine ya da saldırgan hayvana ait ipuçlarına (saldırgana ait koku, tüy, idrar vb) maruz bırakma kullanılmaktadır. Oluşturulan strese karşı bu çalışmalarda genellikle aşırı irkilme, bilişsel bozukluklar, gelişmiş korku, düşük sosyal etkileşim gibi anksiyete davranışlarındaki değişimler ölçülmektedir. Sık kullanılan modeller arasında; açık alan, zorunlu yüzme, çatışma testleri, tekrarlayan stres uygulamaları, kuyruktan asma, yükseltilmiş labirentler, sosyal izolasyon, uzun süreli tek bir strese maruz bırakma, kronik hafif stres ve saldırgan ya da saldırgan ile ilgili ipuçlarına maruz bırakma testlerini saymak mümkündür. Bu derlemede, farklı stresörler ile anksiyete oluşturmada kullanılan sıçan modelleri tanımlanmaktadır. Modellerin özellikleri ve kullanım alanları gözden geçirildiğinde; kolay oluşturulabilir Aslı Aykaç ( ) Biyofizik Anabilim Dalı, Tıp Fakültesi, Yakın Doğu Üniversitesi, Lefkoşa, KKTC e-mail: aykacasli@yahoo.com Kaya Süer Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Tıp Fakültesi, Yakın Doğu Üniversitesi, Lefkoşa, KKTC Cahit Taşkıran Tıp Eğitimi Anabilim Dalı, Tıp Fakültesi, Yakın Doğu Üniversitesi, Lefkoşa, KKTC Gönderilme/Submitted: 17.10.2014 Kabul/Accepted: 03.12.2014 ve tekrarlanabilir oluşları, yeni geliştirilmekte olan ilaçların ya da mevcut benzer ilaçların anksiyeteyi önleme ve tedavi edici etkileri daha etkin olarak araştırılmaktadır. Anahtar kelimeler: Anksiyete, Sıçan davranışları, Hayvan modelleri. ABSTRACT This review focuses on the methods of study that investigated the anxiolytic effects of new drugs with animal models. In a research setting, researchers investigate inquiry and recognition behavior changes of animals with anxiety in response to drug therapy. This forms the basis of a research. Although, anxious behaviors of rats do not exactly match the actual human behavior, they are still used as a model of human behavior. Several different stressor agents have been used including electric shocks, tilting the cage, olfactory bulbectomy, elevation of the setup, changing the lighting situation, under water trauma or exposure to predator materials. In these studies, generally the reaction to the stress is tested by observing the changes in the anxious behavior, cognitive impairment, fear and decreased social interaction. Frequently used models are; open field test, forced swimming test, social isolation, conflict tests, repeated stress test, tail suspension test, elevated maze tests, single prolonged test, chronical mild stress and predator scent tests. We explain various rat models and their properties and show how they are used to create anxiety with different stressor agents. Ease and repeatability of these models suggest that they are effective for studying drugs for the prevention and treatment of anxiety. Keywords: Anxiety, Rat behavior, Animal models. Giriş Anksiyete, farklı durumların neden olduğu, kişinin içten ya da dıştan algıladığı tehlikeye karşı duyduğu endişe, 1

2 Aykaç ve ark. Anksiyete araştırmalarında sıçan davranış modelleri Marmara Medical Journal 2015; 28: 1-7 hatta korku duygusudur. Farklı olaylar ya da oluşumlar anksiyeteye sebep olabilir. Anksiyete semptom olarak bir çok mental hastalıkta karşımıza çıkmaktadır [1]. Son yıllarda dünyada anksiyetinin sıklıkla görülmesi bu hastalığın tedavisi ile ilgili gerek klinik, gerekse preklinik çalışmaların artmasına yol açmıştır. Klinik öncesi çalışmalarda, yapılan hayvan modelleri ile yeni ilaçların anksiyolitik etkileri araştırılmaktadır. Bu modellerde kemirgenler arasında en sık kullanılanları sıçanlar ve farelerdir. Bu türler, zemindeki emosyonel ve motivasyonel işlevlerin altındaki mekanizmayı araştırmada yoğun olarak kullanılmaktadır. Sıçanlar, yeni çevreye ilk girdiklerinde, alanın kuytu kısımlarında ya da duvar kenarları boyunca ilerleyip onlar için korunmasız olan alanı tanımak üzere çevrede bulunan nesneleri ve potansiyel tehlikeleri araştırmaya başlarlar. Araştırma davranışları olarak sıçanlar; iki ayağı üzerine kalkma (vertikal aktivite), tırmanma, havayı koklama, süslenme gibi davranışlar sergilerler. Tüm canlı türlerinde olduğu gibi sıçanlar da türlerini tehdit eden bir uyarı ile karşılaştıkları zaman kendi türlerine özgün davranışlar sergilemektedirler. Sıçanlar, kendini tehdit eden şeyin ne olduğunu anlamak, hakkında bilgi toplamak veya çevreyi incelemek için risk ölçümü davranışı olarak nitelendirilen havayı koklama ve uzanma hareketleri ile savunmaya geçmektedirler. Sıçanlar, kendileri için korunmasız alan olarak gördükleri alanlarda bu davranışlarını arttırmış olmaları anksiyete ile yakından ilişkilidir. Anksiyete durumu arttıkça sıçanların araştırma davranışları azalmaktadır [2]. Sıçanların bilmedikleri bir alanı araştırırken ortamın aydınlık ya da karanlık olması araştırma davranışlarını etkilemektedir. Sıçanlar, bilmedikleri çevrenin karanlık alanlarında hareket etmede rahat hissederlerken, parlak ışıklı alanlardan uzak durmayı tercih ederler. Sıçanın ortamın karanlık alanlarında hareket etmesi ve aydınlık alanda hareketten sakınması anksiyetenin göstergesidir. Sıçanın karanlık bölmede kalıp aydınlık bölmeye ilk geçiş süresindeki uzama anksiyetedeki artışa paralel olarak değerlendirilmektedir [3]. Sıçanların bilmedikleri bir çevreden uzak durmasında etkili olan bir diğer etken ise alanın yükseltilmiş olmasıdır. Sıçanın yükseltilmiş alanın kıyı noktasını görmesi de, o alandan sakınması için iyi bir etkendir. Korunma davranışı, hayvanın görme kapasitesi, lokomotor aktivitesi, motive edici etkenler ve onun araştırma yöntemine bağlı olarak değişebilmektedir [4]. Yeni bir çevreye giren sıçanlar yemek yemede isteksizleşirler ve yemeği yemeleri için geçen süre uzamaktadır [2, 5, 6]. Stres kaynaklı anksiyete ile ilgili literatürde yer alan hayvan modelleri çok çeşitlilik göstermektedir [7]. Deney hayvanlarının kullanıldığı anksiyete modelleri ile insandaki duruma benzer değişiklikler taklit edilmeye çalışılmaktadır. Ancak insandaki durumu bire bir yansıtan bir hayvan modeli bulunmamaktadır [8]. Hayvan modelleri her ne kadar insanda görülen anksiyete davranışlarını tam olarak karşılamasa da aşağıda sınıflandırılmaya çalışılan sıçan davranışları araştırmalarda kullanılan modeller için çıkış noktası oluşturmaktadır. Anksiyete oluşturmada kullanılan sıçan modelleri Sıçanların kullanıldığı klinik öncesi araştırmalarda anksiyete oluşturmada çeşitli tiplerde stresörler kullanmıştır [9, 10]. Stresör olarak elektrik şoku, kafeslere eğim verilmesi, koku alma duyusunun yok edilmesi, ortamın yükseltilmesi, ışıklandırma seviyeleri değiştirilmiş ortamlar, sosyal izolasyon, sualtı travmaları (su dolu ortamlar), saldırgan hayvanın kendisine ya da saldırgan hayvana ait ipuçlarına (saldırgana ait koku, tüy, idrar vb.) maruz bırakma kullanılmaktadır. Sıçanda anksiyete oluşup oluşmadığının izlenmesi ya da oluşan anksiyetenin skorlanmasında çeşitli testler kullanılmaktadır. Bu testler arasında; açık alan, zorunlu yüzme, çatışma testleri, tekrarlayan stres uygulamaları, kuyruktan asma, yükseltilmiş labirentler, uzun süreli tek bir strese maruz bırakma, kronik hafif stres ve saldırgan ya da saldırgan ile ilgili ipuçlarına maruz bırakma testlerini saymak mümkündür [10-15]. 1. Açık alan testleri Açık alan korkusu ile tetiklenen anksiyete, spontan lokomotor aktivitelerin ve sedasyonun tespitinde kullanılan testtir. Açık alan testi, yuvarlak, kare veya dikdörtgen bir alanda sıçanın kaçışını engelleyen duvarlara yakın bir yere ya da merkeze bırakılıp günün değişik saatlerinde hareketlerinin gözlendiği bir testtir (Şekil 1). Bu modelde kullanılan test alanlarının yanısıra, aydınlatma seviyeleri, kullanılan aydınlatma çeşitleri hatta alanın aydınlatılan yerleri de farklı olabilir. Ayrıca alanda platform, kolon, tünel gibi bölümler de yer alabilir [16, 17]. Açık alan testinde zaman ölçütleri olarak; merkeze ilk giriş latensi, merkezde geçirilen süre ve duvar diplerinde geçirilen süreler değerlendirilmektedir. Aydınlık-

