i T.C ERCĠYES ÜNĠVERSĠTESĠ ECZACILIK FAKÜLTESĠ ANALĠTĠK KĠMYADA ÖRNEK HAZIRLAMA TEKNĠKLERĠ Hazırlayan Aysun ĠLGÜN DanıĢman Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ Bitirme Ödevi Haziran 2014 KAYSERĠ
i BĠLĠMSEL ETĠĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Aysun ĠLGÜN
ii YÖNERGEYE UYGUNLUK Analitik Kimyada Örnek Hazırlama Teknikleri adlı bitirme ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmıştır. Hazırlayan Aysun İLGÜN DanıĢman Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ Analitik Kimya Anabilim Dalı BaĢkanı Prof. Dr. İbrahim NARİN
iii Analitik Kimyada Örnek Hazırlama Teknikleri adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Analitik Kimya Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Hazırlayan Aysun İLGÜN DanıĢman Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ Analitik Kimya Anabilim Dalı BaĢkanı Prof. Dr. İbrahim NARİN ONAY : Bu bitirme ödevinin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın... tarih ve.. sayılı kararı ile onaylanmıştır. / / Prof. Dr. Müberra KOġAR Dekan
iv TEġEKKÜR Bu tezin hazırlanmasında bana destek olan ve hiçbir zaman yardımlarını esirgemeyen danışmanım Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ a, Tez çalışmalarımda yardımlarını esirgemeyen çok değerli arkadaşlarım; Mürüvvet AYDEMİR, Sema BAŞER, Fatma İLHAN, Kübra AKSOY, Nermin ÖZDEMİR, Hale GÜRKAN, Hatice Nur DEMİR e, Hayatım boyunca maddi ve manevi desteğini esirgemeyen çok sevdiğim aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Aysun ĠLGÜN
v ANALĠTĠK KĠMYADA ÖRNEK HAZIRLAMA TEKNĠKLERĠ Aysun ĠLGÜN Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Ödevi, Haziran 2014 DanıĢman: Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ ÖZET Analitler, çevresel veya biyolojik orijinli karmaşık matrislerde bulunduğu durumda, örneğin doğrudan analitik cihaza verilmesi genellikle uygun değildir. O zaman, analitik çalışmalarda örnek hazırlama çok önemli ve gerekli bir basamak haline gelir. Bu basamak ne kadar hızlı gerçekleştirilirse, analiz de o kadar hızlı tamamlanır. Uygulanan örnek hazırlama prosedürü son derece tekrarlanabilir olmalı ve önemli derecede analit kayıplarına neden olmamalıdır. İdeal bir örnek hazırlama prosedürü, minimum sayıda basamak içermeli, öğrenmesi kolay olmalı, çevre dostu ve ekonomik olmalıdır. Sıvı-sıvı ektraksiyonu, katı faz ekstraksiyonu ve katı faz mikroekstraksiyonu yaygın olarak kullanılan örnek hazırlama metotlarıdır. Bu tez çevresel örnekler için kullanılan ekstaksiyon metotlarının prensiplerini ve uygulamalarını sunmaktadır. Anahtar Kelimeler: Örnek Hazırlama, Örnek Hazırlama Yöntemleri, Ekstraksiyon Teknikleri.
vi SAMPLE PREPARATION METHODS IN ANALYTICAL CHEMISTRY Aysun ĠLGÜN Erciyes University, Faculty of Pharmacy Department of Analytical Chemistry Graduation Project, June 2014 Advisor: Assist. Prof. Dr. Vedat YILMAZ ABSTRACT In cases when the analytes of interest are peresent in complex matrices, such as environmental or biological origin, the sample is usually not suitable for direct introduction into the analytical instruments. Then sample preparation becomes is an important and essential step in the analytical studies. The faster this process can be done, the more quickly the analysis will be completed. This procedure must be highly reproducible and without appreciable loss of analytes. An ideal sample preparation should involve a minimum number of working steps, be easy to learn, be environmentally friend and be economical. Commonly used sample preparation methods include liquid-liquid extraction (LLE), solid phase extraction (SPE) and solid phase microextraction (SPME). This thesis presents principles and applications of extraction methods used for environmental samples. Key Words: Sample Preparation, Sample Preparation Methods, Extraction Methods.
vii ĠÇĠNDEKĠLER BĠLĠMSEL ETĠĞE UYGUNLUK... i YÖNERGEYE UYGUNLUK... ii KABUL ONAY... iii TEġEKKÜR... iv ÖZET.... v ABSTRACT... vi ĠÇĠNDEKĠLER... vii TABLOLAR LĠSTESĠ... X ġekġller LĠSTESĠ...Xİ 1. GĠRĠġ... 1 2. GENEL BĠLGĠLER... 3 2.1.Örnek Hazırlama... 3 2.2. Örnek Hazırlama Teknikleri... 5 2.2.1. Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE)... 5 2.2.1.1. Katı Faz Ekstraksiyonunun Amaçları... 6 2.2.1.2. SPE Metodunun Prensipleri... 6 2.2.1.3. SPE Metodunun Başlıca Kullanım Alanları... 9 2.2.1.4. SPE Metodunda Yeni Gelişmeler... 12 2.2.2. Katı Faz Mikroekstraksiyonu... 13 2.2.2.1. Katı Faz Mikroekstraksiyonunun Gelişimi... 13 2.2.2.2. Katı Faz Mikroekstraksiyonunun Prensipleri... 13 2.2.2.3. Katı Faz Mikroekstraksiyonunun Başlıca Kullanım Alanları... 15 2.2.2.4. SPME de Yeni Gelişmeler... 18 2.2.3. Stirbar Sorptif Ekstraksiyonu(SBSE) (Karıştırma Çubuğu Sorptif Ekstraksiyonu)... 18 2.2.3.1. SBSE Metodunun Prensipleri... 19
viii 2.2.3.2. SBSE Metodunun Başlıca Kullanım Alanları... 20 2.2.3.3. SBSE Metodunda Yeni Gelişmeler... 21 2.2.3.3.1. Moleküler Baskılama Tekniği ile Kaplama... 22 2.2.4. Membran Ekstraksiyonu... 23 2.2.4.1. Membran Ekstraksiyonunun Prensipleri... 23 2.2.4.2. Membran Ekstraksiyonunun Başlıca Kullanım Alanları... 25 2.2.4.3. Membran Ekstraksiyonunda Yeni Gelişmeler... 25 2.2.5. Sıvı Faz Mikroekstraksiyonu... 26 2.2.5.1. Sıvı Faz Mikroekstraksiyonunun Prensipleri... 26 2.2.5.2. Sıvı Faz Mikroekstraksiyonunun Başlıca Kullanım Alanları... 26 2.2.5.3. Sıvı Faz Mikroekstraksiyonunda Yeni Gelişmeler... 27 2.2.6. Süperkritik Akışkan Ekstraksiyonu (SFE)... 28 2.2.6.1. Süperkritik Akışkan Ekstraksiyonu (SFE) nun Prensipleri... 29 2.2.6.2. Süperkritik Akışkan Ekstraksiyonunun Başlıca Kullanım Alanları... 32 2.2.6.3. Süperkritik Akışkan Ekstraksiyonunda Yeni Gelişmeler... 33 2.2.7. Sıkıştırılmış Çözücü Ekstraksiyonu (PSE)... 34 2.2.7.1. Sıkıştırılmış Çözücü Ekstraksiyonu (PSE) Prensipleri... 35 2.2.7.2. Sıkıştırılmış Çözücü Ekstraksiyonu nun Başlıca Kullanım Alanları... 36 2.2.7.3. Sıkıştırılmış Çözücü Ekstraksiyonu nda Yeni Gelişmeler... 37 2.2.8. Matriks Katı-Faz Dispersiyonu (MSPD)... 38 2.2.8.1. Matriks Katı-Faz Dispersiyonunun Prensipleri... 39 2.2.8.2. Matriks Katı-Faz Dispersiyonunun Başlıca Kullanım Alanları... 40 2.2.8.3. Matriks Katı-Faz Dispersiyonunda Yeni Gelişmeler... 41 2.2.9. Dispertif Katı-Faz Ekstraksiyonu (DSPE)... 42 2.2.9.1. Dispertif Katı-Faz Ekstraksiyonunun Prensipleri... 43 2.2.9.2. Dispertif Katı-Faz Ekstraksiyonunun Başlıca Kullanım Alanları... 43
ix 2.2.10. Ultrasonik Ekstraksiyon... 44 2.2.10. 1. Ultrasonik Ekstraksiyonun Prensipleri... 44 2.2.10.2. Ultrasonik Ekstraksiyonun Başlıca Kullanım Alanları... 46 2.2.11. Mikrodalga-Destekli Solvent Ekstraksiyonu (MAE)... 46 2.2.11.1. Mikrodalga-Destekli Solvent Ekstraksiyonunun Prensipleri... 47 2.2.11.2. Mikrodalga-Destekli Solvent Ekstraksiyonunun Başlıca Kullanım Alanları... 48 3. TARTIġMA VE SONUÇ... 50 KAYNAKLAR... 51 ÖZGEÇMĠġ... 55
x TABLOLAR LĠSTESĠ Tablo 1a. Referanslarda bulunan farmasötiklerin fiziko-kimyasal özellikleri... 3 Tablo 1b. Sulu örneklerden farmasötiklerin ekstraksiyonunda SPE metodları... 11 Tablo 2. Farmasötiklerin belirlenmesinde kullanılan uygulama örnekleri... 23 Tablo 3. Çevresel örneklerden membran ekstraksiyonu ile örnek hazırlama koşulları.. 25 Tablo 4. Membran yöntemlerinin özelliklerinin karşılaştırılması... 31 Tablo 5. Süperkritik karbondioksitte çözünebilen madde grupları... 33 Tablo 6. Çevresel örneklerden SFE ile ekstraksiyonu yapılan farmasötikler... 41
xi ġekġller LĠSTESĠ Şekil 1a. Kolon tekniğinin uygulama basamakları... 8 Şekil 1b. SPME metodunun prensipleri... 14 Şekil 2. PPY kaplı ve Host kapillerin elektron mikroskobundaki görüntüleri... 14 Şekil 3. SPME metodunun uygulanışı... 15 Şekil 4. SPME tekniğinin kullanım alanlarındaki verim parametreleri... 16 Şekil 5. SPME-LC-MS sisteminin sistematik diyagramı... 18 Şekil 6. Stirbar sorptif ekstraksiyonunun mekanizması... 19 Şekil 7. Yıllara göre SBSE metodu hakkındaki yayım sayısı... 21 Şekil 8. Stirbar çubuğunun uygulama öncesi ve sonrası görüntüsü... 21 Şekil 9. Farklı maddelerle baskılanmış SBSE sistemleri... 22 Şekil 10. Ekstraksiyon işleminin SLM tekniği ile uygulanması... 24 Şekil 11. Ekstraksiyon işleminin MMLLE tekniği ile uygulanması... 24 Şekil 12. Faz diyagramı... 28 Şekil 13.Süperkritik sıvı ekstraksiyonu yönteminin şematik gösterimi... 29 Şekil 14. Karbondioksitin süperkritik forma dönüşmesi... 29 Şekil 15.Süperkritik sıvı ekstraksiyonu yönteminin şematik gösterimi... 30 Şekil 16. SFE sistemi... 31 Şekil 17. PSE sistemi... 35 Şekil 18.Örnek matriksinde analitin pozisyonu... 36 Şekil 19. PLE şeması... 37 Şekil 20. MSPD ekstraksiyon basamakları... 39 Şekil 21. MSPD prosedürü... 39 Şekil 22. MSPD-SPE-HPLS/DAD çoklu ekstraksiyon sistemi... 40 Şekil 23. Farklı doku matrikslerinden ekstrakte edilen kinolonlar... 41 Şekil 24. Dinamik ses dalgaları destekli ekstraksiyonun şematik gösterimi... 45
xii Şekil 25. Dinamik ses dalgaları ekstraksiyonunun analiz sistemine bağlanması... 45 Şekil 26. MAE de kapalı ve açık sistem... 47 Şekil 27. MAE de ısıtma modelleri.... 48
xiii KISALTMALAR AA DAD DSPE ECD EPA HPLC IS LC LLE MAE MIP : Atomik Absorpsiyon : Sıralı Diyot Dedektörü : Dispertif Katı Faz Ekstraksiyonu : Elektron Yakalama Dedektörü : Amerikan Çevre Koruma Ajansı : Yüksek Performanslı Sıvı Kromotografisi : İmmüno Sorban : Likit Kromotografisi : Sıvı Sıvı Ekstraksiyonu : Mikrodalga Destekli Solvent Ektraksiyonu : Moleküler Baskılanmış Polimer MMLLE : Mikroporöz Membran Sıvı Sıvı Ekstraksiyonu MS MSPD PAH PLE PVDF RAM RIA SFE SLM SPE SPME : Kütle Spektroskopisi : Matriks Katı Faz Dispersiyonu : Poli Aromatik Hidrokarbon : Sıkıştırılmış Çözücü Ekstraksiyonu : Polivinilendiflorür : Sınırlı Geçiş Maddeleri : Radyo İmmuno Analiz : Süperkritik Sıvı Ekstraksiyonu : Desteklenmiş Sıvı Membran : Katı Faz Ekstraksiyonu : Katı Faz Mikroekstraksiyonu
1 1. GĠRĠġ Farmasötikler yakın zamanda ortaya çıkmış ve gelecekte daha çok önemli olacak çevresel kirletici ajanlardır. Onların çevre için sürekli olumsuz etki oluşturmaları için bu negatif etkilerinin sürekllik göstermesine gerek yoktur çünkü üretim süreçlerinde kullanılmayacak ürünlerin ve atıkların sürekli olarak çevreye verilmesi söz konusudur. Buna ek olarak farmasötiklerin ekotoksik olduklarına dair veri veya risk değerlendirmesi yoktur, bu nedenle onların organizmaların sağlığı üzerinde gösterdikleri etkileri tahmin etmek zordur [1]. Özellikle kanalizasyon, deniz suyu gibi biyolojik çevre örnekleri çok komplekstir ve bileşiminde araştırılan maddeyi maskeleyebilecek birçok karmaşık bileşen içerir. Bu yüzden örneği direkt analiz etmek mümkün değildir. Dahası analizi yapılacak maddenin örnekteki mevcut olduğu ilk konsantrasyonu ile analiz sonucu saflaştırılacağı konsantrasyonunun kayıpsız olması için kullanılacak yöntem önemlidir. Analitik prosesler genellikle 5 adımdan oluşur. 1- Örnek alma 2- Örnek hazırlama 3- Ayrıştırma 4- Tayin 5- Veri analizi Her adım tam bir doğrulukta yapılabilir fakat örnek alma ve örnek hazırlama analitik sürecin anahtar basamaklarıdır. Analiz sürecinin %80 inden fazlası bu iki basamakta harcanır. Akılda tutulacak bir önemli nokta da bu beş analitik basamağın tümü art arda gerçekleştirilir ve bir sonraki basamak, bir önceki basamak tamamlanmadan başlayamaz. Eğer bu basamaklardan bir tanesi bile uygun bir şekilde ve tam anlamıyla takip edilemezse prosedür tamamen zayıf kalır, hatalar oluşur ve sonuçlar tutarsız çıkar. Bu yüzden analitik prosedürün en önemli şartı örnek hazırlamada kuşkuya yer
2 vermeyen bir çalışmadır. Olası sorunlardan genellikle analitler sorumludur. Bu nedenle bu tezde çeşitli örneklerin farmasötik analizlerinde kullanılan son yılların örnek hazırlama teknikleri derlenmiştir. Biz burada örnek hazırlama basamağındaki güncel gelişmelere ve çeşitli uygulamalara yer verdik.
