25-Hydroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analysis Kit User Manual ZV D. No: ZV-3046-KK-10.R15

Transkript

1 25-Hydroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analysis Kit User Manual ZV D. No: ZV-3046-KK-10.R15

2 Contents 1. INTENDED USE SUMMARY AND EXPLANATION IVD SYMBOLS TEST PRINCIPLE WARNINGS AND PRECAUTIONS STORAGE AND STABILITY MATERIALS SUPPLIED MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED PROCEDURE NOTES PRE-SETUP INSTRUCTIONS LIMITATIONS OF PROCEDURE SAMPLE PRETREATMENT QUALITY CONTROL CALCULATION OF RESULTS INTERPRETATION OF RESULTS EXPECTED VALUES LC-MS/MS PARAMETERS ANALYTICAL PERFORMANCE SAMPLE CHROMATOGRAM D. No: ZV-3046-KK-10.R15 2

3 1. INTENDED USE Quantitative HPLC analysis kit for 25-hydroxy metabolites of Vitamin D2 and D3 in human serum samples. 2. SUMMARY AND EXPLANATION Vitamin D, commonly known as the sunshine vitamin, is essential for maintaining calcium metabolism and bone health. The major physiologic function of Vitamin D is to maintain the blood calcium and phosphorus levels within the normal range in order to maintain metabolic functions that are essential for most life processes, Vitamin D3 and Vitamin D2 are metabolized to 25-OH-Vitamin D3 and 25-OH-Vitamin D2 in the liver by the 25-OHase enzyme. The quantitation of these metabolites is widely used for determining of vitamin D status in human. The Vitamin D status has a clinical significance in a variety of disorders which related to hormones. The measurements of the serum concentration of 25-OH-Vitamin D3 and 25-OH-Vitamin D2 have been used for differential diagnosis of hypocalcemic and hypercalcemic metabolic bone disorders. The analysis of these metabolites is considered to be difficult. Some reasons of the difficulties are given below. - The low concentrations of 25-OH Vitamin D metabolites in serum (level of μg/l). - The low stability in the presence of light and heat. - The presence of other metabolites which have chemical similarity. - The large amount of other related neutral lipids (such as cholesterol) 25-OH Vitamin D2-D3 HPLC Analysis Kit was developed for rapid, automated, sensitive and reliable quantitative detection of the 25-OH Vitamin D2-D3 concentrations in human serum samples and it gives results in 2 minutes. Main methods and procedures that have been selected are based on EN ISO and 98/79/EC. D. No: ZV-3046-KK-10.R15 3

4 3. IVD SYMBOLS Conformite European Manufacturer In vitro diagnostic Lot number Order number Sufficient for <N> Tests Temperature limits 4. TEST PRINCIPLE The 25-hydroxyvitamin D metabolites are extracted from human serum samples using an organic extraction solution after deproteinization step. Separation was made with an isocratic elution on Zivak 25-OH Vitamin D HPLC column and measured by Tandem mass spectrometer system. 5. WARNINGS AND PRECAUTIONS For in-vitro diagnostic use only. For professional use only. Read the instructions carefully, before you start. In case of damage of the kit package, please contact Zivak or your supplier. Do not use expired kits and components. Please check the lot number and expiry date before start. Protective gloves and goggles should be worn. Please take any necessary precautions to prevent infection with blood borne pathogens while working with biological fluids. Appropriate bio-safety precautions and disposal of bio-hazardous wastes should be followed. Please check the labels on reagent bottles. Reagents of this kit contain hazardous material may cause eye and skin irritations. D. No: ZV-3046-KK-10.R15 4

5 6. STORAGE AND STABILITY This analysis kit can be shipped at room temperature. Serum controls, calibrators and reagent 2 must be stored at 2-8 C until reconstitution. After arrival, mobile phases and reagent 1 must be stored at room temperature. After reconstitution serum calibrators and controls must be stored at -20 C. All components are guaranteed until expiry date when stored at recommended temperatures and used as described in these instructions. 7. MATERIALS SUPPLIED Order No Volume Symbol Component ZV R1-10 ZV R2-10 ZV MP-10 ZV MT-10 3 x 45 ml 3 x 45 ml 1 x 0.5 L 1 x 0.5 L R1 R2 MA MB Reagent 1, Contains aqueous buffer Reagent 2, Contains Internal Standard Mobile Phase A, Contains organic solvent SPE Buffer, Contains organic solvent ZV WB-10 2 x 1 L WB Wash Solution ZV-4027-KK-10 1 x 1 pc KK User Guide D. No: ZV-3046-KK-10.R15 5