Marmara Medical Journal 2015; 28: 1-7 Aykaç ve ark. Anksiyete araştırmalarında sıçan davranış modelleri 3 karanlık tercih testinin zaman değerlendirilmesinde çeşitli parametreler değerlendirilmektedir. Bunlar; sıçanın aydınlık bölümden karanlık bölüme (ya da tam tersi olan karanlık bölümden aydınlık bölüme) ilk geçişinde geçen süre, sıçanın tüm test süresi boyunca aydınlık alanda geçirdiği toplam süre ve sıçanın test süresi boyunca karanlık alanda geçirdiği toplam süredir. Sıçanların kendilerini savunma için sergiledikleri donakalma hareketi ise en az 10 solunum sayısı kadar geçen sürede hiçbir hareket yapmaması olarak değerlendirilmektedir [16, 17]. 2. Zorunlu yüzme testleri Morris in su tankı olarak da bilinen Porsolt un zorunlu yüzme testi, sıklıkla depresyon ve anksiyete araştırmalarında, antidepresanların etkinliğini araştırmada kullanılmaktadır. Su dolu tankın içinde sıçanların kaçabilmeleri için bir platformun bulunduğu test düzeneği; 45 cm yüksekliğinde pleksiglastan yapılmış silindir kabın 30 cm sinin 25ºC opak su ile doldurulmasıyla oluşturulmaktadır. Deneylerin ilk aşamalarında sıçanların kaçmak için kullanabilecekleri platform, deney düzeneğinde yer alırken, anksiyetenin değerlendirileceği deneyler sırasında platform deney düzeneğinden çıkarılmaktadır. Onar dakikalık periyotlarda gerçekleştirilen deneylerde sıçanların ortamdan kurtulmak için çabalamaktan vazgeçip tamamen hareketsizleştiği süre skorlanmaktadır. Bu davranışsal parametreler dışında sıçanların tankın içindeki davranışları; yüzme ve tırmanma hareketleri de kaydedilmektedir [18-20]. Deneylerde sıçanın ortamdan kurtulmak için platformu bulma çabasından kısa süre içinde vazgeçmesi anksiyetedeki artış ile doğru orantılı olarak artmaktadır. Şekil 1. Açık alan testi düzeneği Lokomotor aktivitesi olarak; deney düzeneğinin merkezinde ve duvar diplerinde sıçanın geçtiği karelerin sayısı, merkezden geçiş sıklığı kaydedilmektedir. Açık alan testinde davranış ölçütleri olarak incelenen parametreler; duvara dayalı olarak ayağa kalkma davranışı (düzenekten dışarı çıkma isteği), serbest ayağa kalkma davranışı (düzeneği araştırma isteği) ve merkezde serbest ayağa kalkma davranışıdır. Aydınlık-karanlık tercih testinde davranış ölçütleri olarak; aydınlıktan karanlığa baş uzatma sayısı, karanlıktan aydınlığa baş uzatma sayısı, karanlık bölüme geçiş sıklığı, aydınlık alandan karanlık alana ve karanlık alandan aydınlık alana toplam giriş-çıkış sayısı skorlanmaktadır. Bu verilerin değerlendirilmesi sırasında; merkezi alanda geçirilen toplam sürenin azalması, merkezi alana geçiş sayısının azalması ve vertikal aktivitedeki artış, sıçandaki anksiyolitik etkinin varlığı ile doğru orantılıdır. Bu düzenekte duvarlara yakın alanlar sıçan için korumalı, güvenli alanlarken, merkezi alan sıçan için anksiyojenik etki yaratmaktadır [16, 17]. 3. Ödül-ceza sistemine dayalı çatışma testleri Çatışma testleri genellikle potansiyel anksiyolitik ajanların etkilerini araştırmada kullanılmaktadır. Çatışma testleri önce cezasız sonra cezalı ödüllendirme bölümlerinden oluşmaktadır. Ödül olarak yiyecek ve/veya su kullanılmaktadır (Şekil 2). Şekil 2. Ödül testi düzeneği Şartlı zıtlaşma testinde; su ve yem vererek ödüllendirme ve ayaktan şok vererek cezalandırma sistemi kullanılmaktadır.

4 Aykaç ve ark. Anksiyete araştırmalarında sıçan davranış modelleri Marmara Medical Journal 2015; 28: 1-7 Vogel zıtlaşma testinde; elektriksel uyarılar sıçana su içerken verilmektedir. Bir gün boyunca sussuz bırakılan sıçana 5 dk su içme izninin verilmesi sırasında 21. yalamadan itibaren ayaktan şok uygulanmaktadır. Geller Seifter çatışma testi ise aç ve susuz bırakılan sıçana kafesin tabanında yer alan pedala her basışında şekerli su ile ödüllendirme sistemi uygulanır. Sonraki bölümlerde ödül sistemi ile birlikte pedala bastıkça bellirli aralıklar ile ayaktan şok uygulanmaktadır [2, 21, 22]. Bu testlerin ödül etaplarında, sıçanın pedala kaç kez basmış olduğu veri olarak toplanmaktadır. Testin cezalı ödüllendirilme bölümünde yine sıçanın pedala basış sayısı veri olarak toplanmaktadır. Şekil 3b. Yükseltilmiş artı labirent düzeneği 4. Yükseltilmiş labirent testleri Yerden yüksekliği 50 cm olan sıfır ve artı şekillerinde, uzunlukları 50 cm ve genişlikleri 10 cm lik açık ve kapalı alanlar içeren labirentler kullanılmaktadır (Şekil 3a, 3b). Sıçanların bilmedikleri çevreyi tanıma davranışları sırasında alanın yükseltilmiş olması anksiyeteyi arttırıcı bir etkendir [23]. Yükseltilmiş labirent deneylerinde sıçanlar genellikle yüzü açık olan kollardan birine bakar şekilde alanın merkezine doğru bırakılırlar. Sıçanın açık kolu görecek şekilde labirent üzerine yerleştirilmesinin nedeni, sıçanların doğuştan açık ve yüksek yerlerden korkuyor olmalarıdır [4, 24]. Anksiyeteye işaret eden davranış değerlendirmeleri; kapalı kol üzerinde geçen zamanın uzaması, donakalma süresindeki artış, açık kola giriş sayısındaki azalma, merkezi alanda gezinme süresindeki azalma ve iki ayağı üzerinde kalkıp havayı koklama sayısındaki ve süresindeki artışlardır [25]. Şekil 3a. Yükseltilmiş sıfır labirent düzeneği 5. Kronik hafif stres testleri Sıçanların tekrarlayan şekilde çeşitli ve hafif stresörlere maruz bırakılması üzerine kurulu bu modellerde; kafeslerine eğim verilmesi, kafeslerin sarsılması, kafeslerin altlık malzemelerinin ıslatılması, sosyal ortamlarından izole edilmeleri, gece/gündüz sikluslarının ters döndürülmesi gibi stresörler dönüşümlü olarak uygulanmaktadır. Aç bırakıldıktan sonra dönüşümlü uygulanan stresörler ile karşılaşan sıçanların kafeslerine geri alındıktan sonra anksiyetedeki artışa paralel olarak yeme-içme ve hareketlerinde azalma meydana geldiği belirlenmiştir [26]. 6. Sosyal etkileşim testleri Sosyal etkileşim testinde sıçanlar ya gruplarından izole edilmektedirler ya da çok daha kalabalık ve büyük (agorafobi) kafeslere alınmaktadırlar (Şekil 4). Gruplar halinde izole edilen sıçanlarda hiyerarşik bir yapı oluşmaktadır. Gruplar arasında baskın karakteri sergileyemeyen sıçanlarda anksiyete benzeri davranışlar görülmeye başlamaktadır. Anksiyetenin etkisi ile sıçanın hareket ve oyun davranışlarında, yeme-içmede ve sosyal etkileşimde azalma görülmektedir [27]. Sıçanın sosyal grubundan ayrılmış olması, kendi yaşam koşullarına göre içinde bulunduğu alanın çok büyük olması gibi etmenler de anksiyetedeki artışı tetiklemektedir. Yapılan çalışmalarda, sosyal izolasyonlu sıçanların açık alan test düzeneği merkezine daha kısa sürede girdiği, düzeneğin merkezinde geçirilen sürenin uzadığı görülmüştür. Bu tip değişiklikler anksiyete benzeri davranışlarda azalma olarak değerlendirilmektedir. Çalışmaların bir kısmında anksiyete davranışlarında azalma bulunmasına rağmen bir kısım çalışmalarda ise anksiyetede artış gösterilmiştir [28, 29].

