TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ANJİYOTENSİN DÖNÜŞTÜRÜCÜ ENZİM İNHİBİTÖRÜ VE KALSİYUM KANAL BLOKÖRÜ KOMBİNASYONU İLAÇLARIN YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİ YÖNTEMİ İLE AYNI ANDA ANALİZİ Mehmet GÜMÜŞTAŞ ANALİTİK KİMYA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Sibel A. ÖZKAN ANKARA

2 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ANJİYOTENSİN DÖNÜŞTÜRÜCÜ ENZİM İNHİBİTÖRÜ VE KALSİYUM KANAL BLOKÖRÜ KOMBİNASYONU İLAÇLARIN YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİ YÖNTEMİ İLE AYNI ANDA ANALİZİ Mehmet GÜMÜŞTAŞ ANALİTİK KİMYA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Sibel A. ÖZKAN 2009 ANKARA

3 iii İÇİNDEKİLER SAYFA Kabul ve Onay İçindekiler Ön söz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler ii iii ix x xi xvi 1. GİRİŞ İlaç Dışı Tedavi İlaç Tedavisi Diüretikler Adrenerjik Reseptör Blokerleri Alfa Blokerler Kalsiyum Kanal Blokerleri ADE İnhibitörleri Anjiyotensin II Reseptör Blokerleri Kombinasyon Tedavileri Kombinasyon Tedavisinin Dayandığı Başlıca Prensipler Kuramsal Temeller Çalışmalarda Kullanılan Maddelerin Kimyasal, Fiziksel, Farmakolojik, Farmakokinetik Özellikleri Trandolapril Verapamil HCl 17

4 iv Lerkanidipin HCl Enalapril Maleat Çalışmanın Amacı Kullanılan Etken Maddeler Üzerine Yapılmış Çalışmalar Trandolapril Üzerine Yapılan Çalışmalar Verapamil Üzerine Yapılan Çalışmalar Enalapril Üzerine Yapılan Çalışmalar Lerkanidipin Üzerine Yapılan Çalışmalar Verapamil ve Trandolapril İkili Karışımı İçin Yapılan Analizler Kromatografi Adsorpsiyon Kromatografisi İyon Çifti Kromatografisi İyon Değiştirme Kromatografisi Eleme Kromatografisi Dağılma Kromatografisi Ters-faz Sıvı Kromatografisi Normal-faz Sıvı Kromatografisi Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi Sıvı Kromatografi Cihazları Hareketli Faz Hazneleri ve Çözücü Sistemleri Pompa Pistonlu Pompalar Şırınga Pompalar Pnömatik Pompalar Enjektör Manüel Enjeksiyon Valfleri Otomatik Enjektör Kolon 58

5 v Dedektörler Ultraviyole-Görünür Bölge Dedektörü Foto Diyot Dizi Dedektör (FDD) Floresans dedektör Elektrokimyasal dedektör Kaydedici Kromatografide Temel Parametreler Alıkonma Zamanı ve Kapasite Faktörü Seçicilik, α Teorik Tabaka Sayısı (N) Ayırma Gücü, R s Ters Faz Sıvı Kromatografide ph ve Seçicilik İyonlaşma ve ph Hareketli Faz ve ph Sıvı Kromatografide Hareketli Faz Optimizasyonu Hareketli Fazda ph Standardizasyonu Analitik Yöntemin Validasyonu (Yöntem Geçerlik Testleri) Validasyonun Genel İşlemleri Tipik Validasyon Karakteristikleri Doğruluk (Geri Kazanım) Referans Standart ile Karşılaştırmak Kör Matriks Ortamına Analizi Yapılan Maddeyi İlave Etmek Standart Ekleme Yöntemi İle Saf Madde İlavesi Kesinlik Tekrarlanabilirlik Orta-Kesinlik Tekrar Elde Edilebilirlik Seçicilik Teşhis Sınırı, Gözlenebilirlik Sınırı (TS, LOD) Tayin Alt Sınırı (TAS, LOQ) 88

6 vi Doğrusallık Kalibrasyon Doğrusu (Grafiği) Çalışma Aralığı Kararlılık Tutarlılık Sıvı Kromatografik Yöntemle pka Tayini Kromatografide pka Tayininde Kullanılan Horvath Melander Molnar Bağıntıları GEREÇ ve YÖNTEM Genel Bilgi Kullanılan Cihazlar Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi Cihazı Diğer Cihazlar Kullanılan Kimyasal Maddeler Çalışma Yapılan Farmasötik Preparatlar Kullanılan Çözeltiler Kromatografik Çalışmalar Çalışılan Bileşiklerin YPSK Ayırımında Kullanılan Çözeltileri Yöntem Deneyin Yapılışı YPSK Yönteminin Optimizasyonu BULGULAR Standart Maddelerin Saflık Kontrolleri Çalışılan Bileşiklerin ACD-Lab ve SPARC Programı ile Hesaplanan İyonlaşma Sabitleri Verapamil için İyonlaşma Sabiti 106

7 vii Trandolapril için İyonlaşma Sabiti Enalapril için İyonlaşma Sabiti Lerkanidipinin için İyonlaşma Sabiti Ramipril için İyonlaşma Sabiti YPSK Yöntemiyle İyonlaşma Sabitlerinin Tayini Çalışılan Bileşiklerin % 50 (h/h) MeOH - Su İkili Karışımında YPSK Yöntemi ile Tayini Çalışılan Bileşiklerin % 55 (h/h) MeOH - Su İkili Karışımında YPSK Yöntemi ile Tayini Çalışılan Bileşiklerin % 60 (h/h) MeOH - Su İkili Karışımında YPSK Yöntemi ile Tayini Çalışılan Bileşiklerin % 65 (h/h) MeOH - Su İkili Karışımında YPSK Yöntemi ile Tayini Enalapril-Lerkanidipin ve Trandolapril-Verapamil Karışımları için Geliştirilen YPSK-DAD Yöntemine Ait Analiz Bulguları YPSK Sisteminin Optimizasyonu Sabit Faz Seçimi Hareketli Fazın Belirlenmesi Hareketli Fazın Organik Çözücü Yüzdesinin Belirlenmesi Hareketli Faz ph sı, Akış Hızı ve Kolon Sıcaklığının Belirlenmesi İç Standardın Belirlenmesi Sistem Uygunluk Testi Sonuçları Trandolapril ve Verapamilin YPSK-DAD Yöntemi ile Analizinde Validasyon Parametreleri Kalibrasyon Doğrusu Duyarlılık ve Doğrusallık Trandolapril ve Verapamilin Sentetik Karışımda Tayini Tablet ve Geri Kazanım Çalışmaları 137

8 viii Doğruluk ve Kesinlik Cihaz Tekrarlanabilirliği Enalapril ve Lerkanidipinin YPSK-DAD Yöntemi ile Analizinde Validasyon Parametreleri Kalibrasyon Doğrusu Duyarlılık ve Doğrusallık Trandolapril ve Verapamilin Sentetik Karışımda Tayini Tablet ve Geri Kazanım Çalışmaları Doğruluk ve Kesinlik Cihaz Tekrarlanabilirliği TARTIŞMA Çalışılan Bileşiklerin pk Değerlerinin Kromatografik Yöntemle Tayini Çalışılan Bileşiklerin Sıvı Kromatografik Yöntemle Ayrılması SONUÇ ve ÖNERİLER 158 ÖZET 160 SUMMARY 161 KAYNAKLAR 162 ÖZGEÇMİŞ 168

9 ix ÖN SÖZ Hipertansiyon tedavisinde kullanılan lerkanidipin ve verapamil kalsiyum kanal blokörü, enalapril ve trandolapril ise anjiyotensin dönüģtürücü enzim inhibitörü ilaç grubundadır. Bu ilaçlardan oluģturulmuģ kombinasyonların kullanımıyla daha etkin bir tedavi sağlanmaktadır. Tez kapsamında trandolapril-verapamil ve enalaprillerkanidipin ilaç karıģımlarının iyonlaģma sabitleri tespit edilmiģ ve bu ikili karıģımların aynı anda analizi için en uygun kolon ve kolon sıcaklığı seçilmiģ, hareketli faz bileģimi, ph sı, akıģ hızının etkisi incelenmiģ ve yeni, basit, hızlı, duyarlı, seçici bir analiz yöntemi geliģtirilmeye çalıģılmıģtır. GeliĢtirilen yöntemin bu maddelerin dozaj formlarından aynı anda analizine uygulanabilirliği araģtırılmıģtır. Öncelikle, danıģmanlığımı yürüten çok değerli hocam, Prof.Dr.Sibel A. Özkan a ufkumu geniģletip, iyi bir akademisyen olma yolunda ilerlemem için yüksek lisans eğitimim boyunca bana göstermiģ olduğu güveninden, yakın ilgi ve alakasından ötürü, tezimin her aģamasında yararlandığım tecrübesinden ve çalıģmalarımın bilimsellik dahilinde yürümesi için, faydalandığım engin bilgisinden dolayı teģekkür ederim. EĢ danıģmanlığımı üstlenen, bana akademisyenliği tanıtan, hiçbir zaman desteğini benden esirgemeyen Yrd.Doç.Dr. Nurullah ġanli ve değerli eģi Öğr.Gör.Dr. Senem ġanlı ya sağladığı imkan ve yardımlarından ötürü teģekkürlerimi sunarım. Yüksek lisans eğitimim ve yüksek lisans tezim boyunca baģta saygı değer hocalarıma olmak üzere Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya A.B.D. nin tüm personeline ve eğitimimi sürdürmem için sağlamıģ olduğu imkanlardan ötürü Hitit Üniversitesi Rektörü ve Fen-Edebiyat Fakültesi Dekanı sayın Prof.Dr. Serdar KILIÇKAPLAN ve Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölüm BaĢkanı sayın Prof.Dr. Ahmet AKBAġ a teģekkür ederim. Değerli hocalarım, Prof.Dr. Feyyaz Onur a, Doç.Dr. Bengi Uslu ya ve Anabilim Dalının bütün hocalarına vermiģ oldukları bilgiler için teģekkür ederim. ÇalıĢmalarımda benden desteğini esirgemeyen ve bu çalıģmanın yapılması için gerek maddi gerekse manevi desteklerinden dolayı ABBOTT, Nobel, Fako Ġlaçları A.ġ., Kramer&Martin firmalarına, ArĢ.Gör. Burcu DOĞAN TOPAL a, kuzenim Filiz BAKAR a, arkadaģım Kim.Hakan ġġmġek e, Uzm.Dr. Sinan BAġÇEKEN e teģekkür ederim. Bana her türlü imkanı tanıyan, varlıklarını her zaman hissettiren, beni yetiģtiren ve bugünlere gelmemde büyük emeği olan sevgili anne ve babama, sıkıntılı günlerimde bana moral kaynağı olan ablam ve yeğenime, çalıģmalarımı gerçekleģtirirken ve tezimin yazımı esnasında her fırsatta bana güvenini, desteğini ve sevgisini gösteren, niģanlım AyĢen YILDIRIM a, hayatımı paylaģan gerçek dostlarıma ve arkadaģlarıma tüm kalbimle teģekkür ederim.