3 2. GENEL BĠLGĠLER 2.1.ÖRNEK HAZIRLAMA Örnek hazırlama metotlarının basitçe konsepti, bir matriksin analiz için uygun bir örneğe dönüştürülmesidir. Bu süreç bileşenler ile onların somut kimyasal çevreleri arasındaki etkileşimi kaçınılmaz şekilde değiştirmektir. Analit ve matriksin fiziksel ve kimyasal özellikleri vasıtasıyla bu etkileşimler tespit edilir ve bu özellikler onların verim ve tekrar üretilebilirliğini etkiler. Bundan dolayı, bir örneğin fizikokimyasal drumunun karakterizasyonu örnek hazırlama basamaklarının ilave bir önşartıdır. Bu bir analitin fiziksel ve kimyasal özellikleri hakkında bilgi sahibi olmak çok önemlidir çünkü bazı spesifik özellikleri olan bileşenlerin olup olmadığı gibi durumların belirlenmesinde yardımcı olabilir. Tablo 1a. Referanslarda bulunan bazı farmasötiklerin fizikokimyasal özellikleri [1] Bileşik logko/w pka Kd logkoc Amoksisilin Ampisilin Benzil penisilin Karbamazepin Kloramfenikol 0,87; 0,97 1,45; 1,45 1,87; 1,85 2,45; 2,25 1,14; 0,92 2,4; 2,8 7,2 2,52; 2,7;7,3 2,79; 2,8 13,9-1,06 - - 25,52-2937 2728 2625 3588 - Siprofloksasin 0,4; -0,00 6,38 416,9 1550 Diklofenak 4,51; 4,02 4,15 0,72 2921 Eritromisin 3,06; 2,48 8,9; 8,88 164,76 1000 İbuprofen 3,97; 3,79 4,4 453,79 2596 Norfloksasin -1,0; -0,31 6,4-1964 Oksitetrasiklin -1,22; -2,87 3,27; 3,3; 7,4 0,02 1988 Parasetamol 1,70; 0,46 9,5 0,4139 3944 Propranolol 2,60 9,49-3086 Sülfadiazin -0,09; -0,34 6,15; 6,50-2276 Sülfaguanidin -1,07 11,3-2109 Sülfametazin 0,89; 0,76 2,65; 2,4 7,4-2695 Tetrasiklin -1,1; -1,33 3,3; 7,7 9,7-1760 Trimetropin 0,73 6,6-2957
4 log Ko/w:Oktanol/su partisyon katsayısının logaritması; pka: Asidik disosiasyon sabiti; Kd: Atık/su partisyon sabiti; logkoc: Organik karbonun absorblama katsayısının logaritması. Farmasötiklerin çoğu asidik veya bazik fonksiyonel gruplar içerirler. Bu maddelerin iyonizasyon oranı yerine göre; asitlik ayrışma sabiti( pka değeri) ve çözeltinin ph kontrolü(örneğin pka1 ve pka2 değerleri sülfonamidler için 2-3 ve 5-8 arasındadır.) ile belirlenebilir. ph ın 3-5 olduğu aralıkta karışım genellikle doğal formundadır oysa daha yüksek ph ta karışım ağırlıklı olarak non-iyoniktir. B-blokörlerin çoğu ve antiülser ajanlar 7.1-9.7 pka değerleri ile doğada basittir, fakat nonsteroidal antiinflamatuar ilaçlar (NSAİİ) 4.0-4.5 Pka değerleri ile asidiktir. Bu farklı kimyasal yapılar (anyonik, katyonik, nötral) genellikle geniş ve farklı özelliklere sahiptirler. Matriks etkisi ekstraksiyon analizindeki en büyük problemdir. Matriks etkisi örneğin özelliklerinin etkilenmesi olarak tanımlanabilir. Geri kazanım verimliliği, ekstrakt miktarı(farmasötikler örnekteki organik maddelere bağlanabilir bundan dolayı saflaştırılan farmasötiklerin konsantrasyonu düşük olabilir ve bunu tespit etmek zordur) ve analitin varlığından bağımsız olarak oluşabilir. Örnek hazırlama basamağında geniş aralıklı tekniklerle çalışarak başarılı olunabilir fakat tüm metotların amaçları aynıdır; Potansiyel istenmeyen girişimleri uzaklaştırmak, Analit konsantrasyonunu artırmak, Eğer gerekliyse, analiti daha uygun br forma dönüştürmek, Örnek matriksteki varyasyonlardan bağımsız, güçlü tekrarlanabilir bir metot sağlamak, Daha düşük miktarlardaki örneklerin kullanımı, küçük hacimde organik çözücü kullanarak veya organik çözücü kullanmaksızın, Ekstraksiyonda daha iyi spesifiklik veya daha iyi seçicilik sağlamak, Otomasyon potansiyelini artırmaktır. Ayrıca örnek hazırlama basamağı sonuç analite özel olmalıdır. Kullanılacak aletlerin ve gereken doğruluk derecesinin de kalitatif yada kantitatif yöntem olması göz önünde bulundurulmalıdır.
5 2.2. Örnek Hazırlama Teknikleri 2.2.1. Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE) Katı faz ekstraksiyonu örnek hazırlamada kullanılan bir tekniktir. Geçmiş yıllarda örnek hazırlamada en çok kullanılan yöntem sıvı-sıvı ektraksiyonudur(lle). Fakat sıvı-sıvı ektraksiyon uygulamalarında fazla miktarda çözücü harcanması, çok zaman harcanması ve yüksek maliyetli olması gibi dezavantajlar vardır. Bu nedenle günümüzde örnek hazırlamada yaygın olarak katı faz ekstraksiyonu kullanılmaktadır. Çünkü bu iki sistem karşılaştırıldığında (SPE LLE) SPE metodu daha hızlı, daha az çözücüye ihtiyaç duyan, emülsiyon oluşumunun şekillenmediği çok daha ucuz bir tekniktir. Günümüzde katı faz ekstraksiyonu yavaş yavaş sıvı-sıvı ekstraksiyonunun yerini almış ve çevresel alanlarda en yaygın örnek hazırlama tekniği haline gelmiştir. Katı faz ekstraksiyonunun sıvı-sıvı ekstraksiyonundan üstünlükleri şu şekilde sıralanabilir; 1- SPE metodu klasik sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemine göre 2/3 daha hızlı sonuç verir ve örnek hazırlama süresinin oldukça kısalmasını sağlar. 2- SPE, çok pratik ve bütün laboratuvarlarda kolaylıkla uygulanabilir bir metottur. 3- Bu yöntemde daha az çözücü ve ayıraç madde kullanıldığından daha ekonomik bir örnek hazırlama yapılabilir. 4- Geri kazanım (recovery) oranı yüksektir ve istenilen derişimde örnekler elde edilebilir. En az düzeyde örnek transferi yapıldığından yüksek geri kazanımlar ile yüksek zenginleştirme ve saflıkta örnekler elde edilebilmektedir. 5- Örnek, adsorban madde ve çözücüler arasında çapraz bulaşma riski düşük olduğundan yüksek doğrulukta sonuçlar alınabilir. 6- Düşük miktarda örnek işlendiğinden sıvı-sıvı ekstraksiyondaki gibi emülsiyon oluşma problemi yoktur. 7- SPE metodunda en az düzeyde evaporasyona ihtiyaç duyulduğundan kararsız örnek oluşumu nadirdir. 8- Çözücü ve örneklerin az miktarlarda kullanılmasından dolayı zehirli maddelerle temas daha azdır ve ayrıca daha az cam malzeme kullanılması nedeniyle analizi yapanlar için oldukça güvenli bir metottur. Ayrıca çevreyi kirletme riski daha düşüktür. 9- Çok sayıda örneğin aynı anda ve tekrarlanabilir şekilde işlenebilmesine olanak sağlayacak şekilde çok kolay otomasyon sağlanabilir [2].
6 Analiz öncesi yapılması gereken örnek hazırlama, çoğu zaman zor, pahalı ve uzun süren bir işlemdir. Bu nedenle kimyasal analiz yapan kişiler her zaman daha pratik ve basit yöntem arayışı içindedirler. Bu konuda, özellikle kromatografik sistemlerle çalışan 152 araştırıcı ve uygulayıcı ile yapılan bir anket çalışmasında, örnek hazırlama yönteminin seçiminde numunenin özelliği başlıca etken olmakla birlikte, kolay uygulanabilir ve ucuz olmasının da önemli rol oynadığı belirlenmiştir. SPE bu öncelikler doğrultusunda öne çıkmaktadır. 2.2.1.1. Katı Faz Ekstraksiyonunun Amaçları Örnek, analizden önce tanınmasına, ölçülmesine ihtiyaç duyulmayan bileşenlerden temizlenmelidir. Daha sonra ise analize uygun şekle çevrilmelidir. Bir fabrikanın çıkış borularından toplanan bir numuneyi ele alalım; Sulu ve analiz edilmeleri gereken eser halde yağ ve gres ihtiva eden örnekteki alg ve yosunlar uzaklaştırılmalıdır. Ayrıca örnek, ihtiyaç duyulan analiz metodu için freon-13 gibi bir çözücüde hazırlanmış olmalıdır. Daha sonra örnek deriştirilmelidir. Deriştirme işlemi çevreyle ilgili ölçümlerde veya insanda yapılan analizlerde çok kritiktir. Her iki durumda da ölçümlerin örnek matriksi zenginleştirilmeden yapılması gerekir. Bunun için spesifik ve duyarlı metotlar gereklidir. SPE ürünleri ekstraksiyon, zenginleştirme ve temizlik bakımından mükemmeldir. SPE sorbanlarının temizleme prosedürü sadece katı örneklerin ekstraksiyonuyla sınırlı değildir, fakat çevresel örneklerin(özellikle atıksu örnekleri) ekstraksiyonlarının tümünde de uygulanabilir. Temizleme işlemi düşük miktarlardaki analitlerin tayininde çok önemli bir basamağı oluşturur ve tabiki bu işlem, örnek matriksine ve dedektör moduna(özellikle analiz sıvı kromotografi ile gerçekleşmiş ise) bağlıdır. 2.2.1.2. SPE Metodunun Prensipleri SPE metodunda maddelerin birbirinden ayrılması, analizi yapılacak maddenin molekülleri ile adsorbandaki etkin gruplar arasındaki moleküller arası etkileşimler sayesinde açıklanır. Analizi yapılacak madde molekülleri adsorbanlardaki etkin gruplara iyonik, hidrojen, dipol-dipol, dipol-indüklenmiş dipol ve indüklenmiş dipol-
7 indüklenmiş dipol (van der Waals) bağları ile bağlanır. Bu şekilde aranan madde, matriksteki istenmeyen bileşikler ve çözücüler birbirinden ayrılmış olur [2]. SPE yöntemi, temel olarak küçük, tek kullanımlık ekstraksiyon kolon veya disklerine çeşitli tutucu maddelerin doldurulması ve sıvı örneklerini istenmeyen bileşenlerden ayırma (temizleme), zenginleştirme ve ileriki analiz aşamaları için örnek matriks yapısının değiştirilmesi amaçlarıyla hazırlanmış olan kolon ve disklerden geçirilmesi esasına dayanmaktadır. Sıvı örneğin kolondan geçirilmesi, yerçekimi vasıtasıyla (manual) gerçekleştirilebildiği gibi, zaman kaybının önüne geçmek amacıyla vakum manifoldları yardımıyla da yapılabilir. Katı faz ekstraksiyonunun prensibi maddelerin iki faz arasındaki geçişini içeren sıvı-sıvı ekstraksiyonuna benzerdir. Ancak LLE deki iki karışmayan sıvı fazın yerine, SPE de, bir sıvı (örnek matriksi) ve katı faz (adsorban) arasındaki dağılım sözkonusudur. Bu basit teknik katı adsorbanın sağladığı absorbisyon ile analitin konsantre hale getirilmesi ve saflaştırılması sağlanır. Bu temel yaklaşım, sıvı örneğinin bulunduğu bir kolon, bir kartuş, analitleri tutan bir adsorban içeren bir disk veya bir borudan oluşur. Tüm örnek adsorban boyunca yol aldıktan sonra, tutunan analitler uygun bir çözücü ile yıkanarak elde edilir. İlk deneysel SPE uygulamaları elli yıl önce başlamıştır. Katı faz ekstraksiyonu yönteminde en yaygın olarak kolon tekniği kullanılır. Kolon tekniğine dayanan katı faz ekstraksiyonu yöntemi daima Şekil 1a da resimlerle açıklandığı gibi birbirini takip eden 3 veya 4 basamaktan oluşur. Birinci basamak, katı adsorbanın örneğin çözücüsüyle aynı olan uygun bir çözücü kullanılarak şartlandırılmasıdır. Bu basamak çok önemlidir. Çünkü bu basamak, dolgu maddesinin ıslanmasını ve fonksiyonel grupların solvatize olmasını sağlar. Buna ilaveten, başlangıçta katı adsorban üzerinde bulunabilecek kirlilikleri uzaklaştırır. Hatta bu basamak kolon içerisinde bulunan havayı uzaklaştırarak boş hacimlerin çözücü ile dolmasını sağlar. Şartlandırıcının seçimi çözücünün ve katı adsorbanın türüne bağlıdır. Şartlandırma ve örnek muamele basamakları arasında katı adsorbanın kurumasına izin verilmemelidir. Aksi takdirde, analitler yeterli bir şekilde tutunmaz ve düşük geri kazanmalar elde edilir. Şayet, adsorban birkaç dakikadan daha uzun süre kuru kalırsa, tekrar şartlandırılmalıdır.