Marmara Medical Journal 2015; 28: 1-7 Aykaç ve ark. Anksiyete araştırmalarında sıçan davranış modelleri 5 olasılığını arttırmaktadır. Bir hafta sonra aynı sıçan bu defa temiz kumaş ya da temiz ve kuru kedi kumunun bulunduğu deney düzeneğine alınmaktadır. Sıçanlara tekrarlanarak uygulanan hatırlatıcı etken olarak kullanılan saldırgan hayvan kokusu ya da saldırgan hayvan tüyü (temiz kumaş ya da temiz kedi kumu) maruz bırakılma ile birden fazla kaçınılmaz travmatik deneyimler yaşatılmaktadır. Sıçan ikinci kez saldırgan hayvana ait ipucuna maruz kaldığında, yeniden deneyimleme ile orijinal stresi yaşamaya zorlanmış olmaktadır [30-33]. Şekil 4. Sosyal etkileşim testi düzeneği 7. Saldırgan hayvana ya da saldırgan hayvan ile ilgili ipuçlarına (koku, tüy, ses vb) maruz bırakma testleri Stres temelli anksiyete oluşturmada kullanılan saldırgan hayvanın kendisinin ya da saldırgan hayvana ait koku, tüy, idrar, ses vb ipuçlarının kullanıldığı modeldir. Bu modelde sıçan arada bir ayırıcı bölmenin yer aldığı test düzeneğinde saldırgan hayvanın kendisi ile direkt olarak karşılaştırılmaktadır. Türünü tehdit eden saldırgan hayvan ile karşılaşan sıçan kendini koruma amaçlı donakalma hareketi göstermektedir. Saldırgan hayvana ait ipucu olarak çoğunlukla kedi tüyü ya da ıslatılmış ve kirletilmiş kedi kumu kullanılmaktadır. Tüyün kullanıldığı deneylerde aynı kedinin üzerine 2 gün boyunca giydirilmiş kumaştan aparatın, sıçanın bırakılacağı panelde yer alan plakaya kaplanarak kullanılmasıyla oluşturulmaktadır. Aynı kedi tarafından 2 gün boyunca kullanılmış olan kirli ve ıslak kedi kumundan 125 ml alınarak sıçanın yerleştirileceği 24x30x30 cm boyutlarındaki pleksiglass kaba aktarılır. Deneylerde sıçanların, 10 dakika boyunca tüy ve kokunun yedirildiği ya da kirletilmiş ve ıslatılmış kedi kumunun bulunduğu kaptaki davranışları incelenir. Korunmasız ortamda olduğunu farkeden sıçan, her an saldırgan hayvan ile karşılacağı endişesiyle ortamdan uzaklaşmak için çabalar. Deneyin sonlarına doğru sıçan çabalamaktan vazgeçip kabın kenar kısımlarında pusmuş bir şekilde çaresizlik duygusunun analoğu olan donakalma hareketi sergilemektedir. Sıçanın umutsuzluğa düşüp ortamdan uzaklaşma çabasından vazgeçerek donakalma süresindeki artış anksiyete düzeyi ile doğru orantılı olarak artmaktadır. Sıçanın bir stresöre maruz kalması ve bu stresöre maruz kalma süresinin uzaması sıçanda anksiyete gelişme 8. Olfaktor bulbektomi testi Sıçanlar için koku alma temel duyu modalitesi olduğundan, olfakter bulbuslarının bilateral olarak alınması ile depresyon yaratılmaktadır [25, 34]. Bu modelin kullanıldığı antidepresan aktivite değerlendirme çalışmalarında, sıçanların açık alandaki davranışlarında hiperaktivite azalması kaydedilmiştir [35]. 9. Kuyruktan asma testi Sıçanların kuyruklarından havaya asıldığı bir modeldir. Bu modelle de antidepresanların etkinliği değerlendirilmektedir. Bu testte sıçanın hareketsiz kalıncaya kadar geçirdiği süre ölçülmektedir [20, 36]. 10. Ultrasonik vokalizasyon testi Bu model, korku ve benzeri emosyonel durumların anksiyeteden ayırtedilmesinde kullanılmaktadır. Farklı uyaranların (bir tehlike sinyali ardından kuyruktan elektrik şoku verilmesi gibi) oluşturduğu etkiler sıçanın çıkardığı ultrasonik seslerin frekans aralıkları ile karşılaştırılmaktadır. Düşük frekanslardaki sesler sıçanın kaçınılması gereken uyaran ile karşılaştığında, yüksek frekansdaki sesler ise sıçan oyun oynarken ya da mutlu olduğu zamanlarda ortaya çıkmaktadır. 18-32 khz frekans aralığındaki sesler kaçınılmaz korku ve anksiyeteyi göstermektedir [37]. Bu model ile oluşturulan ayrıntılı spektrogramlar aracılığıyla, standart davranış ölçümleri ile saptanamayan tedavinin etkisine bağlı ve bireysel farkları saptamak mümkün olmaktadır [38]. Sonuç Deney hayvanlarında çeşitli stresörlerin kullanıldığı bu çalışmalarda, genellikle aşırı irkilme, bilişsel bozukluklar, gelişmiş korku, düşük sosyal etkileşim gibi anksiyete davranışlarındaki değişimler ölçülmektedir.

6 Aykaç ve ark. Anksiyete araştırmalarında sıçan davranış modelleri Marmara Medical Journal 2015; 28: 1-7 Sıçanların ansiyeteye verdikleri yanıtın gözlenmesi amacı ile incelenen lokomotor aktivite davranışındaki değişimlerin değerlendirilmesinde; açık alan, sosyal etkileşim ve olfaktor bulbektomi testlerinde düzeneğin değişik bölümlerinde geçirilen zaman; zorunlu yüzme testlerinde yüzme ve tırmanma hareketleri; ödül ve ceza sistemine dayalı çatışma testlerinde pedala basma sayısı; yükseltilmiş labirent testinde merkezde, açık ve kapalı kollarda geçirilen süre; kronik hafif stres testlerinde hareketlerdeki değişimler ölçülmektedir. Zorunlu yüzme testleri, labirent testleri, kronik hafif stres testleri, kuyruktan asma testi ve saldırgan hayvan ya da saldırgan hayvanla ilgili ipuçlarına maruz bırakma testlerinde donakalma ve hareketsizlik süreleri skorlanmaktadır. Kronik hafif stres ve sosyal etkileşim testlerinde ise ayrıca sıçanların yeme ve içme alışkanlıklarındaki değişimler gözlenmektedir. Ultrasonik test modeli ile farklı frekans aralıklarında elde edilen ses ölçümleri yoluyla standart davranış ölçümleri ile saptanamayan farklılıkların tespit edilmesi mümkün olmaktadır. Bu modellerde incelenen anksiyete davranışları, altında yatan mekanizmaların araştırılması ve ilaçların etkinliğinin değerlerdirilmesinde yol gösterici olmaktadır. Her modelin özellikleri ve kullanım alanları göz önüne alındığında; kolay ve tekrarlanabilir olmalarının yanı sıra benzer davranış biçimlerinin gözlenebilmesi, geliştirilmekte olan ilaçların ya da benzerlerinin anksiyete tedavisinde klinik kullanım için yararlı olup olmayacaklarının daha etkin olarak araştırılabilmesine olanak sağlamaktadır. Teşekkür Bu yazıda kullanılmış olan şekiller Yakın Doğu Üniversitesi, Güzel Sanatlar ve Tasarım Fakültesi, Grafik Tasarımı Bölümü nden Araştırma Görevlisi Raif M. Kızıl tarafından çizilmiştir. Raif Kızıl a katkıları için teşekkür ederiz. Kaynaklar 1. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders: DSM-V. Amer Psychiatric Pub Incorporated, 2013. 2. Barnett SA. The rat: a study in behavior. New Jersey: Transaction Publishers, 2007. 3. Belzung C, Misslin R, Vogel E. Anxiogenic effects of methyl- carboline-carboxylate in a light/dark choice situation. Pharmacol Biochem Behav 1987;28:29-33. doi:10.1016/0091-3057(90)90260-o 4. Montgomery KC. The relation between fear induced by novel stimulation and exploratory behaviour. J Comp Physiol Psychol 1955;48:254-60. doi: 10.1037/h0043788 5. Foa EB, Keane TM, Freidman MJ, Kohen JA, (editors). Effective Treatments for PTSD: Practice Guidelines From the International Society of Traumatic Stress Studies. New York: Guilford Press, 2005. 6. Boissier JR, Simon P, Soubrie P, Airaksinen M, (editors). New approaches to the study of anxiety and anxiolytic drugs in animal: CNS and behavioral pharmacology. New York: Pergamon, 1976. 7. Ohl F. Testing for anxiety. Clin Neurosci Res 2003;3:233-8. doi:10.1016/s1566-2772(03)00084-7 8. Uzbay T. Depresyon Modelleri, PsikofarmakolojininTemelleri ve Deneysel Araştırma Teknikleri. Ankara: Çizgi Tıp Yayınevi, 2004. 9. Pynoos RS, Ritzmann RF, Steinberg, AM, Goenjian A, Prisecaru I. A behavioral animal model of post traumatic stress disorder featuring repeated exposure to situational reminders. Biol Psychiatry 1996;39:129-34. doi:10.1016/0006-3223(95)00088-7 10. Servatius RJ, Ottenweller JE, Natelson BH. Delayed startle sensitization distinguishes rats exposed to one or three stress sessions: Further evidence toward an animal model of PTSD. Biol Psychiatry 1995;38:539-46. doi:10.1016/0006-3223(94)00369-e 11. Rau V, De Cola JP, Fanselow MS. Stress-induced enhancement of fear learning: An animal model of post traumatic stress disorder. Neurosci Biobehav Rev 2005;29:1207-23. doi:10.1016/j.neubiorev.2005.04.010 12. Richter LG. Acute and long-term behavioral correlates of underwater trauma: Potential relevance to stress and post stress syndromes. Psychiatry Res 1998;79:73-83. doi:10.1016/ S0165-1781(98)00030-4 13. Kohda K, Harada K, Kato K, et al. Glucocorticoid receptor activation is involved in producing abnormal phenotypes of single prolonged stress rats: A putative post traumatic stress disorder model. Neurosci 2007;148:22-33. doi:10.1016/j. neuroscience.2007.05.041 14. Cohen, H, Joseph Z, Matar M. The relevance of differential response to trauma in an animal model of posttraumatic stress disorder. Bio Psychic 2003;53:463-73. doi:10.1016/s0006-3223(02)01909-1 15. Rodgers RJ, Dalvi A. Anxiety, defence and the elevated plusmaze. Neurosci Biobehav Rev 2007;21:801-10. doi: 10.1016/ SO149-7634(96)00058-9 16. Prut I, Belzung C. The open field as an a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. Eur J of Pharmacol 2003;463:3-33. doi:10.1016/s0014-2999(03)01272-x 17. Belzung C. Measuring exploratory behavior. In: Crusio WE, Gerlai RT, editors. Handbook of Molecular Genetic Techniques for Brain and Behavior Research: Techniques in the Behavioral and Neural Sciences. Amsterdam: Elsevier, 1999:739-49. 18. Porsolt RD, Bertin A, Blavet N, et al. Behavioral despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatments. Eur J Pharmacol 1978;47:379-91. 19. Lucki I. The forced swimming test as a model for core and component behavioral effects of antidepressant drugs. Behav Pharmacol 1997;8:523-32. 20. Willner P. Animal models as simulations of depression.