10 x SİMGELER ve KISALTMALAR α YPSK k' IS TS TAS N N et R s R r 2 SS BSS t DAD IR İTK Seçicilik Yüksek performanslı sıvı kromatografisi Kapasite faktörü İç standart Teşhis Sınırı Tayin alt Sınırı Eşdeğer teorik tabaka sayısı Etkin eşdeğer teorik tabaka sayısı Ayrım gücü Korelasyon katsayısı Tanımlayıcılık katsayısı Standart sapma Bağıl standart sapma Alıkonma zamanı Diode Array Dedektör Kızıl Ötesi İnce Tabaka Kromatografisi

11 xi ŞEKİLLER Şekil 1.1. Trandolaprilin Yapısı 14 Şekil 1.2. Verapamilin Yapısı 17 Şekil 1.3. Lerkanidipinin Yapısı 19 Şekil 1.4. Enalaprilin Yapısı 21 Şekil 1.5. Kromatografik ayırımın şematik olarak gösterilmesi 40 Şekil 1.6. Kromatografik sistemin sınıflandırılması 41 Şekil 1.7. Sıvı-sıvı dağılım (partisyon) kromatografisinde çözünmüş maddenin ayrımı 51 Şekil 1.8. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi cihazının fotografı 52 Şekil 1.9. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi cihazının şematik görünüşü 53 Şekil YPSK için bir pistonlu pompa 55 Şekil Rheodyne 7125 model enjeksiyon valfi 57 Şekil Bağlı faz dolgu maddelerinin elde edilmesi. a) Yüzey silanolünün klorodimetilsilanla reaksiyonu, b) Yüzey silanollerinin trifonksiyonel klorosilanla reaksiyonu, c) Yüzey silanollerinin trifonksiyonel alkoksisilanla reaksiyonu 59 Şekil YPSK de kullanılan bir UV dedektörü 63 Şekil Dedektörlerin % kullanımları 64 Şekil Floresans dedektör 66 Şekil Sıvı kromatografide bir kromatogram 68 Şekil Ayırma gücü (R s ) değerinin piklerin birbirinden ayrılmasına etkisi 71 Şekil Hareketli faz ph sı ile asidik, bazik ve zwitter türlerin alıkonma faktörlerinin değişimi 74

12 xii Şekil Asetat tamponunun çeşitli derişimlerdeki tampon kapasitesi 76 Şekil Metanol-su ikili karışımlarında çeşitli tamponların pk değerleri: fosfat (sulu ph 2 ve 7), format, asetat, amonyum tamponları 76 Şekil Asetonitril-su ikili karışımlarında çeşitli tamponların pk değerleri: fosfat (sulu ph 1 ve 7), asetat (sulu ph 4 ve 5), borat, hidrojenkarbonat tamponları 77 Şekil Teşhis sınırının hesaplanmasında kullanılan sinyal/gürültü oranı şekli 88 Şekil Tayin alt sınırı hesaplanmasında kullanılan sinyal/gürültü oranı şekli 89 Şekil Kalibrasyon doğrusu (grafiği) ve eşitliği 90 Şekil Zayıf asidik bileşiklerde k-ph arasındaki ilişki 95 Şekil Zayıf bazik bileşiklerde k-ph arasındaki ilişki 96 Şekil Amfoterik bileşiklerde k-ph arasındaki ilişki 96 Şekil 3.1. Trandoapril için IR Spektrumu 103 Şekil 3.2. Verapamil için IR Spektrumu 104 Şekil 3.3. Lerkanidipin için IR Spektrumu 104 Şekil 3.4. Enalapril Maleat için IR Spektrumu 105 Şekil 3.5. Ramipril için IR Spektrumu 105 Şekil 3.6. Verapamilin iyonlaşma şemaları 106 Şekil 3.7. Trandolaprilin 1. ve 2. iyonlaşma şemaları 107 Şekil 3.8. Enalaprilin 1. ve 2. iyonlaşma şemaları 108 Şekil 3.9. Lerkanidipinin iyonlaşma şemaları 109 Şekil Ramiprilin 1. ve 2. iyonlaşma şemaları 110 Şekil Trandolaprilin %50 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 1. İyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 111 Şekil Trandolaprilin %50 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 2. İyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 112 Şekil Verapamilin %50 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 112

13 xiii Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Enalaprilin %50 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 1. İyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 113 Enalaprilin %50 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 2. İyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 113 Ramiprilin %50 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 1. İyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 114 Ramiprilin %50 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 2. İyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 114 Trandolaprilin %55 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 1. İyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 115 Trandolaprilin %55 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 2. İyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 116 Verapamilin %55 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 116 Enalaprilin %55 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 1. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 117 Enalaprilin %55 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 2. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 117 Ramiprilin %55 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 1. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 118 Ramiprilin %55 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 2. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 118 Trandolaprilin %60 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 1. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 119 Trandolaprilin %60 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 2. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 120 Verapamilin %60 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 120 Enalaprilin %60 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 1. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 121 Enalaprilin %60 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 2. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 121

14 xiv Şekil Ramiprilin %60 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 1. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 122 Şekil Ramiprilin %60 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 2.iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 122 Şekil Trandolaprilin %65 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 1. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 123 Şekil Trandolaprilin %65 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 2. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 124 Şekil Verapamilin %65 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 124 Şekil Enalaprilin %65 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 1. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 125 Şekil Enalaprilin %65 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 2. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 125 Şekil Lerkanidipinin %65 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 126 Şekil Ramiprilin %65 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 1. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 126 Şekil Ramiprilin %65 (h/h) MeOH-H 2 O ortamında elde edilen 2. iyonlaşma basamağına ait NLREG grafiği 127 Şekil Enalapril (10 µg/ml ) (a) lerkanidipin (5 µg/ml) (b) analizi için iç standart olarak ramiprilin (2 µg/ml) (IS) kullanıldığı kromatogram. (55 :45 (h/h) metanol-su; 15 mm H 3 PO 4 ph =2,70; akış hızı 1,2 ml/dk, kolon sıcaklığı 40 C). Görüntüleme dalga boyu 210 nm dir. 131 Şekil Verapamil (5 µg/ml) (a) trandolaprilin (25 µg/ml) (b) analizi için iç standart olarak ramiprilin (20 µg/ml) (IS) kullanıldığı kromatogram. (55 :45 (h/h) metanol-su; 15 mm H 3 PO 4 ph =2,70; akış hızı 1,2 ml/dk, kolon sıcaklığı 40 C). Görüntüleme dalga boyu 210 nm dir. 131 Şekil Trandolapril analizi için kalibrasyon grafiği 134 Şekil Verapamil analizi için kalibrasyon grafiği 135

15 xv Şekil Enalapril analizi için kalibrasyon grafiği 142 Şekil Lerkanidipin analizi için kalibrasyon grafiği 142 Şekil 4.1. Enalapril (2,5 µg/ml) (a), verapamil (2,5 µg/ml) (b), Trandolapril (2,5 µg/ml) (c), lerkanidipin (d) (2,5 µg/ml) ve ramiprilin (2,0 µg/ml) (IS) analizi için kromatogram. (53 :47 (h/h) metanol-su; 15 mm H 3 PO 4 ph =2,70; akış hızı 1,2 ml/dk, kolon sıcaklığı 40 C). Görüntüleme dalga boyu 210 nm dir 153 Şekil 4.2. Verapamil (12 µg/ml) (a) - trandolapril (0,2 µg/ml) (b), ramipril (2,0 µg/ml) (IS) sentetik karışımına ait kromatogram. Görüntüleme dalga boyu 210 nm dir 155 Şekil 4.3. Enalapril (10 µg/ml) (a) - lerkanidipin (10 µg/ml) (b), ramipril (2,0 µg/ml) (IS) sentetik karışımına ait kromatogram. Görüntüleme dalga boyu 210 nm dir. 155 Şekil 4.4. Verapamil (a) ve trandolapril (b) içeren Tarka Forte (ABBOTT) (240+4 mg) tabletlerin analizine ait kromatogram. Verapamil (12 µg/ml) (a) - trandolapril (0,2 µg/ml) (b), ramipril (2,0 µg/ml) (IS). Görüntüleme dalga boyu 210 nm dir. 156 Şekil 4.5. Enalapril (a) ve lerkanidipin (b) içeren Zanipress (RECORDATI) (10+10 mg) tabletlerin analizine ait kromatogram. Enalapril (10 µg/ml) (a) - lerkanidipin (10 µg/ml) (b), ramipril (2,0 µg/ml) (IS). Görüntüleme dalga boyu 210 nm dir. 157

16 xvi ÇİZELGELER Çizelge1.1. Zorunlu endikasyonlarda kullanılması önerilen antihipertansifler 3 Çizelge 1.2. Antihipertansif tedavi seçimini etkileyen bazı hasta özellikleri 4 Çizelge 1.3. Katyon ve Anyon Değiştiriciler 44 Çizelge 1.4. Eleme kromatografisinde kullanılan çözücüler ve fiziksel özellikleri 45 Çizelge 1.5. Çözücülerin fiziksel özellikleri 47 Çizelge 1.6. Ters ve Normal-faz sıvı kromatografilerin karşılaştırılması 49 Çizelge 1.7. Ters ve Normal-faz sıvı kromatografide kullanılan sabit ve hareketli fazlar 49 Çizelge 1.8. Kolon Verimliliğine Etkiyen Değişkenler 61 Çizelge 1.9. Seçicilik ve sistem etkinliğinin ayırma gücünü 1-1,5 aralığında değiştirmesi için gerekli değerler 72 Çizelge Ters-faz sıvı kromatografisinde kullanılan tamponlar 74 Çizelge Sıvı kromatografide sıklıkla kullanılan çözücüler ve özellikleri 78 Çizelge 2.1. Çalışılan bileşikler ve özellikleri 98 Çizelge 2.2. Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler 99

17 xvii Çizelge 3.1. Çalışılan bileşiklerin çeşitli kolonlarda elde edilen kapasite faktörleri 128 Çizelge 3.2. Çalışılan bileşiklerin çeşitli kolonlarda elde edilen kuyruklanma faktörleri 128 Çizelge 3.3. Çalışılan bileşiklerin çeşitli MeOH-H 2 O ortamları için kromatografik verileri 129 Çizelge 3.4. Sistem Uygunluk Parametreleri 132 Çizelge 3.5. Trandolaprilin YPSK-DAD yöntemi ile analizine ait kalibrasyon verilerinin istatistiksel değerlendirilmesi 135 Çizelge 3.6. Verapamilin YPSK-DAD yöntemi ile analizine ait kalibrasyon verilerinin istatistiksel değerlendirilmesi 136 Çizelge 3.7. Verapamil ve trandolaprilin sentetik karışımlarına ait analiz sonuçları 137 Çizelge 3.8. Trandolapril (4mg) ve verapamil (240 mg) içeren Tarka Forte tabletlerin YPSK-DAD yöntemi ile analizine ait bulgular 138 Çizelge 3.9. Trandolapril (4mg) ve verapamil (240 mg) içeren Tarka Forte tabletlerin YPSK-DAD yöntemi ile analizine ait % geri kazanım sonuçları 139 Çizelge Trandolapril ve verapamilin YPSK-DAD yöntemi ile analizine ait gün içi, günler arası bulguları 140 Çizelge Trandolaprilın YPSK-DAD yöntemi ile analizine ait cihaz tekrarlanabilirliği analiz bulguları 141 Çizelge Enalaprilın YPSK-DAD yöntemi ile analizine ait kalibrasyon verilerinin istatistiksel değerlendirilmesi 143

18 xviii Çizelge Lerkanidipinin YPSK-DAD yöntemi ile analizine ait kalibrasyon verilerinin istatistiksel değerlendirilmesi 143 Çizelge Enalapril ve lerkanidipinin sentetik karışımlarına ait analiz sonuçları 144 Çizelge Enalapril (10 mg) ve lerkanidipin (10 mg) içeren Zanipress tabletlerin YPSK-DAD yöntemi ile analizine ait bulgular 145 Çizelge Enalapril (10 mg) ve lerkanidipin (10 mg) içeren Zanipress tabletlerin YPSK-DAD yöntemi ile analizine ait % geri kazanım sonuçları 146 Çizelge Enalapril ve Lerkanidipinin YPSK-DAD yöntemi ile analizine ait gün içi ve günler arası bulguları 147 Çizelge Enalapril ve Lerkanidipinin YPSK-DAD yöntemi ile analizine ait cihaz tekrarlanabilirliği analiz bulguları 148 Çizelge 4.1. Trandolapril, verapamil, enalapril, lerkanidipin ve ramiprilin iyonlaşma sabiti değerleri 151

19 1 1. GİRİŞ Ölüm nedenleri arasında üçüncü sırada olan hipertansiyon (yüksek kan basıncı, YKB) tedavisindeki temel hedef kalp damar morbidite ve ölüm oranını azaltmaktır (Bolli, 2005). Birçok hastada, özellikle de 50 yaşın üzerindeki hipertansiflerde, sistolik kan basıncı hedefine ulaşıldığı zaman diyastolik kan basıncı hedefine de ulaşılmaktadır. Bu nedenle tedavideki temel hedef, sistolik kan basıncını olması gereken noktaya çekmektir. Amerikan Birleşik Ulusal komitesinin 7. Raporu, hipertansiyon tedavisindeki yaklaşımları ve tedavi hedeflerini yeniden düzenlemiştir (JNC-7). Sağlıklı yaşam kriterlerini uygulamak hipertansiyonun tedavisinde olduğu kadar önlenmesinde de çok önemlidir ve her hastada mutlaka uygulanmalıdır. Şişman ve kilolu hastaların zayıflaması, sodyumdan fakir ve potasyum ile kalsiyumdan zengin sağlıklı beslenme rejimlerinin uygulanması, alkol alımının azaltılması ve fiziksel aktivitenin arttırılması özellikle önerilmektedir. Sağlıklı beslenme ve diyet yaklaşımının tek ilaç tedavisi ile benzer sonuçlar verdiği gösterilmiştir. Komite, raporunda bütün antihipertansif ilaçların kan basıncını düşürme üzerinde benzer etkileri olduğunu belirtmiştir. Ancak kalp damar ölüm oranı ve morbiditeyi önleme konusunda tiazid grubu diüretiklerin en iyi sonuçları verdiği belirtilmiş ve tiazid diüretiklerinin başlangıç tedavisinde tek veya kombine olarak kullanılması gerektiği vurgulanmıştır (JNC-7). Antihipertansif ilaç tedavisine başlandıktan sonra hedef kan basıncına ulaşıncaya kadar aylık takiplerle hastayı izlemek önemlidir. Hedef kan basıncına ulaşıldıktan sonra ise bundan sonraki takiplerin süresi uzatılabilir ve 3-6 ay aralıklarla yapılabilir. Tedavinin öneminden çok daha önemlisi tedaviye başlamadan önce hastanın YKB hakkında bilinçlendirilmesidir. YKB'nin kontrolünde hasta eğitimi önemli bir konu olup tedavinin temelini oluşturur. Hastaların tedaviye uyumunu kolaylaştırmak için başlıca şu noktalara dikkat edilmelidir (Sağlam, 2007).