8 Ġkinci basamak, katı adsorban içerisinden örneğin süzülmesidir. Kullanılan sisteme bağlı olarak, örnek hacimleri 1 ml den 1 L ye kadar değişebilmektedir. Örnek, kolona yerçekimi, pompalama, vakum yardımıyla çektirilerek ya da bir otomatik sistem ile verilebilir. Örneğin adsorban içerisindeki akış hızı analitlerin yeterli tutunmasına imkân sağlayacak kadar yavaş ve aynı zamanda aşırı süreden kaçınacak kadar yüksek olmalıdır. Bu basamak süresince, analitler katı adsorban üzerinde deriştirilir. Hatta ortam bileşenleri katı adsorban ile tutulsa bile, bunların büyük bir kısmı kolondan geçer, böylece örneğin kısmi saflaştırılması (ortamın ayrılması) sağlanmış olur. Üçüncü basamak (isteğe bağlıdır), analitleri kolondan uzaklaştırmaksızın, katı adsorban üzerinde tutulmuş olan ortam bileşenlerini bertaraf etmek için katı adsorban düşük elüsyon şiddetinde uygun bir çözücü ile yıkanabilir. Dördüncü basamak, tutunan ortam bileşenlerini almayacak uygun bir çözücü ile analitlerin elüsyonundan oluşur. Çözücü (elüent) hacmi, analitlerin kantitatif geri kazanılmasını sağlayacak şekilde ayarlanmalı ve buna ilaveten, elüent akış hızı ise yeterli elüsyonun sağlanması için doğru bir şekilde ayarlanmalıdır [3]. Yıkama/Şartlandırma Yükleme (Örnek muamelesi) Yıkama Elüsyon ġekil 1a. Kolon tekniğinin uygulama basamakları [3] SPE metodunda kromatografik yöntemlere benzer şekilde, analiz edilecek madde, çözücü ve tutucu maddelerin özelliklerine göre çeşitli ayırma mekanizmaları rol oynar. Belli başlı ayırma mekanizmaları olarak 1. Normal faz 2. Ters faz 3. İyon değişim (katyonik ve anyonik değişim) 4. Moleküler eleme sayılabilir.
9 2.2.1.3. SPE Metodunun BaĢlıca Kullanım Alanları SPE metodu sahip olduğu avantajlar sayesinde özellikle çevre, gıda, analitik biyokimya, farmasötik biyoanaliz,(tablo 1b.) toksikoloji ve adli tıp, kozmetik, organik sentez vb. alanlarda günümüzde en fazla kullanılan örnek hazırlama metodlarından birisi haline gelmiştir. SPE bugün birçok farklı özellikteki bileşiklerin kimyasal analizinde tercih edilen bir metottur. Farmakoloji ve toksikoloji bilimleri kapsamında numuneleri; su, toprak gibi çevresel; kan, serum, idrar gibi biyolojik örneklerdeki kirleticiler ile ilaç ve zehir analizleri SPE'nin en önemli kullanım alanlarıdır. Gıdaların besin madde analizlerinin yanı sıra, içerdikleri kimyasal ve biyolojik kirleticilerin tespit edilmesinde SPE önemli bir örnek hazırlama metodudur. Özellikle fındık gibi mikotoksin kirliliği açısından önem taşıyan gıdalarda başta aflatoksinler ve diğer mikotoksinlerin, hemen hemen bütün bitkisel ve bal, süt, peynir gibi hayvansal gıdalarda ve bebek mamalarında pestisit, et ve et ürünlerinde steroid hormon ve PAH'ların tespit edilmesi, bu alanda SPE metodunun kullanılmasına verilebilecek en önemli örneklerdir. SPE çevresel örneklerden en çok sudaki organik kirleticilerin analizinde kullanılmaktadır. SPE'nin örnek hazırlama amacıyla kullanıldığı su kirleticileri arasında organik klorlu ve organik fosforlu pestisitler, anilinler, fenolik bileşikler, organik azot ve nitro-aromatik maddeler sayılabilir [4]. İdrar, kan, serum, safra, mide içeriği, karaciğer, beyin gibi biyolojik örneklerde ilaç düzeylerinin tespiti günümüzde SPE'nin en önemli kullanım alanlarından birisidir. Bilindiği gibi ilaç geliştirme aşamalarının önemli bir basamağı; ilaç ve metabolitlerinin vücut sıvılarındaki seviyelerinin tespit edilmesidir. Bunun yanında tedavi etkinliğinin takibi amacıyla da biyolojik örneklerde ilaç miktarının analizi önem taşımaktadır. Özellikle yüksek geri kazanımlara sahip olması, daha saf süzüntüler elde edilebilmesi ve çok sayıda örneğin kısa zamanda işlenmesine olanak verecek şekilde otomasyon sağlayabilmesi nedeniyle hemen hemen bütün ilaç ve benzeri maddelerin analizinde SPE yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunun yanısıra son yıllarda pek çok tıbbi bitkinin ekstraksiyonunda da SPE yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. Zehirlenmelerde zehirleyici madde ile amaç dışı kullanılan opiat, kokain, amfetamin gibi ilaç ve diğer maddelerin belirlenebilmesi için bunların vücut sıvılarında tespit edilmesi gerekmektedir. Bu tip analizler, tam olarak ne arandığının bilinememesi ve aranan maddelerin fiziksel ve kimyasal özelliklerinin aşırı değişkenlik göstermesi
10 nedeniyle oldukça zahmetli ve zaman alıcıdır. SPE metodu, diğer örnek hazırlama yöntemlerine göre sahip olduğu avantajların yanında özellikle polar, polar olmayan yapıda ve asidik, bazik veya nötral özellikte hemen her tür maddeye uygun tutucu maddeler bulunması nedeniyle toksikolojik analizlerde en fazla tercih edilen örnek hazırlama yöntemidir.
9 Tablo 1b. Sulu örneklerden farmasötilklerin ekstraksiyonunda SPE metotlarının incelenmesi [1] Farmasötikler Örnek Adsorban tipi ġartlandırıcı çözücü Elüsyon çözeltisi Sonuç analiz B-laktam antibiyotikleri (Penisilin G, Ampisilin, Amoksisillin) Tetrasiklinler Oksitetrasiklin, Klortetrasiklin, Tetrasiklin, Sulfonamidler, Sulfamethazine, Sulfametoksazol, Makrolitler Eritromisin, Tilosin Atıksu, 250 ml ph 7,5 Nehir suyu Oasis MAX 500 mg/6 ml 120 ml Oasis HLB 60 mg/3 ml, su 1. Metanol, 6 ml 2. Milli Q-water, 6 ml 3. 0,05M fosfat tamponu (ph 7,5), 6 ml 1. Metanol, 3 ml 2. Deiyonize su, 3 ml 2 x 1 ml 0,05M tetra-nbütilamonyum hidrojen sülfat 2 x 1 ml metanol/su (0,1 M fosfat tamponu), 60/40 (v/v) Metanol, 5 ml HPLC-DAD LC-MS-MS Sulfonamidler, Sulfaguanidin, Sulfadiazin, Sulfametazin, Sulfametoksazol Tetrasiklinler, Oksitetrasiklin, Klortetrasiklin, Tetrasiklin, Atıksu 500 ml, ph 3,0 Deniz suyu, ph 3,4 Oasis MCX Oasis HLB 30 mg 1.Su, 5 ml 2. Metanol, 5 ml 1. Metanol, 5 ml 2. Su, 5 ml 3. Formik asit tamponu (ph 3,4) 5% Amonyum hidroksit metanolde, 2 ml Metanol, 1% TFA, 1 ml LC-ESI-MS- MS LC-FLD Makrolitler(Klaritromisin) Fluorokinolonlar(siprofloksasin) NSAİİler(İbuprofen) Psikiyatrik ilaçlar(diazepam) Benzimidazoller, Antihelmintikler (Albendazol, Fenbendazol, Mebendazol, Oksibendazol, Tiabendazol) Atıksu 500 ml, ph 2,0 Su 1,5 ml Oasis MCX 60 mg/3 ml Isolute HCX 130 mg/6 ml 1. Metanol, 6 ml 2. Milli-Q water, 3 ml Asetonitril : asetik asit = 95 : 5, 1,5 ml 1. Metanol, 2 ml 2. 2% amonyum(metanolde), 2 ml Asetonitril : 29,3% Amonyum = 95 : 5, 3 ml HPLC-MS-MS LC-ESI-MS 11
12 2.2.1.4. SPE Metodunda Yeni GeliĢmeler SPE metodunda adsorban maddelerdeki gelişmeler sayesinde çok geniş bir polarite spektrumundaki maddelerin ayrımı kolaylıkla yapılabilmektedir. Yeni tutucu maddeler arasında bulunan monofonksiyonel C18 silika ve buna benzer maddelerde, silika yüzeyindeki modifiye olmamış silanol grupları artırılmış, böylece analiz edilecek madde çözeltisi ile meydana gelebilecek ikincil etkileşimlerin azaltılması sağlanarak daha iyi bir ayrım gerçekleşmesi temin edilmiştir. Çevresel su analizlerinde karşılaşılan polar maddelerin ekstraksiyon problemleri ise karbon bazlı ve sitren-divinilbenzen gibi yeni adsorban madeler kullanılarak azaltılmıştır [5]. SPE metodunda, zaman zaman adsorban maddelerin analiz edilecek bileşik için yeterli seçiciliğe sahip olmaması sorunu yaşanabilmektedir. Bu sakıncanın ortadan kaldırılması amacıyla, bir çok SPE adsorbanlarına hedef maddeye spesifik bileşenler eklenmiş ve seçicilikleri arttırılmıştır. Tutucu maddelere eklenen bu özel maddeler arasında boronat, lektin, protein A ve G, sabit metal iyonları, peptidler ve antikorlar sayılabilir. Özellikle antikorlar, bileşik ya da grup spesifik adsorbanlar (immunosorbanlar) elde edilmesine olanak sağlamakta ve dayanıklı olmayan biyolojik örneklerde başarılı sonuçlar alınmaktadır. Aynı zamanda bu tutucu maddeler sayesinde ekstraksiyon, zenginleştirme ve izolasyon tek basamakta gerçekleştirilebilmektedir. Örnek hazırlama prosedürlerinin gelişiminde ise örnek hazırlama basamağını mümkün olduğunca basitleştiren, ekstraksiyon ve temizleme basamaklarının bir arada yapılabilmesine olanak sağlayan, bunun yanında özellikle çevresel örnek analizlerinde bir çok madde kalıntısını aynı anda ekstrakte ve analiz etmeye (çoklu kalıntı metodu) yönelik prosedür geliştirme çalışmaları dikkat çekmektedir [6]. Literatürde analitik metotların çoğunda, RAM (sınırlı gerçiş maddeleri) ve MIP (moleküler baskılanmış polimer), çok spesifik ve selektif adsorbanların özel çeşitleridir. SPE adsorbanlarından RAMlar; kücük ilaçların analizi, safsızlıkları ve metabolitlerinin analizinde sıklıkla kullanılır. MIPler; bir analitin fonksiyonel grupları ve şekline göre üç boyutlu uyumlu alanlar içeren, son derece kararlı polimerlerdir. Sülfonamidler, trimetroprim ve tetrasiklinler için MIP adsorbanların geliştirilmesi konusunda çeşitli bilgiler vardır. MIPler özellikle polar bileşiklerin problemleri gibi tüm ekstraksiyon sorunlarını çözebilir(örneğin; yukarıda bahsedilen sülfaguanidinler). MIPler
13 adsorbanların çok umut verici bir türüdür fakat MIP çalışmaları çok zaman alıcıdır, ayrıca sabır ve beceri gerektirir. Gelecekte MIPler muhtemelen diğer farmasötik sınıfların çoğunun ekstraksiyonunda kullanılacaktır. 2.2.2. Katı Faz Mikroekstraksiyonu SPME nin mekanizması SPE ile aynı olmakla birlikte SPME, SPE metodunun minyatür hali olarak düşünülebilir. SPME çevresel örneklerden farmasötiklerin analizinde, örnek hazırlama tekniği olarak belirgin hale gelmiştir. Balakrishnan ve arkadaşları DI-SPME ve SPE ile atıksulardan sülfonamidlerin ekstraksiyonu için birçok çalışma yapmışlardır [7]. SPE, sulfalazinler için etkili bir yöntem olmamasına rağmen SPME ile tüm sülfonamid bileşikleri %75 den yüksek bir verimlilikte(sülfametazin%39.8 ve sülfametoksazol %59.2) ekstrakte edilebilmektedir. 2.2.2.1. Katı Faz Mikroekstraksiyonunun GeliĢimi 1989 yılında Pawliszyn ve arkadaşları tarafından bulunan katı-faz mikroekstraksiyon (SPME) yöntemi, örnek hazırlama kademesine oldukça başarılı yeni bir yaklaşım getirmiştir. SPME, örnek hazırlama, ekstraksiyon ve zenginleştirme aşamalarını çözücü içermeyen tek bir aşamada birleştirmiştir. Bu yöntemle işlem süresi ve maliyetlerde önemli kazançlar sağlanırken, teşhiste de iyileşmeler görülmüştür. SPME, GC veya GC- MS ile birlikte özellikle çevre, biyoloji ve gıda örneklerindeki uçucu ve yarı uçucu organik bileşiklerin ekstraksiyonunda kullanılmaktadır. Ayrıca, yüksek-performanslı sıvı kromatografisinde de (HPLC) uygulanmaktadır. 2.2.2.2. Katı Faz Mikroekstraksiyonunun Prensipleri Çok basit bir cihaz olan SPME, modifiye edilmiş bir şırıngaya benzemektedir. İç kısmında bir lif tutucu ve lif grubu bulunmaktadır. Sondaki lif, 1-2 cm uzunluğunda ileri geri hareket edebilen bir SPME lifidir. SPME lifi ince polimer film kaplı eritilmiş silika optik bir liftir. SPME uygulaması gaz (headspace) yada çözelti halindeki örneğe uygulanabilmektedir. Her iki durumda da SPME iğnesi kapalı ortama sokulur, lifi koruyan kısım geri çekilir ve lifin ortamla temas etmesi sağlanır. Lif üzerindeki polimer kaplama tıpkı bir sünger gibi absorpsiyon/adsorpsiyon yöntemiyle örneği alır ve daha
14 sonra koruma amaçlı olarak lif, metal iğnenin içerisine geri çekilir. Bir sonraki aşama lif üzerindeki örneğin GC veya GC-MS e termal desorpsiyon ile aktarılarak analiz edilmesidir. ġekil 1b. SPME metodunun prensibi [8] (D) SPME modeli (S) Örnek(F) Hareketli fiber (I) GC enjeksiyon yeri (C) Kapiler başlık ġekil 2. A D PPY-kaplı kapillerin işlem boyunca elektron mikroskobunda görünüşü [9] SPME yönteminin etkinliğini etkileyen en önemli faktör lifi kaplayan materyalin tipi ve kalınlığıdır. PDMSDVB [poly(dimethylsiloxane)-divinilbenzene] tipi lifler terpenler gibi önemli uçucu bileşiklerin tutulmasında kullanılmaktadır. SPME ekstraksiyonunun süresi 1-20 dak. arasında değişmektedir. Sürenin kısa olması hekzenal gibi uçucu bileşiklerde yeterli olabilmekte ancak daha az uçucu bileşikler için daha uzun sürelere ihtiyaç duyulmaktadır.