6 8. MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Materials listed in the table below are required and should be ordered separately. Order No Volume Symbol Component ZV S x 3 ml Calibrator Level 1 Lyophilized, Serum Calibrator Level-1 ZV S x 3 ml Calibrator Level 2 Lyophilized, Serum Calibrator Level-2 ZV S x 3 ml Calibrator Level 3 Lyophilized, Serum Calibrator Level-3 ZV S x 3 ml Calibrator Level 4 Lyophilized, Serum Calibrator Level-4 ZV S x 3 ml Calibrator Level 5 Lyophilized, Serum Calibrator Level-5 ZV S x 3 ml Calibrator Level 6 Lyophilized, Serum Calibrator Level-6 ZV K x 3 ml Control Level 1 Lyophilized, Serum Control Level-1 ZV K2-10 ZV C1-10 ZV-3046-CSPE-10 ZV C x 3 ml 1 x 1 pc 1 x 1 pc 1 x 1 pc Control Level 2 Lyophilized, Serum Control Level-2 25-Hydroxyvitamin D2- D3 Serum LC-MS/MS APCI Analytical Column 25-Hydroxyvitamin D2- D3 Serum LC-MS/MS Trap Column Cartridge 25-Hydroxyvitamin D2- D3 Serum LC-MS/MS Trap Column Holder ZS µl pipette ZS µl pipette tips ZS-2ML x 100 pc 2 ml glass vial ZS x 100 pc 2 ml glass vial caps pre-slit Distilled or deionized water D. No: ZV-3046-KK-10.R15 6

7 9. PROCEDURE NOTES Any inappropriate handling of samples or modification of the test procedure may influence the results. The indicated pipetting volumes, temperatures and pretreatment steps have to be performed strictly according to the instructions. Use calibrated pipettes and devices only. Once the test has been started, all steps should be completed without interruption. Make sure that required reagents, materials and devices are prepared ready at the appropriate time. Leave aside all reagents to reach room temperature (18-25 C) and gently swirl each vial of liquid reagent before use. Mix reagents without foaming. Avoid contamination of reagents, pipettes and tubes. Use new disposable plastic pipette tips for each reagent, standard or specimen. Do not interchange the vial caps. Always keep vials closed when not been used. Do not re-use vials. 10. PRE-SETUP INSTRUCTIONS Instrument Setup Purge HPLC pumps with 5000 µl/min flow rate after connecting mobile phase A and SPE buffer. Purge pumps until there are no air bubbles inside the tubing lines. Connect wash solution into system and purge syringe pumps until there are no air bubbles in tubing lines. Make sure the bottle of mobile phase is closed well, otherwise components of the mobile phase could evaporate; this alters the retention times. Wait for 15 minutes for conditioning after activating method. Valve Connections Injection Valve Switching Valve D. No: ZV-3046-KK-10.R15 7

8 Preparation of Calibrators Add 3 ml of deionized water to each serum calibrator and dissolve. After preparation, they must be aliquoted into 450 µl volumes and stored at - 20 C. Preparation of Controls Add 3 ml of deionized water to each serum control and dissolve. After preparation, they must be aliquoted into 450 µl volumes and stored at - 20 C. 11. LIMITATIONS OF PROCEDURE Specimen collection and storage have a significant effect on the test results. Serum samples from earlier days must be kept frozen before the analysis. 12. SAMPLE PRETREATMENT Sample Pretreatment (Manual) Take 400 µl of patient sample (or calibrators and controls) into the sample preparation tube. Add 450 µl Reagent 1 and vortex for 10 seconds. Add 400 µl Reagent 2 and vortex for 10 seconds. Centrifuge at 5000 rpm x 3 minutes. 0.5 ml Take the upper phase to vial. Inject 50 µl to LC-MS/MS system. Prepared samples are stable for 24 hours at 2-4 C temperature. D. No: ZV-3046-KK-10.R15 8