20 2 1. Hasta, hastalığı konusunda bilgilendirilmeli, tedavi edilmediği takdirde ne gibi problemlerle karşılaşacağı hastaya anlatılmalıdır. 2. Hasta takibi basit ve ucuz tutulmalıdır. 3. Yaşam tarzı değişikleri teşvik edilmelidir. 4. Uzun etkili ilaçlar tercih edilmelidir. 5. Başarısız tedavi hızla değiştirilmelidir. Hipertansiyon tedavisini iki ana başlıkta inceleyebiliriz: 1. İlaç dışı tedavi (yaşam tarzı düzenlemesi), 2. İlaç tedavisi İlaç Dışı Tedavi İlaç dışı tedavinin diğer bir adı yaşam tarzının değiştirilmesidir. Hastalarda kan basıncının kontrol altına alınmasına gösterdiği katkı dışında, yüksek kan basıncının önlenmesinde de faydalıdır. Yaşam tarzının değiştirilmesi yüksek kan basıncını tek başına kontrol altına alabileceği gibi, ilaç gereken durumlarda ilaç dozunun azaltılmasına da olanak sağlar (İlegen, 2005). İlaç dışı tedavinin içeriği, 1. Aşırı alkolün önlenmesi, 2. Tuz alımının kısıtlanması, 3. Diyetle yeterli kalsiyum ve magnezyum alınması, 4. Diyetle doymuş yağ ve kollesterol alımının sınırlandırılması, 5. Sigaranın bırakılması, 6. Fiziksel aktivitenin artırılması, 7. Hastanın ideal kiloya getirilmesi, 8. Diyetle doymuş yağ ve kolesterol alımının azaltılmasıdır.

21 3 Yaşam tarzının düzeltilmesi tüm hastalar için tedavinin başlangıcında düşünülmelidir. Özellikle diyastolik kan basıncı (DKB) 100 mmhg dan düşükse bu önlemler kan basıncının düzenlenmesinde kullanılacak ilaçların dozajının azaltılmasında veya YKB nin kontrolünde önemli etkiye sahip olabilir İlaç Tedavisi Hipertansiyon tedavisindeki asıl unsur, hedef organ hasarını önleyerek morbiditeyi ve ölüm hızını azaltmaktır. YKB'de ilaç tedavisine başlama kararını etkileyen temel faktörler; kan basıncı düzeyi, hedef organdaki hasar oluşumu ile kalp damar hastalığı veya diğer risk faktörlerinin varlığıdır. Bazı zorunlu endikasyonlarda kullanılması önerilen ilaçlar Çizelge 1.1 de gösterilmiştir (Büyüköztürk, 2000; Süleymanlar, 2000; İlegen, 2005) Çizelge 1.1. Zorunlu endikasyonlarda kullanılması önerilen antihipertansifler Zorunlu endikasyon Başlangıç ilaç seçeneği Kalp yetersizliği Tiazid, BB, ADEI, ATIIRB, Aldosteron antagonistleri Kronik böbrek yetersizliği ADEI, ATIIRB Yüksek kalp damar hastalık riski Tiazid, BB, ADEI, KKB Şeker hastalığı Tiazid, BB, ADEI, ATIIRB, KKB İnme ataklarından korunma Tiazid, ADEI BB: Beta bloker, ADEİ: Anjiotensin dönüştürücü enzim inhibitörü, KKB: Kalsiyum kanal blokeri, ATIIRB: Anjiotensin II resptör blokeri Bir antihipertansif ilacın tüm YKB li hastaları aynı derecede etkilemesi beklenemez. Genetik ve çevresel faktörlerin karışık etkileşimi, kişiyi yüksek kan basıncına yatkın hale getirebilmektedir. YKB li kişiler arasında farklılıklar gözlenebilir. Bu nedenle aynı antihipertansif ajan tüm hastalar için aynı derecede

22 4 etkili olmayabilir. Aşağıdaki çizelgede antihipertansiflerin seçimini etkileyen hasta özellikleri verilmiştir (Çizelge 1.2) (Sağlam, 2007). Çizelge 1.2. Antihipertansif tedavi seçimini etkileyen bazı hasta özellikleri Yaşlılık Şişmanlık Tıkayıcı hava yolları hastalığı Hiperlipidemi Depresyon Böbrek yetersizliği Diüretikler ve KKB'lerine, - blokerler veya ADEİ daha iyi yanıt verirler. Diüretikler sıklıkla etkilidir. Bronkospazmı teşvik eden ajanlar verilmemelidir ( -blokerler, guanetidin, guanadrel, labetalol). Diüretikler veya -blokerler daha da kötüleştirebilir. Merkezi etkili ajanlar veya -blokerler ile kötüleşebilir. ADEİ tercih edilir. Tek ilaç tedavisi (monoterapi) seçenekleri yaklaşık olarak hastaların %60'ında etkilidir. Üstelik tek ilaç tedavisi seçeneklerinin artışı da bu gerçeği değiştirmemektedir. Tek ilaç tedavisi makul bekleme süresi 4-6 hafta kadar olup kan basıncı kontrol altına alınmadığı zaman ikinci bir seçeneğe geçilmektedir. JNC 7 de sonuç olarak tiazidlerin tedavideki öneminin artışına dikkat çekilmiştir. Zorunlu endikasyonlar dışında tedaviye tiazid veya tiazid içeren bir kombinasyonla başlanması önerilmektedir. Tedavide kullanılan başlıca 5 antihipertansif ilaç sınıfı; 1. Diüretikler, 2. blokerler, 3. Kalsiyum kanal blokerleri,

23 5 4. ADE inhibitörleri, 5. Anjiyotensin 2 reseptör antagonistleri Bazı merkezlerde rezerpin ve metildopa da sık olarak kullanılmaktadır. Her ilaç sınıfının yan etkilerinde önemli farklılıklar bulunmasına rağmen, kan basıncını düşürücü etkileri arasında büyük farklar bulunduğunu gösteren güvenilir ya da tutarlı veriler bulunmamaktadır. İlaç sınıfları arasında tedavinin morbidite ve ölüm oranı üzerindeki etkilerine ilişkin olarak, rastgele, kontrollü çalışmalardan elde edilen bulgular açısından da önemli farklar bulunmaktadır. Diüretikler ve blokerler gibi geleneksel ilaçların yararlarını gösteren çok sayıda veri bulunmasına rağmen kalsiyum antagonistleri ve anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibitörleri (ADEİ) ile ilgili olarak daha az veri bulunmakta, blokerler ya da anjiyotensin II reseptör antagonistleri gibi en yeni ilaç sınıflarıyla ilgili olarak ise veriler henüz yetersiz kalmaktadır (Sağlam, 2003) Diüretikler Diüretik (idrar söktürücü) ilaçlar 40 yıla yakın süredir yüksek kan basıncı tedavisinin temelini oluşturmaktadır. En önemli özellikleri ucuz, etkili, düşük dozlarda genellikle iyi tolere edilebilmeleridir (Gül, 2007). Diüretik içeren tedavi uygulamalarının çeşitli hipertansif hasta guruplarında, inme ve koroner kalp hastalığı da dâhil olmak üzere önemli kalp damar hastalıklarını önlediği açık bir şekilde gösterilmiştir. Diüretik ilaçlar ağızdan veya parenteral yolla verildiği zaman başlıca sodyum olmak üzere çeşitli elektrolitlerin ve suyun, böbrek yoluyla atılımını arttıran ilaçlardır. İdrar söktürücüler, yapıları, etki ettikleri bölge ve atılımını artırdıkları elektrolite göre gruplara ayrılır (Sağlam, 2003). Bu guruplar; - Tiazid gurubu: klorotiazid, hidroklorotiazid, politiazid. - Tiazid benzerleri: klortalidon, indapamid,metolazon. - Lup diüretikleri: furosemid, torsemid, bumetanid.

24 6 - Aldosteron antagonistleri: spironolakton, eplerenon. - Diğer potasyum tutucu diüretikler: amilorid, triamterendir.. Diüretikler özellikle sistolik hipertansiyonlu yaşlı hastaların tedavisinde önerilmektedir (İlegen, 2005) Adrenerjik Reseptör Blokerleri adrenerjik reptörleri bloke eden ( bloker) ilaçlar, başlangıçta aritmi tedavisinde kullanılmışlardır. Kan basıncını düşürücü özellikleri ise daha sonralarda bulunmuştur (Kayaalp, 1990). Esansiyel yüksek kan basıncı olan bireylerde, bugüne kadar diüretikler dışında ölüm oranının azalmasına yol açtığı kanıtlanan bir diğer ilaç gurubu ise blokerlerdir. Ek olarak hem 5. hem de 6. Amerikan Ulusal Birleşik Komitesi (JNC) raporlarında birincil ilaç olarak önerilmektedir. blokerler diüretiklerle beraber, diğer antihipertansiflere nazaran oldukça ucuzdurlar. Özellikle genç ve orta yaşlı, stres düzeyi yüksek olan hasta guruplarında kombine ilaçların dışında ilk seçilecek ilaç olarak önerilmiştir. blokerlerin, kan basıncını düşüren etki mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir. bloker ilaçlara başlandığı zaman ilk olarak kalbin atış hızı, atım hacmi ve kalp debisinde hemen azalma gözlenir. Fakat total çevresel damar direnci (TÇDD) artar. TÇDD'nin artması blokerlerden umulan kan basıncı düşmesinin daha az olmasına neden olur. Genel olarak hafif ve orta derecede YKB'si olanların %50-70'i bloker tedavisine ilk hafta içinde cevap verir. İlaç kullanımına başladıktan sonra tam etki 7 ila 10 günde ortaya çıkar. Eğer bu süre sonunda istenen etki elde edilememiş ise başka bir bloker ile de istenen etki elde edilemez. Tolerans gelişimi azdır (Sağlam,

25 7 2003; İlegen, 2005). Uzun süreli bloker tedavisi uygulaması, vücudun telafi edici mekanizmaları ile reseptör sayısının artmasına yol açmaktadır. Bunun sonucunda ilacın ani kesilmesi, açıkta kalan yüksek sayıdaki reseptörün aktive olmasına ve istenmeyen durumların ortaya çıkmasına yol açabilir (ilaç kesilmesi sendromu). AKB yükselmesi ile taşikardi, çarpıntı, tremor, terleme, baş ağrısı oluşabilir. bloker ilaçların yan etkileri çok iyi bilinmektedir. Hastalardaki tolerans bu yan etkilere karşı oldukça iyidir. Bu yan etkiler, ilacın tercih edilmesine engel teşkil edecek kadar ağır sorunlara, çoğunlukla yol açmamaktadır. Miyokardiyal depresyon, kalp bloğu ve bradikardi; uykusuzluk görülebilir; hipoglisemi semptomlarını ve glikojenolizi baskılarlar, insülin direncini artırırlar, insülin salınımını baskılarlar (hiperglisemi). Başlıca bloker preparatlar: - Kardiyoselektif olanlar: atenolol, asebutalol, betaksolol, bisoprolol, esmolol metoprolol, nebivolol. - Kardiyoselektif olmayanlar: busindolol, karvedilol, nadolol, oksprenolol penbutolol, pindolol, propranolol, sotalol, timolol. - Intrensek sempatomimetik aktivitesi (ISA) olanlar: asebutalol, busindolol oksprenolol, penbutalol, pindolol (en yüksek ISA olan). - Alfa bloker etkisi de olanlar: karvedilol ve labetolol (İlegen, 2005) dır Alfa Blokerler YKB'nin tedavisinde seçici bloker ilaçlar da kullanılmaktadır. reseptörleri bloke ederek periferik damar direncini ve kan basıncın düşürürler. Lipid profili üzerine olumlu etkileri gözlenen bu grubun, insülin duyarlılığını etkilememeleri de avantajlı bir yön olarak gösterilebilir (İlegen, 2005).