15 ġekil 3. SPME metodunun uygulanışı [9] SPME ile yüzeye tutunan analitlerin yüzeyden ayrılması, analitin kaynama noktasına, kaplama maddesinin kalınlığına ve enjeksiyon noktasının sıcaklığına bağlıdır. Bazen maddelerin tutundukları yüzeyden yavaş ayrılmaları için kılcal sütun girişinde kriyojenik soğutma işlemi yapılabilir. SPME uygun ekstraksiyon koşulları ve uygun içşartlar sağlandığında örneğin hızlı bir şekilde taranmasında kullanılabilir, resmi ve kantitatif analizlerin güvenilir bir parçası olabilir. 2.2.2.3. Katı Faz Mikroekstraksiyonunun BaĢlıca Kullanım Alanları SPME ler bulunuşlarından buyana hızlı bir gelişme göstermişlerdir. İlk gelişmeler çevresel kimyasalların ekstraksiyonu alanında olmuştur (Tablo 3). En fazla çalışılan organik bileşikler pestisitler, herbisitler ve biyolojik aktiviteye sahip maddelerdir. Şimdiye kadar uçucu, yarı uçucu bileşikler, organometalik bileşikler, koku bileşikleri, kloro ve nitro benzenler, kloro ve nitro anilinler, cıva bileşikleri, aseton gibi kimyasallar SPME metodu ile analiz çalışmaları yürütülmüş örneklerdir. SPME ile sık çalışılan farmasötik maddelere B-blokörler, sülfonamitler(tablo 2), amfetamin ve metamfetamin gibi stimülanlar, histamin gibi H-2 reseptör blokörleri örnek verilebilir.
ġekil 4. SPME tekniğinin kullanım alanlarındaki verim parametreleri [9] 16
15 Tablo 2. Farmasötiklerin belirlenmesinde kullanılan uygulama örnekleri [1] Farmasötikler Örnek SPME optimizasyon parametreleri Desorpsiyon Sonuç analiz Sülfonamidler (ör;sülfaguanidin, sülfadiazin,sülfametazin, sülfametoksazol.) Atık su 25 ml PDMS 100 μm; CW/DVB 65 μm; CW/TPR 50 μm; PA 85 μm; PDMS/DVB 60 μm; İyonik güç: 5%, 10%, 15%, 20% KCl Ekstraksiyon süresi: 5, 10, 15, 20, 25. 30. 40 dk. ph: 3.0 4.5 5.3 6.0 Metanol 100 μl 30 dk. LC-ESI-MS-MS Tablo 3. Sulu örneklerden SPME metoduyla ekstraksiyonu yapılan bazı farmasötik maddeler [1] Farmasötikler Örnek Fiber Dezorpsiyon Sonuç analiz Sülfonamidler Süt Poli(MAA- Metanol:0,02M HPLC-UV (ör;sülfadiazin, EGDMA) sülfametazin, Na2HPO4=3:7, v/v; sülfametoksazol) ph 3,0 Florokinolonlar (ör;siprofloksasin, norfloksasin, enrofloksasin) Atıksu örnekleri 1mL CAR 1010 PLOT 17 μm, Supelco; 5mM amonyum format ph 3,0;asetonitril=85:15, v/v LC-MS-MS 17
18 2.2.2.4. SPME de Yeni GeliĢmeler SPME ile örnek hazırlama aşamasındaki ekstraksiyon etkinliği ve seçiciliği yeni maddelerle kaplanmış yeni kapiler kolonların tasarlanması ile büyük bir gelişimin göstermektedir. SPME için örneğin sayısı, hacmi, mekanizmadan çıkış hızı ve ph ı önemli parametrelerdir, ayrıca kapiler kolonda tutulan analitlerin ayrılması da çözücü hacmi ve bileşenlerine bağlıdır. Bu nedenle bu parametrelerin optimize edilmesi ve en elverişli hale getirilmesi spme metodunun yeni gelişme kanallarındaki hedefleri oluşturur. SPME metodunun bir diğer gelişim alanı ise diğer ayırma yöntemleri ile yapılan kombinasyonlu çalışmalardır. SPME nin; HPLC, LC-MS ve GC ile birlikte kullanımları ile yeni analitik ayırma teknikleri söz konusu olmaktadır (Şekil 5). SPME tekniği ekstraksiyon ve desorbisyon koşullarının iyileştirilmesi, analitik otomasyon sistemlerinin gelişmesi, ve çok çeşitli örnek matrikslerine yüksek verimli ekstraksiyon ile optimize bir örnek hazırlama basamağı sunması açısından gelecekte de bir çok alanda gelişme gösterecektir. ġekil 5. SPME-LC-MS sisteminin sistematik diyagramı [9] 2.2.3. Stirbar Sorptif Ekstraksiyonu(SBSE) (KarıĢtırma Çubuğu Sorptif Ekstraksiyonu) Bu solventsiz ekstraksiyon tekniği SPME ile aynı prensibe dayanmaktadır, fakat polimer kaplı fiber yerine; bir karıştırma çubuğu üzerine kaplanmış yüksek miktarda
19 ekstraksiyon fazı bulunmaktadır (Şekil 6). En yaygın kullanılan sorptif ekstraksiyon fazı polidimetilsiloksandır (PDMS). Sulu fazdan analitin ekstraksiyonu, silikon faz ve sulu faz arasındaki maddenin partisyon özelliğine dayanan bir etkileşim sayesinde gerçekleşir ve bir katsayı ile kontrol edilir (KPDMS/w). Son çalışmalar oktanol ile su arasındaki partisyon katsayısının(kow) kolerasyonunu içermektedir. KPDMS/w ve Kow değerleri arasındaki benzerlik kimyagerlerin ekstraksiyon verimliliğini tahmin edebilmelerini sağlamaktadır. SBSE yanlızca log Kow değeri 2 civarında olan hidrofobik bileşikler için kullanılır. Bununla birlikte SPME de ektraksiyon ortamının alanı çok sınırlıdır(örneğin; fibere kaplı PDMS miktarı). SPME nin aksine desorbisyon süreci daha yavaş ilerler çünkü ekstraksiyon fazı daha geniştir, bu yüzden desorbisyon basamağının soguk tuzaklama ve yeniden yoğunlaştırma işlemlerine ihtiyacı vardır. Buna bir seçenek olarak analistler sıvı desorbisyonunu kullanabilirler. ġekil 6. Stirbar sorptif ekstraksiyonunun mekanizması [10] 2.2.3.1. SBSE Metodunun Prensipleri Farmasötik maddelerin analizinde örnek hazırlama basamağında kullanılan SBSE tekniği ile hedef farmasötiğin sulu matriksten ekstraksiyonu ve zenginleştirilmesi gerekir. Ekstraksiyon prensibi maddenin kaplı stirbar ve örnek matriksi arasındaki dağılımına bağlıdır. Kaplı stirbarın karakteri örnekte aranan farmasötik maddenin özelliklerine göre ayarlanır. Emici kaplamalar genellikle homojen bir polimer olan poli (dimetilsiloksan) (PDMS) ve poliakrilat kaplamalardır [11]. Sulu çözelti içindeki farmasötik maddeler bu işlem boyunca stirbar kaplamasına selektif bir sekilde tutunur ve daha sonra uygun bir organik solventle yıkanarak ayrılırlar.
20 SBSE yöntemi SPME ile prensip açısından büyük benzerlikler gösterir. SPME ve SBSE arasındaki esas farklılık SBSE de kullanılan ekstraksiyon fazının hacminin SPME ye göre 50-250 kat daha fazla olması, daha yüksek saflıkta gerikazanım ve daha yüksek örnek kapasitesine sahip olmasıdır. Bu nedenle, SBSE yüksek zenginleştirme faktörü, iyi tekrarlanabilirlik, yüksek absorpisyon kapasitesi ve yüksek verim şağlaması açısından iyi bir yöntemdir. Çevre, gıda ve biyolojik örneklerden örnek hazırlama basamağında başarıyla uygulanan bir yöntem olmuştur. Ancak SBSE yönteminin daha da gelişmesini sekteye uğratan çeşitli sorunlar da mevcuttur. Bunlar; 1- Ticari kaplamaları çok sınırlı, pahalı ve zayıf selektivite göstermektedir. 2- Ekstraksiyon modlarının yetersizliği, polar bileşiklerin analizi için uygun cihaz özelliklerindeki aksaklıklar veya farklı özelliklere sahip bileşiklerin eşzamanlı analizinin zorluklarının olması söz konusudur. 3- Otomasyondaki veya örnekleme alanına uygulanma güçlüklerinin bulunmasıdır. Bu zorluklar yeni gelişmelerle aşılmaya çalışılmaktadır. Yeni eğilimler genellikle kaplanan maddenin yapısal olarak dizaynına getirilen eklemelerle spesifiteyi artırmaya yöneliktir. 2.2.3.2. SBSE Metodunun BaĢlıca Kullanım Alanları 1999 yılında tanıtılmasından beri SBSE çevre kirliliği kontrol ve izlemi, gıda güvenliği ilaç ve klinik analiz aşamalarında yani genellikle gıda farmasötik ve biyomedikal alanlarda kullanılmıştır. SBSE tekniği ile yapılan ekstraksiyonların çoğu ticari olarak mevcudiyet gösteren PDMS kaplı stirbar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Teknik genellikle nonpolar veya zayıf polar farmasötiklerin veya maddelerin analizinde kullanılmıştır. PAH(poliaromatik hidrokarbonlar), poliklorlu bifeniller, polibromine difenil eterler, organik klorlu pestisitler, triazin herbisitler, koruyucular, tatlandırıcı maddeler, koku maddeleri, UV emici maddeler, uçucu organik bileşikler, ve çok çeşitli ilaçlar ile örnek hazırlama aşamasında girişim yapan kirliliklerin uzaklaştırılıp yapılan hedeflenmiş örnek hazırlama aşamasında SBSE oldukça verimli şekilde kullanılmaktadır [12]. Ayrıca Tienpont ve arkadaşları SBSE metodunu spesifik olarak, idrar ve kan örneklerinden barbitürat ve benzodiazepam gibiilaçların ve metabolirlerinin
21 analizinde başarıyla uygulamışlardır [13]. Bu amaçla, ince bir tabaka halinde (24uL) PDMS kaplı cam bir karıştırma çubuğu kullanmışlardır. 2.2.3.3. SBSE Metodunda Yeni GeliĢmeler Geçmişten günümüze baktığımızda SBSE ekstraksiyon tekniğinin farmasötik maddeler üzerinde çalışılma ve yayımlanan makaleler boyutunda oldukça ivmeli bir gelişim gösterdiğini görmekteyiz (Şekil 7). ġekil 7. SBSE metodu hakkında yıllara göre yayımlanan çalışma sayısı ve çalışılan maddeler bakımından dağılımı Geçen birkaç yıl içinde SBSE, çok düşük miktarlarda ve çok çeşitli analitin biyolojik ve çevresel örneklerden ekstraksiyonu için çok başarılı olmuş ve hızlı bir şekilde gelişme göstermiştir. Yeni kaplamaların keşfi ile yüksek ekstraksiyon verimi ve farklı polariteye sahip çeşitli hedef analitlerin selektivitesi SBSE otomasyonunun sağlanması ve otomatik cihazların geliştirilmesi, taşınabilir cihazların örnekleme alanlarında kullanımlarının acil ve önemli şekilde daha da geliştirilmesi söz konusudur [14]. ġekil 8. Stirbar çubuğunun kaplanmamış (a) ve uygulama sonrası kaplanmış (b) halinin elektron mikroskobundaki görüntüsü [15]
22 2.2.3.3.1. Moleküler Baskılama Tekniği ile Kaplama Moleküler baskılanmış polimerler ( MIPs ) seçilen hedef molekülleri diğer maddelerden ayıran özel bağlanma bölgesi olan sentetik bir materyal tipidir. Kataliz, sensörler, ilaç taşıyıcılar, suni antikorlar ve örnek hazırlama tekniklerinde SPEstirbar, SPME ve SBSE metotlarında yer alırlar. MIP sentezi 3 temel basamaktan oluşur; 1- Kovalent veya nonkovalent bağlarla kalıp molekül ve fonksiyonel monomerin bütünleşmesi sağlanır. 2- Meydana gelen kompleksler çapraz bağlayıcı ajanlar ile polimer maddeleri oluşturma için reaksiyona girerler. 3- Şablon molekül veya iyon ayrılır. SBSE için MIP leri kullanan ilk araştırmacılar Zhu ve ekibidir. L-glutamat baskılanmış polimer sistemiyle kaplanmış stirbarları pestisit ekstraksiyonu, aminoasit enantiyomerlerinin ayrılması, çevresel ve biyolojik materyellerden örnek hazırlama gibi alanlarda kullanmışlardır. MIP nylon-6 membranlarının elektron mikroskobundaki görüntüleri verilmiştir (Şekil 9). ġekil 9. Farklı maddelerle baskılanmış SBSE sistemleri [16] MIP film ile kaplı stirbar hazırlanışı oldukça hızlı ve basit bir şekilde gerçekleştirilir. MIP kaplı tabaka 60 dk.dan düşük bir sürede hazırlanmış, yüksek afinite ve güçlü absorpisyon gözlenmiştir. Geleneksel MIP ve SBSE kombinasyonu sadece yüksek selektivite göstermekle kalmaz aynı zamanda hızlı absorpisyon dinamikleri de gösterir.