9 Sample Pretreatment (Automated) If Calibrator/Control will be analyzed, take 400 µl of calibrator/control sample into glass vial and put vials into related tray on instrument. Place serum samples into system tray on Zivak Multitasker Full Automated Sample Preparation and Injection System. Analysis will automatically start after clicking Start button on software. Injections, calculations and reporting done automatically by instrument. Prepared samples are stable for 24 hours at 2-4 C temperature. 13. QUALITY CONTROL The test results are only valid if the test has been performed by following the instructions. Moreover the user must strictly adhere to the rules of GLP (Good Laboratory Practice) or other applicable standards/laws. All standards and kit controls must be found within the acceptable ranges as stated on the QC (Quality Control) Certificate. If the criteria are not met, the run is not valid and should be repeated. Each laboratory should use known samples as further controls. In case of any deviation, the following technical issues should be proven. Expiry dates of (prepared) reagents, storage conditions, pipettes, devices, incubation conditions and washing methods. It is recommended to participate at appropriate quality assessment trials. 14. CALCULATION OF RESULTS Results of Vitamin D2 and D3 will be calculated by the ratio between compound peak area to Internal Standard area. A linear calibration curve will created with these ratios from each calibrator levels. Calculation formula is given below. D3 Area Ratio = D2 Area Ratio = D3 Area IS Area D2 Area IS Area D3 Amount Ratio = D2 Amount Ratio = D3 Amount IS Amount D2 Amount IS Amount Sample signals above the highest control level have to be confirmed by a reference method. D. No: ZV-3046-KK-10.R15 9

10 15. INTERPRETATION OF RESULTS Various societies recommend different Cut-Off values for repetition of the measurement and the application of confirmatory assays. Depending on the application of patient samples from different populations, it is highly recommended that each laboratory establishes its own range of normal values and that this distribution of values is coordinated with the recommendations of the responsible society of this geographic region. The results themselves should not be the only reason for any therapeutic consequences. They have to be correlated to other clinical observations and diagnostic tests. 16. EXPECTED VALUES These reference ranges represent clinical decision values, based on the 2011 Institute of Medicine report, that apply to males and females of all ages, rather than populationbased reference values. Population reference ranges for 25-OH-VitD vary widely depending on ethnic background, age, geographic location of the studied populations, and the sampling season. <10 ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml >80 ng/ml Severe deficiency Mild to moderate deficiency Optimum levels Increased risk of hypercalciur ia Toxicity possible Could be associated with osteomalacia or rickets May be associated with increased risk of osteoporosis or secondary hyperparathyroidism Optimum levels in the healthy population; patients with bone disease may benefit from higher levels within this range Sustained levels >50 ng/ml 25OH-Vitamin D along with prolonged calcium supplementation may lead to hypercalciuria and decreased renal function 80 ng/ml is the lowest reported level associated with toxicity in patients without primary hyperparathyroidism who have normal renal function. Most patients with toxicity have levels >150 ng/ml. Patients with renal failure can have very high 25-OH- Vitamin D levels without any signs of toxicity, as renal conversion to the active hormone 1.25-OH-Vitamin D is impaired or absent It is recommended that each laboratory establishes its own range of normal values. D. No: ZV-3046-KK-10.R15 10

11 17. LC-MS/MS PARAMETERS Instrument Column Injection Volume Ionization Mode CID Gas API Nebulizing Gas Vaporizer Gas Vaporizer Gas Temperature Drying Gas Drying Gas Temperature Spray Chamber Temperature SIM Width Scan Time Zivak Tandemgold LC-MS/MS System Zivak 25-Hidroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analytical Column 50 µl APCI Positive 2.4 mtorr 55 psi 15 psi 350 C 25 psi 300 C 60 C 1.5 amu Corona Current 10 µa Shield Voltage Detector Voltage Pump Program seconds 600 V 1600 V Time Flow Rate (min) (µl/min) %A %B Online SPE Valve Program Time (min) Position Load Inject Load D. No: ZV-3046-KK-10.R15 11

12 MS Scan Parameters No Analyte Retention Time (min) First Mass (m/z) Second Mass (m/z) Capillary (ev) 1 25-OH Vitamin D (+) V 16 V 2 25-OH Vitamin D (+) V 18 V 3 IS 1.06 (+) V 16 V CE Multitasker Method Parameters Parameter Barcode Sample Reagent Reagent Sample Centrifuge Reading Adding Adding (R1) Adding (R2) Injection Process Type Parallel Serial Parallel Parallel Parallel Serial From Tray Sample Sample Analysis LR LR Tray Tray Tray Analysis Tray Vial Needle Height mm Quantity µl 650 µl - 60 µl Use Detection - Active Passive Passive - Active Search Limit Shake Passive - Passive Passive - Passive To Tray - Analysis Analysis Analysis Tray Tray Tray - - Vial Needle Height Amount µl 400 µl - - Washing Wash Place - 1. Wash C 1. Wash B 1. Wash C 1. Wash B 2. Injection 2. Wash C - 2. Wash A 2. Wash A Valve 3. Wash A 3. Wash A Syringe Pump - Reagent Reagent Reagent Reagent - Syringe Syringe Syringe Syringe Volume x Count x x x x x x x x x x 1 Aspirate Port - I6 I6 I6 - I6 Dispense Port - 1. O1 1. O4 1. O4 O1 2. O4-2. O1 2. O1 3. O1 3. O1 Syringe Speeds Syringe Pump - Reagent Reagent Reagent Syringe Syringe Syringe - XCalibur Aspirate Speed / Wait / Port - 18 / 1500 / I1 13 / 3000 / I2 D. No: ZV-3046-KK-10.R / 3000 / I5-16 / 1500