Marmara Medical Journal 2015; 28: 1-7 Aykaç ve ark. Anksiyete araştırmalarında sıçan davranış modelleri 7 Trends Pharmacol Sci 1991;12:131-6. doi:10.1016/0165-6147(91)90529-2 21. Lyons DM. Animal models of anxiety disorders. In: Schatzberg AF, Nemeroff CB, editors. The American Psychiatric Publishing Texbook of Psychoparmacology. 4th edition. Arlington: American Psychiatric Publishing, 2009:153-9. 22. Vogel JR, Beer B, Clody DE. A simple and reliable conflict procedure for testing anti-anxiety agents. Psychopharmacol 1971;21:1-7. 23. Wall PM, Messier C. Methodological and conceptual issues in the use of the elevated plus-maze as a psychological measurement instrument of animal anxiety-like behavior. Neurosci Biobehav Rev 2001;25:275-86. doi:10.1016/s0149-7634(01)00013-6 24. Pellow S, Chopin P, File SE, Briley M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods 1985;14:149-67. doi:10.1016/0165-0270(85)90031-7 25. O Neill MF, Moore NA. Animal models of depression: are there any? Hum Psychopharmacol Clin Exp 2003;18:239-54. 26. Willner P. Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model of depression: a 10-year review and evaluation. Psychopharmacol 1997;134:319-29. doi: 10.1007/ s002130050456 27. Blanchard RJ, McKittrick CR, Blanchard DC. Animal model of social stress: effects on behavior and brain neuro- chemical systems. Physiol Behav 2001;73:261-71. doi:10.1016/s0031-9384(01)00449-8 28. Kocahan S, Akıllıoğlu K, Babar Melik E, Melik E. Beyin ve davranışlar üzerine sosyal çevrenin etkileri. İstanbul Tıp Derg 2010;73:108-12. 29. Hellemans KGC, Benge LC, Olmstead MC. Adolescent enrichment partially reverses the social isolation syndrome. Dev Brain Res 2004;150:103-15. doi: 10.1016/j. devbrainres.2004.03.003 30. Cohen H, Zoher J. An animal model of posttraumatic stress disorder: The use of cut-off behavioral criteria. Ann N Y Acad Sci 2004; 1032: 167-78. doi: 10.1196/annals.1314.014 31. Mazor A, Matar MA, Kaplan Z, Kozlovsky N, Zohar J, Cohen H. Gender-related qualitative differences in baseline and poststress anxiety responses are not reflected in the incidence of criterion-based PTSD-like behaviour patterns. Bio Pschy 2007;1:1-14. doi:10.1080/15622970701561383. 32. Kesner Y, Zohar J, Merenlender A, I Gispan, F Shalit, G Yadid. WFS1 gene as a putative biomarker for development of post-traumatic syndrome in an animal model. Mol Psychiatr 2009; 14: 86-94. doi:10.1038/sj.mp.4002109 33. Aykaç A, Aydın B, Cabadak H, Gören M. The change in muscarinic receptor subtypes in different brain regions of rats treated with fluoxetine or propranolol in a model of posttraumatic stress disorder. Behav Brain Res 2012; 232:124-29. doi:10.1016/j.bbr.2012.04.002 34. Nowak G, Szewczyk B, Wieranska JM, et al. Antidepressant like effect of acute and chronic treatment with zinc in forced swim test and olfactory bulbectomy model in rat. Brain Res Bull 2003;61:159-64. 35. Kelly JP, Wrynn AS, Leonard BE. The olfactory bulbectomized rat as a model of depression: an update. Pharmacol Ther 1997;74:299-316. doi:10.1016/s0163-7258(97)00004-1 36. Steru L, Chermat R, Thierry B, Simon P. The tail suspension test: a new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacol 1985;85:367-70. doi:1 0.1007/BF00428203 37. Jelen P, Soltysik S, Zagrodzka J. 22-kHz Ultrasonic vocalization in rats as a index of anxiety but fear: behavioral pharmacological modulation of affective state. Behav Brain Res 2003;141:63-72. doi:10.1016/s0166-4328(02)00321-2 38. Brudzynski SM. Pharmacological and behavioral characteristic of 22kHz alarm calls in rats. Neurosci Biobehav Rev 2001;25:611-7. doi:10.1016/s0149-7634(01)00058-6

Marmara Medical Journal 2015; 28: 8-12 DOI: 10.5472/MMJ.2015.03691.1 DERLEME / REVIEW Glokom, Parkinson hastalığı ve nörodejenerasyon Glaucoma, Parkinson s disease and neurodegeneration Sevcan Yildiz BALCI, Muhsin ERASLAN, Ahmet TEMEL ÖZET Glokom, ilerleyici retinal ganglion hücre (RGH) ölümü ile karakterize olup, geri dönüşümsüz görme kaybına neden olan bir hastalıktır. Glokomatöz nörodejenerasyonun patogenezinde göz içi basıncından bağımsız mekanizmalar gündeme gelmiştir ve bu mekanizmalar Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların patogenezi ile benzerlikler göstermektedir. Etyopatogenezde ortak noktalar tespit edilmiş olsa da glokom ve nörodejeneratif hastalıklar arasındaki ilişki net değildir. Optik koherens tomografi (OKT), glokomlu hastalarda RGH hasarına bağlı olarak, etkilenen retina sinir lifi tabakasının (RSLT) non-invaziv olarak görüntülenmesini sağlayan bir görüntüleme yöntemidir. Son zamanlarda OKT ile RSLT kalınlık ölçümleri, Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklarda da çalışılmaya başlanmıştır. Aksonal hasar varlığında yapısal değişiklikler gösteren RSLT, nörodejenerasyonun invivo olarak tespit edilebilmesi için uygun bir model olmakta ve son zamanlarda glokomla ortak patogenezi olan ve nöron hasarı ile karakterize nörodejeneratif hastalıklarda, RSLT kalınlık ölçümlerinin takibi gündeme gelmektedir. Biz bu yazımızda, glokom, Parkinson hastalığı ve nörodejenerasyon arasındaki ilişikiyi anlatmağa çalıştık. Anahtar kelimeler: Dönüşümsüz görme kaybı, Nörodejeneratif hastalıklar, Nöroprotektif tedavi ABSTRACT Glaucoma is a disease that causes irreversible vision loss characterized by progressive retinal ganglion cell (RGC) death. The mechanisms independent of intraocular pressure are also implicated in glaucomatous degeneration pathogenesis and numerous similarities exist between glaucoma and neurodegenerative diseases such as Alzheimer s and Parkinson s diseases. Although, there is a common pathway between glaucoma and neurodegenerative disorders, pathogenesis of the relationship between neurodegenerative disorders and glaucoma remains poorly undefined. Optical coherence tomography (OCT), noninvasively quantifies the thickness of the retinal nerve fiber layer (RNFL) which is effected due to RGC damage in glaucomatous patients. Recently, RNFL thickness measurements have been studied by using OCT in several neurodegenerative conditions, including Parkinson s disease. The RNFL is unique as a model of neurodegeneration where the changes in its structure is represented with axonal damage. RNFL thickness measurements are important in neurodegenerative disorders which are characterized with neuronal loss and have common pathogenesis with glaucoma. In this review, we emphasize the relationship between glaucoma, Parkinson s disease and neurodegeneration. Keywords: Irreversible vision loss, Neurodegenerative disorders, Neuroprotective therapy Sevcan Yildiz Balci ( ) Oftalmoloji Kliniği, Iğdır Devlet Hastanesi, Iğdır, Türkiye e-mail: svcnyldz@hotmail.com Muhsin Eraslan, Ahmet Temel Oftalmoloji Anabilim Dalı, Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi, Üst Kaynarca, Pendik, Türkiye Gönderilme/Submitted: 18.09.2014 Kabul/Accepted: 21.11.2014 Giriş Glokom hastalığı, sinsi seyirli olması ve tedavi edilmediği takdirde görmeyi ciddi derecede tehdit etmesi nedeniyle, erken tanı ve tedavi yöntemlerinin halen yoğun bir biçimde araştırıldığı güncel bir hastalıktır. Glokom yüksek göz içi basıncı (GİB) ve oküler kan akımı dengesizliği sonucu, retina ganglion hücrelerinin (RGH) kendine özgü harabiyeti ile optik sinir başında (OSB) ilerleyici atrofi yapan ve bunun sonucunda görme alanı (GA) kaybı oluşturan, kronik bir optik nöropatidir [1]. Tedavi edilmediği takdirde geri 8