23 2.2.4. Membran Ekstraksiyonu Membran ekstraksiyonları birçok ektraksiyon problemini ortadan kaldıran kesin avantajlar sunan bir ekstraksiyon ailesidir. Bu teknikler en az miktarda organik solvent kullanılarak yapılan yüksek temizlik verimliliği vadeden örnek hazırlama yöntemleridir. Ayrıca çok yüksek oranlarda zenginleştirme sağlanabilmekte ve bu sistemler diğer analitik tekniklerle otomasyon içinde kullanılabilmektedir. Organik veya inorganik özellikteki farmasötik maddeler, çok geniş aralıktaki bileşikler kolay bir şekilde girişim yapan maddelerden ayrılmaktadırlar. Ekstraksiyon koşulları; farmasötiklerin serbest olarak bulunduğu veya proteinlere yada çevresel kirlilik oluşturan atık sulardaki diğer bileşiklere bağlı olarak bulunan farmasötiklere göre ayarlanmaktadır. Tablo 3. Çevresel örneklerden membran ekstraksiyonu ile yapılan örnek hazırlama basamağının uygulandığı farmasötik maddeleri ve deney koşulları [1] Farmasötikler Örnek Membran Membran sıvısı Sonuç analizi Benzimidazol Su, süt, Poröz Verici LCantihelmintikleri(albendazol, fenbendazol, mebendazol, idrar PTFE, tip FG faz;naoh/nahco3 ph 9,6 tamponu 1,2 ESI- MS oksibendazol, tiabendazol) 1,5 ml millipor mm Alıcı faz; 0,6 mm Sülfonamidler (sülfadiazin, sülfametazin, sülfametoksazol) Su 10 ml, süt, idrar ph 6,0 Karaciğer yada böbrek dokusu 5,0 g. Poröz PTFE, tip FG millipor Verici faz; ph6,0 tamponu Alıcı faz; ph10 tamponu HPLC- MS 2.2.4.1. Membran Ekstraksiyonunun Prensipleri Membran ekstraksiyonu tekniğinde membran, 2 çözelti arasında belirli bir kimyasal yapıya spesifik bir filtre olarak davranmaktadır. Membran ekstraksiyonunun en önemli tekniği desteklenmiş sıvı membran ekstraksiyonudur(slm; supported liquid membrane). SLM 3 fazlı su/organik/su sistemine dayanmaktadır. Burada ince bir film şeklindeki organik faz 2 sulu fazın arasına yerleştirilmiştir. Farklı transport
24 mekenizmaları kullanılabilir fakat tüm analitler organik memebran sıvısından geçmek zorundadırlar. Maddelerin dağılım katsayıları ile organik maddeye geçiş miktarları belirlenmektedir. Ayrıca SLM çeşitli analitik cihazlarla kombine kullanılabilmektedir. İkinci membran ekstraksiyon tekniği ise mikroporöz membran olarak adlandırılır (MMLLE) ve su/organik 2 fazlı sisteme dayanır. Bu teknik klasik LLE ile karşılaştırıldığında yüksek seçicilik, daha yüksek hacim oranları ve zenginleştirme faktörü, daha temiz ekstrakt, daha az organik solvent kullanımı gibi avantajlar sağlar. SLM ekstraksiyon tekniğinin prensibi esas olarak aminler gibi basit farmasötiklerin ayrılmasında kullanılan şematik gösterim olarak aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. ġekil 10. Ekstraksiyon işleminin desteklenmiş sıvı membran (SLM) tekniği ile uygulanışı [17] MMLLE de ise, akseptör faz, hidrofobik membran porlarını dolduran su ile karışmayan organik bir fazdır[19]. Bu teknik çoğunlukla yüksüz hidrofobik farmasötik maddelerin ekstraksiyonunda kullanılmaktadır. Bu maddeler sulu fazdan organik faza daha kolay şekilde çekilebilmektedirler. MMLLE tekniğinde de SLM de kullanılan membranlar kullanılabilmektedir. ġekil 11. Ekstraksiyon işleminin MMLLE tekniği ile uygulanışı [18]
25 Tablo 4. İki membran yönteminin özelliklerinin karşılaştırılması [19] Analitler SLM İyonik bileşikler(asitler ve zayıf bazlar) MMLLE Yüksüz hidrofobik bileşikler Ekstrakt tipi Sulu Organik Tespit teknikleri ile Tutunma derecesine bağlıdır Partisyon katsayısına bağlıdır kombinasyon Otomasyon imkanı İyon kromotografisi, ters faz sıvı Gaz kromotografisi,normal faz kromotografisi sını kromotografisi Otomasyon mümkündür Otomasyon mümkündür 2.2.4.2. Membran Ekstraksiyonunun BaĢlıca Kullanım Alanları Membran ekstraksiyonu çok çeşitli analitlere ve matrikslere uygulanabilmektedir. Bir numaralı uygulama alanları çevresel, endüstiyel ve gıda hammaddelerinden yapılan biyoanalizler oluşturur. Bunlardan önemli bölümü de çevresel matrikslerden farmasötik maddelerin çekilerek örnek hazırlama basamağının gerçekleştirilmesi de söz konusudur. Biyoanalizler çoğunlukla çevresel veya biyolojik sıvılarda ilaçların saptanması yönündedir. Bu uygulamalarda seçicilik oldukça önemlidir ve otomasyon mümkün kılınmaktadır. Membran ekstraksiyon tekniği ile zenginleştirilen farmasötikler diğer bazı tekniklerle karşılaştırıldığında verimin 30-70 kat daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir. Özellikle SLM metodu ile atık sulardaki, fenoksi asitler, triazin herbisitler, anilin türevi farmasötikler, metal iyonları ve sürfaktanlar ekstrakte edilip zenginleştirme işlemi yapılıp örnek hazırlama basamağına uygulanabilir. MMLLE tekniği ise toluen, klorobenzen ve naftelen grubu gibi noniyonik grup bulunduran farmasötik maddelerin ayrımında kullanılır. 2.2.4.3. Membran Ekstraksiyonunda Yeni GeliĢmeler Membran ekstraksiyonlarının gelişim gösteren en görünün avantajları kullanılan solvent miktarının diğer tekniklerle karşılaştırıldığında aşırı miktarda azaltılması olarak karşımıza çıkmaktadır. Örneğin Amerikan Çevre Koruma Ajansı(EPA) Metod 3535 olarak adlandırdığı SLM tekniği ile 1 L. Sudaki analitin ekstraksiyon aşamasında 85 ml. organik solvent kullanımının yeterli olduğunu tespit etmiştir. SLM metodunda membranda 30 μl solvent kullanılır ve örneğe göre haftada 1 kez veya daha sık değiştirilerek ekstraksiyon sağlanabilmektedir. MMLLE metodunda ise her örnek için yaklaşık 1ml. solvent kullanılmaktadır. Membran ekstraksiyonları eşsiz bir temizlikte
26 örnek hazırlama, yüksek zenginleştirme faktörü ve tüm otomasyon sistemleriyle birleştirilebilir olması gibi imkanlar sağlar ve gelecekteki hem tekniksel hemde ticari araştırmalar tekniğin bu yönlerinin mükemmelleştirilmesi için yapılmaktadır. 2.2.5. Sıvı Faz Mikroekstraksiyonu Sıvı-sıvı ekstraksiyon (LLE) örnek hazırlamada yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Son yıllarda sıvı-sıvı ekstraksiyonda kullanılan organik çözücü miktarını minimize eden, sıvı faz mikroekstraksiyon (LPME) yöntemleri geliştirilmiştir. Matriks örneklerdeki (biyolojik, çevresel, gıda vb.) madde veya maddelerin kalitatif veya kantitatif tayinlerinde yüksek hassasiyetli analitik cihazlar geliştirilmesine rağmen, analitik cihaz çoğunlukla matriks ortamında tayinde başarısız olmaktadır. Bundan dolayı matriks ortamdan maddenin alınması (saflaştırma) ve deriştirilmesi (zenginleştirme) için genellikle ön işlem uygulanması gerekmektedir. Bu açıdan, LPME basit, hızlı, ucuz ve yüksek oranda seçici ve yüksek zenginleştirme faktörüne sahip bir yöntemdir. 2.2.5.1. Sıvı Faz Mikroekstraksiyonunun Prensipleri LPME sisteminde fiber, alıcı fazın örnek çözelti ile doğrudan temasını kestiğinden dolayı, şiddetli karıştırma hızlarında ekstraksiyon çözücüsü kaybını en az düzeylere indirir. Polipropilen fiber çok ucuz bir maliyete sahiptir. Bu nedenle, her analizde bir kez kullanılır. Fiberin her analizde bir kez kullanılması, önceki analizlerden kirlilik gelmesini engeller. Polipropilen hollow fiber küçük gözeneklere sahip olduğu için, matriks ortamdaki büyük molekül ağırlıklı kirliliklerin alıcı faza girmesini engelleyerek iyi bir ön temizleme işlemi yapar. 2.2.5.2. Sıvı Faz Mikroekstraksiyonunun BaĢlıca Kullanım Alanları Oyuk fiber mikroekstraksiyon yöntemi çevresel, biyolojik, gıda örneklerinde ve asidik ve bazik ilaç analizlerinde zenginleştirmenin yanı sıra ön temizleme işlemini de aynı anda yaparak kullanılabilir. LPME üzerine en geniş yayınlar temel ayrımlar üzerinde yoğunlaşmaktadır fakat çevresel örneklerden, kan, idrar örneklerinden ilaç analizi örnek hazırlama ve monitarizasyon basamaklarında uygulamaları da mevcuttur. Çeşitli grup ilaçların LPME tekniği ile ekstraksiyonu sağlanmaktadır. Özellikle antiinflamatuvar
27 ajanların, analjezikler, psikoanaleptikler, antihistaminler bağzı istismar edilen farmasötik maddelerin bu teknikle ekstraksiyon, zenginleştirme ve örnek hazırlama alanındaki yeri daha geniş olarak çalışılmıştır. Bu maddeler genellikle hidrofobik özellik gösterirler ve üç fazlı LPME tekniği ile %40-90 oranlarında geri kazanılırlar. Quintana ve ekibi hollow-fiber LPME tekniği ile asidik farmasötiklerin(örn;ibuprofen, diklofenak, benzafibret, klofibrik asit) sulu örneklerinin ekstraksiyonunu ve zenginleştirilmesini sağlamışlardır. Bu asidik ilaçların geri kazanım oranları işlem görmüş atıksularda %93 ± 35 iken, işlenmemiş atıksularda 123 ± 45% oranlarında bulunmuştur [20]. 2.2.5.3. Sıvı Faz Mikroekstraksiyonunda Yeni GeliĢmeler Örnek hazırlamada yeni bir alternatif oluşturmak için hızlı, ucuz, uygulaması basit, toksik ve pahalı organik çözücü kullanımını minimize eden, sıvı faz mikroekstraksiyon (LPME) yöntemleri geliştirilmiştir. Sıvı faz mikroekstraksiyon yöntemlerinin ilk uygulaması asılı damla mikroekstraksiyon (single drop microextraction, SDME) şeklinde olmuştur. SDME yöntemi ekstraksiyon fazının tek bir damla olduğu LPME yöntemidir. Sıvı veya gaz fazdaki maddeler mikro enjektör ucunda asılı duran ve su ile karışmayan damla (1 10 μl) formundaki ekstraksiyon fazına alınır. Ekstraksiyon sonrası organik damla mikro enjektöre geri çekilerek GC, HPLC ve CE gibi analitik cihazlar ile analiz edilir [21]. SDME; 1- Doğrudan Daldırma-Asılı Damla Mikroekstraksiyon (Direct Immersion-Single Drop Microextraction, DI SDME) 2- Tepede-Asılı Damla Mikroekstraksiyon (Headspace Single Drop Microextraction HS SDME) 3- Üçlü Faz-Asılı Damla Mikroekstraksiyon (Three Phase-Single Drop Microextraction, Three Phase SDME) 4- Sürekli-Akış Mikroekstraksiyon (Continuous Flow Microextraction, CFME) olarak isimlendirilen yöntemler şeklinde uygulanmaktadır.