13 Dispense Speed / 14 / 1500 / 14 / 3000 / 14 / 3000 / - Wait / Port O1 O1 O1-18 / 1500 Waste Before Quantity To - - Wash B Wash B - - Air Segment Quantity Selection - At First At First At First - At First and Last Centrifuge Run Time min - Speed RPM - Vortex Active - V. Run Time min - V. Speed RPM - Purge Before Wash Place Syringe P. Volume Repeat Aspirate P. Dispense P. Wash A Reagent Syringe I6 O1 Batch Parameter Value Batch Active Batch Count ANALYTICAL PERFORMANCE No 1 2 No 1 2 Analyte 25-OH Vitamin D3 25-OH Vitamin D2 Analyte 25-OH Vitamin D3 25-OH Vitamin D2 Accuracy (%) Intra-assay Precision (%CV) Inter-assay Precision (%CV) LOD (µg/l) LOQ (µg/l) Linearity (R 2 ) Analytical Specificity (Cross Reactivity): No cross-reactivity was found with the typical substances tested. D. No: ZV-3046-KK-10.R15 13

14 19. SAMPLE CHROMATOGRAM D. No: ZV-3046-KK-10.R15 14

15 25-Hidroksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analiz Kiti Kullanım Kılavuzu ZV C D. No: ZV-3046-KK-10.R14

16 İçindekiler 1. KULLANIM AMACI ÖZET VE AÇIKLAMA IVD SEMBOLLERİ TEST PRENSİBİ UYARILAR VE ÖNLEMLER SAKLAMA VE DAYANIKLILIK KİT İÇERİĞİ KİT İÇERİĞİ DIŞINDA GEREKLİ OLAN MALZEMELER ÇALIŞMA NOTLARI TEST ÖNCESİ HAZIRLIKLAR YÖNTEMDEKİ KISITLAMALAR NUMUNE HAZIRLIĞI KALİTE KONTROL SONUÇLARIN HESAPLANMASI SONUÇLARIN YORUMLANMASI BEKLENEN DEĞERLER LC-MS/MS PARAMETRELERİ ANALİTİK PERFORMANS ÖRNEK KROMATOGRAM D. No: ZV-3046-KK-10.R14 2

17 1. KULLANIM AMACI Serum ve plazma numunelerinde Vitamin D2 ve D3 ün 25-hidroksivitamin metabolitlerinin LC-MS/MS yöntemi ile kantitatif analizi. 2. ÖZET VE AÇIKLAMA Vitamin D, halk arasında güneş ışığı vitamini olarak bilinen, kalsiyum metabolizması ve kemiklerin sağlığı açısından çok önemli olan bir maddedir. Vitamin D nin en önemli fizyolojik fonksiyonu yaşamsal faaliyetler için gerekli olan kalsiyum ve fosforun kandaki seviyesini belirli limitler içinde tutmaktır. Vitamin D2 ve D3 karaciğerde 25- hidroksilaz enzimi tarafından sırasıyla 25-OH Vitamin D2 ve D3 e metabolize edilmektedir. Bu metabolitlerin miktar tayini yaygın olarak insan kanındaki vitamin D miktarını tespit etmek için kullanılmaktadır. Vücuttaki Vitamin D durumu hormonlara bağlı olan birçok hastalık için klinik anlamda önem taşır. 25-OH-Vitamin D3 ve 25-OH-Vitamin D2 serumdaki konsantrasyonlarının miktarı hipokalsemik ve hiperkalsemik gibi metabolik kemik hastalıklarının ayrıcı tanısında kullanılır. Bu metabolitlerin analizi aşağıdaki bazı nedenlerden dolayı oldukça zordur. - Serumdaki düşük 25-OH Vitamin D metabolit konsantrasyonu(μg/l seviyesinde). - Işık ve sıcaklık etkisi altında düşük kararlılık. - Benzer kimyasal özelliklere sahip başka metabolitlerin varlığı. - Kolesterol gibi doğal yağların fazla miktarda bulunması 25-Hidtoksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analiz Kiti ile serumdaki 25-OH Vitamin D2-D3 metabolit konsantrasyonlarının ölçümü hızlı, hassas ve güvenilir bir biçimde 2 dakikada sonuç alacak şekilde yapılabilmektedir. Kullanılan yöntem ve prosedürler EN ISO ve 98/79/EC direktiflerine dayanmaktadır. 3. IVD SEMBOLLERİ D. No: ZV-3046-KK-10.R14 3