26 8 bloker ilaçlar yorgunluk, halsizlik, uyuşukluk, baş ağrısı, güçsüzlük, çarpıntı, taşikardi, burun tıkanıklığı, baş dönmesi ve ödem oluşturabilirler. Erkeklerde seksüel fonksiyon bozulması seyrek görülen yan etkileridir. Kadınlarda idrar inkontinansı yapabilirler (Sağlam, 2003). Başlıca alfa bloker preparatlar: -Yalnızca alfa bloker etkileri olanlar: doksazosin, prazosin, terazosin. -Hem alfa hem de beta bloker etkileri olanlar: karvedilol, labetaloldır Kalsiyum Kanal Blokerleri Kalsiyum kanal blokerleri veya diğer adlandırmayla kalsiyum antagonistleri kalp kası, kalbin ileti sistemi ve damar duvarı düz kas hücresi üzerine çok çeşitli etkilere sahip heterojen bir guruptur. Bu gurup ilaçlar, hipertansiyon ve hipertansif acil durumların tedavisinde etkilidirler. Kalsiyum kanal blokerleri 4 guruptur: 1. Dihidropridin (DHP) türevleri (nifedipin, lerkanidipine ve benzerleri) 2. Fenilalkilamin türevleri (verapamil ve gallopamil) 3. Benzotiazepin türevleri (diltiazem) 4. Tetralol türevleri (mifebradil) Ülkemizde izin almış ve ruhsatlandırılmış amlodipin, diltiazem, felodipin, nifedipin, nitrendipin, nisoldipin, isradipin, lacidipin, nikardipin, verapamil ve lerkanidipin gibi kalsiyum antagonistleri klinikte kullanılmaktadır. Kalsiyum kanal blokerlerinin damar genişletici etkisi arteriyollerde belirgindir. AKB'yi düşürmelerine rağmen böbrek ve beyin kan akımında ve glomeruler filtrasyon hızında (GFR) azalma yapmazlar. Nifedipin ve diğer DHP türevleri,

27 9 böbreklerden sodyum ve su atıcı etki gösterirler. Hafif ve orta birincil yüksek kan basıncı tedavisinde tek ilaç tedavi seçeneklerinden biridir. Bu grup ilaçların ilk çıkan kısa etkili preparatları, günde birkaç dozda alınma mecburiyeti nedeniyle, yüksek kan basıncı tedavisinde yeterince kullanım alanı bulamamıştır. Ancak son yıllarda uzun etki süreli, günde tek veya iki dozda alınan preparatları piyasaya sürülmüştür. Kalsiyum antagonistlerinin, özellikle beyin kan akımını da artırdığı için, yaşlılarda uygun seçenek olduğunu düşünülmektedir. Kalsiyum antagonistleri bilinen tüm antihipertansif ilaçlarla kombine edilebilirler. Genel olarak şeker hastalarında böbrek koruyucu etkilerinden yararlanmak amacıyla, yaşlılarda beyin kan akımını artırdıkları için tercih edilmesi gereken ilaçlardır. Birçok ülkede yüksek kan basıncı tedavisinde en çok kullanılan ilaç grubu dihidropiridinlerdir (DHP). Bu guruptan ilk kullanıma gireni ve prototipi sayılanı nifedipine'dir. Daha sonra çıkan ve 2. kuşak kalsiyum kanal blokerleri de denilen amlodipine, felodipine, nikardipine, nitrendipine, lerkanidipine ve lasidipine, nifedipine'e göre daha damar seçicidir (vazoselektif) ve yarılanma ömrü uzundur. Günde tek dozda kullanılabilme üstünlüklerine sahiptir. DHP türevi olmayan kalsiyum antagonistleri ise diltiazem ve verapamildir (Bayazıt, 1993; İlegen, 2005; Sağlam, 2003) Anjiyotensin Dönüştürücü Enzim (ADE) İnhibitörleri ADE inhibitörlerinin, hipertansiyon tedavisi, çeşitli böbrek hastalıkları ve özellikle diyabetik nefropatide kullanımları, konjestif kalp yetersizliğinde ölüm oranı ve morbiditeyi azaltmaları, felç tedavisinde kullanımları gibi çok çeşitli ve önemli uygulamaları vardır (Sağlam, 2007). Kan basıncını düşüren etkinin oluşumu aktif olmayan anjiyotensin I'in aktif, anjiyotensin II'ye dönüşmesini sağlayan ADE baskılamasıyla gerçekleşmektedir. ADE baskılanması ile plazma ve dokularda anjiyotensin düzeyi azalır. Böylece hem arteriollerde hem venillerde genişlemeyle (vazodilatasyonla) çevresel damar direnci azalır, dolayısıyla AKB

28 10 düşer. ADE aynı zamanda kininaz II olarak da bilinmektedir. ADE tek etkili bir enzim değildir (Kayaalp, 1993). Başka peptidlerin yıkımından da sorumludur. Bu peptidler içinde en iyi bilineni bradikinindir. ADE baskılanması sonucu bradikinin yıkımı azalmakta ve organizmada birikim olmaktadır. Bu birikim ADE inhibitörü (ADEİ) tedavisinin en fazla bırakılmasına neden olan öksürük yan etkisini ortaya çıkarır. ADE inhibitörleri esansiyel YKB'li bireylerde tek ilaç olarak kullanılabilmektedir. Zamanla ilaçların antihipertansif etkinlikleri azalabilmektedir. Bu durumdaki hastalara diüretik eklemek, ilacın antihipertansif etkinliğini yeniden eski düzeyine getirmektedir. ADEİ esas olarak sistemik damarlar üzerine etkilidir. Akciğer yatağı üzerine etki yok denecek kadar azdır. ADE inhibitörlerinin diüretiklere ve beta blokerlere göre yan etkilerinin nispeten az oluşu bakımından üstünlükleri vardır. Ancak hafif ve orta derecedeki YKB'lilerde etkinlikleri diğer ilaçlardan fazla değildir. Kalp debisini düşürmezler, refleks, taşikardi yapmazlar, böbrek koruyucu etkileri vardır. ADE inhibitörlerinin antihipertansif etkilerinden bağımsız olarak kalp damar hipertrofisini önlediği gösterilmiştir. ADE inhibitörleri kalp yetersizliğinde de ilk seçenek olarak kullanılabilir. Guruba özgün en sık rastlanan yan etki öksürüktür. Kinin ve substance P'nin artması öksürüğe yol açmaktadır. Nadir görülen fakat sonuçta ciddi olabilen anjio ödem oluşabilir. Potasyum seviyesinde yükselme, hacim eksilmesine karşı yanıtlarda zayıflama, döküntü ve kan şekeri düşüklüğü, tat bozuklukları, pankreatit, kolestatik sarılık diğer görülebilen yan etkileridir (Demir, 1994; Sesoko, 1985; Vidt, 1982). Başlıca ADE inhibitörü preparatları: Benazepril, enalapril, fosinopril, kaptopril, kinapril, lisinopril, moeksipril, perindopril, ramipril, silazapril, trandolapril, zofenoprildir.

29 Anjiyotensin II Reseptör Blokerleri (AT II RB) ADE inhibitörlerinin klinik uygulamadaki etkisi bir yandan yeni ilaçları geliştirme çalışmalarına hız verirken, diğer yandan renin anjiyotensin sisteminin alternatif yollardan engellenmesini de gündeme getirmiştir. ADEİ'lerde görülen öksürük ve diğer yan etkiler bu yolu baskılayabilecek yeni ilaç araştırmalarını hızlandırmıştır. Renin anjiyotensin aldosteron (RAA) sisteminde reninin inhibisyonu, denenmiş fakat sonuçlar klinik pratik açısından uygulanabilir bulunmamıştır. Bazı renin inhibitörleri ile çalışmalar devam etmektedir. Öte yandan sistemin son basamağı, yani anjiyotensin II (AT II) reseptörlerinin bloke edilmesi çok daha etkin ve başarılı sonuçlar vermiştir (Sağlam, 2003). Anjiyotensin II hücre membranındaki kendine has reseptörüne bağlanarak etki gösterir. Bu reseptörler AT II-I ve AT II- II reseptörü olmak üzere iki tiptir. Her ikisi de polipeptid yapısındadır. AT II reseptör antagonistleri AT II-I reseptörleri üzerinden etkilerini gösterirler. AT II-I özellikle adrenal korteksten aldosteron salınımı ve adrenerjik blokajdan sorumludur. AT II-II'nin hasarlı dokunun yeniden şekillenmesinde rol alabileceği düşünülmektedir. AT II RB sistemik damar direncini düşürerek kan basıncını azaltır. Bu arada kalp hızı ve kalp debisini etkilemezler (İlgen, 2005). Yaşlı hastalarda iyi tolere edilirler. Kalp yetersizliğinde belirgin etkisi gösterilmiştir. Bunlar nispeten yeni ilaçlardır. Endikasyon ve klinik özellikler olarak ADE inhibitörlerine benzerler. Hem yüksek hem de normal kan basınçlı kişilerde AKB'yi düşürürler (De Leeuw, 1999). Anjiyotensin reseptör blokerlerinin kininler üzerine etkisi yoktur. Bu yüzden öksürük yapıcı yan etkisi görülmez. Bu gurup ilaçlarda seyrek de olsa anjioödem bildirilmiştir. Başlıca yan etkileri hiperkalemi, semptomatik kan basıncı düşüklüğü yapabilir. Gebelikte ve böbrek arter darlığında kontrendikedir. Anjiyotensin reseptör blokerleri, ADE inhibitörleri ile birlikte kombine olarak kullanılabilir. Başlıca AT-II RB preparatları: eprosartan, irbesartan, kandesartan, losartan, olmesartan, telmisartan, valsartan.

30 Kombinasyon Tedavileri İlaç tedavisinde kullanılabilecek diğer bir seçenek ise kombinasyon tedavisi yani birleşik tedavidir. Kombinasyon tedavisi ile tek ilaçla sağlanabilecek başarı oranları arttırılabilmektedir. Genellikle iki farklı ilaçtan oluşan kombinasyonlara hastaların %75-80'i cevap verirken tek ilaç tedavisinde ilacın en yüksek dozuna bile, hastaların yaklaşık %55-60 kadarı yanıt vermektedir. Birleşik tedavi yaklaşımı ile yan etkiler en düşük düzeye çekilebilmektedir Kombinasyon Tedavisinin Dayandığı Başlıca Prensipler Kombinasyon tedavisinin dayandığı başlıca prensipler şunlardır: a) Antihipertansif etkinliğin farklı mekanizmalar kullanılarak artırılması: Farklı mekanizmalar ile kan basıncını düşüren iki ilaç kombinasyonunun kan basıncı kontrol altına alınabilen hipertansif hasta sayısını artırdığı bilinmektedir. Artmış antihipertansif etkinlik olasılıkla anormal kan basıncı yükselmesinde rol oynayan pek çok sayıdaki düzenleyici sisteme aynı anda etki edilmesiyle ilişkilidir. Bunun anlamı sistemlerden birinin özgün olarak bloke edilmesinin sonucunda oluşan kan basıncı düşüşünün hemen her zaman diğer sistemlerin dengeyi sağlamayı amaçlayan aktivitesini tetikleyeceği ve bunun sonucunda da, genele bakıldığında antihipertansif etkinlikte bir azalma görüleceği şeklindedir. Bu nedenle iki farklı mekanizmaya sahip iki ilaç kombinasyonunun tek ilaç tedavisine göre daha iyi sonuç vereceği düşünülmektedir. b) Yan etki sıklığının azaltılması: Yan etkilerden bahsederken bunların doza bağımlı olduğu unutulmamalıdır. Kan basıncı ve yan etki profili kombine ilaçlar ve tek ilaç tedavisi ile karşılaştırıldığında, kullanılan ilaç dozu daha düşük olup yan etki görülme sıklığı da daha azdır. Örneğin yüksek dozlarda diüretik

31 13 kullanımının yan etkileri, ADE inhibitörleri veya blokerlerle birlikte kullanılması ile azaltılabilir. Bu sayede hem daha az yan etki, hem de daha fazla kan basıncı düşüşü sağlanır. Burada kombine ilaç kullananlar için dozlarının ayarlanması süreci hastanın birçok defa muayeneye gelmesine yol açabilmektedir. Sabit dozlu ilaçlarda ise doz ayarlaması kısmen doktorun kontrolü dışındadır. Bütün kan basıncı düşürücü ilaçlar beraber kullanılabilir, ancak kişiye özel tedavi gerçeği unutulmamalı ve beraber kullanıldıklarında istenmeyen yan etkinin artacağı kombinasyonlar tercih edilmemelidir (Messerli, 2003; İlegen, 2005; Sağlam, 2003).