28 2.2.6. Süperkritik AkıĢkan Ekstraksiyonu (SFE) İlk kez 1879 da Royal Society seminerlerinde (Londra) Hannay ve Hogart tarafından, bir katının yüksek basınçtaki gazda çözündüğü, basınç düşürülünce katının çöktüğü açıklanmıştır. Bir kaç yıl sonra Eduard Buchner (1907 de biyokimya alanında Nobel ödülü almıştır), uzun süren bir çalışmanın ardından naftalinin SC- içindeki çözünürlüğünü ölçmüştür. Doğal ürünlerin organik çözücülerle muamele edilmesi gerek çevresel gerekse sağlık açısından son yıllarda pek istenmeyen bir olgu haline gelmiştir. Bu noktada daha az çözücü harcayan, ekstraksiyon süresi daha kısa olan ve normal koşullarda yüksek sıcaklıkta çözünen bileşikleri ayrıştırma özelliği ile süperkritik sıvı ekstraksiyonu giderek büyük ilgi çekmektedir. Süperkritik akışkan ekstraksiyonu (SFE), aslında bir çözücü ekstraksiyonudur. Organik çözücüler yerine, süperkritik sıvı özelliği gösteren maddeler çözücü olarak kullanılmaktadır. ġekil 12. Faz diyagramı [22] Süperkritik akışkanların özellikleri ; 1- Süperkritik akışkanların sıvı gaz arası özellikleri vardır. Sıvıya benzer yoğunlıkları olup sıvı bir çözücü gibi davranırlar.düşük viskozite ve kütle transfer özelliği veren iyi difüzyon özelliklerine sahiptirler. 2- Yüksek bağıl yoğunlukları iyi bir çözgen özelliği kazandırır. 3- Buharlaşma gizli ısısı sıfır, bu nedenle ısı kapasitesi çok yüksektir. 4- Sistemin enerji gereksinimi azdır. Yüzey gerilim katsayıları ve viskoziteleri düşüktür ve bu nedenle pompalama masrafları düşüktür.
29 ġekil 13. Süperkritik sıvı ekstraksiyonu yönteminin şematik gösterimi ġekil 14. Karbondioksitin süperkritik forma dönüşümü Bir numune matriksi ile ekstraksiyon akışkanı arasındaki kütle aktarım hızı, ekstrakte edilecek türün akışkandaki difüzyon katsayısına ve akışkanın viskozitesine bağlıdır(difüzyon hızı ne kadar büyük ve viskozite ne kadar küçükse, kütle aktarımı o kadar hızlı olur).bir süperkritik akışkanın çözücü gücü basıncı ve sıcaklığı değiştirerek geliştirilebilir. Diğer yandan sıvıların çözücülük güçleri sıcaklıkla artarken basınçtan fazla etkilenmez. Bu sebeple, süperkritik akışkanlarla ekstraksiyon yapılırken, basınç ve sıcaklık bir analit için en uygun değerlere ayarlanabilir. Bu nedenle hızlı bir tekniktir. Süperkritik akışkanlarla ekstraksiyon genelde 10-60 dakikada tamamlanırken, sıvılarla gerçekleştirilen bir ekstraksiyon saatler, hatta günler alabilir. 2.2.6.1. Süperkritik AkıĢkan Ekstraksiyonu (SFE) nun Prensipleri Pek çok süperkritik akışkan, oda koşullarında gazdır. Çözeltilerdeki analitlerin geri kazanılması sıvı çözeltilere göre basittir. Çünkü sıvıları ısıtarak buharlaştırmak gerekir ve bu da bir yandan sıcaklığa duyarlı maddelerin bozunmasına, bir yandan da uçucu
30 analitlerin kaybına yol açar. Halbuki süperkritik bir akışkanı, sadece basıncı kaldırarak analitten ayırmak mümkündür. Alternatif olarak, süperkritik akışkandaki analit çözeltisini, içine analiti iyi çözen bir sıvı çözücü konmuş küçük bir kaptan kabarcıklar halinde geçirmek ve böylece analitin derişik bir çözeltisini hazırlamak mümkündür. Difüzyon katsayısı, süperkritik akışkanlara yönelik süreçlerin modellenmesinde vazgeçilmez bir parametredir. Çeşitli organik bileşiklerin süperkritik içindeki difüzyon katsayıları deneysel olarak ölçülerek buna bağlı olarak difüzyon katsayısı korelasyonu önerilebilir. ġekil 15. Süperkritik akışkan ekstraksiyonu yönteminin şematik gösterimi SFE nin sıvıdan bileşen ayrılmasında kullanılması katıda olduğu gibi temiz bir ürünle sonuçlanır ve herhangi bir çözücü kalıntısı oluşmaz. Sıvıdan süperkritik ekstraksiyonda inert bir dolgu maddesi içeren dolgulu kolonlar kullanılır. Bu sistemde sıvı karışımı kolona ek bir pompa yardımıyla yüklenir. kolona alt kısımdan verilir ve tepeye doğru ilerler. Sıvı karışım ise kolona üst veya orta kısımdan beslenir. Doğal ürünlerden lipitler, esansiyel yağlar, aromalar gibi biyolojik aktif maddelerin ekstraksiyonu; hayvansal sıvılardan lipit ve proteinlerin ekstraksiyonu bu alanda yapılan uygulamalardan bazılarıdır.
31 ġekil 16. SFE sistemi [23] apolar bir madde olduğu için apolar farmasötik meddeleri çözer. Genellikle farmasötik bileşiğin C-C çift bağ sayısı arttıkça çözünürlük artar. Düşük molekül ağırlıklı hidrokarbonlar, lipofilik organik bileşikler (eterler, esterler) kolaylıkla ekstrakte edilir. Yağ asitleri ve trigiseritler düşük çözünürlüğe sahiptir. Meyve asitleri ve birçok inorganik tuzlar süperkritik de çözünmezler. Polar ve yüklü maddeler örneğin şekerler ve aminoasitler süperkritik de çözünmezler. Amidler ve üre de düşük çözünürlük gösterir. Tablo 5. Süperkritik de çözünebilen madde grupları Kolay çözünenler Az çözünenler Hiç çözünmeyenler Düşük molekül ağırlığa sahip Yüksek molekül ağırlıktaki Şekerler, proteinler organikler organikler Tiyoller, tiyazoller, pirazoller Asetik asit, benzaldehit, hekzanol, gliserol asetatlar Molekül ağırlığı 250 ye kadar olan bileşikler Su, oleik asit, gliserol, dekanol Doymuş yağlar Molekül ağırlığı 400 e kadar olan bileşikler Klorofil, karatenoidler, sitrik ve malik asitler Aminoasitler, nitratlar, pestisitler, insektisitler Molekül ağırlığı 400 ün üzerinde olan bileşikler Süperkritik içinde bir maddenin çözünürlüğü az miktarda kosolvent veya yardımcı çözücüler ilavesiyle artırılabilir. Kosolvent olarak aseton, metanol ve etanol gibi bileşikler kullanılmaktadır. Çözünürlük artışının nedeni çözünen ile yardımcı çözücü arasındaki interaksiyonlar sonucu oluşan H bağlarıdır.
32 2.2.6.2. Süperkritik AkıĢkan Ekstraksiyonunun BaĢlıca Kullanım Alanları SFE, dünyada gıda bilimi ve teknolojisi açısından birçok uygulama alanı bulmuştur. Atık sulardaki klorlu bifenillerin, dioksan, poliaromatik hidrokarbonlar (PAH) ve diğer toksik maddelerin uzaklaştırılmasında kullanılmaktadırlar. Ham sebze yağları gıda endüstrisinde yaygın olarak kullanılır. İstenmeyen bileşiklerin uzaklaştırılması için tüketilmeden önce yağların rafine edilmesi gerekir. Saflaştırma süreci sırasında, yağdaki faydalı bileşikler de kaybolabilir. Buğday tanesi yağında, preslenerek elde edilen yeşil kahve yağında, ham palmiye yağında, ilgilenilen bileşiklerle zenginleştirilmiş ekstraktlar elde etmek için alternatif bir saflaştırma metodu olarak SFE önerilmiştir. Yeşil çaydan seçici olarak kafein ekstraksiyonunda yardımcı solvent olarak su ile süperkritik kullanılmış ve matriksten antioksidanların ekstraksiyonu önlenmiştir. Uçucu yağlar, yağ asitleri veya karotenoitler gibi biyoaktif bileşikler meyve ve sebzelerden süperkritik kullanarak ekstrakte edilmiştir. Daidzein ve genistein gibi izoflavonlar 350-500 bar arasındaki yüksek basınçlarda sulu metanol ve süperkritik kullanılarak ekstrakte edilmişlerdir. SFE nin en ilginç uygulamalarından biri, genetik olarak değiştirilmiş farklı mısır ve soya türlerinde amino asit ilişkisini belirlemede kullanılmasıdır. polaritesi nispeten düşük olduğu için birçok farmasötik grup ve ilaç örneklerinde kullanılması aşamasında sorun oluşturabilmektedir. Fakat tekniğin başarıyla uygulandığı farmasötik gruplar aşağıdaki Tablo 6 da gösterilmiştir.
33 Tablo 6. Çevresel örneklerden süperkritik sıvı ekstraksiyonu kullanılarak ekstraksiyonu yapılan farmasötik örnekleri Farmasötikler Örnek Çöz ücü Sülfonamidler Tavuk (sülfadimetoksin, KC sülfametazin, 1,0 g. sülfametoksazol) Benzodiazepin(diazepam, oksazepam, nordiazepam, prazepam) Anabolik ajanlar(fluoksimestron, norestosteron, metilestosteron) NSAİİ ler(tolmetin, ketoprofen, fenbufen, indometazin,naproksen) Su Şartlar Temizleme Sonuç analiz 680 bar, Elüsyon(yıkama);4 ml HPLC- 40 C, HPLC mobil faz (0,05 DAD 5 dk. M fosfat tamponu ph Akış hızı 7,0) 0,1% 2,5- tetrabütilamonyum 2,7L/dk. hidroksit:metanol=68:3 45 C, 329 MPa Ref 24 2 - HPLC 25 Özellikle çevresel alanda kullanım çerçevesinde sisemin otomasyonunun kolay olması büyük bir avantaj oluşturmaktadır. SPE su numunelerinde yapılan çalışmalarda daha kapsamlı bir örnek hazırlama basamağı gerektirebilir. SFE farmasötik maddelerin katı veya sıvı matrikslerden ekstraksiyonu için örnek hazırlanmasında kullanımı son yıllarda gittikçe yaygınlaşmaktadır. 2.2.6.3. Süperkritik AkıĢkan Ekstraksiyonunda Yeni GeliĢmeler Süperkritik akışkan (scf) süreçleri, bilimsel ve teknolojik açıdan hızla gelişen bir alan haline gelmiştir. Son yıllarda, Almanya başta olmak üzere USA ve Japonya da bu konuyla ilgili çalışmalar yoğun bir şekilde yürütülmektedir. Çözünürlüğünün ayarlanabilir olmasından dolayı, süperkritik akışkanlar (başta süperkritik karbon dioksitsc olmak üzere) ayırma ve saflaştırma, kromatografi, polimerizasyon ve fraksiyonlama, tanecik tasarımı, biyoteknoloji, yağların modifikasyonu, suların arıtılması gibi çok değişik uygulamalarda geniş bir kullanım alanına sahiptir. Eczacılık alanında scf yöntemiyle ilaçlara yönelik yapılan çalışmalar büyük umutlar vaad etmekte, yapılan projeler, araştırmalar ve uygulamalar önümüzdeki 10 yıl içerisinde toplumların ihtiyaçlarının daha da fazla karşılanabilir duruma geleceğini göstermektedir. Son yıllarda, süperkritik akışkan ekstraksiyonu, süperkritik ortamda
34 çeşitli reaksiyonlar ve homojen veya heterojen tanecik tasarımı gibi uygulamalar endüstride ilgi odağı haline gelmiştir. Bu gibi uygulamalar için uygun süreçlerin tasarımı çeşitli maddelerin (yüksek kaynama noktalı maddeler, ürünler ve katalizörler) süperkritik ortamdaki çözünürlüklerinin belirlenmesini gerektirir. Faz dengesi verilerinin alınması ve faz davranışının modellenmesi, optimum süreç koşullarının belirlenerek deneysel ve endüstriyel tasarımlar için bir ön çalışma yapılmasıyla sistem optimize edilmekte ve maksimum verim alınma yolunda geliştirilmektedir. 2.2.7. SıkıĢtırılmıĢ Çözücü Ekstraksiyonu (PSE) Ekstraksiyon için oldukça yeni bir tekniktir. Hızlandırılmış solvent ekstraksiyonu olarak da adlandırılır. Örneği sızdırmaz bir yüksek basınç ortamında tutarak, geleneksel solventler için daha yüksek sıcaklıklar kullanılmasına izin veren bir ekipman kullanır. Yükseltilmiş basınç, solventin daha yüksek sıcaklıklarda sıvı halde bulunmasını sağlar. PSE de verim ve seçiciliği etkileyen kritik faktörlerden biri ekstraksiyon sırasında uygulanan sıcaklıktır. Yüksek sıcaklıkların kullanımı, van der Waals kuvvetleri, hidrojen bağı ve dipol çekim gibi analit-örnek matriksi etkileşimlerinin bozulmasına yardımcı olarak ekstraksiyon verimini artırır. Bu durumda geribırakma (desorpsiyon) süreci için gerekli aktivasyon enerjisi azalır. Yükseltilmiş sıcaklık solventin, çözünenin ve matriksin yüzey gerilimini oluşturur. Bu yüzden örneğin ıslanması artar. Solvent yüzey geriliminde azalma, solvent kavitesinin daha kolay oluşmasını sağlar. Böylece analitlerin solventte daha hızlı çözünmesine izin verilir [26]. Artan sıcaklık sıvı solventin viskozitesini azaltır ve matriks partiküllerinin içine girmesini kolaylaştırır. Sıcaklık, güclü analit ve matriks etkileşimlerinin bozulmasına yardım eder ve denge zamanını kısaltan difüzyon hızlarını artırır. Bu durum özellikle difüzyon kontrollu örneklerde daha hızlı ekstraksiyonlara izin verir. PSE nin temel özelliği, gerekli solvent miktarını önemli ölçüde azaltırken, ekstraksiyon sürecinin hızını artıran yüksek difüzyon sıvıları kullanmasıdır [27].