Marmara Medical Journal 2015; 28: 8-12 Balcı ve ark. Glokom, Parkinson hastalığı ve nörodejenerasyon 9 dönüşümsüz körlüğün önde gelen sebeplerinden birisidir. Tüm dünyada 67 milyonu aşkın insanı etkilediği ve bunların yaklaşık %10 unun kör olabileceği tahmin edilmektedir [2]. Glokom nedeni ile 2020 yılında 79,6 milyon insanın etkilenmesi ve bunların 11 milyondan fazlasının kör olması beklenmektedir [3] Glokomun tanı ve takibinde GİB ölçümünün büyük önemi vardır. GİB ve GİB i düzenleyen hümör aköz dinamikleri; halen glokomatöz hasar gelişiminde bilinen ve ilerleyici glokomatöz hasarın önlenmesinde kontrol edilebilen en önemli risk faktörleridir. Aksonların artmış GİB veya OSB ye karşı artmış basınç gradiyentine karşı intoleransı apoptozisi başlatan süreçlerden birisi olsa da, kontrol altına alınmış GİB e rağmen hasarın devam etmesi veya normal GİB e sahip kişilerde glokomatöz optik sinir hasarının görülmesi, hastalığın etyopatogenezinde vasküler ve bağ doku değişiklikleri ile nöral mekanizmaların da rol oynadığını düşündürmektedir [4]. Glokomatöz RGH ve aksonların hasarını açıklayan ve birbiri ile yakın ilişki içerisinde olan 3 temel görüş ortaya atılmıştır: 1. Mekanik Teori Bu teoride trabeküler ağ, schlemm kanalı, duvarlarının episkleral damarlar gibi hümor aközü drene eden sistemde ortaya çıkan dejenerasyonlara bağlı boşaltım sorunları sonucunda GİB artışı ile oluşan basınç nedeniyle glokomdaki nöron ölümünün gerçekleştiği savunulmuştur ve hasarın lamina kribroza (LK) düzeyinde başladığı ortaya atılmıştır [5]. Erken glokomatöz hasarda basıncın etkisi ile astrositlerde ekstrasellüler matriks (ECM) sentezi uyarılır ve LK bölgesinde değişiklikler başlar. Basınca direnebilmek için laminer bölgede astrosit ve kapiller endotel hücrelerinin bazal membranlarında kalınlaşma meydana gelir. Hasarın devam etmesi ile metalloproteinazların (MMP) sentezi artar ve ECM yıkımı başlar [6,7]. Mekanik basınç devam ettiğinde LK düzeyinde meydana gelen değişiklikler ile durum dengelenemez ve bağ doku hasarı oluşur. Skleral kanal genişler, prelaminer tabaka incelir, ECM de bağ dokuda azalma meydana gelir, destek dokusunu kaybeden LK incelir, kribriform düzlem arkaya doğru yayılır ve lamina arkaya doğru çöker. Ganglion hücre aksonlarında oluşan destek doku kaybı, RGH lerde hasara yol açar. Nöroretinal rim aksonların kaybına bağlı olarak incelir. 2. İskemik Teori Vasküler teori, mekanik teori ile açıklanamayan düşük tansiyonlu glokom olgularını açıklamak üzere gündeme gelmiştir. İskemik teoride optik siniri besleyen damarlarda perfüzyon basıncının azalması RGH lerde oksidatif strese yol açar. Oküler perfüzyon basıncının azalması sonucu ortaya çıkan iskemi, hücrenin oksijen ve glukoz sağlamasını kısıtlar. Ortaya çıkan iskemik etki hücrede K + ve nörotransmitterlerin salınmasıyla aksonal depolarizasyona neden olur. Bu durum hücre dışı Ca ++ u hücre içine taşır. Hücre içinde artan Ca ++, NO sentetazın uyarılmasına, protein fosforilizasyonuna ve proteaz etkinliğine neden olur, hücrenin enerji üretim mekanizması bozulur ve böylece hücre içi glutamatın ekstrasellüler aralığa aşırı salınımına neden olur. Ektrasellüler glutamat artışı retina hücrelerinde eksitotoksisite yaratır [8]. 3. Apoptozis Patolojik veya fizyolojik uyaranlara sekonder genetik programlanmış hücre ölümü apoptozis olarak adlandırılır. Apoptoziste hücre ciddi olarak hasarlandığında hücre ölüm sinyalini alır. Hücre içinde DNA yapısı bozulur, mitokondrilerden serbest oksijen radikalleri açığa çıkar. Oluşan ilk başlangıç sensör protein denilen yapılar (apoptozis uyarıcı faktör-apoptosis-inducing factor (AIF)) proapoptotik bir protein olan p53 ü aktive eder. Bu proteinin aktivasyonu bcl-2 gen ailesi tarafından kontrol edilir. Oluşan proapoptotik proteinler mitokondriyal membranlarda sitokrom c geçişine neden olarak, proteaz enzim grubu olan kaspazları uyarır ve kaspazlar hücrenin apoptotik cisimlere ayrılıp makrofaj etkisi gösteren komşu hücrelerce yok edilmesine neden olur. Deneysel çalışmalarda RGH lerde apoptotik p53 ve antiapoptotik bcl-2 gen yapıları saptanmıştır [9]. Son yıllarda non-invaziv olarak RGH ölümünü gösteren görüntüleme yöntemleri sayesinde yüksek GİB oluşturulan ratlarda RGH lerde apoptozis invivo olarak kanıtlanabilmiştir [10]. Retinal hücrelerin apoptotik değişikliklerini tespit eden ve (detection of apoptosing retinal (DARC)) adı verilen teknikte; floreseinle işaretlenmiş olan insan proteini annexin-5, apoptozisin başladığı hücrelerde, plazma membranının yüzeyinde fagositik hücrelere ye beni sinyali gönderen fosfatidilserine bağlanır ve invivo olarak konfokal tarayıcı lazer oftalmoskopi ile apoptotik hücreler görüntülenir [11]. Teknolojideki gelişmelerle birlikte glokomun tanı ve takibinde kullanılabilecek, optik disk, retina sinir lifi tabakası (RSLT) ve dolayısıyla RGH hasarları konusunda güvenilir ve objektif veriler sağlayacak invivo görüntüleme yöntemleri geliştirilmiştir. Bunlardan birisi, retinanın ve optik sinirin non-invaziv bir şekilde yüksek çözünürlükte

10 Balcı ve ark. Glokom, Parkinson hastalığı ve nörodejenerasyon Marmara Medical Journal 2015; 28: 8-12 tomografik kesit görüntülerinin elde edildiği ve invivo histopatolojik incelemeye olanak sağlayan optik koherens tomografidir (OKT) [12]. Optik koherens tomografi ile, retina tabakaları ayırt edilerek RGH lerin uzantısı olan RSLT kalınlığı ve OSB parametreleri objektif olarak elde edilmekte ve glokomatöz hasarın bu yapılarda meydana getirdikleri değişikliklerin invivo olarak tespit edilmesi mümkün olmaktadır. Glokomda GA kaybı ya da optik sinir çukurlaşması tespit edilerek glokom tanısı konduğunda %10-50 arasında RSLT kaybının çoktan geliştiği bildirilmiştir [13]. Bu sebeple OKT ile yapılan peripapiller RSLT kalınlık analizi sadece glokomlu hasta takibinde değil, hastalığın erken tanısında da önemli yer tutmaktadır. Glokomda RGH ölümünün nörodejeneratif hastalıklardaki gibi apoptozis ile başladığı deneysel glokomda gösterilmiş olsa da apoptozisi başlatan süreç henüz tam olarak aydınlatılamamıştır [14,15]. Genel olarak glokom göz hastalığı olarak bilinse de, etyopatogenezinde rol oynayan nörodejeneratif değişimler glokom hastalığının aynı zamanda vizüel sistemin nörodejeneratif hastalığı olarak düşünülmesi gerektiğinin kanıtıdır. Glokomdaki bu GİB bağımsız, RGH hasarına yol açan mekanizmaların, Alzheimer hastalığı veya Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar olarak tanımlanan bir grup santral sinir sistemi (SSS) hastalıklarının da etyopatogenezinde rol aldığı son zamanlarda çalışmalarla kanıtlanmıştır [16-20]. Belirli beyin bölgelerinde ortak özelliklere sahip nöron gruplarının ölümü sonucunda nörodejeneratif hastalıklar ortaya çıkmaktadır. Nörodejeneratif hastalıklar, farklı klinik fenotiplere ve genetik etyolojiye sahip bir grup heterojen hastalıktır. Bunlar arasında Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Hungtington hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar yer almaktadır. Bu hastalıklarda nöronal hücre hasarını başlatan süreç net olarak aydınlatılamamış olsa da, hücre hasarının ortak temel 4 basamağı şu şekilde sıralanabilir: 1.Azalmış enerji metabolizması, 2.Oksidatif stres, 3.Ekzotoksisite (Glutamat salınımı), 4.Bozulmuş Ca++ homeostazı ve enzim sistemlerinin indüksiyonu. Bu basamaklar özellikle mitokondri membranında hasara yol açar ve farklı uyarılarla apoptozisi başlatabilir. Başlatılan apoptozis ile nöron kayıpları oluşmaktadır. Parkinson, SSS nin progresif nörodejeneratif bir hastalığı olup, nigrostriatal dopaminerjik yolda dejenerasyonla karakterizedir [21]. Dopaminerjik yolaktaki dejenerasyonun nedenleri henüz bulunamamıştır. Motor sistemin yanında non-motor sistemlerde de etkilenme gözlenen multisistemik bir hastalıktır. Görme sisteminin Parkinson da etkilenen nonmotor sistemlerden biri olduğu tespit edilmiştir. İlk olarak Bodis-Wollner ve Yahr [22] tarafından Parkinson lularda vizuel evok potansiyel (VEP) değişiklikleri bildirilmiştir. Daha sonraları ise Regan ve Neima [23] tarafından bu hastalarda ilk kez kontrast sensitivitesine azalma olduğu bildirilmiş ve Parkinson lularda görme sistemi bozuklukları araştırılmaya başlanmıştır [24]. Görme keskinliği ve renkli görmede azalma, kontrast duyarlılığında azalma, kapaklarda kırpma refleksinde ve pupil reaksiyonlarında bozukluklar görme sistemi ile ilgili oluşan bozukluklardır [25]. Parkinson da insan ve hayvan deneylerinde; retinanın amakrin ve interpleksiform hücrelerinde bulunan ve mediatör bir nörotransmittör olan dopaminin düzeylerinde azalma olduğu saptanmıştır [26-28]. Şekil 1. Glokomlu (A), Parkinson lu (B) ve normal (C) olgularda RSLT kalınlık örnekleri. RSLT de glokomlu hastada (A) superiotemporal (ST) alanda incelme sınırda ve inferiotemporal (IT) alanda incelme görülmektedir. Parkinson lu hastada (B) superiotemporal (ST) bölgede incelme mevcuttur. Yeşil: normal, Sarı: sınır, Kırmızı: incelmiş alanı göstermektedir.

