AKUT LÖSEMĐLERDE SOCS-1 GENĐNĐN METĐLASYON ANALĐZĐ

Transkript

1 TÜRKĐYE CUMHURĐYETĐ ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ AKUT LÖSEMĐLERDE SOCS-1 GENĐNĐN METĐLASYON ANALĐZĐ Nuray VAROL TIBBĐ BĐYOLOJĐ ANABĐLĐM DALI YÜKSEK LĐSANS TEZĐ DANIŞMAN Prof. Dr. Asuman SUNGUROĞLU 2007-ANKARA

2 Kabul ve Onay ii

3 ĐÇĐNDEKĐLER Kabul ve Onay...ii Đçindekiler...iii Önsöz...iv Simgeler ve Kısaltmalar... v Şekiller Dizini...vii Çizelgeler Dizini... x 1.GĐRĐŞ DNA Metilasyonu DNA Metiltransferazlar CpG Adacıkları DNA Metilasyonu ve Transkripsiyonel Susturulma DNA Metilasyonunun Kanserle Đlişkisi DNA Metiltransferaz Đnhibitörleri Sitokin Sinyalini Baskılayan Proteinler (SOCS) JAK/STAT Yolağı SOCS1 Proteini Amaç GEREÇ VE YÖNTEM Çalışma Gurubu Periferal Kandan DNA Đzolasyonu DNA nın Kantitasyonu Metilasyon Spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu (MSP) DNA Modifikasyonu Metilasyon Spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu (MSP) Metilasyon Profilinin Belirlenmesi Sonuçların Değerlendirilmesi BULGULAR AML de SOCS-1 Geni Metilasyon Durumu ALL de SOCS-1 Geni Metilasyon Durumu Sağlıklı Bireylerde SOCS-1 Geni Metilasyon Durumu TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERĐLER...44 ÖZET...45 SUMMARY...46 KAYNAKLAR...47 EK...53 ÖZGEÇMĐŞ...55 iii

4 ÖNSÖZ Bu tez çalışamamı hazırlamam esnasında bana verdikleri sonsuz destek, gösterdikleri fedakarlık ve anlayıştan dolayı canım anneme, babama ve kardeşlerime başta olmak üzere her konuda desteğini gördüğüm sayın danışmanım Prof. Dr. Asuman Sunguroğlu na, bugüne kadar bana gerek bilgi gerekse de tecrübesi ile yol gösteren sayın hocam Prof. Dr. Ahmet Kadıkıran a, örnekleri titizlikle ve kısa sürede toplanmasında emeği geçen Doç. Dr. Tülin Şaylı, Uzm. Dr. Zekai Avcı ve Uzm. Dr. Barış Malbora ya, sonuçların değerlendirilmesinde titizlikle ve sabırla emek veren sayın Doç. Dr. Atilla Halil Elhan a, çalışmalarım süresince yardımını ve desteklerini esirgemeyen Dr. Bio. Güvem Gümüş Akay a, Dr. Bio. Aydın Rüstemov a, her konuda bana yardımcı olan sevgili arkadaşlarım Uzm. Bio. Dilara Akçora a, Bio. Aslı Büyükekmekçi ye, tez çalışmam süresince bana yardımcı olan Uzm. Bio. Tülin Özkan a, Uzm. Bio. Aynur Karadağ a, Uzm. Bio. Buket Altınok a, Bio. Sibel Arat a ve diğer çalışma arkadaşlarıma sonsuz teşekkürler ederim. iv

5 SĐMGELER ve KISALTMALAR AML Akut Myeloid Lösemi ALL Akut Lenfoid Lösemi AP-2 Adaptor protein-2 ATP Adenozin trifosfat Bcl-2 B-cell CLL/lymphoma 2 bç Baz Çifti CpG Sitozin-Guanin dinükleotidi -CH 3 Metil grubu camp Siklik Adenozin monofosfat CREB camp response element binding protein CTF CCAAT-box binding transcription factor CIS Cytokine-inducible SH2 protein DNA Deoksiribo Nükleik Asit DNA-MTaz DNA metiltransferaz DNMT1 DNA-cytosine5-methyltransferase 1 DNMT2 DNA-cytosine5-methyltransferase 2 DNMT3A DNA-cytosine5-methyltransferase 3A DNMT3B DNA-cytosine5-methyltransferase 3B DNMT3L DNA-cytosine5-methyltransferase 3-like dh 2 O Distile su ddh 2 O Deiyonize su E3 Elongin 3 EtOH Etanol HDAC Histone deasetilase HTP HpaII Tiny Fragment HMT Histon metiltransferaz ICF Facial anomalies syndrome IFN γ Interferon-gama v

6 IL-6 Interleukin-6 L Litre JAK Janus kinase JAB JAK-binding protein JH 1 JAK homolog 1 KIR Kinase inhibitory region KIT v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog kb Kilobaz 5-MeC 5- Metilsitozin Myc myc myelocytomatosis viral oncogene homolog Myn Murine homologue of Max MDBP Metile DNA ya bağlanma protein MeCP Metile CpG binding protein MBD Metil bağlanma domaini MHL1 mutl homolog 1 6-MP 6-Mercaptopurine MTOC Mikrotübül organizasyon kompleksi MTX Methotrexate MSP Metilasyon Spesifik PCR µl Mikro litre NaOH Sodyum Hidroksit NF- K B Nuclear localization signals OD Optik Dansite PIAS Protein inhibitor of activated STAT RT-PCR Reverse transcriptase PCR RB Retinoblastoma Rpm Revolution per minute SP1 Specificity protein-1 Sin3A SIN3 homolog A SH2 Scr-homology-2 SHP Src homology 2-containing phosphatase SOCS Supressor of cytokine signalling vi

7 STAT Signal transducer and activator of transcription TRD Transkripsiyon baskılama domaini TEL Ets variant gene 6 TE Tris-EDTA vii

8 ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ Şekil 1.1. Sitozin metilasyonu,demetilasyonu, sitozin ve 5-mC in mutagenezi için biyokimyasal yolağın şematik gösterimi...3 Şekil 1.2. Sitozin bazının 5-metilsitozine dönüşüm mekanizması...4 Şekil 1.3. Memeli DNMT üyelerinin genel yapısı...4 Şekil 1.4. (A) De novo DNA metiltransferazlar (B) maintanence DNA metiltransferaz...5 Şekil 1.5. Kanserde metilasyon profili...7 Şekil 1.6. Şekil 1.7. Şekil 1.8. DNA metilasyonu aracılığıyla transkripsiyonel baskılanma mekanizması...10 Onkogenezde, sitozin metilasyonunun neden olduğu mekanizmalar Azasitidin aracılığıyla hipometilasyon ve gen reaktivasyonu...15 Şekil 1.9. SOCS ailesi üyelerinin domain yapıları ve alternatif adları...16 Şekil Negatif feedback loop mekanizması...17 Şekil JAK/STAT yolağı...18 Şekil SOCS-1 geninin DNA yapısı ve sahip olduğu CpG bölgeleri dağılımı Şekil JAK kinazın JH1 domaininin aktivasyonu ve SOCS-1 aracılığıyla inhibisyonu...19 Şekil JAK ın SOCS box aracılı degradasyonu...20 Şekil 2.1. MSP aşamaları Şekil 2.2. Bisülfid modifikasyon aşamaları...25 Şekil 2.3. Şekil 3.1 Kontrol, AML ve ALL hasta DNA larının MSP ile hipermetilasyon sonuçlarının örnek bir jel görüntsü.35 Kontrol, AML, Erişkin AML ve Çocuk AML hasta gruplarının SOCS-1 gen hipermetilasyon durumlarının dağılımı 37 viii

9 Şekil 3.2. Kontrol, ALL, Erişkin ALL ve Çocuk ALL hasta gruplarının SOCS-1 gen hipermetilasyon durumlarının dağılımı.38 Şekil 3.3. Akut lösemili hastalarda SOCS-1 geni metilasyon dağılımları...39 ix

10 ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ Çizelge 1.1. Epigenetik inhibitörler...14 Çizelge 1.2. SOCS moleküllerinin çeşitli proteinlerle interaksiyonları...20 Çizelge 2.1. Metilasyon-spesifik PCR ın avantaj ve dezavantajları...24 Çizelge 2.2. SOCS-1 geninin ekzon2 si için primer dizisi. F:forward, R: reverse...28 Çizelge 2.3. MSP ürünlerinin beklenen büyüklükleri...29 Çizelge 3.1. Yetişkin ve çocuk AML hastalarında SOCS-1 gen metilasyon dağılımı...36 Çizelge 3.2. Çizelge 4.1. Yetişkin ve çocuk ALL hastalarında SOCS-1 gen metilasyon dağılımı...38 SOCS1geninin primer posizyonlarına göre çeşitli tümör tiplerinde metilasyon profili...42 x