32 Kuramsal Temeller Çalışmalarda Kullanılan Maddelerin Kimyasal, Fiziksel, Farmakolojik, Farmakokinetik Özellikleri Trandolapril Formül Şekil 1.1. Trandolaprilin Yapısı Kapalı Formül C 24 H 34 N 2 O 5 Sistematik Adı (2S, 3aR, 7aS)-1-[(S)-N-[(S)-1-Karboksi-3-fenilpropil]alanil] hekzahidro-2- indolinkarboksilik asit, 1-etil ester

33 15 Fiziksel Özellikleri Trandolapril renksiz, kristalize bir tozdur. Kloroform (>100 mg/ml), diklorometan ve metanolde çözünür o C arasında kontrollü oda sıcaklığında ve ağzı kapalı ışık geçirmez kaplarda saklanmalıdır, nemden korunmalıdır. Erime noktası 125 o C ve molekül ağırlığı da 430,54 g dır. Farmakolojik Özellikleri Trandolapril, sülfidril içermeyen bir ADE inhibitörü olan trandolaprilat ın etil ester ön ilacıdır. Trandolapril plazma rennin anjiyotensin aldosteron sistemini (RAS) baskılar. Renin böbrekler tarafından sentezlenerek dolaşıma verilen endojen bir enzimdir. Dolaşım içinde anjiyotensinojeni göreceli olarak inaktif bir dekapeptid olan anjiyotensin I e dönüştürür. Anjiyotensin I daha sonra, bir peptidildipeptidaz olan ADE tarafından anjiyotensin II ye dönüştürülür. Anjiyotensin II güçlü bir vazokonstriktördür; arteriyel vazokonstriksiyon ve kan basıncı artışından, aynı zamanda adrenal bezin aldosteron salgılamak üzere uyarılmasından sorumludur. ADE nin inhibe edilmesi plazmada anjiyotensin II miktarının azalması, bu ise vazopressör aktivitede azalma ve azalmış aldosteron salgılaması ile sonuçlanır. Aldosteron salgılamasındaki azalma küçük olmakla birlikte, sodyum ve sıvı kaybının yanı sıra serum potasyum konsantrasyonlarında küçük artışlar ortaya çıkabilir. Anjiyotensin II nin renin salgılanması üzerindeki negatif geri-bildiriminin kesilmesi, plazma renin aktivitesinde artış ile sonuçlanır. Dönüştürücü enzimin başka bir fonksiyonu, güçlü bir vazodilatör kinin peptidi olan bradikinini inaktif metabolitlerine parçalamaktır. Bu nedenle ADE inhibisyonu, dolaşımdaki ve lokal kallikrein-kinin sisteminin aktivitesinde artış ile sonuçlanır; bu sistem prostaglandin sistemini aktive ederek periferik vazodilatasyona katkıda bulunmaktadır. Bu mekanizmanın ADE inhibitörlerinin hipotansif etkilerinde yer alması ve belirli yan etkilerinden sorumlu olması

34 16 muhtemeldir. Hipertansiyonu olan hastalarda ADE inhibitörü uygulaması, kalp hızında telafi edici artışlar olmaksızın, sırtüstü ve ayaktaki kan basınçlarında hemen hemen aynı boyutlarda bir azalma ile sonuçlanır. Periferik arteriyel direnç azalmasının yanı sıra kalp debisi değişmez ya da artış gösterir. Renal kan akımında artış vardır ve glomerüler filtrasyon hızı genellikle değişmez. Kan basıncında optimal azalmanın sağlanması, bazı hastalarda birkaç haftalık bir tedaviyi gerektirebilir. Antihipertansif etkileri uzun dönemli tedavi sırasında kalıcıdır. Trandolapril in antihipertansif etkisi dozdan sonraki bir saat içinde ortaya çıkar ve en az 24 saat sürer (Üstünes, 2009). Farmakokinetik Özellikleri Oral yoldan uygulanan trandolapril hızla emilir. Absorpsiyonu %40-60 arasında ve yiyeceklerden bağımsızdır. Doruk plazma konsantrasyonuna ulaşma süresi 30 dakika civarındadır. Trandolapril plazmadan çok hızlı bir şekilde kaybolur ve yarı ömrü bir saatin altındadır. Trandolapril plazmada, spesifik bir anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibitörü olan trandolaprilat oluşturmak üzere hidrolize olur. Trandolaprilatın doruk plazma konsantrasyonuna ulaşma süresi 4-6 saattir. Trandolaprilatın plazma proteinlerine bağlanması %80 nin üzerindedir. Trandolaprilat ADE ye yüksek bir afiniteyle bağlanır ve bu doyurulabilir bir süreçtir. Dolaşımdaki trandolaprilatın çoğunluğu albumine doyurulabilir olmayan bir süreç ile bağlanır. Tekrarlı günde bir kez uygulama rejimiyle kararlı duruma, sağlıklı gönüllülerde ve yanı sıra genç ve yaşlı hipertansif hastalarda yaklaşık 4 gün sonra ulaşılır. Birikimlerden hesaplanan efektif yarı ömrü saattir. Uygulanan trandolapril dozunun %10-15 i idrarla değişmemiş trandolaprilat olarak atılır.

35 Verapamil HCl Formül Şekil 1.2. Verapamilin Yapısı Kapalı Formül C 27 H 38 N 2 O 4 Sistematik Adı (RS)-2-(3,4-dimetoksifenil)-5-[[2-(3,4-dimetoksifenil)etil]-(metil)amino]-2- izopropilpentanitril] Fiziksel Özellikleri Verapamil hidroklorür beyaz veya beyaza yakın bir renkte, kokusuz, kristalize bir tozdur. Suda iyi çözünür, alkolde az çözünürken kloroformda serbest olarak çözünebilir bunların yanı sıra eterde çözünmez. Verapamil HCl nin sudaki %5 lik

36 18 çözeltisinin ph sı 4,5-6,5 değerleri arasındadır. Molekül ağırlığı 491,1 g dır. Erime noktası 142 o C dir. Verapamil HCl 30 o C nin altındaki oda sıcaklığında ve sıkıca kapalı hava, ışık ve nem geçirmeyen kaplarda saklanmalıdır. Farmakolojik Özellikleri Verapamil hidroklorür kalsiyum iyonu giriş inhibitörüdür (yavaş kanal blokeri ya da kalsiyum iyon antagonisti). Verapamil in farmakolojik aktivitesi, vasküler düz kas hücreleri ve kalpteki iletici ve kontraktil hücrelerin membranlarındaki yavaş kanallar yoluyla kalsiyum iyonları girişinin inhibisyonuna bağlıdır. Verapamil beta-adrenerjik reseptörleri bloke etmediği için, kalbin sempatik düzenlemesi ile etkileşmez. Farmakokinetik Özellikler Uygulanan verapamil in yaklaşık %90 ı ince bağırsaktan emilir. Ortalama sistemik yararlanım, yoğun hepatik ilk geçiş etkisi nedeniyle %22 gibi düşüktür ve büyük değişkenlik gösterir (%10-35). Tekrarlı uygulamalar sonrasında ortalama biyoyararlanım %30 a yükselebilir. Yiyeceklerin verapamil biyoyararlanımı üzerinde etkisi yoktur. Doruk plazma konsantrasyonuna ulaşım süresi 4 saattir. Norverapamilin doruk plazma konsantrasyonu, dozdan 6 saat kadar sonra elde edilir. Verapamilin plazma proteinlerine bağlanması %90 civarındadır. Tekrarlı uygulamalardan sonraki ortalama eliminasyon yarı ömrü 8 saattir. Dozun %3-4 ü böbreklerden değişmemiş ilaç olarak atılır. Metabolitlerin atılımı idrar (%70) ve feçes (%16) yoluyla olmaktadır. Norverapamil idrarda tanımlanan 12 metabolitten biridir, verapamildeki farmakolojik aktivitenin %10-20 sine sahiptir ve atılan ilacın %6 sını oluşturur. Norverapamil ve verapamilin kararlı durum plazma konsantrasyonları benzer niteliktedir.

37 19 Trandolapril ve verapamilin kombine kullanımında gözlemlenen sinerjik aktivite, her iki ajanın birbirini tamamlayan farmakolojik etkilerine bağlanmaktadır. Klinik çalışmalarda verapamil/trandolapril kombinasyonu yüksek kan basıncını düşürmek açısından, tek başına her iki ilaçtan daha etkili, emniyet ve tolerabilitesi ise, her iki ilaç kadar iyi bulunmuştur (Sweetman, 2002; PDR, 2003, Üstünes, 2009) Lerkanidipin HCl Formül Şekil 1.3. Lerkanidipinin Yapısı Kapalı Formül C 36 H 41 N 3 O 6 Sistematik Adı 2[(3,3-difenilpropil)(metil)amino]-1,1-dimetiletilmetil-2,6-dimetil-4-(3- nitrofenil)-1,4-dihidropiridin-3,5-dikarboksilat

38 20 Fiziksel Özellikleri Kloroform ve metanolde rahatça çözünebilen, pratik olarak suda çözünemeyen açık sarı renkli bir etken maddedir. 30 o C nin altındaki oda sıcaklığında nemden korunarak saklanmalıdır. Molekül ağırlığı 648,2 g dır. Erime noktası o C civarındadır. Farmakolojik Özellikleri Lerkanidipin dihidropiridin grubundan bir kalsiyum kanal blokörüdür ve kalsiyumun hücre zarı üzerinden kalp kası ve düz kas hücrelerinin içine akımını inhibe eder. Antihipertansif etkisinin mekanizması, damar düz kası üzerindeki direkt gevşetici etkisine ve böylelikle total periferik direnci düşürmesine bağlıdır. Lerkanidipinin farmakokinetik plazma yarı-ömrünün kısa olmasına karşın, membran partisyon katsayısının yüksek olması sayesinde uzun bir antihipertansif etkinlik süresine sahiptir ve yüksek vasküler seçiciliği sayesinde negatif inotropik etkileri bulunmaz. Lerkanidipinin indüklediği vazodilatasyonun kademeli bir başlangıca sahip olması nedeniyle, refleks taşikardi ile birlikte akut hipotansiyon, tedavi amaçlı ilaç kullanan hipertansiyonlu hastalarda nadiren gözlemlenmiştir. Diğer asimetrik 1,4- dihidropiridinlerde olduğu gibi, lerkanidipinin antihipertansif aktivitesi temelde (S)-enantiyomerine bağlıdır (Üstünes, 2009). Farmakokinetik Özellikleri Lerkanidipin, 10 veya 20 mg'lık oral uygulamadan sonra tümüyle emilir ve uygulamadan yaklaşık 3-4 saat sonra, plazmadan dokulara ve organlara dağılım

39 21 hızlı ve yaygındır. Lerkanidipinin plazma proteinlerine bağlanma oranı % 98'i aşar. Şiddetli böbrek veya karaciğer fonksiyon bozukluğu bulunan hastalarda plazma protein düzeyleri düşük olduğundan, bu hastalarda serbest ilaç fraksiyonu yükselebilir. Farmakokinetik yarı-ömrü 3-5 saat olmasına karşın, lipid zarlarına yüksek bağlanışı nedeniyle terapötik aktivitesi 24 saat devam eder. Lerkanidipin predominant olarak inaktif metabolitlere dönüştürülür ve uygulanan dozun yaklaşık %50'si idrarla atılır Enalapril Maleat Formül Şekil 1.4. Enalaprilin Yapısı Kapalı Formül C 20 H 28 N 2 O 5 Sistematik Adı (2S)-1-[(2S)-2-[[(2R)-1-etoksi-1-okso-4-fenilbutan-2-il]amino]propanoil] pirolidin - 2- karboksilik asit

40 22 Fiziksel Özellikleri Enalapril maleat beyaza yakın renkte kristal yapılı bir tozdur. Suda az çözünmekle beraber metanol ve dimetilformamitte çözünür. Yarı polar organik çözücülerde hafifçe çözünür. 30 o C nin altında karanlık ve nem kapmayacak bir ortamda saklanmalıdır. Erime noktası ,5 o C ve molekül ağırlığı 492,5 g dır. Farmakolojik Özellikleri Enalapril maleat hipertansiyon ve konjestif kalp yetmezliklerinin tedavisinde kullanılır. Sülfidril kökü içermeyen enalapril maleat uzun etkili, seçici ADE inhibitörüdür ve bu inhibisyon ile anjiotensin II oluşumunu azaltır ve kan basıncını ayarlar. Yaklaşık %75-55 oranında gastro-intestinal kanaldan süratle absorbe olur. Oral alımından sonra 1 saat içinde serumda pik konsantrasyonuna ulaşır. Enalaprilatın yarı ömrü yaklaşık 11 saattir. Bu süre böbrek yetersizliğinde uzar. Enalapril karaciğerde hidroliz sonucu etil grubunu kaybederek etkili şekli olan enalaprilata dönüşür. Atılım hem enalapril hem de enalaprilat için başlıca böbrekler yoluyladır. Enalaprilat sirkülasyondan hemodiyalizle uzaklaştırılabilir. Farmakokinetik Özellikleri Enalapril maleatın etki mekanizması, anjiotensin I in kuvvetli bir vazokonstriktör olan, aldosteron salımını uyaran, anjiotensin II ye dönüşümünü sağlayan, anjiotensin dönüştürücü enzimi (ADE) inhibe etmesine dayanmaktadır. ADE in inhibisyonu plazma anjiyotensin II düzeyini düşürerek vazopresör aktivitenin ve aldosteron sekresyonunun azalmasına neden olur. Enalapril karaciğerde hidroliz sonucu etil grubunu kaybederek etkili şekli olan enalaprilata dönüşür. Oral yoldan alınan enalapril yaklaşık %60 oranında mide-barsak kanalından emilir. Enalaprilatın doruk serum konsantrasyonuna 3-4 saat içerisinde erişilir.