18 Conformite European Üretici firma In vitro diagnostic Sipariş kodu Lot numarası <N> Test için yeterli Sıcaklık aralığı 4. TEST PRENSİBİ 25-hidroksivitamin D metabolitleri, deproteinizasyon adımından sonra bir organik ekstraksiyon çözeltisi kullanılarak insan serum örneklerinden ekstrakte edilir. Daha sonra, bu metabolitlerin Zivak 25-OH Vitamin D UHPLC kolonu kullanarak izokratik ayırımı sağlanır ve ölçümü tandem kütle spektrometresi ile yapılır. 5. UYARILAR VE ÖNLEMLER Sadece in-vitro tanı amaçlı kullanım içindir. Yalnızca profesyonel kullanım içindir. Başlamadan önce talimatları dikkatli bir şekilde okuyun. Kit paketinin hasar görmesi durumunda lütfen Zivak veya tedarikçiniz ile temasa geçin. Süresi geçmiş kitleri ve bileşenleri kullanmayın. Başlamadan önce lot numarası ve son kullanma tarihini kontrol edin. Koruyucu eldiven ve gözlük takılmalıdır. Biyolojik sıvılarla çalışırken kan yoluyla bulaşan patojenlerle bulaşmayı önlemek için lütfen gerekli tedbirleri alın. Uygun biyogüvenlik önlemleri alınmalı ve biyolojik tehlikeli atıkların atılması prosedürü takip edilmelidir. Lütfen reaktif şişeleri üzerindeki etiketleri kontrol edin. Bu kitin reaktifleri tehlikeli madde içerdiğinden göz ve cilt tahrişlerine neden olabilir. 6. SAKLAMA VE DAYANIKLILIK Bu analiz kiti oda sıcaklığında saklanabilir. D. No: ZV-3046-KK-10.R14 4

19 Reaktif 2, Serum kalibratör ve kontrolleri 2-8 C de saklanmalıdır. Serum kalibratör ve kontrolleri saf su ile çözüldükten sonra -20 C de saklanmalıdır. Diğer bileşenler oda sıcaklığında saklanmalıdır. Tüm bileşenler, tavsiye edilen sıcaklıklarda depolandığında ve bu talimatlarda açıklandığı gibi kullanıldığı takdirde son kullanma tarihine kadar garanti kapsamındadır. 7. KİT İÇERİĞİ Sipariş Kodu Miktar Sembol Bileşen ZV R x 45 ml R1 Reaktif 1, Sulu tampon içerir ZV R x 45 ml R2 Reaktif 2, İnternal standart içerir ZV MP-10 1 x 0,5 L MA Mobil Faz A, Organik çözücü içerir ZV MT-10 1 x 0,5 L SPE SPE Buffer, Organik çözücü içerir ZV WB-10 2 x 1 L WB Yıkama Solüsyonu ZS-2ML x 100 adet 2 ml cam vial ZS x 100 adet 2 ml kesikli cam vial kapağı ZV-3046-KK-10 1 x 1 adet KK Kullanım Kılavuzu D. No: ZV-3046-KK-10.R14 5

20 8. KİT İÇERİĞİ DIŞINDA GEREKLİ OLAN MALZEMELER Aşağıdaki tabloda yer alan ürünler ayrıca sipariş edilmelidir. Sipariş Kodu Miktar Sembol Bileşen ZV S x 3 ml Calibrator Level 1 İyofilize, Serum Kalibratör Level-1 ZV S x 3 ml Calibrator Level 2 İyofilize, Serum Kalibratör Level-2 ZV S x 3 ml Calibrator Level 3 İyofilize, Serum Kalibratör Level-3 ZV S x 3 ml Calibrator Level 4 İyofilize, Serum Kalibratör Level-4 ZV K x 3 ml Control Level 1 İyofilize, Serum Kontrol Level-1 ZV K2-10 ZV C1-10 ZV-3046-CSPE-10 ZV C x 3 ml 1 x 1 adet 1 x 1 adet 1 x 1 adet Control Level 2 İyofilize, Serum Kontrol Level-2 25-Hidroksivitamin D2- D3 Serum LC-MS/MS APCI Analitik Kolon 25-Hidroksivitamin D2- D3 Serum LC-MS/MS Trap Kolon Kartuşu 25-Hidroksivitamin D2- D3 Serum LC-MS/MS Trap Kolonu Tutucu ZS µl pipet ZS µl pipet ucu Bidistile veya deiyonize su 9. ÇALIŞMA NOTLARI Numunelerin uygunsuz şekilde taşınması veya test prosedürünün değiştirilmesi sonuçları etkileyebilir. Belirtilen pipetleme hacimleri, sıcaklık ve ön işlem basamakları kesinlikle talimatlara uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Kalibre edilmiş pipetleri ve cihazları kullanın. Test başladıktan sonra, tüm basamaklar kesintisiz tamamlanmalıdır. Gerekli reaktiflerin, materyallerin ve cihazların uygun zamanda hazır olduğundan emin olun. D. No: ZV-3046-KK-10.R14 6