11 1.GĐRĐŞ Lösemi, hücre proliferasyonu ve hücre maturasyonu arasındaki dengenin bozulması sonucunda oluşan kan veya hematopoetik hücrelerin malign hastalığıdır. Hematolojik kanserler, kanser nedenli ölümler sıralamasında ikinci sırayı almaktadır. Lösemi, klinik ve patolojik olarak akut ve kronik lösemi olmak üzere ikiye ayrılmaktadır. Akut lösemiler de kendi içerisinde, akut myeloid ve akut lenfoid lösemiler olmak üzere ikiye ayrılır. Akut myeloid lösemi (AML), kanda ve kemik iliğinde olgunlaşmamış myeloblastların kontrolsüz olarak çoğalması ile karakterize olan ve hızlı seyir gösteren malign bir hastalıktır. Hem çocuklarda hem de erişkinlerde hastalarda görülmektedir. Akut lenfoid lösemiler (ALL) ise lenfoblastların maturasyon duraklaması ve kontrolsüz çoğalmasıyla birlikte, fatal seyirli, klonal hemotopoietik dokunun malign hastalığıdır (Klinik hematoloji;1997). Genellikle genetik bir hastalık olarak kabul edilen lösemi gelişiminde epigenetik mekanizmalarında rol oynadığı bilinmektedir (Melki ve Clark, 2002; Takahashi ve ark., 2004). Epigenetik modifikasyonlar, kanseri de içine alan birçok insan hastalıklarında oldukça önemlidir (Esteller, 2007) Epigenetik değişiklikler, DNA sekansında herhangi bir değişiklik olmaksızın söz konusu bir genin ekspresyonundaki bölgesel ve geçici değişiklikler (Melki ve Clark, 2002) olup kromatin yapısının stabilitesi, genom bütünlüğü, doku spesifik gen ifadelerinin düzenlenmesi, embriyonik gelişim, intragenomik parazitlerin baskılanması, genomik imprinting ve X kromozomunun inaktivasyonundan sorumludur (Bird ve Wolffe, 1999; Momparler ve Bovenzi, 2000; Wade, 2001; Takai ve Jones, 2002;Turek-Plewa ve Jagodzınskı, 2005). Epigenetik programlanma memeli gelişimi için oldukça önemlidir ve bunun stabil bir şekilde kalıtılması doku ve hücre tipine göre spesifik fonksiyonlarını sürdürülebilmesi için oldukça önemlidir 1

12 (Melki ve Clark, 2002; Lund ve Lohuizen, 2007). Hayvan gelişiminde üç farklı epigenetik mekanizma söz konusudur; DNA metilasyonu; kromatin yapısını değiştirmek ve transkripsiyon faktörlerinin bağlanmasını engellemek suretiyle transkripsiyonel inaktivasyona neden olan mekanizmadır. Polycomb-trithorax gen regülasyonu; Polycomb grubu represörler ve Trithorax grubu aktivatörler bazı anahtar gelişimsel düzenleyicilerin (örneğin; homeotik genler) doğru bir şekilde ifade edilmesini sağlamaktadırlar. Histon modifikasyonları; spesifik genomik lokalizasyonlarda ekspresyon durumunun sürdürülmesinden sorumlu olan bir epigenetik mekanizmadır. Bu epigenetik mekanizmalar içerisinde en önemlisi DNA metilasyonudur ve bir diğer epigenetik mekanizma olan histon modifikasyonuyla da ilişki içerisindedir. Küçük-ölçekli epigenetik işaretlerin çalışılması kanser biyolojisinin anlaşılmasında oldukça önemlidir. Örneğin tümör baskılayıcı genlerin hipermetilasyonu onların transkripsiyonel baskılanmasıyla ilişkili olup kanser patogenezinin tanımlanmasında anahtar öneme sahiptir. Bununla birlikte halen cevaplanmamış önemli sorular bulunmaktadır. Bunlardan bir tanesi bir kanser tipinde kaç tane genin hipermetile olduğu sorusudur. Bu nedenle son yıllarda epigenom projesi içerisinde DNA hipermetilom (DNA hipermetile dizi) çalışmaları önem kazanmıştır (Esteller, 2007). DNA metilasyonu bir çok bitki ve memeli türlerinde yaygın olarak görülürken Drosophila ve Saccharomyces cerevisia gibi bazı ökaryotlarda görülmemektedir (Bird, 2002; Human Molecular Genetics, 2004). Ayrıca, Ascobolus immersus ve Neurospora crassa da transkripsiyonel uzamayı tamamen durdurmaz sadece zayıflatır (Jones ve Laird, 1999) DNA Metilasyonu DNA metilasyonu hem prokaryotlarda hemde ökaryotlarda adenin ve sitozin bazlarında meydana gelmektedir (Turek-Plewa ve Jagodzınskı, 2005; Klose ve Bird, 2

13 2006). Memeli genomunda metilasyon yalnızca 5 -CpG dinükleotidlerindeki guaninin 5 ucunda lokalize olan sitozin bazında gerçekleşir ve DNA metilasyonu, sitozin halkasının 5. posizyonundaki karbonuna metil (-CH3) grubunun kovalent bağla eklenmesiyle meydana gelir (Baylin ve Herman, 2000; Jones ve Baylin, 2002; Baylin, 2005) (Şekil 1.1.). Đlave olan metil grubu baz çifti oluşumunu etkilemez ancak DNA nın major oluğu içerisinde DNA-protein interaksiyonunu etkilemektedir (Jones ve Lair, 1999; Momparler ve Bovenzi, 2000; Baylin, 2005). Memeli hücrelerinin genomik DNA larının yaklaşık olarak %3 ila % 5 inde sitozin rezidülerinde metilasyon görülmektedir. Sitozin bazında gerçekleşen bu modifikasyon DNA replikasyonundan sonra meydana gelir ve bu olay DNA metiltransferaz enzimi tarafından katalizlenir. DNA metiltransferaz enzimi, genomik DNA daki CpG dinükleotidlerini (CpG adacıkları) substrat olarak kullanır (Lewis ve Bird, 1991; Momparler ve Bovenzi, 2000). Şekil 1.1. Sitozin metilasyonu, demetilasyonu, sitozin ve 5-mC in mutagenezi için biyokimyasal yolağın şematik gösterimi (Singal ve Ginder, 1999). 3

14 Metilasyon miktarı herhangi bir lokusta hücreden hücreye, bir DNA ipliğinden diğerine, bir CpG adacığından diğerine dinamik olarak sürekli değişmektedir (Jones ve Baylin, 2002). Ayrıca metilasyon kromozomların replikasyon zamanını değiştirmektektedir. Đnaktif X kromozomu S fazında geç replike olur. Hücreler 5- azasitidin ile muamele edildiğinde X kromozomunda demetilasyon meydana gelir ve S fazında erken replike olur (Lewis ve Bird,1991) DNA Metiltransferazlar DNA metiltransferaz enzimi, sitozin halkasına metil (-CH3) grubu transfer eden bir enzim olup ökaryotlarda, sitozin 5-metiltransferaz olarak da adlandırılır. Bu enzim, metil vericisi olarak S-adenosil-L-metionin i kullanır (Şekil 1.2.). DNA metiltransferaz (DNA-MTaz) enziminin hedef bölgeleri CpG adacıklarıdır. Đlk olarak insanda karakterize edilen metiltransferaz enzimi DNMT1 (DNA-cytosine5- methyltransferase 1) dir. DNMT1, ilk kez kolon kanserlerinde bildirilmiş olup, artan ekspresyon miktarından dolayı DNA metilasyonu profilini değiştirdiği gösterilmiştir (Singal ve Ginder, 1999; Jones ve Baylin, 2002; Turek-Plewa ve Jagodzinski, 2005). Şekil 1.2. Sitozin bazının 5-metilsitozine dönüşüm mekanizması (Turek-Plewa ve Jagodzinski, 2005). 4