41 23 Enalaprilatın yarı ömrü yaklaşık 11 saattir. Bu süre böbrek yetersizliğinde uzar. %50-60 oranında plazma proteinlerine bağlanır. Normal dozlarda hastaların büyük kısmında antihipertansif etki 24 saate kadar devam edebilir. Ancak maksimum terapötik etkiye birkaç hafta sonra ulaşılabilir (Üstünes, 2009; Sweetman, 2002; PDR, 2003). Enalapril ve lerkanidipinin kombine kullanımında gözlemlenen sinerjik aktivite, her iki ajanın birbirini tamamlayan farmakolojik etkilerine bağlanmaktadır. ADE inhibitörü (Enalapril) ve kalsiyum kanal blokeri (Lerkanidipin) antihipertansif etkili bir ilaç kombinasyonudur. Kan basıncı tek başına Enalapril veya Lerkanidipin ile yeterince kontrol altına alınamayan hastalarda esansiyel arteriyel hipertansiyon tedavisinde endikedir (Sweetman, 2002; PDR, 2003, Üstünes, 2009) Çalışmanın Amacı Bu çalışmada, enalapril-lerkanidipin ve trandolapril-verapamil ikili karışımlarının ayrı ayrı ve bu 4 maddenin aynı anda YPSK tekniği ile analizleri için gerekli parametrelerin saptanması ve bu parametreler kullanılarak da aynı anda analizlerinin yapılabilmesi amaçlanmıştır. Bu nedenle değişik kolon, akış hızı, sıcaklık, ph, dalga boyu ve hareketli faz kullanılarak en iyi koşulların saptanabilmesi amaçlanmıştır. Saptanan bu en iyi koşullarda da YPSK yöntemi ile aynı anda hızlı duyarlı ve tamamen validasyonu yapılmış miktar tayini çalışmalarının yapılması ve geliştirilecek bu yöntemin farmasötik dozaj formlarına uygulanması planlanmıştır. Ayrıca geliştirilmesi planlanan bu yöntemin literatürde yer alan diğer yöntemlere göre daha hızlı, ucuz ve basit olması için parametreler araştırılacak ve eğer bu şartlar da sağlanırsa bu da ayrı bir orijinallik taşıyacaktır. Bununla beraber bu 4 etken maddenin aynı anda analizleri için gerekli parametreler incelenip, ayrılma şartları için optimizasyon çalışmaları yapılacaktır.

42 24 Bu tez kapsamında bu 4 etken maddenin iyonlaşma sabitlerinin tespitine de çalışılacaktır. İyonlaşma sabitleri (pk a değerleri) bileşiklerin iyonlaşma davranışını belirleyen temel parametreleridir. Bu tez kapsamında bu bileşiklerin pk a değerleri de tespit edilmeye çalışılacaktır Kullanılan Etken Maddeler Üzerine Yapılmış Çalışmalar Trandolapril Üzerine Yapılan Çalışmalar PISTOS ve arkadaşları (2005), insan plazmasında trandolapril tayini için sıvı kromotografi-kütle spektrometrisi metodu geliştirmiş ve tamamen valide etmişlerdir. Örnekler HLB Oasis katı-faz ekstraksiyon kartuşu kullanılarak ekstrakte edilmiştir. Kromotografik ayrımda X-Terra C 8 MS kolonu (150 mm 4,6 mm ID, 5 µm) kullanılmış ve 25 o C de çalışılmıştır. Hareketli faz kompozisyonu hacimce 4,3 mm trietilamin/asetonitril (40:60) ile hazırlanmıştır. Akış hızı 0.35 ml/dk ya ayarlanmıştır. Tayinde trandolaprilin alıkonma zamanı 7,0 dk olarak tespit edilmiştir. Trandolapril için kalibrasyon grafiği 2,0-750 ng/ml konsantrasyon aralıklarında doğrusal (r=0,996, n=9) ve gün içi ve günler arası BSS değerleri %3,83 ve 3,86 dır Verapamil Üzerine Yapılan Çalışmalar ÖZKAN ve arkadaşları (2000) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada, verapamilin YPSK yöntemiyle analizi ve bunun farmasotik preparatlara uygulanması amaçlanmıştır. İç standart olarak fluoksetin tercih edilmiştir. Yöntemde kullanılan kolon RP Supelcosil LC-18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) dir. Hareketli faz içeriği 0,05 M potasyum dihidrojen fosfat, asetonitril, o-fosforik asit

43 25 69,5:30:0,5, (h/h/h) olup ph 3,60 a ayarlanmıştır. Akış hızı olarak 1,5 ml/dk seçilmiştir. Çalışmada UV ve floresans dedektör birlikte kullanılmıştır. UV dedektörün dalga boyu 276 nm ye, floresans dedektörün eksitasyon dalga boyu 280 nm, emisyon dalga boyu ise 313 nm ye ayarlanmıştır. Saf standartların kromatogramına baktığımızda verapamilin alıkonma zamanı bu koşulda UV dedektörle 3,47 dk, fluoksetinin (iç standart) ise 4,67 dk dir. Florometrik dedektörle yapılan analizdeki alıkonma zamanı verapamil için 3,62, fluoksetin için 5,03 dk bulunmuştur. Tablet analizinde, on adet tablet tartılmış ve toz haline getirilmiş, yaklaşık 10 mg alınarak çözülmüş, süzülerek hareketli fazla seyreltilmiştir. Geri kazanım verileri incelendiğinde UV dedektör kullanıldığında %99,24 ve floresans dedeksiyon sonucunda %99,16 sonuçları bulunmuştur. Teşhis sınırları UV dedektör için 10 ng/ml, florimetrik dedektörde 750 pg/ml dir. Yöntemin rutin kalite kontrol analizlerinde kolayca uygulanabileceği sonucuna ulaşılmıştır. VALVO ve arkadaşları (1997), verapamil HCl ve bozunma ürünleri için geliştirdikleri ve validasyonunu gerçekleştirdikleri sıvı kromatografi yönteminde 5 µm Suplex pkb-100 (250 mm x 4,6 mm ) kolon kullanarak oda sıcaklığında ve akış hızı 1,5 ml/dk olacak şekilde çalışmalarını yapmışlardır. Görüntüleme dalga boyu olarak 278 nm seçilmiştir. Çalışma gradient olarak yapılmış olup hareketli faz bileşimi (A) ph sı 7,20 ye ayarlanmış 0,04 M potasyum dihidrojen fosfat, (B) asetonitril karışımı kullanılmış ve analiz süresi yaklaşık 36 dakika olarak bulunmuştur. Verapamil HCl için alıkonma zamanı 16 dakikadır. DEMİRCAN ve arkadaşları (2007), verapamilin elektro analitik olarak karakterize edilmesi ve farmasötik dozaj formlarıyla insan serumundan voltametrik tayini ile ilgili bir çalışma yapmıştır. Yapılan çalışmada, çalışma elektrodu olarak camsı karbon elektrot, referans elektrot olarak Ag/AgCl, yardımcı elektrot olarak da platin elektrot kullanmışlardır. Yöntem olarak dönüşümlü voltametri, diferansiyel puls voltametri (DPV) ve kare dalga voltametri (KDV) seçilmiştir. Analiz BAS

44 26 100W cihazı kullanılarak gerçekleşmiştir. ph 1-12 arası incelenmiş ve verapamilin yükseltgenmesi geri dönüşümsüz özellik göstermiştir. Elektrokimyasal olarak yapı incelendiğinde, yükseltgenmenin fenil halkasına bağlı metoksi grubundan gerçekleştiği düşünülmüştür. Kalibrasyon aralığı 8 x 10-7 M - 1 x 10-4 M arasında tutulmuştur. Teşhis sınırı DPV için 1,61 x 10-7 M ve SWV için 1,33 x 10-7 M olarak tespit edilmiştir. Tüm validasyon çalışmaları hem serum hem de etken madde üzerinde gerçekleştirilmiştir. Yapılan serum çalışmaları sonucunda insan plazmasından hiçbir elektro aktif girişim olmadığı gözlenmiştir. IVANOVA ve arkadaşları (2008), insan plazmasındaki verapamil tayini için hızlı ve duyarlı bir YPSK metodu geliştirmişlerdir. YPSK ayrımları Lichrospher 60 RP-select B (250 mm 4 mm I.D., 5 µm) kolonunda gerçekleşmiştir. Çalışma oda sıcaklığında yapılmıştır. Hareketli faz %40 asetonitril ve 0,025 mol/l KH 2 PO 4 ile hazırlanmış, ph 2,5 ve akış hızı 1 ml/dk olarak ayarlanmıştır. Dalga boyu 200 nm olarak belirlenmiş ve kalibrasyon grafiğinin ng/ml sınırında doğrusal olduğu bulunmuştur. Alıkonma zamanı verapamil için 4,2 dk olarak tespit edilmiştir. Geliştirilen metodun insan plazmasındaki verapamilin rutin analizleri için elverişli olduğu vurgulanmaktadır. VENKATESH ve arkadaşları (2007), buparvakon, atenolol, propranolol, kinidin ve verapamilin eş zamanlı miktar tayini için basit ve seçici ters faz YPSK metodu geliştirmişlerdir. Çalışmada 251 nm dalga boyunda UV dedektör kullanılmışlardır. Denenen farklı sabit fazlardan Thermo Hypersil C 4 (5 µm, 250 mm 4,6 mm) kolon en iyi sonucu vermiştir. Çalışma sıcaklığı 35 o C olarak belirlenmiştir. Örnek, sisteme 50 µl olarak enjekte edilmiştir. Hareketli faz; amonyum asetat tamponu (0,02 M, ph 3,5, asetik asitle ayarlanmış) ve asetonitrilin hacimsel olarak 30:70 oranında birleşmesiyle hazırlanmış ve sistem 1,0 ml/dk lık akış hızına ayarlanmıştır. Alıkonma zamanları atenolol, kinidin, propranolol, verapamil ve buparvakon için sırasıyla 4,30; 5,96; 6,55; 7,98 ve 8,54

45 27 dakikadır. Kalibrasyon doğrusu her analit için seçilmiş alanda doğrusal (tanımlayıcılık katsayısı 0,996) dır. Tayin alt sınırları atenolol için 15 µg/ml, kinidin için 0,8 µg/ml, propranolol için 5 µg/ml, verapamil için 10 µg/ml ve buparvakon için 200 ng/ml olup yöntem seçici ve duyarlıdır. Farklı saklama koşullarında yapılan kararlılık çalışmaları sonucunda tüm etken maddeler kararlı bulunmuştur. Bu geliştirilen yöntem basit, tekrar edilebilir ve rutin olarak kalite kontrol analizleri için kullanılabileceği vurgulanmıştır Enalapril Üzerine Yapılan Çalışmalar Al-OMARI ve arkadaşları (2001), ilaç matriksinin tablet formundaki enalapril maleatın dayanıklılığına etkileri üzerine bir çalışma yapmışlardır. ph, sıcaklık ve UV ışık etkisi ile bozundurulan enalapril maleattan, diketopiperazin ve enalaprilat ortaya çıktığı gözlenmiştir. 50 µl lik enjeksiyonlarla kolon fırını 65 o C de tutularak akış hızını 1,5 ml/dk olduğu koşulda, Licosphere C 8 kolon (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) kullanılmıştır. Hareketli faz bileşimi olarak 17:8 fosfat tamponu ve asetonitril tercih edilmiştir. Hareketli fazda kullanılan fosfat tamponu; 0,001 M potasyum dihidrojen fosfatın fosforik asitle ph 2,0 a ayarlanmasıyla oluşturulmuştur. Tayin yapılırken UV dedektör 215 nm ye ayarlanmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda bozundurulmayan enalapril maleatın alıkonma süresi 5 dakika civarında tespit edilmiştir. WANG ve arkadaşları (2007), enalapril ve enalaprilatın bir biyoeşdeğerlilik çalışması için insan plazmasından LC-MS ile tayinini gerçekleştirmişlerdir. Yöntemde enalapril ve onun birincil aktif metaboliti olan enalaprilatın ayrım ve tayini için LC-ESI-MS metodu geliştirilerek validasyonu yapılmıştır. Kromatografik koşullar incelendiğinde Thermo Hypersil- HyPURITY C 18 (150 mm x 2,1 mm, 5 µm) kolon kullanılmış ve kolon fırını 45 o C olarak ayarlanmıştır. Hareketli faz bileşimi içerisinde metanol ve %0,15 triflor asetik asit içeren 20 mm