21 Oda sıcaklığına (18-25 C) erişmek için tüm reaktifleri bir kenara bırakın ve kullanımdan önce sıvı reaktifin her şişesini hafifçe döndürün. Reaktifleri köpürmeden karıştırın. Reaktiflerin, pipetlerin ve tüplerin kirlenmesini önleyin. Her reaktif, standart veya numune için yeni atılabilir plastik pipet uçları kullanın. Şişe kapaklarını değiştirmeyin. Kullanılmadığı zamanlarda tüpleri daima kapalı tutun. Tüpleri tekrar kullanmayın. 10. TEST ÖNCESİ HAZIRLIKLAR Cihazın Hazırlanması HPLC pompalarına mobil faz ve SPE buffer bağlandıktan sonra 5000 µl/dak akış hızı ile yıkama verilir. Hatlarda hava kabarcığı kalmayana kadar yıkama işlemine devam edilir. Yıkama sıvısı sisteme bağlanır ve şırınga pompalarının hatlarında hava kabarcığı kalmayana kadar yıkama verilir. Mobil faz şişesinin iyi kapalı olduğundan emin olun, aksi takdirde mobil faz bileşenleri buharlaşabilir; Bu, alıkonma sürelerini değiştirir. Metot aktif edildikten sonra sistemin şartlanması için 15 dakika beklenmelidir. Valf Bağlantısı Enjeksiyon Valfi Değiştirme Valfi Kalibratörlerin Hazırlanması Serum kalibratör numuneleri 3 ml distile su eklenip çözülür. Hazırlanan kalibratörler 450 µl lik hacimlere bölünerek -20 C de saklanmalıdır. D. No: ZV-3046-KK-10.R14 7

22 Kontrollerin Hazırlanması Serum kontrol numuneleri 3 ml distile su eklenip çözülür. Hazırlanan kontroller 450 µl lik hacimlere bölünerek -20 C de saklanmalıdır. 11. YÖNTEMDEKİ KISITLAMALAR Numune toplama ve saklama koşulları test sonuçları üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Daha sonraki günlerde çalışılacak serum numuneleri analiz yapılana kadar dondurulmuş olarak saklanmalıdır. 12. NUMUNE HAZIRLIĞI Numune Hazırlığı (El ile) 400 µl kalibratör, kontrol veya hasta numunesi 2 ml lik cam viallere alınır. Üzerine 450 µl Reaktif 1 eklenir ve 10 saniye vortekslenir. Üzerine 400 µl Reaktif 2 eklenir ve 10 saniye vortekslenir rpm x 3 dakika santrifüj edilir. Üst faz 0.5 ml lik plastik viale alınır. LC-MS/MS sistemine 50 µl enjeksiyon verilir. Hazırlanmış numune 2-4 C de 24 saat boyunca stabildir. Numune Hazırlığı (Otomatik) Kalibratör/Kontrol çalışılacak ise, 400 µl kalibratör veya kontrol numunesi 2 ml lik cam viallere alınır ve cihaz üzerindeki ilgili tablaya yerleştirilir. Serum tüpüne alınmış hasta numunesi Zivak Multitasker Tam Otomatik Numune Hazırlama ve Enjeksiyon Sistemi üzerindeki yerine yerleştirilir. D. No: ZV-3046-KK-10.R14 8

