Neurotransmitters in Urine LC-MS/MS Analysis Kit

Transkript

1 Neurotransmitters in Urine LC-MS/MS Analysis Kit ZV C User Manual

2 Table Of Contents Page 1. INTENDED USE: SUMMARY AND EXPLANATION: TEST PRINCIPLE: WARNING AND PRECAUTIONS: STORAGE AND STABILITY: MATERIALS SUPPLIED: MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED: PROCEDURE NOTES: LIMITATIONS OF THE PROCEDURE: PRE-TEST SET-UP INSTRUCTIONS: TEST PROCEDURE: QUALITY CONTROL: CALCULATION OF RESULTS: INTERPRETATION OF RESULTS: EXPECTED VALUES: LC-MS/MS PARAMETERS: MS SCAN PARAMETERS: ANALYTICAL PERFORMANCE: SAMPLE CHROMATOGRAMS: Automated Sample Preparation Method Parameters for Zivak ASP

3 1. INTENDED USE: Quantitative LC-MS/MS analysis kit for Epinephrine, Norepinephrine, Dopamine, Serotonin, Gamma-aminobutyric acid, Glutamic Acid, Histamine, 5-Hydroxy-L- Tryptophan in urine. 2. SUMMARY AND EXPLANATION: Zivak Neurotransmitters LC-MS/MS Analysis Kit was developed for accurate analysis of Epinephrine, Norepinephrine, Dopamine, Serotonin, Gammaaminobutyric acid, Glutamic Acid, Histamine, 5-Hydroxy-L-Tryptophan in urine samples. 3. TEST PRINCIPLE: Neurotransmitters are extracted from human urine samples by using an acidic extraction and deproteinization steps. After the extraction, these analytes derivatized via reagents. Then derivatizated Neurotransmitters analyzed by LCcoupled tandem mass spectrometry. 4. WARNING AND PRECAUTIONS: For in-vitro diagnostic use only. Read the instructions carefully, before you start. In case of damage of the kit package, please contact Zivak or your supplier. Do not use expired kits and components. Please check batch no and expiry date before you start. Although the concentration of all toxic components is low, for safety reasons the sample preparation station should be placed in an exhaust hood. Protective gloves and goggles should be worn. Please take any necessary precautions to prevent infection with blood borne pathogens while working with biological fluids. Appropriate bio-safety precautions and disposal of bio-hazardous wastes should be followed. Please check the labels on reagent bottles. Reagents of this kit contain hazardous material may cause eye and skin irritations. 3

4 5. STORAGE AND STABILITY: Reagent 1,2,3,4 and calibrators, controls should be stored at between 2-8 C. Other all components of the kit should be stored at room temp. Urine calibrators and control must be stored at -20 C after reconstitution. All components are guaranteed until expiry date when stored at recommended temperatures and used as described in this instructions. 6. MATERIALS SUPPLIED: Order No. Volume Symbol Component ZV R1-20 1x 30ml R1 Reagent 1, Contains deuterated internal standart ZV R2-20 1x 50ml R2 Reagent 2, Contains base ZV R3-20 1x 50ml R3 Reagent 3, Contains base and derivatization reagent ZV R4-20 1x 50ml R4 Reagent 4, Contains organic extraction solvent ZV MA-20 1x1 L MA Mobile Phase A, Contains organic solvent ZV MB-20 1x 0,5 L MB Mobile Phase B, Contains organic solvent ZV WB-20 1x 1 L WB Washing Solution ZS-2ML x100pcs 2 ml glass autosampler vial ZS x100pcs 2 ml glass autosampler vial caps pre-slit ZV-3033-KK-20 1x 1pc User Guide 4

5 7. MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED: Calibrator Level 1 ZV S1-20 1x 8ml Lyophilized Urine Calibrator Level 1 ZV K1-20 Calibrator Level 2 1x 8ml Lyophilized Urine Calibrator Level 2 ZV K2-20 1x 8ml Control Level 1 Lyophilized Urine Control Level 1 Zivak Neurotransmitters in Urine LC-MS/MS Analytical Column µl pipette Pipette tips Vortex mixer 2.0 ml glass sample preparation tube (for Manual Sample Preparation) Centrifuge Bidistilled or deionised water 0,5 ml conical autosampler vial or vial insert (for Manual Sample Preparation) 8. PROCEDURE NOTES: Any inappopriate handling of samples or modification of the test procedure may influence the results. The indicated pipetting volumes, incubation times, temperatures and pretreatment steps have to be performed strictly according to the instructions. Use calibrated pipettes and devices only. Once the test is started, all steps should be completed without interruption. Make sure that required reagents, materials and devices are prepared ready at the appropriate time. Leave aside all reagents and specimens to reach room 5