46 28 amonyum asetat hacimce 53:47 şeklinde bulunmaktadır. Çalışma ortamı olarak ph 3,0 tercih edilmiş ve akış hızı 0,25 ml/dk olarak ayarlanmıştır. Metodun validasyonunda kalibrasyon aralığı 1, ng/ml arasında tutulmuştur. Validasyon aşamasında matriks etkisi, seçicilik, doğrusallık, hassaslık, dayanıklılık ve geri kazanım çalışmalarına da yer verilmiştir. Kromatografik ayrım zamanı 3,5 dakika civarındadır. Biyoeşdeğerlilik çalışması 20 sağlıklı insanda 20 mg enalapril maleatın oral yolla verilmesinden sonra gerçekleşmiştir. ROSKAR ve arkadaşları (2009), yeni buldukları ve potansiyel bir ACE inhibitörü olabilecek bir yapının farklı ph lardaki sulu çözeltilerinin dayanıklılığı üzerine yaptıkları çalışmada bu maddeyle birlikte enalapril maleat ve perindopril maddelerini de incelemişlerdir. Bu yeni yapıya xpril adını vermişlerdir. Çalışimada farklı ph larda (2,0; 6,8; 12) ve sıcaklıklarda (40, 60 ve 80 o C) bu yapıların bozundurulması amaçlanmıştır. YPSK ile yapılan çalışmalarda dayanıklılıklar ölçülmüştür. En yüksek kararlılık ph 2,0 de gözlemlenmiştir. xpril yapısı için kromatografik koşullar incelendiğinde Synergi Hydro (250 mm x 4,6 mm, 4 µ) kolon kullanılmıştır. Kolon fırını 60 o C ve akış hızı da 1 ml/dk şeklinde ayarlanmıştır. Hareketli faz kompozisyonu 30:70 metanol-trietilamin sulu çözeltisi seçilerek ph 2,3 olacak şekilde orto fosforik asitle ayarlanmıştır. UV tayini 215 nm de gerçekleştirilmiştir. Bunun yanı sıra enalapril maleat ve perindopril için geliştirilen YPSK yönteminde Hypersil ODS (250 mm x 4 mm, 5 µm) kolon kullanılmıştır. Kolon fırını sıcaklığı 70 o C ve hareketli faz çözücüsü yüzdeleri hacimce 48:52 fosfat tamponu ve asetonitril içermektedir. Bu hareketli faz bileşiminde ph 2,0 olarak ayarlanmıştır. Çalışma gradient yapılmış ve tayin 215 nm de gerçekleşmiştir. Kalibrasyon aralığı 0,2 x ,3 x 10-3 mg/ml arasındadır. Teşhis sınırı 0,05 µg/ml bulunmuştur. LU ve arkadaşları (2009), enalapril ve enalaprilatın insan plazmasından YPSK- MS ile miktar tayini üzerine çalışmışlardır. İç standart olarak benazepril kullandıkları çalışmada analitik kolon olarak Ultimate TM XB-C 18 (50 mm x 2,1

47 29 mm, 3 µm) kullanmışlardır. Bununla birlikte hareketli faz bileşimi olarak metanol-su-formik asit 62:38:0,2 (h/h/h) tercih edilmiştir. Çalışma yapılırken oto örnekleyicinin sıcaklığı 4 o C de tutulmuştur. Tayin ESI-MS ile yapılmıştır. Analiz 2,5 dakikada tamamlanmıştır. Kalibrasyon grafiği 0, ng/ml arasında doğrusaldır. Tayin alt sınırı 0,638 ng/ml olarak hesaplanmıştır. Enalapril maleat için geliştirilen bu metodun validasyonu yapılarak, farmakokinetik çalışmalar 20 erkek gönüllü ile gerçekleştirilmiştir. HILLAERT ve arkadaşları (2001), bazı ACE inhibitörlerinin kapiler elektroforez ile kantitatif olarak tayini üzerine yaptıkları çalışmada ph 7,0 ve 6,25 olan 100 mm fosfat tamponları kullanmışlardır. Bu tamponların yüksek seçiciliğine dayanan yöntemde enalapril, lisinopril, fosinopril, kinapril, perindopril ve benazeprilin farmasötik dozaj formlarından tayin edilmişlerdir. Özellikle eş zamanlı tayinlerde etkileyici sonuçlarla karşılaşıldığı belirtilmiştir. Uygulanan voltaj 30 kv olup tayin 214 nm de yapılmış ve enalapril için cevap 7,896 dakikada tespit edilmiştir. LIMA ve arkadaşları (2008), enalapril maleat üzerine dayanıklılık ve in vitro salınım profili tespiti için bir çalışma yapmışlardır. Bu çalışmada enalapril maleatın yüksek sıcaklıklarda bozunup iki temel bozunma ürünü ortaya çıkardığı tespit edilmiştir. Bunlardan birisi enalaprilat iken diğerinin diketopiperazin olduğunu belirtmişlerdir. Yapılan dayanıklılık çalışmaları neticesinde 20 mg enalapril maleat içeren tabletlerdeki salınım ve ilaç konsantrasyonu değerlerine dikkat çekmişlerdir. Kromatografik koşullar göz önüne alındığında C 18 Chrompack ters faz (250 mm x 4,6 mm, 5µm) kolon kullanılmıştır. Hareketli faz bileşenlerine bakıldığında ph sı 2,2 ye ayarlanmış hacimsel olarak %25 asetonitril, %75 10 mm sodyum dihidrojen fosfat tamponu çözeltisi kullanılmıştır. İzokratik olarak gerçekleşen çalışmada akış hızı 1,5 ml/dk ve kolon fırın sıcaklığı 60 o C olarak ayarlanmış, UV görüntüleme 215 nm de gerçekleşmiştir. Enalaprilat,

48 30 enalapril ve diketopiperazinin alıkonma zamanları sırasıyla 2,5 dakika, 11,5 dakika ve 31 dakika olarak tespit edilmiştir. BHARDWAJ ve arkadaşları (2008), enalapril maleatın bozunma davranışını inceledikleri çalışmalarında sıvı kromatografi ve sıvı kromatografi-kütle spektroskopisi yöntemlerini kullanmışlardır. Yapılan çalışmalarda enalapril maleat asidik ortamda, nötral ortamda ve bazik ortamda 80 o C de bekletilmiştir. Fotoliz aşamalarında ise 0,1 N HCl, su ve 0,1 N NaOH içeren 40 o C lik ortamlar kullanılmıştır. Bunun yanı sıra 50 o C lik kuru banyoda 60 gün boyunca ışıklı ve ışıksız ortamlarda da bekletilmiştir. Bu aşamalardan sonra YPSK analizleri gerçekleştirilmiş ve daha sonra da kütle spektroskopisi kullanılarak bozunma ürünlerinin neler olduğu bulunmaya çalışılmıştır. Gözlenen beş safsızlıktan ikisi enalaprilat ve diketopiperazin yapılarıyla eşleşmişlerdir. Ayrımlar için farklı koşullar denenerek uygun metot geliştirilmiştir. Burada öncelikle yüksek sıcaklıklar için (70 o C ve üstü) C 8 polimerik kolonlar denenmiş, kolonda pik şekillerinin düzgün olmadığı gözlemlenmiş, daha düşük sıcaklıklara inilerek C 18 kolonlar tercih edilmiştir. Farklı ph modifikasyonlarıyla birlikte farklı hareketli faz bileşimleri de denenerek metanol ile asetat tamponu karışımına karar verilmiştir. Çalışma dalga boyu olarak 215 nm tercih edilmiştir. Alıkonma zamanları incelendiğinde enalapril maleat 26 dakikada kolondan alınmıştır. GARG ve arkadaşları (2008), enalapril maleat ile amlodipin besilatın kombinasyonunu birlikte içeren farmasötik dozaj formlarından eş zamanlı analizleri için türev spektroskopisi yöntemini geliştirmişlerdir. Kullanılan yöntemler incelendiğinde ilk metot olarak enalaprilin 209 nm ve amlodipinin 238 nm deki dalga boyları alınmış ve farklı konsantrasyonlardaki çözeltileriyle ayrı ayrı kalibrasyon grafikleri oluşturulmuştur. Daha sonra ikisinin karışımlarının 219 nm deki kalibrasyon grafiği çizilmiştir. İkinci metot olarak oranlama (ratio) yöntemi seçilmiş ve birbirlerinin maksimum dalga boylarına bir diğer bileşik bölünerek girişim azaltılmıştır. Üçüncü yöntemde ise türev spektroskopisi

49 31 metodundan faydalanılmıştır. Enalapril maleat ve amlodipin besilatın birinci dereceden türevleri alınıp ayrımın en net gerçekleştiği ve birbirlerine girişimleri olmadığı dalga boylarına bakıldığında enalapril için 227 nm ve amlodipin için 327,5 nm olduğu görülmüştür. Her üç metot da kıyaslanmış ve tablet analizlerindeki geri kazanımlar açısından türev spektoskopisi metodunun daha iyi sonuç verdiği belirtilmiştir. STOLARCZYK ve arkadaşları (2008), hidroklorotiazid, valsartan, kandesartan ve enalapril için yeni bir kromatografik ve dansitometrik analiz yöntemi geliştirmişlerdir. Bu ilaç etken maddeler hipertansiyon tedavisinde çeşitli kompleksler yaptırılarak kullanılmaktadır. Enalapril için yaptıkları ince tabaka kromatografisi analizinde sabit faz olarak F 254 tabakalar, hareketli faz olarak 1- bütanol-asetik asit-su kompozisyonunu hacimsel olarak 12:3:5 şeklinde belirlemişlerdir. Dansitometrik analizlerdeki dalga boyu olarak enalapril için 208 nm seçilmiştir. Çalışmalar oda sıcaklığında gerçekleşmiş olup 10 cm x 10 cm 5 µm tabakalar kullanılmıştır. Çalışmada enalaprilin R f değeri 0,61 olarak ölçülmüştür ve teşhis sınırı 0,172 µg dır. BONAZZI ve arkadaşlarının (1997), yaptığı çalışmada ACE inhibitörlerinin (ramipril, benazepril, enalapril maleat, lisinopril ve kinapril) türev spektroskopisi ve YPSK yöntemiyle farmasotik dozaj formlarından tayini amaçlanmıştır. Bunun için; öncelikle seçicilik ve duyarlılığı sağlamak adına UV spektrofotometri yöntemi için bir türev metodu uygulaması geliştirilmiş, daha sonra yeni bir YPSK yöntemi optimize edilmiştir. Bu iki yöntem birleştirilmiş ve farmasotik preparatlara uygulanmıştır. Spektrofotometrik analizler çift ışın yollu spektrofotometre kullanılarak gerçekleştirilmiştir. YPSK yöntemi için tercih edilen kolon Hypersil ODS (250 x 4,5 mm i.d, 5 µm) analitik kolondur. Hareketli faz stok karışımı olarak asetonitril-thf (95:5) kullanılmış, 20 mm sodyum heptasulfonat ilave edilmiş ve ph 2,5 e ayarlanmıştır. Akış hızı olarak 1 ml/dk seçilmiştir. Hareketli faz bileşimi ramipril, kinapril, benazepril için 52:48 h/h,

50 32 lisinopril ve enalapril için ise 63:37 h/h olarak ayarlanmıştır. Kromatografik olarak yapılan çalışmalar sonucu yüksek sıcaklık ve/veya düşük ph değerlerinde ayrımın ve pik şeklinin daha iyi olduğu görülmüştür. Bileşiklerin alıkonma sırası bu yöntemde; lisinopril, enalapril benazepril, ramipril ve kinapril olup analiz yaklaşık 25 dakikada tamamlanmıştır. Dozaj formlarına uygulanırken tek bir etken madde içeren dozaj formları kullanılmıştır. F-testi ve T-testi de uygulanarak iki yöntemin kıyaslamasına gidilmiştir. %95 güven aralığında yöntemler arası anlamlı bir fark bulunmadığı sonucuna varılmıştır. Geri kazanım değerleri (%98,7-99,8) değişiklik göstermektedir. PISAREV ve arkadaşları (2005), kan plazmasında enalapril ve enalaprilat tayini için tekrar edilebilir ve hassas bir analitik yöntem geliştirmişlerdir. Tayinde YPSK ile kütle spektrometrik dedektör kullanılmıştır. Hassasiyet ve tekrar edilebilirliğin devamlılığını sağlamak amacıyla, analiz edilen bileşiklerden metil esterleri elde etmek için örnekler diazometan ile muamele edilmiştir. Miktar tayini yapılırken iç standart kullanılmıştır. Kullanılan iç standart kaptoprildir. Enalaprilat ve kaptopril katı faz ekstraksiyonuyla kan plazmasından izole edilmiştir. Kolon olarak Zorbax SB-C (4,6 mm 150 mm, 5 µm) kullanılmış ve 80 o C de çalışılmıştır. Hareketli faz iki çözelti karışımından oluşmuştur: (A) hacimce metanol 0,1 M amonyum asetat formik asit (95:5:0,5); (B) hacimce su 0,1 M amonyum asetat formik asit (95:5:0,5). Çözelti derişimi karışım A da %55 ten 75 e kadar artarak 8 dk boyunca geçmiştir. Kalibrasyon grafiği 0,5-200 ng/ml arasında doğrusaldır. Kan plazmasında enalaprilat ve enalaprilin teşhis sınırı 0,1 ng/ml dir. Akış hızı 0,7 ml/dk ve örneğin enjeksiyon hacmi 50 µl dir. Enalapril in alıkonma zamanı 8,4 dakikadır. Kandan analiz, 18 gönüllüden alınan örneklerle yapılmıştır. Çalışma ilaç verildikten sonra 14 gün arayla iki aşamada tamamlanmıştır. ELMALI ve arkadaşları (2003), enalapril maleat için diferansiyel puls polarografisi metodu geliştirmişlerdir. Çalışmalarda enalapril maleat metanol içerisinde -1,4 V de pik vermiştir. Kalibrasyon eğrisi µg/ml arasında