15 Ökaryotlarda DNMT lerin 5 üyesi tanımlanmıştır; DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B ve DNMT3L dir. Memeli DNMT leri en az 2 yapısal bölge içerirler, bunlar; - N-terminal regülatör domain (nükleusda DNMT lerin lokalize olmasından sorumludur) - C-terminal katalitik domain [de novo ve sürdürme (maintenance) metiltransferaz aktivitesi için gereklidir] (Şekil 1.3.). Şekil 1.3. Memeli DNMT üyelerinin genel yapısı.(villa ve ark.2004) Memeli sitozin DNA metiltransferaz enzimi, tercih ettikleri DNA substratlarına göre; - De novo metiltransferazlar ( DNMT 3A ve 3B ) - Sürdürme (maintenance) metiltransferazlar (DNMT1) olmak üzere 2 gruba ayrılır (Şekil 1.4.) (Esteller, 2005; Turek Plewa ve Jagodzınskı, 2005; Klose ve Bird,2006). - Memeli DNA metilasyon paternleri erken gelişim döneminde de novo metiltransferaz DNMT3A ve DNMT3B tarafından tayin edilmektedir ve sürdürme metiltransferaz DNMT1 aracılığıyla somatik hücrelerde kopyalanmaktadır. 5

16 Şekil 1.4. (A) De novo DNA metiltransferazlar (B) maintanence DNA metiltransferaz (Turek-Plewa ve Jagodzınskı, 2005). Sürdürme metilasyon; DNA metilasyon paternlerinin hücre jenerasyonları arasında tekrarlanması işlemi anlamına gelir. Sürdürme metilasyonunda başlıca mekanizmasının parental iplikcik metilasyon paternlerinin semikonservatif kopyalarına bağlı olduğu düşünülmektedir. Bu modele göre; metilasyona neden olan enzim DNMT1, parental iplikçikteki yeni CpG leri metile etmeyi tercih eder ve bu iplikçik bir önceki iplikçiğe uygun olarak metile edilir. Böylece metile ve unmetile CpG paternleri epigenetik bilginin hücre jenerasyonları arasında taşınması için bir yol sağlar. De novo metiltransferazlar DNMT3A ve DNMT3B erken embriyonik hücrelerde yüksek derecede ifade bulmaktadır. DNMT3B özellikle spesifik genom bölgelerinde de novo metilasyon için gereklidir ve bu gende mutasyon varsa X kromozom inaktivasyonunda ve perisentromerik tekrar DNA sekanslarında metilasyon defektleri görülmektedir (Bird, 2002). DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B, HDAC (Histon deasetilaz) lar ile interaksiyona girerek ve ayrıca diğer transkripsiyonel baskılama aktivitesi olan proteinlere bağlanarak direk olarak transkripsiyonun baskılanmasına yol açarlar. 6

17 DNMT1, HDAC2 ile birlikte geç S fazı süresince replikasyon çatalında birlikte lokalize olurlar. Yeni asetile histonlar geldiğinde geç replikasyon süresince bu histonlar deasetile edilir ve transkripsiyonel olarak bu bölgeler baskılanır. DNMT1 ler S fazı süresince DNA replikasyon çatalında lokalize olmalarına karşın DNMT3A ve DNMT3B ise yalnızca geç S fazı süresince ko-lokalize olurlar (Jones ve Baylin, 2002). Kanserli hücrelerdeki, DNMT1 enziminin ekspresyonu ilk zamanlar 100 kat arttığı düşünülse de, daha sonraki kantitatif metodlarda aslında 3.7 kat ila 2.5 kat arttığı gösterilmiştir. Standart kompetitif RT-PCR kullanılarak lösemili hastaların blast hücrelerinde DNMT1 ekspresyonunun ortalama 4.2 kat arttığı gösterilmiştir (Singal ve Ginder, 1999; Baylin ve Herman, 2000; Melki ve Clark, 2002;). Kanserli hücrelerin DNA sında 5-metilsitozin (5-MeC) miktarında azalma görülmektedir. Ancak bazı bölgelerde örneğin, tümör baskılayıcı genlerde DNA hipermetilasyonu saptanmıştır. Buna karşın DNA hipometilasyonu ile de onkogen aktivasyonu gerçekleşmektedir. Bu değişim solid tümörlerde olduğu gibi lösemilerde de görülmektedir (Şekil 1.5.). Akut myeloid lösemi (AML) ve kronik myeloid lösemi (CML) lerde yapılan son zamanlardaki çalışmalarda; AML de DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B metil transferaz enzimlerinin sırasıyla 5.3-, 4.4- ve kat arttığı görülmüş ve KML de ise DNMT1, DNMT2, DNMT3A ve DNMT4B nin önemli ölçüde arttığı görülmüştür (Melki ve Clark, 2002). Bununla birlikte, DNMT1 ve DNMT3B nin her ikisinin de delesyona uğraması sonucunda DNMT aktivitesi hücrede total genomda %95 azalmaktadır (Jones ve Baylin, 2002; Baylin, 2005). 7

18 Şekil 1.5. Kanserde metilasyon profili (Villa ve ark., 2004) DNMT2 ler küçük metiltransferazlar olup sadece C terminal domain içerirler. DNMT2 lerin katalitik domaini de novo ve maintanance metiltransferaz aktivitesi göstermemesine karşın bu enzim; DNA hasarının tanınması, DNA rekombinasyonu ve mutasyon onarımı için gereklidir. Ancak yapılan çalışmalarda DNMT2 nin eksikliğinde embriyonik kök hücrelerde global DNA metilasyonu görülmez. DNMT3L (DNA-cytosine5-methyltransferase 3 like) proteininin metiltransferaz aktivite bölge motifi noksandır, bu yüzden de diğer de novo DNMT ler ile birlikte çalışmak zorundadır. DNMT3L ler HDAC1 (Histone deasetilase 1) ile interaksiyona girerek onları aktive ederler. Buda bize DNMT3L lerin histon deasetilasyonu, kromatin remodeling ve transkripsiyon baskılanması içinde gerekli olduğunu gösterir. DNMT3L, DNMT3A ve DNMT3B nin karboksil terminal kısmına bağlanır 8

19 ve bu enzimlerin aktivite düzeylerini artırır. Yapılan çalışmalarda, DNMT3A/DNMT3L kompleksinin DNA ya bağlanma afinitesi DNMT3A nın yalnız başına bağlanma afinitesinden daha yüksektir. Ayrıca, DNMT3L nin DNMT3A ve DNMT3B nin aktivitesini 1.5 ila 3 kat arttırdığı gösterilmiştir (Turek- Plewa ve Jagodzinski, 2005; Klose ve Bird, 2006) CpG Adacıkları CpG adacıkları ilk olarak, restriksiyon enzimi HpaII için kesimlenme bölgesine sahip kısa genomik DNA bölgeleri olarak tanımlanmış olup, HpaII Tiny Fragment (HTF) adacıkları olarak adlandırılmışlardır. CpG adacıkları 1-2 kb uzunluğunda kısa DNA bölgelerdir ve genomun yaklaşık olarak %2 sini oluşturmaktadırlar. Bu bölgeler %60-70 oranında guanin ve sitozince (GC) zengin dizilere sahiptir (Cross ve Bird, 1995; Jones ve Baylin, 2002; Turek- Plewa ve Jagodzınskı, 2005). Memeli genomunda bulunan CpG dinükleotidleri büyük ölçüde metiledir. Bu kromatinin yeniden düzenlenmesine aracılık etmektedir ve ayrıca tekrar bölgelerinin (Alu sekansları) transkripsiyonunun engellenmesine aracılık eder. CpG adacıkları metilasyondan korunmuş bölgeler olup insan genomunda genlerin yaklaşık olarak %40-50 sinde promotor bölgesinin proksimalinde yer alır. Tam olarak metile CpG adacıkları yalnızca imprintlenmiş otozomal genlerde ve bayanlardaki X kromozomunda görülmektedir (Baylin ve Herman, 2000; Takai ve Jones, 2002; Turek-Plewa ve Jagodzınskı, 2005). CpG adacıkları, house keeping genleri olarak bilinen temel genlerde ve doku spesifik genlerin 5 promotor gölgelerinde ve ayrıca genlerin ekzon larında bulunmaktadırlar. Đnsan genomunda böyle tanımlanmış CpG adacığı bulunmaktadır ve genellikle normal hücrelerde metile olmayan (unmethylated) 9