6 temperature (18-25 C) and gently swirl each vial of liquid reagent and sample before use. Mix reagents without foaming. Avoid contamination of reagents, pipettes and wells/tubes. Use new disposable plastic pipette tips for each reagent, standard or specimen. Do not interchange the vial caps. Always keep vials closed when not used. Do not re-use wells/tubes or reagents. Incubation time affects results. All tubes or wells should be handled in the same order and time sequences. 9. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE: Specimen collection and storage have a significant effect on the test results. Urine samples must be kept frozen or acidified with appropriate acid solution before the analysis. (6N HCl, %50 Acetic acid, Na2CO3 (crystals), Boric acid (crystals)). If the urine sample is not clear, it has to be centrifuged before sample preparation. 10. PRE-TEST SET-UP INSTRUCTIONS: Preparation of Zivak Calibrator Level-I: Add 8 ml 0,1 M HCl to urine calibrator and dissolve. After preparation, calibrator must be aliquoted into 120 µl volumes and stored at -20 C. Preparation of Zivak Calibrator Level-II: Add 8 ml 0,1 M HCl to Urine Control Level I and dissolve. After preparation, Control Level I must be aliquoted into 120 µl volumes and stored at -20 C. Preparation of Zivak Control Level I: Add 8 ml 0,1 M HCl to Urine Control Level II and dissolve. After preparation, Control Level I must be aliquoted into 120 µl volumes and stored at -20 C. 6

7 11. TEST PROCEDURE: Sample Pre-treatment (Automated) Take 100 L of patient sample (or calibrators and controls) into the Zivak Multitasker Sample Preparation vials Make sure that reagents and wash solution are connected to the reagent pump and purged properly. Place the vials on the MULTITASKER system tray. Note: The prepared sample is stable at 2-8 C for 24 hours. Sample Pre-treatment (Manual) Take 100 L of patient sample (or calibrators and controls) into the sample preparation tube. Add 100 L of Reagent 1 and vortex for 10 seconds. Add 200 L of Reagent 2 and vortex for 10 seconds. Add 200 L of Reagent 3 and vortex for 10 seconds. Wait for 2 minutes and vortex again for 10 seconds. Wait for 1 minute. Add 200 L of Reagent 4 and vortex for 10 seconds. After mixing wait for a minute. Centrifuge at x rpm for 3 minutes. Take 200 L the upper phase into the autosampler vial. Inject 3 L to the LC-MS/MS system. Note: The prepared sample is stable at 2-8 C for 24 hours. 7

8 12. QUALITY CONTROL: The test results are only valid if the test is performed by following the instructions. Moreover the user must strictly adhere to the rules of GLP (Good Laboratory Practice) or other applicable standards/laws. All standards and kit controls have to be found within the acceptable ranges as stated on the QC Certificate. If the criterias are not met, the run is not valid and should be repeated. Each laboratory should use known samples as further controls. In case of any deviation the following technical issues should be proven: Expiry dates of (prepared) reagents, storage conditions, pipettes, devices, incubation conditions and washing methods. It is recommended to participate at appropriate quality assessment trials. 13. CALCULATION OF RESULTS: The obtained area of the standard is plotted against their concentration. The standard curve is calculated by a linear regression or a weighted linear regression function. Using computer programs, the curve is best described by a 2-point linear regression fit with linear axes. For the calculation of the regression curve, apply each signal of the standards (one obvious outlier of duplicates might be omitted and the more plausible single value might be used). The concentration of the samples can be read directly from the regression function. Sample signals above the highest standard have to be confirmed by a reference method. (Peak Area of Sample) x (Peak area of IS in Calibrator) Concentration X of Calibrator = (Peak area of Calibrator) x (Peak area of IS in the Sample) Concentration of the Sample *IS: Internal Standard Calculation for 24 hours urine: Concentration of the Sample(mg/L) x Volume of 24h Urine (L) = mg analyte / 24 hours 8