Marmara Medical Journal 2015; 28: 8-12 Balcı ve ark. Glokom, Parkinson hastalığı ve nörodejenerasyon 11 Son yıllarda nörodejeneratif hastalıklarda OKT ile invivo olarak hastaların RSLT kalınlığında meydana gelen değişikliklerin tespiti gündemdedir [29]. Parkinson hastalığında da OKT ile RSLT de incelme olduğu tespit edilmiş ve hastalığın klinik takibinde RSLT de meydana gelen bu yapısal değişikliklerin de kullanılabileceği gündeme gelmiştir [30-32]. RSLT de meydana gelen bu değişiklikler pek çok çalışmada retinal dopamin seviyelerindeki azalmaya bağlansa da Parkinson da biriktiği bilinen Lewy cisimciklerinin (intrasitoplazmik hiyalin cisimcikleri - Lewy cisimcikleri ubikütine edilmiş proteinler barındırmaktadır ki, bunların içinde anormal yapıda - sinüklein ve nörofilament proteinleri mevcuttur) bu konuda henüz yapılmış bir invitro/ postmortem çalışma olmasa da retinal birikimi ve bu olası birikimlerin RGH fonksiyonlarını bozarak nörodejenerasyona yol açması da olasıdır [33,34]. Yapılan çalışmalarda SSS nin nörodejeneratif hastalıkları ile glokom arasındaki bağlantılar kanıtlanmaya çalışılsa da süreci başlatan mekanizmalar net olarak aydınlatılamamıştır. Normal GİB e rağmen glokomdakine benzer RGH ölümü ve RSLT değişikliklerinin bu hastalıklarda da gözlenmesi, glokom ve nörodejeneratif hastalıklar arasındaki ortak risk faktörleri ve patogenez ile açıklanabilir. Retinanın SSS nin periferik bir uzantısı olduğu ve beynin kolayca izlenebilir bir parçası olduğu kabul edilebilir. Glokomatöz süreçte hasarlandığı bilinen ve günümüzde OKT ile objektif olarak tespit edilebilen RSLT kalınlık ölçümleri Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklarda da incelenerek glokomdaki değişikliklerle olan benzerlikleri değerlendirilebilir. Böylece nörodejeneratif süreci net olarak aydınlatılmış SSS nin nörodejeneratif hastalıkları ile son yıllarda patogenezinde nörodejenerasyona dikkat çekilmiş olan glokomun bu tabakalarda meydana getirdikleri yapısal değişiklikler değerlendirilerek ortak noktalar tespit edilebilir ve invivo olarak nöron hasarı değerlendirilebilir. Nörodejeneratif hastalıklar ile glokom arasındaki benzerlikler ışığında, nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde kullanılan nöroproteksiyon, RGH lerin yaşamasını sağlamak ve GA kaybını önlemek amacı ile glokom hastalarında da kullanılabilir [35]. Parkinson hastalarında bilgilerimiz ışığında nöroprotektif tedavi araştırma aşamasındadır [36]. Parkinson da kullanılacak nöroprotektif tedavilerin retina tabakalarındaki morfolojik değişikliklere etkisi OKT ile invivo olarak takip edilebilir ve etkinliği kanıtlanırsa nöroproteksiyonun glokomda da kullanımı geliştirilebilir. Kaynaklar 1. Allingham R, Shields B, Damji K, et al. An overview of glaucoma. In: Allingham R, Damji K, Freedman S, Moroi S, Shafranov G, Shields B, eds. Shield s Textbook of Glaucoma. 5th Edition. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2005: 1-2. 2. Quigley HA. Number of people with glaucoma worldwide. Br J Ophthalmol 1996; 80: 389-93. 3. Quigley HA, Broman AT. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol 2006; 90: 262 7. 4. Quigley HA, Nickells RW, Kerrigan LA, et al. Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. Invest Ophthalmol Vis Sci 1995; 36: 774-86. 5. Quigley HA. Glaucoma: macrocosm to microcosm the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci 2005; 46: 2662-70. 6. Agapova OA, Kaufman PL, Lucarelli MJ, et al. Differential expression of matrix metalloproteinases in monkey eyes with experimental glaucoma or optic nerve transection. Brain Res 2003; 96: 132-43. 7. Pena JD, Agapova O, Gabelt BT, et al. Increased elastin expression in astrocytes of the lamina cribrosa in response to elevated intraocular pressure. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42: 2303-14. 8. Weinreb RN, Khaw PT. Primary open-angle glaucoma. Lancet 2004; 363: 1711-20. 9. Levin LA, Schlamp CL, Spieldoch RL, et al. Identification of the bcl-2 family of genes in the rat retina. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998; 38: 2545-53. 10. Cordeiro MF, Guo L, Luong V, et al. Real-time imaging of single nerve cell apoptosis in retinal neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci 2004; 101: 13352 6. 11. Guo L, Cordeiro MF. Assessment of neuroprotection in the retina with DARC. Prog Brain Res 2008; 173: 437 50. doi: 10.1016/S0079-6123(08)01130-8. 12. Varma R, Bazzaz S, Lai M. Optical tomography-measured retinal nerve fiber layer thickness in normal Latinos. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003; 44: 3369-73. 13. Quigley HA, Addicks EM. Quantitative studies of retinal nerve fiber layer defects. Arch Ophthalmol 1982;100:807-12. 14. Guo L, Moss SE, Alexander RA, et al. Retinal ganglion cell apoptosis in glaucoma is related to intraocular pressure and IOP-induced effects on extracellular matrix. Invest Ophthalmol Vis Sci 2005; 46: 175-82. 15. Garcia-Valenzuela E, Shareef S, Walsh J, et al. Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp Eye Res 1995; 61: 33 44. 16. Dreyer EB, Zurakowski D, Schumer RA, et al. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol 1996; 114: 299-305. 17. Dreyer EB, Pan ZH, Storm S, et al. Greater sensitivity of larger retinal ganglion cells to NMDA-mediated cell death. Neuroreport. 1994; 31: 629-31. 18. Riederer P, Hoyer S. From benefit to damage. Glutamate and advanced glycation end products in Alzheimer brain. J Neural

12 Balcı ve ark. Glokom, Parkinson hastalığı ve nörodejenerasyon Marmara Medical Journal 2015; 28: 8-12 Transm 2006; 113: 1671-7. 19. Beal MF. Excitotoxicity and nitric oxide in Parkinson s disease pathogenesis. Ann Neurol 1998; 44: 110-4. 20. Chiu K, Chan TF, Wu A, et al. Neurodegeneration of the retina in mouse models of Alzheimer s disease: what can we learn from the retina. Age (Dordr). 2012; 34: 633-49. doi: 10.1007/ s11357-011-9260-2. 21. Copeland RL. Parkinson disease. Neurotox Res 2005; 8: 289-93. 22. Bodis-Wollner I, Yahr MD. Measurement of visual evoked potentials in Parkinson s disease. Brain 1978; 101: 661 71. 23. Regan D, Neima D. Low-contrast letter charts in early diabetic retinopathy, ocular hypertension, glaucoma, and Parkinson s disease. Br J Ophthalmol 1978; 68: 885 9. 24. Yenice O, Onal S, Midi I, ve ark. Visual field analysis in patients with Parkinson s disease. Parkinsonism Relat Disord 2008; 14: 193-8. 25. Armstrong RA. Visual signs and symptoms of Parkinson s disease. Clin Exp Optom 2008; 91: 129 38. doi: 10.1111/j.1444-0938.2007.00211.x. 26. Ehinger B. Functional role of dopamine in retina. Progress in Retinal Reseach 1983; 2: 213-32. 27. Denis P, Normdan J, Elena PP, et al. Physiological roles of dopamine and neuropeptides in the retina. Fundam Clin Pharmacol 1993; 7: 293-304. 28. Harnois C, Di Paolo T. Decreased dopamine in the retinas of patients with Parkinson s disease. Invest Ophthalmol Vis Sci 1990; 31: 2473-5. 29. Galetta KM, Calabresi PA, Frohman EM, et al. Optical Coherence Tomography (OCT): Imaging the Visual Pathway as a Model for Neurodegeneration. Neurotherapeutics 2011; 1: 117-32. doi: 10.1007/s13311-010-0005-1. 30. Hajee M, March W, Lazzaro D, et al. Inner retinal layer thinning in Parkinson disease. Arch Ophthalmol 2009; 127: 737 41. doi: 10.1001/archophthalmol.2009.106. 31. Inzelberg R, Ramirez JA, Nisipeanu P, et al. Retinal nerve fiber layer thinning in Parkinson disease. Vision Res 2004; 44: 2793 7. 32. Altintas O, Iseri PK, Ozkan B, ve ark. Correlation between retinal morphological and functional findings and clinical severity in Parkinson s disease. Doc Ophthalmol 2007; 116: 137 46. 33. Palmowski-Wolfe AM, Perez MT, Behnke S, et al. Influence of dopamine deficiency in early Parkinson s disease on the slow stimulation multifocal-erg. Doc Ophthalmol 2006; 112: 209-15. 34. Spillantini MG, Schmidt ML, Lee VM et al. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature 1997; 388: 839-40. 35. Yüksel N. Nörodejeneratif hastalık olarak glokom. Turkiye Klinikleri J Ophthalmol-Special Topics 2012; 5: 14-8. 36. Koppula S, Kumar H, More VS, et al. Recent advances on the neuroprotective potential of antioxidants in experimental models of Parkinson s disease. Int J Mol Sci 2012; 13: 10608 29. doi: 10.3390/ijms130810608.