20 durumdadır (Lewis ve Bird, 1991; Jones ve Laird, 1999; Singal ve Ginder, 1999; Costello ve ark., 2000; Momparler ve Bovenzi, 2000; Nguyen ve ark, 2001; Jones ve Baylin, 2002; Melki ve Clark, 2002; Turek-Plewa ve Jagodzınskı, 2005). Bununla birlikte kanserlerde, promotor bölgelerinin hipermetilasyonu en iyi karakterize edilen epigenetik değişikliktir. Bu hemen hemen bütün tip insan tümörlerinde bulunmaktadır ve ayrıca transkripsiyonel baskılanma ile ilişkilidir (Jones ve Baylin, 2002). Yapılan çalışmalarda, CpG adacıklarında meydana gelen hipermetilasyonu rastgele olmadığı ve tümör tipine göre spesifik olarak meydana geldiği gösterilmiştir (Costello ve ark., 2000; Melki ve Clark, 200; Esteller, 2005). 5-metilsitozinin kendisi mutajeniktir ve spontan olarak hidrolitik deaminasyon sonucu C T transisyonu görülür (Jones ve Baylin, 2002). Bu nedenle bu bölgeler insan DNA sında hot spot (sıcak nokta) bölgeler olarak tanımlanır ve evrim süresince metile CpG bölgeleri elimine olur (Jones ve Laird, 1999; Takai ve Jones, 2002; Turek-Plewa ve Jagodzınskı, 2005) DNA Metilasyonu ve Transkripsiyonel Susturulma DNA metilasyonu, transkripsiyonun negatif regülatörü olarak hareket etmektedir. DNA metilasyonu aracılığıyla transkripsiyon iki tip mekanizma ile baskılanır; Transkipsiyon aktivatör faktörünün bağlanmasına direk müdahale; AP-2, c- myc/myn, camp-bağımlı aktivatör CREB, E2F ve NF-kB gibi bazı transkripsiyon faktörlerinin tanıyıp bağlandığı bölgeler, CpG rezidülerı içermektedir. Bu bölgelerde meydana gelen metilasyon sayesinde transkripsiyon faktörleri bağlanamadığından transkripsiyon inhibe olur. Buna karşın, bazı transkripsiyon faktörleri (örneğin,sp1 ve CTF) bağlanma bölgelerindeki metilasyona duyarlı değildirler ve birçok faktöründe bağlanma bölgesinde CpG dinükleotid rezidüleri bulunmamaktadır. Ancak bu bölgelerde metil-cpg bağlanma proteinin olmaması gerekmektedir (Bird 10

21 ve Wolffe, 1999; Jones ve Laird, 1999; Singal ve Ginder, 1999; Klose ve Bird, 2006). Spesifik transkripsiyonel represyon; Spesifik transkripsiyonel represörün, metillenmiş DNA ya direk bağlanmasıyla meydana gelir. Metile CpG leri tanıyıp proteinler sekans spesifitelerine göre; (i) sekans spesifitesi olan MDBP (metile DNA ya bağlanma protein), (ii) sekans spesifitesi olmayan MeCP (metile CpG bağlanma protein) ler olmak üzere ikiye ayrılır (Lewis ve Bird, 1991). MeCP ler, MeCP1 ve MeCP2 olmak üzere ikiye ayrılır. MeCP1 ve MeCP2 ilk tanımlanan 5 metil-cpg bağlanma aktivitesine sahip proteinlerdir. MeCP1, büyük multi-protein kompleks olarak tanımlanmıştır ve bu kompleksin histon deasetilaz aktivitesi bulunmaktadır. MeCP1 in DNA ya bağlanabilmesi için 12 tane m5cpg dinükleotidine ihtiyacı varken, MeCP2 ise tek bir polipeptid olup, bağlanabilmesi için tek bir tane m5cpg adacık yeterlidir (Momparler and Bovenzi, 2000; Esteller, 2005). MeCP2 nin yapısında MBD (metil bağlanma domaini) ve TRD (transkripsiyon baskılama domaini) olmak üzere 2 domain bulunmaktadır. MBD domaini sayesinde MeCP2 DNA ya bağlanırken TRD domaini sayesinde ko-represör olan Sin3A interaksiyona girer (Razin, 1998). Sin3A da histon deasetilasyonlarla interaksiyona girmek suretiyle bu bölgede toplanmalarını sağlar (Bird ve Wolffe, 1999). Histon deasetilasyonu hem transkripsiyon düzeyinin azalmasıyla hemde sıkı nükleozomal paketlenme ile ilişkilidir (Jones and Laird, 1999; Klose ve Bird, 2006) (Şekil 1.6.). Sekans spesifitesi olan MBDP proteinlerinin varlığı, metile promotorlarının genel özelliğidir. DNMT ler histon deasetilazları ve histon metiltransferazların (HMT) lerin bu bölgeye toplanmasını sağlar. MeCP ve MBDP proteinleri HDAC, ko-represör (Sin3a) ve ATP bağımlı kromatin remodelling proteinler ile oluşturduğu kompleks heterokromatin yapısının stabilizasyonu için gereklidir (Turek-Plewa ve Jagodzınskı;2005). 11

22 Şekil 1.6. DNA metilasyonu aracılığıyla transkripsiyonel baskılanma mekanizması. HDAC; Histon deasetilaz, TF; Transkripsiyon faktörü, CR; Ko-aktivatör, HAT; Histon asetilaz, MBP; Metil sitozin bağlanma proteini, DNMT; DNA metiltransferaz enzimi, CR; Korepresör (Baylin, 2005) DNA Metilasyonunun Kanserle Đlişkisi DNA metilasyonunun onkogenezde rol oynadığı bilinmektedir. DNA metilasyonu profilindeki değişiklikler solid tümörlerde ve ayrıca lösemilerde de görülmektedir. DNA metilasyonunun kanser gelişimindeki rolü birbirini takip eden bir veya daha çok mekanizma ile açıklanmaktadır; 1. Kanser hücrelerindeki C T dönüşümü ; Metile olmamış C nin deaminasyonu sonucu U e dönüşür. Ancak Urasil-DNA glikosilaz enzimi sayesinde G:U eşleşmesi tanınarak ve onarılır. Bununla birlikte, DNA-MTaz enzimi bu onarımı bloklamaktadır. DNA-MTaz enzimi ile CpG adacıklarındaki sitozinlere (C) metil grubu ekler. 5meC in deaminasyonu sonucunda timin (T) bazı oluşur. Ancak bu dönüşüm DNA da tanınarak onarılamaz ve böylece nokta mutasyonları meydana gelir. Bu olaya tümör baskılayıcı gen olan p53 örnek verilebilmektedir. Đnsan solid tümörlerinin %50 sinden fazlasında p53 tümör baskılayıcı geninde mutasyon 12

23 görülmektedir. Ancak,bunların %24 ünde, CpG adacıklarındaki C T dönüşümü görülmektedir. 2. DNA hipometilasyonu; Genomik metilasyon düzeyindeki düşüş bir diğer mekanizmadır. Bu olay sonucunda metilasyon aracılığıyla inaktifleşmiş olan genler, metilasyonun kalkması ile aktif duruma geçerler. Bunlara kronik lenfoid lösemilerdeki bcl-2 onkogeninin reaktivasyonunu örnek verebiliriz. 3. Tümör baskılayıcı genlerin hipermetilasyonu; Hücrenin kontrollü bir şekilde büyümesi için gerekli olan tümör baskılayıcı genlerin ekspresyonlarının azalması kanser oluşumunda oldukça önemlidir. Diğer kanserlerde olduğu gibi lösemilerde de bu genlerin ekspresyonunun azalmasında DNA hipermetilasyonunun rol oynadığını görmekteyiz (Singal ve Ginder, 1999). Tümör baskılayıcı genlerin bialelik inaktivasyonu ya yalnız DNA metilasyonu aracılığıyla ya da mutasyonlar veya delesyonlarla birlikte meydana gelmektedir (Momparler ve Bovenzi, 2000). DNA-MTaz düzeyindeki artış sonucunda, tümör baskılayıcı genlerin promotor sekanslarındaki CpG adacıklarında meydana gelen hipermetilasyon sonucunda gen inaktive olur. Bu durum ilk olarak retinoblastoma (Rb) geninde tanımlanmıştır (Baylin ve Ohm, 2006). 4. Hatalı DNA metilasyonu nedeniyle oluşan bozulmadan dolayı kromozomal instabilite; Kanser gelişimi ve ilerleyişinde kromozomal instabilite oldukça önemlidir. DNA metilasyonu ayrıca DNA nın sıkı bir şekilde paketlenmesinde rol oynamaktadır. Bu sıkı paketlenmeden dolayı örneğin transpozonların genom içerisinde hareket etmeleri engellenmiş olmaktadır. Ancak metilasyon kaybıyla, DNA sıkı bir şekilde paketlenemeyeceğinden transpozonlar genomda rahatlıkla 13