23 Yazılım üzerinde Başlat butonuna tıklandığında analizler otomatik olarak başlayacaktır. Enjeksiyonlar, hesaplamalar ve raporlama cihaz tarafından otomatik olarak yapılır. Hazırlanmış numune 2-4 C de 24 saat boyunca stabildir. 13. KALİTE KONTROL Test sonuçları ancak verilen test talimatlarına uyulduğu takdirde geçerlidir. Kullanıcılar çalışırken GLP(Good Laboratory Practice) veya diğer kurumlar tarafından belirlenmiş olan kurallara ve standartlara bağlı kalmalıdır. Bütün standart ve kontrol değerleri kalite kontrol sertifikasında belirtilen aralıklarda olmalıdır. Değerler bu aralıkların dışında kaldığı takdirde analiz geçerli değildir ve tekrarlanmalıdır. Her laboratuvar daha ileri aşama kontroller için değeri bilinen numuneleri kullanmalıdır. Bu değerlerden sapma olması halinde reaktiflerin son kullanma tarihi, saklama koşulları, kullanılan pipetlerin doğruluğu, cihazlar, inkübasyon koşulları ve yıkama metotları gibi teknik detayların doğruluğundan emin olunmalıdır. Ayrıca uygun dış kalite kontrol programına üye olunması önerilir. 14. SONUÇLARIN HESAPLANMASI Elde edilen analitlerin alanlarının iç standart alanına oranı ile Vitamin D2 ve D3 sonuçları hesaplanır. Her bir seviye kalibratörde yapılan bu oranlama üzerinden lineer kalibrasyon eğrisi oluşturularak sonuçlar hesaplanır. Hesaplamalar için kullanılan denklemler aşağıda belirtilmiştir. D3 Alan Oranı = D2 Alan Oranı = D3 Alan IS Alan D2 Alan IS Alan D3 Miktar Oranı = D2 Miktar Oranı = D3 Miktar IS Miktar D2 Miktar IS Miktar En yüksek kontrol seviyesinin üstündeki örnek sinyaller bir referans yöntemi ile teyit edilmelidir. D. No: ZV-3046-KK-10.R14 9

24 15. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Farklı toplumlarda farklı Cut-Off değerleri belirlenmelidir. Farklı toplumlardaki hasta numuneleri için yapılan çalışmalara bağlı olarak, her laboratuvarın kendi normal değerlerini belirlemesi önemle tavsiye edilir ve bu değerlerin dağılımı o coğrafi bölgedeki sorumlu kurumun önerdiği değerler ile uyumlu olmalıdır. Tanı ve tedavi aşamalarında bu analizlerin sonuçları klinik gözlemler ve tanı testleri ile desteklenmelidir. 16. BEKLENEN DEĞERLER Burada belirtilen referans aralıkları, popülasyona dayalı referans değerlerini değil, her yaştan erkek ve kadın için geçerli olan 2011 Institute of Medicine raporuna dayalı klinik karar değerlerini temsil eder. 25-OH-Vitamin D için popülasyon referans aralıkları, etnik köken, yaş, incelenen popülasyonların coğrafi konumu ve örnekleme mevsimine bağlı olarak büyük farklılıklar göstermektedir. <10 ng/ml Çok düşük Osteomalazi veya raşitizm ile ilgili olabilir ng/ml Düşük ng/ml Normal ng/ml >80 ng/ml Artan Hiperkalsüri riski Olası toksisite Osteoporoz veya sekonder hiperparatiroidizm riski ile ilişkili olabilir Sağlıklı popülasyondaki optimum düzeyler; kemik hastalığı olan hastalar bu aralık içinde daha yüksek düzeylerde yararlanabilir 50 ng/ml üzeri 25OH-Vitamin D ve uzun süreli kalsiyum takviyesi ile devam eden seviyeler hiperkalsüriye ve böbrek fonksiyonlarında azalmaya neden olabilir 80 ng/ml, primer hiperparatiroidizm olmayan, normal böbrek fonksiyonlarına sahip hastalarda toksisite ile ilişkili olarak bildirilen en düşük seviyedir. Toksisiteye sahip hastaların çoğunda >150 ng/ml düzeyi gözlenir OH-Vitamin D aktif hormon böbrek dönüşümü bozulmuş veya mevcut olmadığı için, böbrek yetmezliği olan hastalar toksisite belirtileri göstermeden çok yüksek 25-OH-Vitamin D düzeylerine sahip olabilirler. Her laboratuvarın kendi normal değerlerini belirlemesi önemle tavsiye edilir. D. No: ZV-3046-KK-10.R14 10