Marmara Medical Journal 2015; 28: 13-20 DOI: 10.5472/MMJ.2015.03894.2 ÖZGÜN ARAŞTIRMA / ORIGINAL ARTICLE Prepubertal testis hücre süspansiyonun dondurulmasında seeding etkisi The effects of a seeding process on the cryopreservation of cellular suspensions of prepubertal testis Gülnaz KERVANCIOĞLU, Şule ÇETİNEL, Elif KERVANCIOĞLU DEMİRCİ, Gülçin EKTER KANTER, M. Ertan KERVANCIOĞLU ÖZET Amaç: Prepubertal testis kriyoprezervasyonu, kanser tedavisi yapılacak erkek çocuklarda fertilitenin korunması için günümüz teknolojisinde umut vadetmektedir. Kriyoprezervasyonda en uygun yöntemin geliştirilmesi için prepubertal testis hücre süspansiyonunda farklı taşıyıcılar kullanarak seeding etkisi araştırıldı. Gereç ve Yöntem: Yedi-sekiz günlük Wistar yavru erkek sıçan testis hücre süspansiyonları, programlı yavaş dondurma yöntemiyle donduruldu. Taşıyıcı olarak seçilen yüksek güvenlikli straw ve kriyotüpe seeding uygulandı. Spermatogonyal kök hücreler ve Sertoli hücreleri üzerindeki morfolojik etki, semi-kantitatif olarak ışık, kalitatif olarak geçirimli elektron mikroskobunda incelendi. Bulgular: Canlılık oranı, yüksek güvenlikli straw da seeding uygulanmayan ve uygulanan gruplarda sırasıyla %90,6±3,0, %89,4±1,3, kriyotüpte %77,6±4,2 ve %85,4±2,7 bulundu. Seeding uygulanmasıyla, canlılık oranında straw grupları arasında fark görülmemesine rağmen, kriyotüp grupları arasında fark anlamlıydı (p<0,0001). Straw1. ve 2. grupları ile kriyotüp 3. ve 4. grupları arasında da fark anlamlıydı (p<0,0001 ve p< 0,05). Spermatogonyal kök hücreler ve Sertoli hücrelerinin ışık ve elektron mikroskobik incelemesinde, nukleus ve sitoplazmik yapıların ve membranların seeding uygulanan gruplarda belirgin fark yarattığı, ayrıca yüksek güvenlikli straw ın testis hücre süspansiyonu için kriyotüpe oranla daha üstün bir taşıyıcı olduğu görüldü. Sonuç: Prepubertal testis hücre süspansiyonunun kriyoprezervasyonunda farklı taşıyıcılarda seeding etkisinin ilk defa kıyaslandığı çalışmamızda, taşıyıcı olarak yüksek güvenlikli Gülnaz Kervancıoğlu ( ), Şule Çetinel, Elif Kervancıoğlu Demirci Histoloji Embriyoloji Anabilim Dalı, Tıp Fakültesi, Marmara Üniversitesi, İstanbul, Türkiye e-mail: gkervancioglu@gmail.com Gülçin Ekter Kanter Üremeye Yardımcı Tedavi Eğitim Merkezi, Süleymaniye Eğitim ve Araştırma Hastanesi, İstanbul, Türkiye M. Ertan Kervancıoğlu Kadın Hastalıkları, Üremeye Yardımcı Tedavi Eğitim Merkezi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, İstanbul Üniversitesi, İstanbul, Türkiye Gönderilme/Submitted:11.11.2014 Kabul/Accepted: 20.12.2014 straw ın kullanıldığı seeding uygulanan yöntemin en uygun yöntem olduğu sonucuna varıldı. Anahtar kelimeler: Prepubertal testis, Testis hücre süspansiyonu, Programlı yavaş dondurma, Spermatogonyal kök hücre, Seeding ABSTRACT Objective: The cryopreservation of prepubertal testicular tissue promises to preserve fertility in boys under cancer treatment. The effects of a seeding process was investigated using different carriers for prepubertal testicular cell suspensions in order to develop an appropriate method for cryopreservation. Materials and Methods: Testicular cell suspensions of 7-8 day old male Wistar rats were frozen by a programmed slow freezing method. The straw and cryotube selected as carriers underwent a seeding process. The morphological effects on spermatogonial stem cells and Sertoli cells were evaluated semi-quantitatively by light microscopy and qualitatively with a transmission electron microscope. Results: The rate of vitality with or without seeding in straw was respectively, 90.6% (±3.0), 89.4 (±1.3) and in cryotube 77.6 (±4.2) and 85.4 (±2.7). The seeding process, showed no significant difference between the straw groups, but a significant difference was seen between the cryotube groups (p<0.0001). The nuclei, cytoplasmic structures and membranes of Sertoli and spermatogonial stem cells, showed less degeneration in the straw than in the cryotubes when the seeding process was applied. Conclusion: In this study, we compared two carriers to observe the effect of seeding during cryopreservation of prepubertal testicular cell suspensions and found that seeding in straw was the preferable. Keywords: Prepubertal testis, Testicular cell suspension, Programmed slow freezing, Spermatogonial stem cell, Seeding process Giriş Çocukluk çağı kanserlerinin tedavilerinde fertilitenin korunması halen ciddi bir sorun olarak karşımızdadır. 13

14 Kervancıoğlu ve ark. Prepubertal testis kriyoprezervasyonu Marmara Medical Journal 2015; 28: 13-20 Prepubertal dönemde henüz olgun spermatozoa üretimi başlamadığından bu çocuklar semen kriyoprezervasyonundan faydalanamamaktadır. Gonadotoksik tedavi gören çocuklar için prepubertal testis dokusunun uygun teknikle dondurulup saklanması fertilitenin korunmasında iyi bir seçenek olarak gözükmektedir [1,2]. Spermatogonyal kök hücreleri (SKH) içeren prepubertal testis dokusunun kriyoprezervasyonu, bu çocuklara umut vadetmektedir [3,4]. Kriyoprezervasyon, erişkin ve prepubertal testis hücrelerinin alıcıya transplantasyonuyla spermatogenezin yeniden başlatılmasında [5-8] önemli bir aşamayı oluşturmaktadır. Ancak, henüz prepubertal testis için standart bir dondurarak saklama yöntemi bulunmamaktadır [9-12]. Son yıllarda yapılan çalışmalarda prepubertal testis, ya doku parçaları [9-12] veya hücre süspansiyonu şeklinde [6,13] dondurulup saklanmaktadır. Spermatogonyal kök hücrelerin yüksek oranda yaşamalarını ve fonksiyonlarını sağlayacak dondurma yöntemiyle dondurulması [14] ve çözülmesi gerekmektedir. Kriyoprezervasyon yöntemi, testis hücre süspansiyonunda her hücre tipi için, hücrenin ihtiva ettiği su miktarı, hücrelerin büyüklüğü, şekli ve sitoplazma membranı geçirgenliği arasındaki dengeyi sağlamalıdır. Testis hücre süspansiyonunun dondurulmasında yavaş dondurma yöntemi tercih edilmektedir [6,13]. Yavaş dondurma yönteminde en önemli sorun, büyük buz kristalleri oluşmasının engellenememesidir [15]. Dondurma esnasında hücre içi buz oluşumu hücrenin ölümü ile sonuçlanabilir [16,17]. Seeding, hücrede buz çekirdeği oluşumunu azaltmak ve dokunun donmaya başladığı anda ısıyı kontrol altına almak için uygulanmaktadır [18,19]. Seeding uygulaması, metal bir forsepsle üzerinde beyaz buz çizgisi oluşana kadar taşıyıcının dıştan tutulması şeklinde yapılmaktadır. Çalışmamızda, prepubertal testis hücre süspansiyonları programlı yavaş dondurma yöntemiyle dondurularak, farklı taşıyıcılarla seeding etkisi incelenmiştir. SKH ler ve Sertoli hücreleri (SH) üzerindeki morfolojik etkiler ışık ve geçirimli elektron mikroskobunda değerlendirilmiştir. Gereç ve Yöntem Yedi-sekiz günlük (n=8) Wistar yavru erkek sıçanlardan, servikal dislokasyon ve dekapitasyon uygulanarak postmortem henüz inmemiş bilateral abdominal testisler çıkarıldı. Tunica albuginea çıkarıldıktan sonra her bir testis iki parçaya bölünüp hücre süspansiyonu oluşturmak üzere enzimatik ayrıştırma yapıldı. Seminifer tubulusta Sertoli hücreleri bazal laminaya hemidesmozomlarla, birbirlerine desmozomlar, gap junction lar ve kan-testis bariyerini oluşturan sıkı bağlantılarla bağlıdır. Sertoli hücreleri, germ hücrelerine, desmozom benzeri yapılar, aralık bağlantılar, ektoplazmik uzantılar ve tubulobulbar komplekslerle bağlanmaktadır. 