24 harekete ederek kromozomal instabiliteye neden olmaktadır. Ayrıca DNA onarım genlerindeki anomaliler de kromozomal instabiliteye neden olmaktadır (Singal ve Ginder, 1999) (Şekil 1.7.). Tekrar sekanslarında DNA metilasyonu görülmektedir. Bu sayede rekombinasyona benzer olaylara karşı koruma sağlanır ve potansiyel olarak destabilize transposable elementlerini baskılar. Hipometilasyon sonucu genomda mutasyon oranı (delesyon ve kromozomal kopya sayısında artış) artar (Bayani ve ark., 2007). MLH1 (mutl homolog 1) geni, DNA mismatch onarım komponentlerini kodlar ve bu gen sporadik tümörlerde büyük bir sıklıkla hipermetiledir bu da mikrosatellit instabilitesine yol açmaktadır (Baylin ve Herman, 2000; Jones ve Baylin, 2002; Baylin, 2005). Non-promotor DNA bölgelerinin ve sentromerik DNA lar gibi yapısal elementlerin hipometilasyonu genetik insatabilitenin artmasına neden olur. Örneğin; DNMT3B nin germline mutasyonu ICF (immunodeficiency centromeric instability and facial abnormalities) neden olmaktadır. ICF sendromunda sentromer bölgesinde metilasyon kaybı görülmektedir buda kromozomal yapısal değişikliklere yol açmaktadır. Yine, fare embriyonik kök hücrelerde yapılan bir çalışmada DNMT1 de bir defekt varsa gen delesyon düzeyinde artış olduğu gösterilmiştir (Jones ve Baylin, 2002). 14

25 Şekil 1.7. Onkogenezde, sitozin metilasyonunun neden olduğu mekanizmalar (Singal ve Ginder;1999) DNA Metiltransferaz Đnhibitörleri DNA metilasyonu, oldukça kuvvetli bir şekilde genlerin ifade bulmasını bloke etmektedir. DNA metilasyonunun reversible bir olay olmasından dolayı epigenetik olarak baskılanmış olan tümör baskılayıcı genlerinin reaktivasyonu için yeni kanser ilaçları kullanılmaktadır. Günümüze kadar epigenetik inhibisyonu hedefleyen ilaçlarda hedef; 1. DNA metiltransferazlar 2. Histon deasetilazlardır (Çizelge 1.1.) Ancak bu çizelgedeki ilaçların bir çoğu çoklu etkiye sahiptir. DNA metiltransferazlar ve histon deasetilazlar inhibe edilerek potansiyel olarak epigenetik baskılanma bloke edilir. Ancak, DNA metiltransferaz inhibitörleri 15

26 aracılığıyla transkripsiyonel aktivasyon sağlanırken histon deasetilazlar bu işi tek başına yapamazlar. Çünkü HDAC inhibisyonu yalnız başına promotorda histon asetilasyonuna yol açmasına rağmen genin reaktivasyonu promotor demetile olmadıkça gerçekleşmez, yalnızca bu bölgedeki MeCP2 proteininin azalmasına yol açmaktadır. Bu nedenden dolayı kombine edilmeleri susturulmuş genlerin reaktivasyonunda efektif olarak sinerji göstermektedir (Momparler ve Bovenzi, 2000; Jones ve Baylin, 2002; Laird, 2005). Çizelge 1.1. Epigenetik inhibitörler (Laird, 2005 den modifiye edilmiştir) Đnhibitör Adı Açıklama DNA Metiltransferaz Đnhibitörleri 5-Azasitidin Vidaza FDA, MDS için onaylanmış 5-Aza-2 -deoksisitidin Decitabine,dacogen Faz I/II Arabinosil-5-azasitidin Fazarabine Faz I/II 5-6-Dihidro-5-azasitidin DHAC Faz I/II 5-Fluoro-2 -deoksisitidin Gemcitabine Faz I/II MG98 DNMT 1 antisense Faz II RNAi Histon Deasetilaz Đnhibitörleri FK228 Depsipeptit, FR Faz I/II Trichostatin A SAHA Yüksek toksisite RNAi DNA metiltransferaz inhibitörü olarak 5-azasitidin ve 5-aza-2-deoksisitidin kullanılmaktadır. 5-azasitidin, DNMT enzimine bağlanır ve aktivitesini inhibe etmek süretiyle m5cpg dinükleotidlerinin gen ekspresyonu ve hücre farklılaşması üzerindeki dramatik etkisini inhibe ederler (Santi ve ark., 1984). 5-azasitidin C-6 posizyonundan DNMT1 ile kovalent bağ oluşturmak süretiyle metiltransferaz aktivitesini inhibe eder (Lengauer ve ark., 1997; Momparler ve Bovenzi, 2000; Nelson ve ark; 2004; Yang ve ark., 2006) (Şekil 1.8). Ancak bu 5- aza-2-deoksisitidinin kendisi karsinojeniktir, bu hipometilasyon aracılığıyla onkogenlerin aktivasyonuna yol açmaktadır. 5-aza-2-deoksisitidin S-fazı spesifik 16

27 ajanıdır ve in vivo da dozaj bağımlı olarak DNA metiltransferazları inhibe ederler (Lengauer ve ark.,1997; Momparler and Bovenzi, 2000). Şekil 1.8. Azasitidin aracılığıyla hipometilasyon ve gen reaktivasyonu. (Baylin;2005 ) 1.2. Sitokin Sinyalini Baskılayan Proteinler (SOCS) Sitokinler, salgı glikoproteinleri olup çoklu alt birim içeren reseptör kompleksi ile interaksiyona girmek süretiyle hücre yaşamı, proliferasyonu ve farklılaşması gibi çok çeşitli biyolojik olaylarda önemli role sahiptir. Bu mediatörlerin uyarımı sonucunda JAK/STAT yolağı aktif hale geçer ve ilgili hedef genlerin transkripsiyonu gerçekleşir. Son zamanlardaki çalışmalarda bu yolağın negatif feedback inin disregülasyonu hematopoetik hastalıklar, otoimmun hastalıkları ve daha birçok kanserin oluşumuna neden oldukları gözlenmiştir (Starr ve ark., 1997; Larsen ve Röpke, 2002; Okochi ve ark, 2003; Watanabe ve ark.; 2004, Valentino ve Pierre, 2006). JAK/STAT yolağı 3 protein ailesi tarafından negatif olarak regüle edilir; (i) Aktive olmuş STAT ların protein inhibitörleri (PIAS), (ii) SH2 (Scr-homology-2) içeren protein tirozin fosfatazlar (SHP), (iii) Sitokin sinyali baskılayıcı protein ailesi (SOCS). (Okochi ve ark., 2003; Johan ve ark., 2004). SOCS ailesinin sekiz farklı üyesi bulunmaktadır; SOCS1-7 ve CIS (cytokineinducible SH2 protein). Bu proteinlerin amino terminal bölgelerinde düşük benzerlik 17

28 gösteren ve 50 ila 380 amino asit uzunluğunda bölgeler mevcut iken bütün bu sekiz proteinde de ortak olan yaklaşık 95 amino asit uzunluğunda SH2 (src homolog domain) domaini ve SOCS box (karboksil terminal domain) olarak adlandırılan iki motif bulunmaktadır. Ayrıca SOCS-1 ve SOCS-3 proteinlerinde KIR adı verilen kinaz inhibitör bölgesi yer almaktadır (Yoshikawa ve ark., 2001; Oshima ve ark., 2004, Watanabe ve ark., 2004; Melzner ve ark., 2005; Rakesh ve Agrawal, 2005) (Şekil 1.9.). Şekil 1.9. SOCS ailesi üyelerinin domain yapıları ve alternatif adları (Larsen ve Röpke, 2002). SOCS ailesine ait proteinler sahip oldukları SH2 domainleri sayesinde hem JAK lar (SOCS-1) hemde sitokin reseptörleri (SOCS-2, SOCS-3 ve CIS) üzerindeki fosfotirozin rezidülerine bağlanabilmektedirler (Şekil 1.10.). Bunlar sitokin sinyalini ya JAK aktivitesini inhibe etmek suretiyle veya reseptör üzerindeki fosforile olmuş bölge için STAT lar ile rekabet etmek üzere yada E3 ubiquitin ligazın bir parçası olan SOCS box lar aracılığıyla sinyal proteinine bağlanarak onu ubiquitin proteozom yolağına sokarak degradasyonunu sağlamak suretiyle inhibe ederler. Böylece, SOCS box lar SOCS-SH2 interaktif proteinler ile E3 ubiquitin ligaz arasında bir köprü olarak hareket ederler ve protein turnoverını düzenlerler (Yoshikawa ve ark., 2001; Sutherland ve ark., 2004; Valentino ve Pierre, 2006). SOCS proteinleri, hücrede bazal düzeyde bulunmaktadır. Ancak IFNγ veya IL-6 gibi sitokinler aracılığıyla ekspresyonları hızlı bir şekilde artmaktadır. Normalde hücrede çok düşük veya hiç tespit edilemeyen SOCS proteinleri, özellikle IL-6 aracılığıyla 18