35 ġekil 17. PSE Sistemi Isıtma sonrasında ekstraksiyon hücresi, solventin normal kaynama sıcaklığının altına kadar soğutulur. Daha sonra hücreye yüksek basınç uygulanır. Bu basınç, solvent ve ekstrakte edilen materyali bir filtreden geçerek dışarıya çıkmaya zorlar. Ekstraksiyon kinetiğini artıran 200 C ye kadar yükseltilmiş sıcaklıkların kullanılmasından dolayı, solventin kaynamasını önlemek için 20 MPa kadar basınç gereklidir. Gerekli solvent miktarı, geleneksel sıvı ekstraksiyon yöntemlerinda kullanılan miktardan daha azdır. PSE nin sınırlaması, ısısal kararlı olmayan örnekler için uygun olmamasıdır [28]. 2.2.7.1. SıkıĢtırılmıĢ Çözücü Ekstraksiyonu (PSE) Prensipleri PSE statik modda, dinamik modda veya bunların kombinasyonuyla gercekleştirilebilir. Dinamik modda, solvent örneğin içinden akar. Statik basınçlı sıvı ekstraksiyonu manuel olarak kapalı bir kapta gerçekleştirilebilir. Fakat ekstraksiyon daha çok otomatik bir enstrümanla gerçekleştirilir. Tipik bir PLE sistemi, bir fırın, ekstraksiyon hücresi, pompa ve basınç altında tutan sistem, birkaç vana ve toplama kaplarından oluşur. Statik ekstraksiyon modu şu basamakları içerir: 1. Ekstraksiyon hücresine örneğin yüklenmesi 2. Hücrenin organik solvent ile doldurulması 3. Hücrenin sıcaklık ve basıncının ayarlanması 4. Örneğin belirli bir zaman ekstrakte edilmesi 5. Basıncın serbest bırakılarak solventin toplama kabına transfer edilmesi. 6.Tüm ekstraktın toplama kaplarına ulaşmasını sağlamak icin hücrenin temiz solventle yıkanması 7. Uygun bir gaz kullanarak örnekten solvent atıklarının temizlenmesi
36 Ekstraksiyon verimi, örnek matriksinin doğasına, ekstrakte edilen analite ve analitin matriks içindeki yerine bağlıdır [29]. Ekstraksiyon sürecindeki kritik bir basamak, analitin örnek matriksi içindeki pozisyonudur. Beş farklı pozisyon olduğu varsayılmıştır (Şekil 18). 1. Matriks yüzeyine adsorbe olması 2. Bir solvent gözeneğinde çözünmesi ve/veya yüzeye adsorbe olması 3. Matriksin mikro/nano gözeneğinde çözünmesi/adsorplanması 4. Matrikse kimyasal olarak bağlanması 5. Ekstraksiyon solventinde çözünmesi. ġekil 18. Örnek matriksinde analitin pozisyonu [30] Ekstraksiyon sürecinde hız sınırlayıcı basamak ekstrakte edilen matriksin doğasına bağlıdır. Doğal tortu (sediment), toprak ve çamur örneklerinin çalışıldığı çevresel uygulamalarda, solut matriks etkileşimlerinin üstesinden gelmek zor olduğundan, yüzeyden bırakma basamağı genellikle hız-sınırlayıcı basamaktır. 2.2.7.2. SıkıĢtırılmıĢ Çözücü Ekstraksiyonu nun BaĢlıca Kullanım Alanları PLE nin çok sayıda matriks üzerine uygulamaları mevcuttur. Çevre ve toprak örnekleri üzerine birçok uygulama gözden geçirilmiştir. Stoob ve ekibi tarımsal topraklarda sülfonamid antibiyotiklerinin saptanması konusunda PLE tekniğini kullanmış ve geliştirmişlerdir. Antibiyotik grubu analitlerin yağlı matrikslerden izolasyonunda PSE çok etkili bir teknik olarak karşımıza çıkmaktadır. Polar ilaçların ekstraksiyonunda yüksek basınç ve yüksek sıcaklıkta su kullanılabilir. Katı örneklerden, PLE ve diğer örnek hazırlama metotlarıyla; seçilmiş bileşiklerin bozunma sıcaklıklarının ve spesifik davranışlarının hesaplanması çok önemlidir. Örneğin tetrasiklinlerin etkin bir ekstraksiyonu için, örnek matriksi, bu maddelerin katyonlarla (Ca 2+ Mg 2+ ya da Fe 3+ )
37 komleks oluşturmasını önlemek için, ph 4.7 olacak şekilde sitrat tamponu ya da EDTA solüsyonu ile asitleştirilmelidir. Tetrasiklinler ısıtıldığında, anhidro formuna dönüşebileceklerinden oda sıcaklığında ekstraksiyonu tercih edilmektedir. Aynı zamanda makrolitlerin bozunması da 100 C nin üzerinde başladığı gözlemlenmiştir [31]. ġekil 19. PSE şeması Luthria ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada soya fasulyesinde isoflavonların ekstraksiyonu için sistematik bir çalışma gerçekleştirilmiştir [32]. Zhu ve arkadaşları herbisitlerin topraktan ekstraksiyonunda, kuru topraklar için ekstraksiyon verimine basıncın az etkisi olduğunu gözlemişlerdir ve 100-150 C sıcaklıkta verimin arttığını bulmuşlardır. Bernal ve arkadaşları, sertifikalı patates, havuç, zeytinyağı ve liyofilize edilmiş balık doku örneklerindeki organoklorin pestisitleri ve poliklorlu bifenilleri tayin etmişlerdir. Örnekleri izole etmek icin basınçlı-soxhlet ekstraksiyonunu kullanmışlardır [33]. 2.2.7.3. SıkıĢtırılmıĢ Çözücü Ekstraksiyonu nda Yeni GeliĢmeler Çevre, gıda ve biyolojik analizler konusunda, PSE tekniğini açıklayıcı birçok sayıda uygulama ve yayın mevcuttur. PSE metodu, diğer ekstraksiyon teknikleriyle karşılaştırıldıklarında geniş bir aralıktaki seçicilik ve hassasiyet göstermesi açısından yararlı ve avantajlı bir yöntem olarak gelişim göstermiştir. PSE toprak matriksinde organik bileşiklerin hem basit uygulamalarında hemde otomasyonel ekstraksiyonunda köklü ve çok yönlü bir teknik haline gelmiştir. Aynı anda derivatizasyon(türetme) ve PSE tekniğinin tek basamakta gerçekleşmesi sıradışı bir teknolojidir. Metodun geleceğe
38 dair beklentilerinin çoğu, daha çok matriks ve bileşiğe sorunsuz uygulamanın yapılabilmesi noktasında kendini göstermektedir. Bu alan ilgili konularda büyümeye devam ederken, metodun tasarımı, parametrelerin geliştirilmesi ve enstrümanların daha minimalize ve birleştirilmiş olarak modellenmesi üzerine çalışmalar sürmektedir. Modern dünyada süreçlerin olabildiğince hızlanması en çok istenen özellik olarak karşımıza çıkmaktadır. Bunun yanında reaksiyon oranlarının ve verimin optimal olması sağlanmalıdır. Hızlı reaksiyon süreleri kararsız farmasötik örneklerin ışık ve hava ile maruziyetine bağlı oluşabilecek indirgenme tepkimelerinin de önüne geçebilmektedir. 2.2.8. Matriks Katı-Faz Dispersiyonu (MSPD) 1989 yılında tanıtılmasından bu yana katı faz dispersiyonu (MSPD) hakkında 250 nin üzerinde araştırma yayınlanmıştır. İlaçların pestisitlerin ve birçok bileşiğin çevre örneklerinden geniş bir aralıkta izolasyonu için kullanılan etkinliği kanıtlanmış bir tekniktir(şekil 21). MSPD katı, yarı-katı ya da yüksek oranda viskoz örneklerle yapılan ekstraksiyon ve fraksiyonlama işlemlerinde kullanılmaktadır. Ayrıca bu teknik farklı polaritedeki çeşitli kimyasallarıl ekstraksiyonuna olanak vermektedir. MSPD nin yöntemsel esnekliği ve basitliği, diğer klasik metodlardan üstünlük olarak katkı sağlamıştır. Aslında bu teknik fiziksel ve kimyasal basit kurallar üzerine tasarlanmıştır. MSPD birçok uygulama yöntemi arasında ayrıcalıklı bulunmuştur çünkü sıvı-sıvı veya katı faz ekstraksiyonu gibi klasik yöntemlerde sorun oluşturan, özellikle viskoz ve kompleks biyolojik örneklerde karşılaşılan birçok komplikasyon ekarte edilebilmektedir. İdrar, kan, plazma, serum ve çevresel ilk örnekleme matriksleri kolona direkt olarak uygulanamaz. MSPD katı veya yarı katı örneklerden oluşan bu sorunları ekarte etmektedir.
39 ġekil 20. MSPD ekstraksiyon basamakları [34] 2.2.8.1. Matriks Katı-Faz Dispersiyonunun Prensipleri MSPD işleminde örnek, bağlı faz veya katı destek maddesi (oktadesisil (ODS) türevi bir silika (C18)) gibi uygun bir madde ile uygun bir cam veya seramik havana yerleştirilir. Örnek ve katı destek maddesi birlikre ezilir ve parçalanır. Harmanlana karışım bir kolona aktarılır ve uygun çözücülerle segmentli bir elüsyon(yıkama) gerçekleştirilir(şekil 21). Karışık bir dispersiyon halinde kolonda bulunan bu karışımda örneğin fraksiyonlanması için benzersiz bir karakter gösteren yeni bir faz üretilir. Cokolonlar katı faz veya kromotografik aksama dahil edilebilir, böylece sistem daha temiz analit ekstraksiyonuna olanak vermektedir. ġekil 21. MSPD prosedürü [35]
40 Teknik diğer klasik yöntemlerle karşılaştırıldığında %95 daha az organik solvent gerektirmesi ve %90 oranında daha kısa süreli olması bakımından avantaj göstermektedir. Bu teknik katı faz ekstraksiyonu ve HPLC ile kombinlenip eşzamanlı olarak diyot algılama ( Diode array Detection (DAD)) sistemine eklenerek verimliliği yüksek daha temiz analit örneklerinin elde edilmesinde de ileri laboratuvar çalışmalarında kullanılmaktadır (Şekil 22). ġekil 22. MSPD SPE HPLC/DAD çoklu ekstraksiyon sistemi [ 36] 2.2.8.2. Matriks Katı-Faz Dispersiyonunun BaĢlıca Kullanım Alanları MSPD sıklıkla ilaçların (Tablo 7), hayvan dokularından sebze ve meyvelerden izolasyonunda kullanılmaktadır. Bununla birlikte farmasötiklerin ekstraksiyonu amacıyla yapılmış sınırlı sayıda çalışma mevcuttur (Şekil 23). Antibakteriyel ilaçlar, (örn;sefalosporinler, makrolitler, penisilinler, fenotiazinler, kinolonlar, sulfonamitler, triklosan, amfenikoller, hormonlar, antikoksidiyaller analiz edilmiştir. Balık dokularından(sazan) 13 sülfonamid türevi MSPD-HPLS-DAD tekniğiyle ekstrakte edilmiştir. Yumurta dokularından kinolon ve balık dokularından kloramfenikol ekstraksiyonunda MIP ler dağıtıcı olarak kullanılmıştır.
41 ġekil 23. Farklı doku matrikslerinden ekstrakte edilen kinolonlar [37] Yumurta, balık ve karides gibi matriksler üzerinde ekstraksiyon çalışmaları yapılmıştır fakat bunlar arasında süt ve süt ürünlerinde yapılan çalışmalar başı çekmektedir. MSPD metoduyla gıda örneklerinde mikotoksinlerin tespiti boyutunda hızlı bir gelişme süreci yaşanmaktadır.bu gıdaların başında bebek mamaları, içecekler ve fındıklar yer almaktadır. Kozmetiklerde kullanılan koruyucuların ve alerjen maddelerin tespit edilmesi aşamasında çalışmalar mevcuttur. Tablo 7. Katı örneklerden MSPD metoduyla ekstraksiyonu yapılan farmasötikler Farmasötikler Örnek Absorban tipi Çözücü Sonuç analiz Ref. Sülfonamidler (sülfadiazin, sülfametazin, sülfametoksazol) Et (dana, domuz eti, tavuk) 0,5 g. Al 2 O 3 -N-S, ICN Biyokimyasallar 70% etanol, 10 ml. LC-MS 38 2.2.8.3. Matriks Katı-Faz Dispersiyonunda Yeni GeliĢmeler 1. Ters faz materyallerinin geliştirilmesi: C18, C8 bağlı silikalar lipofilik sorbent materyalleri olarak geniş bir kullanım alanına sahip olmuştur. 2. Alumina ve florisil içerikli normal faz inorganik destek materyallerin geliştirilmesi:bu maddeler karışımda çözünmezler ve sadece organik maddeleri absoblarken matriks bileşiklerinde kısmi bozunma yapılarında hasara neden olurlar.