9 Calculation for spot urine: [ (Concentration of the Sample (mg/l) ] [ (Concentration of Creatinine g/l) ] = mg analyte creatinine g 14. INTERPRETATION OF RESULTS: Various societies recommend different Cut-Off values for repetition of the measurement and the application of confirmatory assays. Depending on the application of samples from different populations, it is highly recommended that each laboratory establishes its own range of normal values and that this distribution of values is co-ordinated with the recommendations of the responsible society of this geographic region. 15. EXPECTED VALUES: It is recommended that each laboratory establishes its own range of normal values. 9

10 16. LC-MS/MS PARAMETERS: Device Column Zivak Tandem Gold LC-MS/MS System Zivak Neurotransmitters in Urine LC-MS/MS Analytical Column Injection volume 3 µl Gradient min 5 % B 07:00 min 100 % B 09:00 min 100 % B 09:01 min 5 % B 13:00 min 5 % B Flow 0,25 ml/min Ionization Mode: ESI positive CID Gas 2,4 mtorr API Nebulizing Gas 55 psi Scan Time 1,3 sec SIM Width 1,5 amu Drying Gas 35 psi Drying Gas Temp. 350 C Needle 5000V Shield 600V Capillary 50V Detector 1700 V 17. MS SCAN PARAMETERS: Analyte RT Capillary CE MH+ (m/z) MS/MS No (min) (ev) (ev) 1 Dopamine 9,4 429,3 412, Epinephrine 9,2 442,2 424, Norepinephrine 8,7 410,2 238, Serotonin 8,7 349,0 203, Gamma-aminobutyric acid 7,8 232,0 86, Glutamic Acid 8,8 318,0 172, Histamine 7,8 284,0 138, Hydroxy-L-Tryptophan 6,9 349,0 261, Dopamine-IS 9,4 433,2 416, Epinephrine-IS 9,2 445,2 427, Norepinephrine-IS 8,7 416,2 244, Gamma-aminobutyric acid-is 9,2 304,0 173, Glutamic Acid-IS 8,8 324,0 178, Histamine-IS 8,6 379,0 204, Hydroxy-L-Tryptophan-IS 8,8 346,0 257, No Analyte IS 10

11 1 Dopamine Dopamine-IS 2 Epinephrine Epinephrine-IS 3 Norepinephrine Norepinephrine-IS 4 Serotonin 5-Hydroxy-L-Tryptophan-IS 5 Gamma-aminobutyric acid Gamma-aminobutyric acid-is 6 Glutamic Acid Glutamic Acid-IS 7 Histamine Histamine-IS 8 5-Hydroxy-L-Tryptophan 5-Hydroxy-L-Tryptophan-IS 18.ANALYTICAL PERFORMANCE: No Analyte LOD (µg/l) LOQ (µg/l) Accuracy (%) Intra-Assay Precision (%CV) Inter-Assay Precision (%CV) Linearity (R 2 ) 1 Epinephrine Norepinephrine Dopamine Serotonin Gamma-aminobutyric acid Glutamic Acid Histamine 5-Hydroxy-L-Tryptophan Analytical Specificity (Cross Reactivity): No cross-reactivities were found with the typical substances tested. 11

12 19. SAMPLE CHROMATOGRAMS: 12

13 13

14 14

15 20. Automated Sample Preparation Method Parameters for Zivak ASP Reagent addition (Parallel) Reagent tray 2 - Reagent addition (Parallel) Reagent tray 3- Reagent addition (Parallel) Reagent tray 4- Reagent addition (Parallel) Reagent tray 3 - Vortex 4 - Injection (Serial) Analysis tray Analysis tray From 1;2;3 (Vial Position) 0 mm (Needle 4;5;6 (Vial Position) 0 mm (Needle 4;5;6 (Vial Position) 0 mm (Needle 4;5;6 (Vial Position) 0 mm (Needle 1 (Vial Position) 1 (Vial Position) 0 mm (Needle 1.5 mm (Needle 110 µl 220 µl 220 µl 220 µl 3 µl No liquid detection No liquid detection No liquid detection No liquid detection Liquid detection - active Analysis tray Analysis tray Analysis tray Analysis tray To 1 (Vial Position) 1 (Vial Position) 16 mm (Needle 16 mm (Needle 1 (Vial Position) 16 mm (Needle 1 (Vial Position) 16 mm (Needle 100 µl 200 µl 200 µl 200 µl Wash station A Wash station A Wash station A Wash station A Wash station A Loop Washing Pump 2 Pump 2 Pump 2 Pump 2 Pump 2 Pump µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 250 µl 5 repeat 2 repeat 2 repeat 2 repeat 1 repeat 1 repeat Pump 2 Pump 2 Pump 2 Pump 2 Pump 1 Syringes ms ms ms ms ms ms ms ms (speed - wait) (speedwait) Air segment Vortex- Centrifuge Parameters First First First First First 100 µl 200 µl 200 µl 200 µl 3 µl 2 - Reagent addition (Parallel) Reagent tray 4;5;6 (Vial Position) 0 mm (Needle Purge Before Syringe Pump Wash Place Flush Volume Repeat Time Pump 1 (250 ul) Wash station A 250 ul 1 Pump 2 (1000 ul) Wash station B 1000 ul 5 Batch 8 15