7-8 günlük prepubertal testiste oluşmaya başlayan bağlantılar [20] iki aşamalı enzimatik ayrıştırmayla ortadan kaldırılarak hücrelerin serbestleşmesi sağlandı. Çalışmamız için Etik Kurul onayı alınmıştır. İki aşamalı enzimatik ayrıştırmayla hücre süspansiyonu oluşturma Hücre süspansiyonu oluşturmak için ilk aşamada 0,4 mg/ml tip IV kollajenaz (C 1889 Sigma-Aldrich, US) ve 0,02 mg/ ml DNAaz (DN25 Sigma-Aldrich, US) içeren Dulbecco`s modified eagle medium (DMEM+F12) (D8062 Sigma- Aldrich,US) kullanıldı. İkinci aşamada 0,5 mg/ml tripsin 0,2 mg/ml etilendiaminotetraasetat (EDTA) (T4299 Sigma- Aldrich,US ) kullanıldı. DMEM+F12 ile 2 kere yıkanarak hücre süspansiyonu elde edildi. Prepubertal testis hücre süspansiyonları, bir gruba seeding uygulanıp diğer gruba seeding uygulanmadan 2 farklı programlı yavaş dondurma yöntemi ile donduruldu. Taşıyıcı olarak dondurma çubuğu (yüksek güvenlikli straw) veya dondurma tüpü (kriyotüp) kullanıldı. Böylece gruplar; 1. Grup SS(-): Straw, Seeding(-) 2. Grup SS(+): Straw, Seeding(+) 3. Grup KS(-): Kriyotüp, Seeding(-) 4. Grup KS(+): Kriyotüp, Seeding(+) şeklinde oluşturuldu. Programlı yavaş dondurma yöntemi Dondurma solüsyonu olarak 1,5 mol/lt dimetil sülfoksit (DMSO) (d2650 Sigma-Aldrich, US), 0,07 mol/lt sukroz (840097 Sigma-Aldrich, US) ve % 10 fetal bovin serum (FBS) (F6178 Sigma-Aldrich, US) içeren DMEM+F12 (D8062 Sigma-Aldrich, US) kullanıldı. Programlı soğutucu olarak Planer series-3 (Planer Products, UK) kullanıldı. Oda ısısından 2 C dk da hızla ısı -7 C ye indirildi. Isı -7 C ye geldiğinde 5 dakika beklendi. Bu aşamada 2. ve 4. gruba seeding uygulandı. -7 0 C den -30 C ye 0.3 C/dk hızla soğutuldu. Sonra -150 C ye 10 C/dk hızla soğutularak donduruldu. Taşıyıcılar -196 C deki sıvı azot tankına yerleştirildi. Çözülme işlemi için, örnekler 37 C deki su banyosuna alındı. Azalan konsantrasyondaki DMSO, sukroz ve FBS ile yıkandı. %10 FBS içeren DMEM+F12 de 30 dakika inkübasyon uygulandı.

Marmara Medical Journal 2015; 28: 13-20 Kervancıoğlu ve ark. Prepubertal testis kriyoprezervasyonu 15 Canlılık testi (Eosin-Y boyası) Testis hücre süspansiyonundan lam üzerine bir damla konup üzerine de bir damla % 0,5 lik Eosin-Yellow (E0201 Surechem products, UK) damlatılıp boyandı. Bu boyamada canlı hücreler boya almadı, ölü hücreler kırmızı boyandı. Her grup için beş örnekleme yapılıp her örnekten en az 200 hücre iki ayrı araştırıcı tarafından sayıldı. Her grupta toplam hücre sayısına göre canlı hücre oranları belirlendi [21]. Testis hücre süspansiyonundan santrifüj işlemi ile hücre peleti oluşturuldu. Pelet rutin geçirimli elektron mikroskobu takibine alındı. Geçirimli elektron mikroskobu preparasyonu Testis hücre suspansiyon peleti 0,1 M fosfat tamponu ile tamponlanmış % 2,5 glutaraldehit fiksatifinde 4-12 saat süreyle + 4 C de fikse edildi. Tampon ile yıkandıktan sonra aynı tampon çözeltisi içindeki %1 lik Osmium tetroksit ile 1 saat ikinci fiksasyon yapıldı. %70, %90, %96, %100 yükselen alkol serisinden ve propilen oksitten geçirip suyu alındı. Hücre peleti daha sonra blok kapsüllere yerleştirilip üzerlerine epon 812 konularak gömme işlemi yapıldı. Eponun polimerizasyonu için 60 C etüvde 24 saat süreyle bekletilip bloklandı. Epon bloklardan Leica Ultracut R ultramikrotomda, cam bıçakla 1000 nm lik yarı ince kesitler alındı. Yarı ince kesitler toluidin mavisi ile boyanarak ışık mikroskobunda (Olympus BX51,Olympus Corporation, Japan) incelendi. Epon bloklardan hazırlanan 60 nm lik ince kesitler geçirimli elektron mikroskobunda (Jeol TEM 1200 EXII-Japan) incelendi. İstatistiksel analiz Canlılık testi için ki-kare testi uygulanıp SPSS 17 istatistik programı kullanıldı. p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Bulgular Canlılık testi değerleri 1. Grup SS (-): %90,6±3,0; 2. Grup SS (+): %89,4±1,3; 3. Grup KS (-): %77,6±4,2; 4. Grup KS (+): %85,4±2,7 bulundu. Canlılık testi sonuçlarına bakıldığında 1. grup sayısal olarak en yüksek değeri verdi. 1. grupta sayısal değerin 2. gruba oranla daha yüksek olmasına karşılık aralarında istatistiksel olarak fark görülmedi. 3. ve 4. gruplar kıyaslandığında ise aralarında istatistiksel olarak fark görüldü (p<0,0001). 1. grup ile 3. ve 4. gruplar arasında fark anlamlı (sırasıyla p<0,0001 ve p< 0,05) olduğu gibi 2. grupla 3. ve 4. gruplar arasında da fark anlamlı (sırasıyla p< 0,001 ve p<0,05) bulundu (Şekil 1). Kesitlerin histolojik değerlendirilmesi Işık mikroskobu değerlendirmesinde, SH leri ve SKH lerin nukleuslarında heterokromatin dağılımı, nukleolusun ayırt edilebilmesi, nukleus şekli, piknotik değişiklikler ile sitoplazmalarında, sitoplazmik vakuolüzasyon, dejenerasyon incelendi. Semi-kantitatif olarak değerlendirildi [22]. Gruplar üzerindeki donma-çözme etkileri orta derecede korunmuş (++), iyi korunmuş (+++) ve çok iyi korunmuş (++++) olarak sınıflandırıldı. Geçirimli elektron mikroskobunda değerlendirme kalitatif olarak yapıldı. Endoplazmik retikulumların (ER) şişip genişlemesi, mitokondrilerde yoğun görünüm, nukleuslarda hafif ve orta derecede heterokromatin yapısının görülmesi geri dönüşümlü (reversible) değişiklikler olarak kabul edildi. Mitokondrilerde atılmış yün görünümü, ER de aşırı şişme genişlemeyle birlikte sitoplazmada geniş vakuollerin oluşması, nukleuslarda piknoz, nukleus membranlarında ayrışmalar ve ondülasyonlar geri dönüşümsüz (irreversible) değişiklikler olarak kabul edildi [23,24]. Şekil 1. Straw ve kriyotüpte seeding uygulamasıyla canlılık oranlarının karşılaştırılması. * = Straw Seeding (-) ile kıyaslandığında (p<0,0001) = Straw Seeding (+) ile kıyaslandığında (p<0,001) Φ = Kriyotüp Seeding (-) ile kıyaslandığında (p<0,005). Error Bars: +/-2 SD. Işık mikroskobu bulguları Tablo I: Prepubertal testis hücre süspansiyonunun dondurulmasında seeding ve taşıyıcının SKH ler ve SH ler üzerine etkisi. (Semikantitatif değerlendirme). Spermatogonyal Kök Hücre Sertoli Hücresi 1.Grup: SS (-) (+++) (+++) 2.Grup: SS (+) (+++) (++++) 3.Grup: KS (-) (++) (+++) 4.Grup: KS (+) (++) (++++) Çok iyi korunma (++++), İyi korunma (+++), Orta derecede korunma (++)