29 uyarıldıkları taktirde 20 dakika içerisinde düzeylerinin oldukça arttığı belirlenmiştir. (Larsen ve Röpke, 2002). SOCS geni aynı zamanda, lipopolisakkaritler gibi diğer uyarıcılarla da uyarılmaktadır (Rakesh ve Agrawal, 2005). Şekil Negatif feedback loop mekanizması. Sitokinler aracılığıyla JAK/STAT yolağı aktive olur bu da CIS, SOCS-1, SOCS-2 ve SOCS-3 ün indüklenmesine neden olur. SOCS proteinleri sinyal yolağını inhibe ederler. (A) SOCS-1, JAK a bağlanır ve onun katalitik aktivitesini inhibe eder. (B) SOCS3 aktive olan reseptöre bağlanarak yine JAK ın katalitik aktivitesini inhibe eder. (C) CIS, STAT ın reseptöre bağlanmasını engelleyerek STAT aktivasyonunu engeller. Tam olarak bilinmemekle birlikte SOCS-2 de aynı işlevi görür (Larsen ve Röpke, 2002) JAK/STAT Yolağı JAK/STAT sinyal yolağı, ekstrasellüler sitokin sinyallerinin nükleusa iletilmesinde önemli bir yere sahiptir ve bu hücre büyümesi, farklılaşması ve transformasyonunu içeren hücresel olayları düzenler (Brankensiek ve ark., 2005). Bu yüzden bu yolak, hematopoez, immün düzenlenme ve onkogenezde kritik öneme sahiptir (Rakesh ve Agrawal, 2005). 19

30 Sitokinlerin aynı aileden gelen reseptörlere bağlanması üzerine reseptör dimerizasyonu meydana gelir ve böylece tirozin fosforilasyonu gerçekleşir bu da reseptör ilişkili JAK ların aktivasyonuna neden olur. Bu kinaz bir çok hedef proteini fosforile eder. Fakat başlangıç olarak reseptörün sitoplazmik domainini fosforile eder. Bunun üzerine STAT molekülü üzerindeki SH2 domaini reseptör zincirinin fosfotirozin bölgesi ile interaksiyona girerek STAT moleküllerinin toplanması sağlanmış olur. JAK bu STAT moleküllerini fosforile ederek reseptörden ayrılmalarını sağlar. Bu aktive olmuş STAT molekülleri birbirleriyle homodimer veya heterodimer oluşturarak nükleusa transloke olurlar ve DNA üzerinde spesifik sekanslara bağlanarak hedef genlerin transkripsiyonuna modüle ederler (Chim ve ark., 2004; Watanabe ve ark.,2004; Campbell, 2005;) (Şekil 1.11.). Şekil JAK/STAT yolağı (Ilangumaran ve ark., 2004) SOCS1 Proteini Sitokin sinyalini baskılayan proteinlerden olan (SOCS)-1/SSI-1/JAB sitokin sinyalinin negatif regülatörü olarak fonksiyon görür. Đnsan SOCS1 geni kromozom 16p13.3 de protamine gen kümesinde yer almaktadır. Genomik DNA sı 2 ekzon ve 1 intron içermesine karşılık tek bir ekzondan (ekzon2) 211 amino asitlik bir protein sentezlenir (Yoshikawa ve ark., 2001). SOCS-1 genindeki CpG adacıklarının 20

31 uzunluğu 2.5 kb uzunluğunda olup promotor, ekzon 1 ve ekzon2 de yer almaktadır (Yoshikawa ve ark., 2001; Liu ve ark., 2003; Oshima ve ark., 2004) (Şekil 1.12.). Yapısındaki merkez SH2 (12 a.a uzunluğunda) çoklu tirozin-fosforile sinyal proteinlerine bağlanır ve KIR (pre-sh2) (24 a.a uzunluğunda) domaini sayesinde enzim aktivitesini inhibe ederken SOCS box domaini (12 a.a uzunluğunda) ise elongin BC içeren komplese bağlanarak ubiquitin bağımlı hedef proteinlerin degradasyonunu hızlandırır (Ilangumaran ve ark., 2004; Vuong ve ark., 2004; Watanabe ve ark., 2004). Şekil SOCS-1 geninin DNA yapısı ve sahip olduğu CpG bölgeleri dağılımı (Watanabe ve ark., 2004). SOCS-1 iki bağımsız bölge sayesinde JAK2 aktivasyonunu inhibe eder; (i) JAB; N- terminal kinaz inhibitör bölgesi JH1 in katalitik oluğuna (Şekil 1.13), (ii) SH2 domainide aktivasyon ilmeğindeki fosforile tirozin rezidusu Tyr-1007 e bağlanarak, yalancı Jak substratı olarak fonkiyon görerek Jak ın inaktivasyonuna yol açar (Kamizono ve ark., 2001, Voung ve ark., 2004) ve sonuçta JAK/STAT yolağı downregüle olur. SOCS-1; IL-6, IL-4, lösemi inhitör faktör, onkostatin M, interferon-gama, thrombopoietin ve büyüme hormonu gibi sitokinlere verilen hücresel cevabı baskılar (Yoshikawa ve ark., 2001; Giordanetto ve Kroemer, 2003; Oshima ve ark., 2004; Watanabe ve ark., 2004; Vuong ve ark., 2004). 21

32 Şekil JAK kinazın JH1 domaininin aktivasyonu ve SOCS-1 aracılığıyla inhibisyonu. (A) Đnaktif konformasyon substratın girişini engeller (B) Aktif JAK, katalitik bölgeye substratın bağlanmasına izin verir (C) Aktivasyon ilmeğine SOCS-1 in bağlanması katalitik cebe substratın girişini engeller (Larsen ve Röpke, 2002). SOCS proteini SH2 domaini sayesinde interaksiyona girdiği proteini sahip olduğu SOCS kutusu sayesinde Elongin B ve C kompleksi ile interaksiyona girerek hedef proteinin degradasyonuna neden olur (Şekil 1.14., Çizelge1.2.). SOCS kutusu JAK2 nin degradasyonu için gereklidir, SOCS kutusu aracılı JAK2 nin degradasyonu için JAK2 nin fosforile durumda olması ve SOCS-1 ile kuvvetli bir interaksiyona girmesi gerekir. Ayrıca SOCS-1 in degradasyon hızı JAK2 nin aktivasyonuna bağlıdır (Kamizono ve ark., 2001; Kile ve ark., 2002; Giordanetto ve Kroemer, 2003; Melzner ve ark., 2005; Valentino ve Pierre, 2006) SOCS-1 protein stabilitesi oldukça sıkı kontrol altındadır. SOCS proteinlerinin stabilizasyonu, proteozom inhibitörleri aracılığıyla sağlandığından SOCS-1 düzeyinin proteozom yolağı aracığıyla regüle edildiği düşünülmektedir. Ayrıca son zamanlardaki çalışmalarda, SOCS-1 in mikrotübül organizasyon kompleksi (MTOC) ile kolokalize ve biyokimyasal olarak kopurifiye olduğu bulunmuştır (Voung ve ark., 2004; Valentino ve Pierre, 2006). 22