16 Neurotransmitters İdrar LC-MS/MS Analiz Kiti ZV C Kullanma Kılavuzu 16

17 İÇERİK Sayfa 1. KULLANIM AMACI: ÖZET VE AÇIKLAMA TEST PRENSİBİ UYARILAR VE ÖNLEMLER SAKLAMA KOŞULLARI VE KARARLILIK KİT İÇERİĞİ KİT İÇERİĞİ DIŞINDA GEREKLİ OLAN MALZEMELER ÇALIŞMA PROSEDÜRÜ YÖNTEMDEKİ KISITLAMALAR TEST ÖNCESİ HAZIRLIKLAR NUMUNE HAZIRLIĞI KALİTE KONTROL SONUÇLARIN HESAPLANMASI SONUÇLARIN YORUMLANMASI BEKLENEN DEĞERLER LC-MS/MS PARAMETRELERİ MS SCAN PARAMETRELERİ ANALİTİK PERFORMANS ÖRNEK KROMATOGRAM Zivak ASP-200 İÇİN OTOMATİK METOT PARAMETRELERİ

18 1. KULLANIM AMACI: İdrar numunelerinde Serotonin, Gama-aminobutirik asit, Glutamik Asit, Histamin, 5-OH-L-Triptofan, Epinefrin, Norepinefrin ve Dopamin in LC-MS/MS yöntemiyle kantitatif analizi. 2. ÖZET VE AÇIKLAMA Adrenalin (epinefrin), noradrenalin (norepinefrin) ve dopamin ölçümü kronik özellikle hipertansiyon hastalarında feokromositoma tümörü taramasında önemlidir. Ayrıca bu test feokromositoma tümörüne rastalanan ve tedavi edilen hastalarda tümörün tekrar oluşumunun kontrolünde de önemlidir. Zivak İdrarda Neurotransmitters Analiz kiti Serotonin, Gama-aminobutirik asit, Glutamik Asit, Histamin, 5-OH-L-Triptofan, Epinefrin, Norepinefrin ve Dopamin in idrar numunlerinde doğru bir şekilde analizi için geliştirilmiştir. 3. TEST PRENSİBİ Neurotransmitters metodunda asidik ekstraksiyon ve deproteinizasyon işlemleriyle idrar numunesinden ekstrakte edilir. Ekstraksiyon işleminden sonra analitler reaktifler ile türevlendirilir. Türevlenmiş katekolaminler LC-MS/MS sisteminde analiz edilir. 4. UYARILAR VE ÖNLEMLER Sadece in-vitro kullanım amaçlıdır. Profesyonel kullanım içindir. Çalışmaya başlamadan önce, kullanım kılavuzunu dikkatlice okuyunuz. Kit ambalajının zarar görmüş olması durumunda, lütfen Zivak veya bayinizle irtibata geçiniz. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri veya bileşenlerini kullanmayınız. Kullanmadan önce seri numarasını ve son kullanma tarihini kontrol ediniz. Toksik bileşen konsantrasyonları çok düşük olmakla birlikte güvenlik amacıyla çeker ocak altında çalışılması önerilir. Çalışırken koruyucu eldiven ve gözlük kullanılmalıdır. Çalışılan kan veya biyolojik örneklerden kaynaklanabilecek enfeksiyonlara karşı gerekli her türlü önlemi alınız. Biyo-zararlı atıklar için uygun biyo-güvenlik ve atık yönetimi koşullarını sağlayınız. 18