25 17. LC-MS/MS PARAMETRELERİ Cihaz Zivak Tandemgold LC-MS/MS Sistemi Kolon Zivak 25-Hidroksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analitik Kolonu Enjeksiyon Miktarı 50 µl İyonizasyon Modu APCI Pozitif CID Gaz 2,4 mtorr API Nebulizing Gaz 55 psi Vaporizer Gaz 15 psi Vaporizer Gaz Sıcaklığı 350 C Drying Gaz 25 psi Drying Gaz Sıcaklığı 300 C Spray Chamber Sıcaklığı 60 C SIM Width 1,5 amu Tarama Zamanı 0,600 saniye Corona Akımı 10 µa Shield Voltajı Dedektör Voltajı Pompa Programı 600 V 1600 V Zaman Akış (dak) (µl/dak) %A %B 1 00, , Online SPE Valf Programı Zaman (dak) Pozisyon 1 00,00 Load 2 00,40 Inject 3 01,80 Load D. No: ZV-3046-KK-10.R14 11

26 MS Tarama Parametreleri No 1 2 Analit 25-OH Vitamin D3 25-OH Vitamin D2 Alıkonma Zamanı (dk) Birincil Kütle (m/z) D. No: ZV-3046-KK-10.R14 12 İkincil Kütle (m/z) Capillary (ev) 1,06 (+) 383,3 257,3 80 V 16 V 1,11 (+) 395,3 269,2 80 V 18 V 3 IS 1,06 (+) 389,3 263,3 80 V 16 V Multitasker Metot Parametreleri Parametre Barkod Numune Reaktif Reaktif Numune Santrifüj Okuma Ekleme Ekleme (R1) Ekleme (R2) Enjeksiyonu İşlem Tipi Paralel Seri Paralel Paralel Paralel Seri Nereden Tabla Numune Numune Analiz LR LR Tablası Tablası Tablası Analiz Tablası Tüp İğne Yüksekliği ,3 mm Miktar µl 650 µl - 60 µl Sıvı Bulma - Aktif Pasif Pasif - Aktif Arama Limiti Shake Pasif - Pasif Pasif - Pasif Nereye Tabla - Analiz Analiz Analiz Tablası Tablası Tablası - - Tüp İğne Yüksekliği Miktar µl 400 µl - - Yıkama Yıkama Yeri - 1. Yıkama C 2. Yıkama A 1. Yıkama B 2. Yıkama A 1. Yıkama B 2. Yıkama C 3. Yıkama A - CE 1. Yıkama C 2. Enjeksiyon Valfi 3. Yıkama A Reaktif Şırıngası x x x 1 Şırınga Pompası - Reaktif Reaktif Reaktif Şırıngası Şırıngası Şırıngası - Miktar x Tekrar x x x x x x x 1 - Çekme Portu - I6 I6 I6 - I6 Basma Portu - 1. O1 1. O4 1. O4 O1 2. O4-2. O1 2. O1 3. O1 3. O1 Şırınga Hızları Şırınga Pompası - Reaktif Reaktif Reaktif Enjeksiyon - Şırıngası Şırıngası Şırıngası Şırıngası Çekme Hız / 18 / 1500 / 13 / 3000 / 13 / 3000 / - Bekleme / Port I1 I2 I5-16 / 1500 Basma Hız / 14 / 1500 / 14 / 3000 / 14 / 3000 / - Bekleme / Port O1 O1 O1-18 / 1500 Önce At Miktar Nereye - - Yıkama B Yıkama B - -

27 Hava Kabarcığı Miktar Seçim - Başta Başta Başta - Başta ve Sonda Santrifüj Çalışma Süresi dakika - Hız RPM - Vorteks Aktif - V. Çalışma Süresi dakika - V. Hız RPM - Önce Yıka Yıkama Yeri Yıkama A Şırınga P. Miktar Tekrar Çekme P. Basma P. Reaktif Şırıngası I6 O1 Grup Parametre Değer Grup Aktif Grup Sayısı ANALİTİK PERFORMANS No 1 2 No 1 2 Analit 25-OH Vitamin D3 25-OH Vitamin D2 Analit 25-OH Vitamin D3 25-OH Vitamin D2 Doğruluk (%) Gün içi Tekrarlanabilirlik (%CV) Günler arası Tekrarlanabilirlik (%CV) 94,7 2,16 2,74 96,4 4,60 4,74 LOD (µg/l) LOQ (µg/l) Doğrusallık (R 2 ) 1,48 4,90 0,993 1,06 3,50 0,992 Analitik Seçicilik (Çapraz reaksiyon): Analitler arasında çapraz reaksiyon veya bir interferans etkisi gözlenmemiştir. D. No: ZV-3046-KK-10.R14 13

28 19. ÖRNEK KROMATOGRAM D. No: ZV-3046-KK-10.R14 14