33 Şekil JAK ın SOCS kutusu aracılı degradasyonu (Kile ve ark., 2002). Çizelge 1.2. SOCS moleküllerinin çeşitli proteinlerle interaksiyonları (Ilangumaran ve ark., 2004) SOCS SOCS molekülünün çeşitli domainlerinin proteinlerle girdiği interaksiyon ailesi N-Terminal SH2 domain Box Tanımlanmamış Üyeleri CIS PKCθ EpoR,GHR,Mpl,IL-2Rβ,IL-3R-βC SOCS-1 Grb2,PI3K,p85, Nck,Fyn,Itk, JAK1,JAK2,JAK3,TYK2,GHR,Kit, Flt3,Fms(M-CSFR),IGF-1R Elongin BC PYK2,IL-2Rβ, TRIM8/GERP,p65/Rel Pim-1,Tec EGFR,Vav,FAK,CD3ζ,,IR,IRS-1,IRS- 2 IRAK1, HPV-E7 SOCS-2 GHR,PLR,IGF-1R SOCS-3 JAK1,epoR,GHR,Leptin R,G-CSFR Elongin BC FGFR,PYK2,Lck,ILgp130 IGF-1R,IR,CD28 P120RasGAP 2Rβ,IL-12Rβ, Calcineurin,CXCR4 SOCS-5 IL-4Rα SOCS-6 IR,IRS-4,PI3Kp85 Kit Elongin BC SOCS-7 Ash,Nck,PLCγ IRS-4,PI3Kp85 SOCS-1 geninin overekspresyonu, KIT reseptörü veya TEL-JAK2 proteininin onkogenik formları sayesinde meydana gelen transforme olan hücrelerin büyümesini baskılamaktadır. Ayrıca SOCS-1 geninin down regülasyonu tümör oluşumuna neden olduğundan dolayı tümör baskılayıcı gen olarak fonksiyon gördüğü düşünülmektedir (Kishimoto ve Kikutani, 2001; Rottapel ve ark., 2002). 23

34 SOCS-1 in inaktivasyonu sonucu JAK/STAT yolağının sürekli aktivasyonuna yol açar. SOCS-1 in geninin CpG adacıklarından hipermetilasyonu; insan hepatoselüler karsinoma, hepatoblastoma, multiple myeloma ve AML de görülmektedir (Oshima ve ark., 2004) Amaç Bugüne kadar DNA hipermetilasyonunun onkogenezdeki rolüne yönelik pek çok çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmalar sonucunda bir çok kanser tipinde tümör baskılayıcı genlerin inaktif hale geçmesine yol açarak onkogenezde rol oynadığı gösterilmiştir. Tümör baskılayıcı genlerindeki CpG adacıklarının hipermetilasyonu, transkripsiyonel susturulma ile ilişkilidir ve bu olay kanser gelişimi ve progresyonunda önemli rol oynamaktadır. Tümörlerde metilasyon olayının iyi anlaşılması erken teşhis, prognozun takibinde ve tedavide önemlidir. (Brakensiek, 2005). Yine bu çalışmalarda, CpG adacıklarında meydana gelen hipermetilasyonun rastgele olmadığı ve tümör tipine göre spesifik olarak meydana geldiği gösterilmiştir. Bu çalışmada, lökomogenezde önemli rol oynadığı düşünülen JAK/STAT yolağının negatif regülatörü olan SOCS1 (suppressor of cytokine signalling-1) geninin akut lösemi tiplerinde (ALL, AML) DNA metilasyon profillerinin çıkarılması amaçlanmıştır. Çalışmadan elde edilecek olan verilerin, akut löseminin patogenezi ve tedavisini yönlendirilmesi açısından önemli olduğu düşünülmektedir. 24

35 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Çalışma Gurubu Bu çalışmaya, akut lösemili hastalarda SOCS-1 geninin DNA hipermetilasyonunun tespit etmek üzere, Dışkapı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Pediatrik Hematoloji Ünitesi ve Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Hematoloji B.D dan akut lösemi tanısı almış 50 olgu ve 25 sağlıklı birey, aydınlatılmış onamları alındıktan sonra dahil edilmiştir (Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurul Karar No: ). Onam formu örneği EK te sunulmuştur. Bu amaçla, sağlıklı ve hasta bireylerden 2 ml periferal kan ve kemik iliği örnekleri alındıktan sonra DNA izolasyonu gerçekleştirilinceye kadar + 4 0C de saklanmıştır. SOCS-1 geninin metilasyon profillerinin tespiti için DNA izolasyonunu takiben DNA modifikasyonu ve MS-PCR gerçekleştirilmiştir. 2.2 Periferal Kandan DNA Đzolasyonu Periferal kandan DNA izolasyonu, QIAamp DNA Kiti (Qiagen, 51306) kullanılarak aşağıda tanımlanan yöntemle gerçekleştirilmiştir. 1.5 ml lik ependorfa sırasıyla 20 µl proteinaz K, 200 µl kan (örnek 200 µl den az ise PBS ile 200 µl ye tamamlanır) ve 200 µl buffer AL konuldu ve kuvvetlice karıştırıldı, 56 0 C lik su banyosunda 10 dakika beklendi, Kısa bir santrifüj edildikten sonra %96 lık EtOH den 200 µl ilave edildi ve kuvvetlice karıştırıldı, Kısa bir santrifüj yapıldıktan sonra örnekler 2 ml lik spin kolona aktarıldı, 25

36 6000 xg de 1 dakika santrifüj edildi ve spin kolon temiz tüpe aktarıldı, Üzerine 500 µl buffer AW I konuldu, 6000 xg de1 dakika santrifüj edildi ve spin kolon temiz tüpe aktarıldı Üzerine 500 µl buffer AW II konuldu, xg de 3 dakika santrifüj edildi, Kolon 1.5 ml lik ependorfa yerleştirildi ve üzerine 200µl buffer AE konuldu ve oda sıcaklığında 1 dakika bekletildi, 6000 xg de 1 dakika santrifüj edildi ve spin kolon atıldı, Örnekler -20 ye kaldırıldı DNA nın Kantitasyonu Đzole edilen DNA ların saflık derecesi ve konsantrasyonu aşağıda belirtildiği gibi spektrofotometrik olarak tayin edilmiştir. Elde edilen DNA örneğinden 20 µl alınıp quartz tüp içinde dh 2 O ile hacmi 500 µl ye tamamlandı ve iyice karıştırıldı, Spektrofotometrede OD 260 ve OD 280 değerleri ölçüldü, 260 ve 280 nm deki optik dansite değerlerinin oranı hesaplanarak DNA nın saflığı belirlendi (OD 260 /OD 280 hesaplanarak). Aşağıdaki formül kullanılarak elde edilen DNA nın konsantrasyonu belirlendi. Konsantrasyon (µg/µl) = OD 260 x 0.05 x 100 (sulandırma katsayısı) 2.4. Metilasyon Spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu (MSP) MSP (Metilasyon Spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu), Herman ve Baylin tarafından geliştirilmiş olup, CpG adacıklarındaki metilasyon durumun tespiti için 26

37 hızlı ve hassas bir yöntemdir (%0.1) (Herman ve ark., 1996; Momparler ve Bovenzi, 2000) (Çizelge 2.1.). Çizelge 2.1. Metilasyon-spesifik PCR ın avantaj ve dezavantajları. Avantajları Dezavantajları Metilasyon tespiti için hızlı bir teknik Oldukça hassas bir yöntem Kantitatif değildir PCR problemleri MSP 3 basamakta gerçekleştirilir; (Şekil 2.1.) Metilasyon Spesifik PCR Nasıl Çalışır? 1.Bisülfit Muamelesi (Đlgilenilen sekans 5.GCGATACTCGCATCG..) Durum 1: DNA unmetiledir 5...GCGATACTCGCATCG... Bisülfit Muamelesi 5...GUGATAUTUGUATUG... Durum 2: DNA metiledir 5...GC m GATACTC m GCATC m G... Bisülfit Muamelesi 5...GC m GATAUTC m GUATC m G Metilasyon spesifik primer setleri ile PCR Tüp 1 Bisülfit ile muamele edilmiş DNA + U primer (unmetile DNA sekansına bağlanacak) Tüp 2 Bisülfit ile muamele edilmiş DNA + M primer (metile DNA sekansına bağlanacak) 3. Jel Analizi (Etidyum bromür ile boyanmış agaroz jel) Durum 1: DNA unmetiledir kuyucuk PCR ürünü Primer U Durum 2: DNA metiledir. kuyucuk PCR Ürünü Primer U Primer M Primer M Şekil 2.1. MSP aşamaları. (Epigenetics, 2006) 1. Bisülfid DNA modifikasyonu; Sodyum bisüfit ile sitozin bazı reaksiyona girdiği zaman seçici olarak urasile dönüşürler. Bu reaksiyon 3 temel adımda meydana gelir; (Şekil 2.3.) 27