19 5. SAKLAMA KOŞULLARI VE KARARLILIK Kitin bütün bileşenleri 2-8 C derece arasında saklanmalıdır. İdrar kalibratör ve kontrolleri çözüldükten sonra -20 C de muhafaza edilmelidir. Bütün bileşenler önerilen koşullarda saklandığı takdirde son kullanma tarihine kadar garantilidir. 6. KİT İÇERİĞİ Sipariş No Hacim Sembol İçerik ZV R1-20 1x 30ml R1 Reaktif 1, ZV R2-20 1x 50ml R2 Reaktif 2, ZV R3-20 1x 50ml R3 Reaktif 3, ZV R4-20 1x 50ml R4 Reaktif 4, ZV MA-20 1x1 L MA Mobil Faz A, ZV MB-20 1x 0,5 L MB Mobil Faz B, ZV WB-20 1x 1 L WB Yıkama Solüsyonu ZS-2ML x100 ad 2 ml cam vial ZS x100 ad 2 ml cam vial kesikli kapak ZV-3033-KK-20 1x 1 ad. Kullanma Klavuzu 19

20 7. KİT İÇERİĞİ DIŞINDA GEREKLİ OLAN MALZEMELER Calibrator Level 1 ZV S1-20 1x 8ml İyofilize İdrar Kalibrator Level 1 ZV K1-20 Calibrator Level 2 1x 8ml İyofilize İdrar Kalibrator Level 2 ZV K2-20 1x 8ml Control Level 1 İyofilize İdrar Kontrol Level 1 Zivak Neurotransmitters Kolonu µl pipet Pipette uçları Vorteks karıştırıcı 2.0 ml cam durhaim hazırlık tüpü (Manuel Numune Hazırlığı) Distile veya deiyonize su 0,5 ml konik autosampler viali or vial insert (Manuel Numune Hazırlığı) 8. ÇALIŞMA PROSEDÜRÜ Test prosedürünün yanlış ve değiştirilerek uygulanması test sonucunu etkileyebilir. Pipetleme hacimleri, inkübasyon zamanları ve hazırlık aşamaları tam olarak belirtilen miktarlarda ve talimatlara uygun bir biçimde yapılmalıdır. Teste bir kere başlandığı zaman, herhangi bir kesintiye uğramadan tamamlanmalıdır. Bunu sağlamak için gerekli reaktiflerin, maddelerin ve cihazların zamanında hazır olduğundan emin olunuz. Çalışmaya başlamadan önce bütün 20

21 reaktiflerin ve numunelerin oda sıcaklığına (18-25 C) gelmesini bekleyiniz, sıvı reaktifleri ve örneklerini kullanmadan önce hafifçe çalkalayarak karıştırınız. Reaktifler, pipetler ve numune hazırlık tüplerinde kirlilik ve bulaşma olmamasına dikkat ediniz. Her reaktif, standart ve numune için ayrı ve yeni pipet ucu kullanınız. Vial kapaklarını kendi aralarında değiştirmeyiniz. Kullanılmadığı zaman vial kapaklarını her zaman kapalı tutunuz. Vialler, vial kapakları, numune hazırlık tüpleri ve pipet uçları tek kullanımlıktır. İnkübasyon süreleri sonuçları etkilemektedir. Bütün numune hazırlık işlemleri belirtilen sırada ve sürede yapılmalıdır. 9. YÖNTEMDEKİ KISITLAMALAR Örnek toplama ve saklama koşullarının test sonuçları üzerindeki etkisi büyüktür. İdrar numuneleri dondurulmuş veya uygun bir asit çözeltisi ile asitlendirilmiş bir biçimde saklanmalıdır. (6N HCl, %50 Asetik asit, Na2CO3 (kristal), Borik asit (kristal)). İdrar numunesi berrak değilse, numune hazırlığından önce santrifüj edilmesi gerekmektedir. 10. TEST ÖNCESİ HAZIRLIKLAR Zivak Kalibratörün Hazırlanması : İdrar standart numunesine 2 ml 0,1 M HCl eklenip çözülür. Hazırlanan kalibratör 120 μl lik hacimlere bölünerek -20 C de saklanmalıdır. Zivak Kontrol 1 Numunesinin Hazırlanması : İdrar kontrol level 1 numunesine 2 ml 0,1 M HCl eklenip çözülür Hazırlanan kontrol numunesi 120 μl lik hacimlere bölünerek -20 C de saklanmalıdır. Zivak Kontrol 2 Numunesinin Hazırlanması : İdrar kontrol level 1 numunesine 2 ml 0,1 M HCl eklenip çözülür 21