42 3. Son derece selektif destek materyallerinin (MIPler) geliştirilmesi: Bu yöndeki gelişmeler MIP sistemine baskılanarak hedeflenmiş istenen grupların taranmasında ve ekstraksiyonunda yüksek verim ile öne çıkan çalışmalardır. 4. Gelişmekte olan bir destek malzemesi olarak; multiwalled karbon nanotübülleri: Çok duvarlı karbon nanotüpler ( MWCNTs ) karbon bazlı bir maddeden üretilmektedirler. Teorikte bu maddeler çok geniş bir yüzey alanına sahiptirler ve mükemmel bir bir tutma yeteneğine sahiptirler. Böylece birçok farmasötik maddenin bu yöntemle tespit ve ekstraksiyonunun gelişim göstermesi ve uygulama alanarının genişlemesi beklenmektedir [39]. 2.2.9. Dispertif Katı-Faz Ekstraksiyonu (DSPE) DSPE, MSPD tekniğiyle benzerlik göstermektedir. Fakat yüksek çözücü maliyeti, MSPD de kullanılabilecek çözücü miktarını sınırlamaktadır. Bununla birlikte DSPE ekstraksiyon sürecinde, orijinal örnekten alınmış her miktarda homojen bir kısım ve az miktarda çözücü kullanımı yeterli olmaktadır. Bu teknik özellikle primer ve sekonder aminlerin direkt olarak QuEChERS ekstraksiyonunun sağlanmasında kullanılmaktadır. DSPE birçok kaynakta QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) ekstraksiyonu ile birlikte anılmaktadır. Bu kısaltma tekniğin belirgin özelliklerine atıfta bulunmaktadır. Bu yöntemin avantajları; hız, yürütme kolaylığı, asgari çözücü gereksinimi ve düşük maliyetidir. Özel isimlendirilmesini açıklayacak olursak; Hızlı ; yüksek örnek hacmi, 8 örnek 30 dk.dan az bir sürede analiz edilebilmektedir. Kolay ; diğer birçok ayırma tekniğine göre daha az ön işleme ve adım gerektirir. Ucuz ; diğer tekniklere kıyasla örnek işleme işlemi için daha az çözücü ve zaman gerektirdiğinden dolayı maliyeti düşüktür. Etkin ; farklı türde birçok dizi bileşik için yüksek doğrulukta geri kazanım seviyeleri gösterir. Sağlam ; yüklü bileşikler ve polar pestisitler de dahil birçok madde tespit edilebilir. Güvenli ; diğer tekniklerin aksine klorlu çözücü kullanımı gerektirmez. Ekstraksiyonda taşıyıcı olarak asetonitril çözeltisi kullanılır, ayrıca GC ve LC ile uyumludur.
43 2.2.9.1. Dispertif Katı-Faz Ekstraksiyonunun Prensipleri Örnek ekstraksiyonu aşamasında, gıda veya çevresel örnek optimum ekstraksiyon verimliliğini sağlamak için analitin yüzey alanını en yüksek dereceye kadar artırmak amacıyla homojenize edilir. Homojenize edilmiş örnek, magnezyum sülfat ve tuz(sodyum klorür, sodyum sitrat tribazik dihidrat) içeren ekstraksiyon tüpüne yerleştirilir. Magnezyum sülfat üzerine asetonitril eklenir, bu sırada bir faz ayrılması meydana gelir, ekstrakte edilecek analit bileşikleri, organik çözücü ile su arasındaki partisyonla organik faza çekilir. Homojen örneğin bulunduğu tüpe asetonitril eklendiğinde magnezyum sülfat ve su arasında ekzotermik bir reaksiyon meydana gelmektedir. Bu adım analitlerin indirgenmiş bir kazanımına yol açabilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, örnek boş bir santrifüj tüpü içersinde direkt olarak tartılır ve ardından asetonitril ilave edilir. Daha sonra tüp bir buz banyosuna daldırılarak yavaşça tuz ilavesi yapılabilir. Yöntemin ikinci aşamasında, adsorbanların bir kombinasyonunu içeren temizleme tübünden istenmeyen örneklerin uzaklaştırılması sağlanır. Analiti içeren faz 50 ml lik ekstraksiyon tüpünden 2ml lik temizleme tüpüne aktarılır. Uygun bir tampon veya çözücüyle yıkanan çözelti direkt olarak analiz edilebilinir. Temizlenmiş örnekte matriks etkisi indirgenmiştir, bundan dolayı metot etkinliği ve sağlamlığı artırılmıştır. 2.2.9.2. Dispertif Katı-Faz Ekstraksiyonunun BaĢlıca Kullanım Alanları Bu yöntem ilk olarak sulu örnekler için geliştirilmiş olsada gıda takviyeleri gibi kuru örnekler içinde başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Bu yaklaşım bir ekstraksiyon kartuşu ve temizleme işleminin geliştirilmesini sağlamıştır. DSPE, gıda takviyeleri ve tütün örnekleri gibi karışık matriksli örneklerde, gelişmiş temizleme kapasitesiyle etkili bir temizlik sağlamaktadır. Posniyak ve ekibi, tavuk kas dokusundan sülfonamid seviyelerini belirlemek çin bu tekniği geliştirmişlerdir. Ayrıca teknik birçok çalışmada meyve ve sebzelerde pestisit kalıntısı tespitinde kullanılmaktadır. Salatalık örneklerinde yapılan çalışmalarda herbisitlerin, fungusitlerin ve organofosforlu pestisitlerin oranları tespit edilmiştir.
44 2.2.10. Ultrasonik Ekstraksiyon Ultrasonik dalgalar bir ortamdan geçerken kütle transferine olan hem iç ve hem de dış dirence tesir eden bir seri etkide bulunurlar. Ultrason destekli ekstraksiyon uygulamalarındaki yüksek yoğunlukta ve yüksek frekanstaki ultrason dalgalarının gıda materyali üzerindeki etkilerine yönelik çalışmalar literatürde bulunmaktadır. Ultrasona maruz kalan bitkisel dokularda fiziksel değişimler meydana gelmektedir. Ultrason etkisiyle hücre duvarları hasar görerek doku içindeki ekstrakte edilebilir bileşenlerin ortaya çıkması kolaylaşmaktadır. Çözücü fazına bu maddelerin kütle transferi ile aktarımı artmaktadır. Bu nedenle ultrason destekli ekstraksiyon gelecekteki uygulamalar için önemli potansiyele sahiptir [40]. Ultrason destekli ekstraksiyon sistemi ucuz, basit ve verimli olması nedeniyle geleneksel ekstraksiyon tekniklerine iyi bir alternatiftir. Ultrasonun katı-sıvı ekstraksiyonunda kullanılmasının başlıca yararları hızlı kinetik ve verim artışıdır. Ayrıca ultrason, düşük sıcaklıklarda da etkin olarak uygulanabildiğinden sıcaklığa duyarlı maddelerin ekstrakte edilmesini mümkün kılar. Mikrodalga destekli ekstraktörler vb. yeni tip ekstraksiyon sistemleriyle karşılaştırıldığında ultrason sistemi daha ucuz ve kullanımının kolay olması nedeniyle daha avantajlıdır. 2.2.10. 1. Ultrasonik Ekstraksiyonun Prensipleri Ses dalgaları-destekli sıvı ekstraksiyonu, ultrasonik ekstraksiyon olarak da adlandırılır. Bu yöntemde örneğe 20 khz üstündeki frekanslarla akustik titreşimler uygulanır. Bu titreşimler sıvının içinden geçtiğinde kavitasyon (boşluk oluşumu) meydana gelir. Ultrasonik enerjinin neden olduğu kavitasyon olarak bilinen bu etki sıvı ortamda çok sayıda ufacık kabarcıklar üretir ve katıların mekanik olarak sarsılmasına neden olarak partiküllerin kopmasını sağlar. En çok kullanılan ve en ucuz ultrasonik radyasyon kaynağı ultrasonik banyodur. Ayrıca örneklerin sonikasyonu icin güçlü silindirik bir prob kullanan daha etkin bir sistem geliştirilmiştir. Banyo ve prob arasındaki seçim analizin gerekliliklerine bağlıdır. Eğer amaç toplam katı-sıvı ekstraksiyonu ise, etkili bir prob kullanımı daha iyi olabilir. Çünkü ekstraksiyon için gerekli zaman daha azdır. Bununla birlikte, çok sayıda örneğin ultrasonik banyo ile analiz edilmesi daha iyi bir seçenektir. Ekstraksiyon verimini artırmak için solvent turu, sıcaklık ve sonikasyon
45 genliği koşulları gibi farklı faktörleri optimize etmek gereklidir. Ultrason radyasyonun ilginç bir uygulaması dinamik ses dalgaları-destekli ekstraksiyondur. Burada numune ultrasonik su banyosuna yerleştirilmiş bir ekstraksiyon hücresi veya ultrasonik problu bir su banyosu içine konulur. Bu sistem taze ekstraksiyon solventinin sürekli olarak örneğe pompalandığı, artan analit transferi olan acık bir sistem veya ekstraktın seyrelmesini engelleyen ekstraksiyon solventinin yeniden dolaştığı kapalı bir sistem olarak kullanılabilir (Şekil 24) [41]. ġekil 24. Dinamik ses dalgaları-destekli ekstraksiyonun şematik gösterimi A) Açık sistem B) Kapalı sistem Ekstraksiyon tipik olarak 20-200 ml solvent gerektirir ve ekstraksiyon zamanı 2 ila 20 dakika aralığındadır. Ayrıca, dinamik ses dalgaları-destekli ekstraksiyon ile enstrumantal analiz yönteminin çevrimiçi bağlanması mümkündür (Şekil 25). ġekil 25. Dinamik ses dalgaları-destekli sıvı ekstraksiyonun analiz sistemine bağlanmasının şematik gösterimi [42]
46 2.2.10.2. Ultrasonik Ekstraksiyonun BaĢlıca Kullanım Alanları Ultrason destekli ekstraksiyon yağ ve esansiyel yağlar, antioksidantlar gibi maddelerin ekstraksiyonunda kullanılmaktadır. Mason ve ark. ultrasonun gıdaların işlenmesinde uygulanan ekstraksiyon, kristalizasyon, dondurma, emülsifikasyon, filtrasyon ve kurutmada gibi işlemlerde kullanımı ile ilgili örnekler vermiştir. Ayrıca ultrasonik yöntem kullanarak kahve kafein ve diğer aktif bileşikler çıkarılması için etkili bir yöntemdir. Ultrason ekstraksiyon verimini arttırmaktadır. Sharma ve Gupta tarafından yapılan çalışmada badem, kayısı ve pirinç kepeğinden yağın ekstrakte edilmesinde yüksek verim elde etmek için ultrason uygulamasının kritik ön işlem olduğu belirtilmiştir. Soyadan yağ ekstraksiyonunda ultrason uygulaması ekstraksiyon verimini önemli ölçüde arttırmıştır. Dereotunun ekstraksiyonunda kullanılan ultrason destekli ekstraksiyon sisteminde alınan sonuçların geleneksel ekstraksiyona göre 1,3-2 kat daha hızlı olduğu bulunmuştur. Ultrason kolza, soya ve ayçiçeği gibi yağlı tohumlardan yağ ekstraksiyonunda da kullanılmıştır. Ultrason uygulamasının ekstrakte edilen yağ kompozisyonunda değişiklik olmadan işlem süresini yarıya indirdiği belirtilmiştir. Wu ve ark. tarafından yapılan çalışmada ginseng saponinlerinin ekstraksiyonunun ultrason destekli sistemde geleneksel Soxhelet ekstraksiyonundan üç kat daha hızlı olduğu bulunmuştur.sanchez-brunete ve arkadaşları toprakta pestisitlerin tayini icin küçük kolonlarda ses dalgaları destekli ekstraksiyon olarak adlandırılan minyaturize edilmiş bir teknik geliştirmişlerdir [43]. 2.2.11. Mikrodalga-Destekli Solvent Ekstraksiyonu (MAE) Mikrodalgalar yüksek frekanslı elektromanyetik dalgalardır (300-300000 MHz). Başarılı bir ekstraksiyon gerçekleştirmek için uygun solvent seçimi çok önemlidir. Seçilen solventlerde mikrodalga ışımasını absorplaması, solventin matriksle etkileşimi ve analitin solventteki çözünürlüğü göz önüne alınmalıdır. Diğer önemli faktörlerden biri de, ekstraksiyon solventi ile ekstraktın analizinde kullanılan analitik metodun uyumluluğudur. Gaz kromatografik analizler için daha az polar solventler, sıvı kromatografik analiz ve imunoassay teknikler için daha polar solventler tercih edilir. MAE nin seçiciliği üzerine çok az literatür rapor edilmiştir. Örneğin içindeki tüm maddeler ekstrakte edildiğinden seçici bir ekstraksiyon tekniği olduğu söylenemez ve hemen hemen her durumda ekstraksiyon sonrası temizleme basamağı gereklidir.[44]
47 2.2.11.1. Mikrodalga-Destekli Solvent Ekstraksiyonunun Prensipleri Mikrodalga enerji kullanılarak ısıtmanın prensibi, iyonların iletimi ve dipol rotasyonu (dönme) yoluyla molekül üzerine mikrodalganın direkt etkisi temeline dayanır. Çoğu uygulamalarda bu iki mekanizma eş zamanlı meydana gelir. İyonik iletim, bir manyetik alan uygulandığında iyonların elektroforetik göçüdür. Çözeltinin bu iyon akışına direnci friksiyon (sürtünme) ile sonuçlanır ve böylece çözelti ısınır. Ekstraksiyon genellikle kapalı bir kapta gercekleştirilir. Bu durumda basınç artar ve solvent kaynama noktasından daha yüksek sıcaklıklara ısıtılabilir. Çoğu solvent için (aseton, asetonhekzan, aseton gibi) kabın icindeki sıcaklık, solventin kaynama noktasının 2-3 katıdır. Temel olarak iki tip MAE sistemi kullanılabilir: Kapalı kap sistemi (kontrollü sıcaklık ve basınç altında) ve açık kap sistemi (atmosfer sıcaklığında). Her iki sistem de Şekil 26 da gösterilmiştir [45]. ġekil 26. MAE de kapalı ve açık sistem Kapalı kap sisteminde hücreler eşzamanlı olarak ışınlanırken, açık sistemde kaplar sıralı olarak ışınlanır. Açık kaplarda sıcaklık solventin atmosferik basıncta kaynama noktasıyla sınırlıyken, kapalı kaplarda sıcaklık uygulanan basınçla yükseltilebilir. Kapalı kap sistemi ucucu bileşikler olması durumunda en uygun görünmektedir. Bununla birlikte, kapalı kaplarda, ekstraksiyon sonrasında kap açılmadan önce