38 i. Sülfonasyon; Düşük sıcaklık ve düşük sıcaklıkta, reversible olarak sitozin bazının sülfonasyonu sonucu sitozin-6-sülfat oluşur ii. Deaminasyon; Yüksek sıcaklık ve ph 5.0 da sitozin-6-sülfat ın irreversible olarak hidrolitik deaminasyonu gerçekleşir. iii. Desülfonasyon; Bu basamakta urasil-6-sülfat ın reversible desülfonasyonu sonucu urasil bazı oluşur. Şekil 2.2. Bisülfid modifikasyon aşamaları (I) sitozinin C6 pozisyondan sülfanasyonu (II) hidrolitik deaminasyon sonucu 6-sülfat-urasil (III) alkali şartlar altında desülfanasyon sonucu urasil bazının oluşumu. Sitozin bazının sodyum bisülfid ile etkin bir şekilde modife edilebil mesi için DNA önce denatüre edilir (DNA Methylation Protocols; 2002 ). 2. PCR; Đkinci aşama olan PCR da ise ilgilenilen bölgeye uygun spesifik metile ve unmetile primerler seçilerek polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirilir 3. Jelde görüntüleme; PCR sonuçları agaroz jelde değerlendirilir (Understanding DNA Methylation and Epigenetic Gene Silensing in Cancer 2004; Momparler ve Bovenzi, 2000) (Şekil 2.3.) DNA Modifikasyonu Periferal kandan izole edilen DNA ların modifikasyonu CpGenome TM DNA Modifikasyon Kiti (S7820) kullanılarak üretici firmanın önerdiği yöntemle modifiye edilerek gerçekleştirilmiştir. 28

39 1. Adım; Solüsyonların Hazırlanması 3M NaOH stok (taze hazırlanır) 1 g NaOH, 8.3 ml steril dh 2 O da çözünür. 20 mm NaOH/%90 EtOH (taze hazırlanır) 940 µl EtOH (%96) 53.4 µl steril dh 2 O 6.6 µl 3 M NaOH Ajan I (taze hazırlanır ve ışıktan korunmalıdır) Kullanmadan önce ajan I in oda sıcaklığına gelmesi beklendi. Her bir örnek için; 0,227 g DNA modifikasyon ajan I 0,571 ml steril dh 2 O içerisinde çözünür,ph 5 olmalıdır. Ajan II (ışıktan korunmalı) Kullanmadan önce toz halindeki ajan II nin oda sıcaklığına gelmesi beklendi. 20 ml ddh 2 O içerisine1µl β-merkaptoetanol (Amresco, 0534B17) ilave edildi. Her bir örnek için; 1,35 g DNA modifikasyon reagent II 750 µl β-merkaptoetanol/ ddh 2 O içerisinde çözündü. 2. Adım; DNA modifikasyon Prosedürü 2 µg DNA (100 µl steril dh 2 O içerisinde 20 ng/ µl) ya 7,0 µl 3 M NaOH eklendi. DNA lar 50 0 C deki su banyısunda (Memmert) 10 dakika inkübe edildi, 29

40 550 µl reagent I ilave edildi ve karıştırıldı, Örnekler 50 0 C de yaklaşık 16 saat inkübe edildi. 3. Adım; Birinci Tuzdan Uzaklaştırma DNA modifikasyon ajan III vortekslenerek iyice karıştırıldı. Oda sıcaklığına gelen örneklere 5 µl reagent III ilave edildi, 750 µl DNA modifikasyonu ajan II ilave edildi ve yavaşça karıştırıldı, oda sıcaklığında örnekler 20 dakika inkübe edildi, Örnekler 5000 xg de 15 saniye santrifüj edildi ve süpernatant atıldı, 1 ml soğuk EtOH ilave edildi ve 5000 xg de 15 saniye santrifüj edildi ve süpernatant atıldı (bu işlem 3 kez tekrarlanır), Son yıkamadan sonra xg de 2 dakika santrifüj edildi ve süpernatant atıldı. 4. Adım; DNA modifikasyonunun Tamamlanması (Desülfonasyon), Đkinci Tuzdan uzaklaştırma Örneklerin üzerine 20 mm NaOH/ %90 EtOH solüsyondan 50 µl konuldu ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edildi, 5000 xg de 15 saniye santrifüj edildi, üzerine 1mL soğuk %96 lık EtOH ilave edildi, 5000 xg de 15 saniye santrifüj edildi ve süpernatant atıldı (bu işlem 2 kez tekrarlanır), 2. yıkamadan sonra xg de 3 dakika santrifüj edildi ve süpernatant atıldı, Örnekler oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı, Pelet üzerine 30 µl TE buffer (10 mm Tris-HCl, 0.1 mm EDTA, ph 5) ilave edildi ve 55 0 C de 15 dakika inkübe edildi, xg de 3 dakika santrifüj edildi ve süpernatant yeni bir tüpe aktarıldı, 30

41 Örnekler -20 de saklandı Metilasyon Spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu (MSP) Bu çalışma kapsamında öngörülen SOCS-1 geninin metilasyon profilinin MSP yöntemi ile tespit edilmesi için kullanılan primer dizileri Çizelge 2.2. de verilmektedir (Yoshikawa ve ark., 2001) Çizelge 2.2. SOCS-1 geninin ekzon2 si için primer dizisi. F:forward, R: reverse. SOCS-1 Geni Ekzon-2 için Primer Dizisi (5 3 ) Metile F TTC GCG TGT ATT TTT AGG TCG GTC R CGA CAC AAC TCC TAC AAC GAC CG Unmetile F TTA TGA GTA TTT GTT GTA TTT TTA GGT TGG TT R CAC TAA CAA CAC AAC TCC TAC AAC AAC CA SOCS-1 geninin metilasyon profilinin tespiti Herman ve Baylin (1996) nin yöntemi modifiye edilerek kullanılmıştır. Bu amaçla içerisinde 0.5 U Hot-Start Taq Polimeraz (Fermentas, #EP0602), 1xPCR hot-start buffer (Fermentas, #EP0602), herbir dntp den 200 µmol/l (Fermentas, #R0181), 2 mm MgCl 2 (Fermentas, #Epo602), herbir primerden 2.5 mm ve 3µl bisülfid DNA içeren toplam 25 µl reaksiyon karışımında Thermocycler da (Biometra T1 Thermocycler TM, T1 96) MSP gerçekleştirilmiştir. Uygulanan PCR protokolü aşağıdaki gibidir. 95ºC - 5 dakika 95ºC - 45 saniye 63 ºC - 45 saniye 72ºC - 30 saniye 72 0 C - 5 dakika 40 döngü 31

42 2.5. Metilasyon Profilinin Belirlenmesi Elde edilen MSP ürünleri U ve M kontrol eşliğinde, %2 lik agaroz jelde 130 V da 15 dakika yürütülmüş (Biometra-Agagek Mini, ) ve UV translüminatör üzerinde sonuçların değerlendirilmesiyle yapılmıştır. Çizelge 2.3. de metile ve unmetile DNA ların beklenen bç büyüklükleri verilmiştir. %2 lik agaroz jel, 1xTBE (0.089 M Trizma base (Sigma, T8524), M Borik Asit (Ampresco, 2937B005), M EDTA (Sigma, E5134) içinde 0.1 µg/µl Etidyum bromid (Applichem, 5C000913) içerecek şekilde hazırlanmıştır. Şekil 2.4 de Kontrol, AML ve ALL hasta DNA larının MSP ile hipermetilasyon sonuçlarının görüldüğü örnek bir jel görüntüsü verilmiştir. Çizelge 2.3. MSP ürünlerinin beklenen büyüklükleri U primer / DNA M primer / DNA SOCS bç 160 bç Şekil 2.4. Kontrol, AML ve ALL hasta DNA larının MSP ile hipermetilasyon sonuçlarının örnek bir Jel Görüntsü. Unmetile birey Heterezigot birey U kontrol M kontrol Metile birey U M U M U M U M Primer dimerler 32

43 2.6. Sonuçların Değerlendirilmesi SOCS-1 geni metilasyonu saptanan ve saptanmayan AML ve ALL li hastalar ile yaşları arasındaki ilişkinin istatistiksel değerlendirilmesi ki-kare testinin alt formu olan Fisher exact testi kullanılmıştır. SOCS-1 geni metilasyonunun AML, ALL, yaş ve cinsiyetle ilişkisini belirlemek amacıyla çoklu lojistik regresyon analizi kullanılmıştır. 33