22 Hazırlanan kontrol numunesi 120 μl lik hacimlere bölünerek -20 C de saklanmalıdır. 11. NUMUNE HAZIRLIĞI Numune Hazırlığı (Otomatik): 100 µl hasta numunesi (veya kalibratör ve kontroller) Zivak Multitasker Numune Hazırlama Tüpüne (Vialine) Alınır. Reaktifler ve yıkama solüsyonunun sisteme bağlandığından emin olunuz. MULTITASKER Analiz tablasına vialleri yerleştiriniz ve başlat butonuna basınız. Hazırlanmış numune 2-8 C de 24 saat boyunca stabildir. Numune Hazırlığı (Manuel): 100 µl hasta numunesi (veya kalibratör ve kontroller) durhaim cam hazırlık tüpüne alınır. 100 µl Reaktif 1 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir. 200 µl Reaktif 2 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir. 200 µl Reaktif 3 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir.5 dakika süresince beklenip tekrar 10 sn vortekslenir. 200 µl Reaktif 4 eklenir ve 10 saniye boyunca vortekslenir. 22

23 12000 x rpm de 3 dakika boyunca santrifüj edilir. 300 µl üst faz bir viale alınıp 3 L enjeksiyon yapılır Hazırlanmış numune 2-4 C de 24 saat boyunca stabildir. 12. KALİTE KONTROL Test sonuçları ancak verilen test talimatlarına uyulduğu takdirde geçerlidir. Kullanıcılar çalışırken GLP veya diğer kurumlar tarafından belirlenmiş olan kurallara ve standartlara bağlı kalmalıdır. Bütün standart ve kontrol değerleri kalite kontrol sertifikasında belirtilen aralıklarda olmalıdır. Değerler bu aralıkların dışında kaldığı takdirde analiz geçerli değildir ve tekrarlanmalıdır. Her laboratuvar daha ileri aşama kontroller için değeri bilinen numuneleri kullanmalıdır. Bu değerlerden sapma olması halinde reaktiflerin son kullanma tarihi, saklama koşulları, kullanılan pipetlerin doğruluğu, cihazlar, inkübasyon koşulları ve yıkama metotları gibi teknik detayların doğruluğundan emin olunmalıdır. Ayrıca uygun dış kalite kontrol programına üye olunması önerilir. 13. SONUÇLARIN HESAPLANMASI Standardın alanına karşı standart konsantrasyonu grafiği çizilir. Standart eğrisi lineer regresyon veya ağırlıklı lineer regresyon fonksiyonu ile hesaplanır. Regresyon eğrisini hesaplamak için, her bir standarda karşılık gelen sinyal değeri grafiğe alınır. Bilinmeyen konsantrasyonu regresyon eğrisinin fonksiyonundan direk olarak okunabilir. Standart eğrisinin üzerinde kalan konsantrasyon değerleri referans bir metot ile teyit edilmelidir. 23

24 14. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Farklı toplumlarda farklı Cut-Off değerleri belirlenmelidir. Farklı toplumlardaki hasta numuneleri için yapılan çalışmalara bağlı olarak, her laboratuvarın kendi normal değerlerini belirlemesi önemle tavsiye edilir ve bu değerlerin dağılımı o coğrafi bölgedeki sorumlu kurumun önerdiği değerler ile uyumlu olmalıdır. Tanı ve tedavi aşamalarında bu analizlerin sonuçları klinik gözlemler ve tanı testleri ile desteklenmelidir. 15. BEKLENEN DEĞERLER Her laboratuvarın kendi normal değerlerini belirlemesi önemle tavsiye edilir. Cihaz Kolon 16. LC-MS/MS PARAMETRELERİ Zivak Tandem Gold LC-MS/MS Sistemi Zivak-Neurotransmitters Kolonu Enjeksiyon Hacmi 3 µl Gradiyant min 5 % B 07:00 min 100 % B 09:00 min 100 % B 09:01 min 5 % B 13:00 min 5 % B Akış 0,25 ml/min Iyonizasyon Modu: ESI positive CID Gaz 2,4 mtorr API Nebulizing Gaz 55 psi Tarama Süresi 1,3 sec SIM Width 1,5 amu Drying Gaz 35 psi Drying Gaz Sıcaklığı 350 C İğne Voltajı 5000V Shield voltajı 600V Kapiler voltaj 50V Dedektör 1700 V 17. MS SCAN PARAMETRELERİ Capillary CE Analit RT (dk) MH+ (m/z) MS/MS No (ev) (ev) 1 Dopamin 9,4 429,3 412, Epinefrin 9,2 442,2 424,

25 3 Norepinefrin 8,7 410,2 238, Serotonin 8,7 349,0 203, Gama-aminobutirik asit 7,8 232,0 86, Glutamik Asit 8,8 318,0 172, Histamin 7,8 284,0 138, OH-L-Triptofan 6,9 349,0 261, Dopamin-IS 9,4 433,2 416, Epinefrin-IS 9,2 445,2 427, Norepinefrin-IS 8,7 416,2 244, Gama-aminobutirik asit -IS 9,2 304,0 173, Glutamik Asit -IS 8,8 324,0 178, Histamin-IS 8,6 379,0 204, OH-L-Triptofan-IS 8,8 346,0 257, No Analyte IS 1 Dopamin Dopamin-IS 2 Epinefrin Epinefrin-IS 3 Norepinefrin Norepinefrin-IS 4 Serotonin 5-OH-L-Triptofan-IS 5 Gama-aminobutirik asit Glutamik Asit -IS 6 Glutamik Asit Histamin-IS 7 Histamin 5-OH-L-Triptofan-IS 8 5-OH-L-Triptofan Dopamin-IS 18. ANALİTİK PERFORMANS No Analit LOD LOQ (µg/l) (µg/l ) 25 Doğruluk (%) Intra- Assay Precision (%CV) Inter- Assay Precision (%CV) Linearit y (R 2 ) 1 Epinefrin Norepinefrin Dopamin Serotonin Gama-aminobutirik asit Glutamic Asit Histamin OH-L-Tryptofan

26 Analitik Seçicilik (Çapraz reaksiyon): Analitler arasında çapraz reaksiyon veya bir interferans etkisi gözlenmemiştir. 19. ÖRNEK KROMATOGRAM 26

27 27

28 28

29 20. Zivak ASP-200 İÇİN OTOMATİK METOT PARAMETRELERİ 1 - Reagent addition (Parallel) Reagent tray 2 - Reagent addition (Parallel) Reagent tray 3- Reagent addition (Parallel) Reagent tray 4- Reagent addition (Parallel) Reagent tray 3 - Vortex 4 - Injection (Serial) Analysis tray Analysis tray From 1;2;3 (Vial Position) 0 mm (Needle 4;5;6 (Vial Position) 0 mm (Needle 4;5;6 (Vial Position) 0 mm (Needle 4;5;6 (Vial Position) 0 mm (Needle 1 (Vial Position) 1 (Vial Position) 0 mm (Needle 110 µl 220 µl 220 µl 220 µl 3 µl 1.5 mm (Needle To No liquid detection Analysis tray 1 (Vial Position) 16 mm (Needle No liquid detection Analysis tray 1 (Vial Position) 16 mm (Needle No liquid detection Analysis tray 1 (Vial Position) 16 mm (Needle No liquid detection Analysis tray 1 (Vial Position) 16 mm (Needle 100 µl 200 µl 200 µl 200 µl Liquid detection - active Wash station A Wash station A Wash station A Wash station A Wash station A Loop Washing Pump 2 Pump 2 Pump 2 Pump 2 Pump 2 Pump µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 250 µl 5 repeat 2 repeat 2 repeat 2 repeat 1 repeat 1 repeat Pump 2 Pump 2 Pump 2 Pump 2 Pump 1 Syringes ms ms ms ms ms ms ms ms (speed - wait) (speedwait) Air segment Vortex- Centrifuge Parameter s First First First First First 100 µl 200 µl 200 µl 200 µl 3 µl 2 - Reagent addition (Parallel) Reagent tray 4;5;6 (Vial Position) 0 mm (Needle Purge Before Syringe Pump Wash Place Flush Volume Repeat Time Pump 1 (250 ul) Wash station A 250 ul 1 Pump 2 (1000 ul) Wash station B 1000 ul 5 Batch 8 29