51 33 doğrusal olarak tanımlanmıştır. Bu metoda karşılaştırma olarak YPSK yöntemi kullanılmıştır. Hareketli faz bileşimi hacimce 84:16 asetonitril, trietilamin sulu çözeltisi karışımıyla hazırlanmış ve ph sı 3,0 a orto fosforik asitle ayarlanmıştır. Hareketli fazın akış hızı 1,0 ml/dk olarak ayarlanmış görüntüleme 256 nm de yapılmıştır. Kolon olarak Bondapak C 18 (300mm x 3.9 mm, 10µm) kullanılmıştır. Çalışmada iç standart metodu uygulanmış ve iç standart olarak hidroklorotiazid tercih edilmiştir. Enalapril malerat için alıkonma zamanı 2,4 dakika olarak ölçülmüştür Lerkanidipin Üzerine Yapılan Çalışmalar POPOVIC ve arkadaşları (2008), çalışmalarında lerkanidipin HCl ve safsızlıklarını Drylab yazılımı ve faktöriyel tasarım prosedürlerini kullanarak analiz etmişlerdir. Lerkanidipin ve üç safsızlığının tayininde hareketli faz olarak %35 asetonitril ve %1,5 TEA içeren sulu çözelti karışımını kullanmışlardır. Hareketli faz ph sı 3,0 olarak ortofosforik asitle ayarlanmıştır. Yöntemlerinde 1 ml/dk lık akış hızı ve 20 mm x 4,6 mm, 3,5 µm lik XTerra C 18 kolon kullanmışlardır. Sıcaklık olarak 20 o C belirlenmiştir. Lerkanidipin ve safsızlıkları 240 nm de görüntülenmiş ve lerkanidipin HCl nin alıkonma zamanı bu koşulda 6,045 dakika bulunmuştur. BARANDA ve arkadaşları (2004), beş adet 1,4 dihidropiridinin farmasötik dozaj formlarından eş zamanlı tayinlerini YPSK cihazında amperometrik dedeksiyonla yapmışlardır. Analiz edilen bileşikler içerisinde amlodipin, nitrendipin, felodipin, lasidipin ve lerkanidipin bulunmaktadır. Kromatografik koşullar incelendiğinde kolon olarak LC ABZ Plus C 18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) tercih edilmiştir. Hareketli faz bileşimi olarak 72:28 asetonitril su karşımı seçilmiş olup 10 mm asetik asit, sodyum asetat tamponu ile ph 5,0 a ayarlanmıştır. Çalışma 30 o C de gerçekleşirken akış hızı 1 ml/dk belirlenmiştir. Çalışma potansiyeli olarak 1100

52 34 mv kullanılmıştır. Lerkanidipin için alıkonma zamanı 10,14 dakika olarak ölçülmüştür. Bu tayin için gerekli validasyon parametreleri de gerçekleştirilmiş, kalibrasyon aralığı 4,5-15 ppm arasında olup teşhis sınırı 1,17 ppm dir. SALEM ve arkadaşları (2004), lerkanidipinin insan plazmasından tespiti için geliştirdikleri seçici ve hızlı sıvı kromatografisi-kütle spektroskopisi metodunda analitik kolon olarak Thermo Hypersil C 8 (150 mm x 4,6 mm, 3 µm) kullanmışlardır ve bu kolonu korumak için de ön kolon olarak Phenomenex C 18 (4 mm x 2 mm) seçilmiştir. Hareketli faz bileşimi %0,5 asetik asit, %0,5 trietilamin içeren metanol-su karışımından oluşmaktadır. Oda sıcaklığında yapılan çalışma için akış hızı 0,8 ml/dk olarak ayarlanmıştır. Lerkanidipin için alıkonma zamanı 5,34 dakikadır. Bu yöntem için gerekli validasyon parametreleri de gerçekleştirilmiş ve kalibrasyon aralığı 0,1-16 ng/ml arasında tutulmuştur. ÁLVAREZ-LUEJE ve arkadaşları (2002), ticari tabletlerdeki lerkanidipin tayini için seçici bir ters faz YPSK metodu geliştirmişlerdir. Tayin için UV dedektör (356 nm) ve elektrokimyasal dedektör (1000 mv) kullanılmıştır. Çalışmanın kalibrasyon aralığı M dır. İlaçtaki diğer etken maddeler (talk, laktoz, mikrokristal selüloz, karboksimetilselüloz, magnezyum stearat ve mısır nişastası) metodun seçiciliğine zarar vermemiştir. Çalışmadaki hareketli faz çözeltisi %45 asetonitril, %55 0,01 M lık fosfat tamponuyla seyreltilerek ph 4 e ayarlanmıştır. Kromatografik kolon olarak Symmetry C 18 (5 µm), koruyucu kolon olarak C18 Bondapak (30 4,6 mm) kolonları kullanılmıştır. UV dedektör görüntülenmesi 356 nm de yapılmıştır. Elektrokimyasal dedektörde çalışma elektrodu olarak camsı karbon elektrot, referans elektrot olarak Ag/AgCl/NaCl 3 M, yardımcı elektrot olarak da platin elektrot kullanılmıştır. Tayin 1000 mv ta yapılmıştır. Çalışılan sıcaklık 25 o C, akış hızı 1 ml/dk dır. Lerkanidipin için alıkonma zamanı 5,0±0,7 dakika olarak ölçülmüştür. MIHALJICA ve arkadaşları (2005), Carmen tabletlerindeki lerkanidipin hidroklorid ve bunun sentetik bozulmaları, indirgenme ve yükseltgenme

53 35 ürünlerinin tayini için bir ters faz YPSK metodu geliştirmişlerdir. En iyi ayrım Zorbax SB C 18 kolonu, 250 mm 4,6 mm, 5 µm partikül büyüklüğünde gerçekleşmiştir. Hareketli faz bileşimi hacimsel olarak asetonitril-su-trietilamin 55:44,8:0,2 (h/h/h) ve akış hızı 1 ml/dk olacak şekilde hazırlanmıştır. ph ortofosforik asit ile 3,0 a ayarlanmıştır. Analiz 240 nm de gerçekleştirilmiştir. Kromotografik ayrım zamanı 6 bileşen için 12 dakikadır. Lerkanidipin için alıkonma zamanı 5 dakikadır. Lerkanidipin hidroklorür ve safsızlıklarının kromotografik koşulları aynıdır, fakat deney için lerkanidipin hidroklorürün konsantrasyonu 0,03 mg/ml iken safsızlıklarının konsantrasyonu 0,3 mg/ml dir. Yöntemin validasyonu da yapılmış olup; doğrusallık, seçicilik, doğruluk, duyarlılık, hassasiyet, geri kazanım ve tekrar edilebilirlik gibi parametreler de incelenmiştir. CHARDE ve arkadaşları (2007), yeni ve hassas bir ters faz YPSK metodu geliştirmişler ve izokratik koşullar altında UV dedektörü kullanarak tavşan kanının serumundan lerkanidipin hidroklorürü ölçmek için valide etmişlerdir. Dedektörden ng/ml konsantrasyon aralığında doğrusal bir sonuç alınmıştır. Çalışmada C 18 ters faz kolonu (Lichrospher, 125 mm 4,6 mm, 5 µm) kullanılmıştır. Hareketli faz, ph sı 4,0 a 0,1 M lık orto fosforik asitle ayarlanmış sulu potasyum dihidrojen fosfat tamponu ve asetonitrilin hacimsel olarak %40 ve % 60 karışımı şeklinde hazırlanmıştır. Bu sistemin de akış hızı 1 ml/dk ya ve dalga boyu 240 nm ye ayarlanmıştır. Enjeksiyon hacmi 100 µl dir. Alıkonma zamanı 9,21±0,24 dakika olarak belirlenmiştir. Hareketli faz olarak %60 yerine %50 asetonitril kullanılırsa alıkonma zamanı 18,34 dakikaya gelmiş, %60 asetonitril yerine %60 metanol kullanılırsa analiz 16,40 dakikada tamamlanmıştır. FIORI ve arkadaşları (2006), lerkanidipinin fotokimyasal dayanıklılığı ve tabletlerinden analizi üzerine yaptıkları çalışmada YPSK-UV yöntemini kullanmışlardır. Lerkanidipin ve onun foto bozunma ürünlerinin ayrımı ters faz YPSK metodu ile yapılmıştır. Bozunmadan sonra ortaya çıkan ürünler YPSK-

54 36 MS/MS analiziyle tanımlanmıştır. Kromatografik kolon olarak Phenomenex Luna C18 (2 mm x 150 mm, 3,5 µm) kullanılmıştır. Hareketli faz içeriği hacimce 60:40 metanol-trietilenamin tamponu olarak seçilmiş ve ph 4,0 a asetik asitle ayarlanmıştır. Seçilen akış hızı ise dakikada 250 µl dir. UV dedektörle yapılan tayinde dalga boyu 265 nm dir. Analizde lerkanidipin için alıkonma zamanı 8,5 dakika ve tüm analiz süresi 18 dakika olarak bulunmuştur. KALOVIDOURIS ve arkadaşları (2006), kolay, duyarlı ve hızlı bir UPSK/ESI- MS/MS metodu geliştirmişler ve insan plazmasındaki lerkanidipin tayini için valide etmişlerdir. Lerkanidipin ve iç standart, nikardipin, tert-bütil metil eter kullanılarak sıvı-sıvı ekstraksiyonuyla plazmadan ayrılmıştır. UPSK analizlerinde Acquity UPLC BEH C 18 analitik kolonu (2,1 mm 50,0 mm i.d., 1,7 µm) kullanılmıştır. Hareketli faz konsantrasyonu hacimsel olarak %0,2 formik asit ihtiva eden su içinde %70 asetonitril ile hazırlanmış ve 0,30 ml/dk lık akış hızında verilmiştir. Lerkanidipin için kalibrasyon grafiği 0,05-30 ng/ml arasında doğrusaldır. Tayin alt sınırı 0,05 ng/ml olarak hesaplanmıştır. Kromatografik ayrım 1 dakikada tamamlanmıştır. Lerkanidipin için alıkonma zamanı 0,41 dakika, nikardipin için ise 0,38 dakika olarak belirlenmiştir. Validasyon çalışmaları yapılmış olup gün içi ve günler arası tekrar edilebilirlik değerleri kontrol edilmiştir. Bu metodun farmakokinetik ve biyoeşdeğerlik çalışmalarında kullanılabileceği öngörülmüştür. ÁLVAREZ-LUEJE ve arkadaşları (2002), lerkanidipinin voltametrik davranışını incelemiş ve tabletlerinden tayini için bir yöntem geliştirmeyi amaçlamışlardır. Lerkanidipinin aromatik halkadaki azot atomu üzerinden indirgendiği düşünülmektedir. Lerkanidipin etanol, 0,04 M Britton Robinson tamponu (20:80; h/h) ortamında analiz edilmiştir. Yapılan analizler sonucunda mekanizmanın geri dönüşümsüz ve difüzyon kontrollü olduğu ortaya konulmuştur. Kalibrasyon aralığı 3 x x 10-5 M olmakla beraber geri kazanım değeri % 98,3 hesaplanmıştır. Karşılaştırma metodu olarak YPSK dan faydalanılmıştır. Analitik

55 37 kolon olarak Bondapak/Porasil C 18 (3,9 mm x 150 mm) ve ön kolon olarak Bondapak C 18 (30 mm x 4,6 mm) kullanılarak tayin 356 nm de gerçekleştirilmiştir. Hareketli faz bileşimi ph 4,0 a ayarlanmış asetonitril-fosfat tampon çözeltisinden (45:55; h/h) oluşmaktadır. Akış hızının 1,0 ml/dk olduğu çalışmada sıcaklık 25 o C de tutulmuştur. Bu analizde lerkanidipin için alıkonma zamanı 5,0 dakika olarak ölçülmüştür Verapamil ve Trandolapril İkili Karışımı İçin Yapılan Analizler CAPELLA-PEIRO ve arkadaşları (2007), verapamil ve trandolaprilin kapiler elektroforez ile ayrımları için faktöriyel tasarım metodu optimize etmişlerdir. Faktöriyel dizaynın çalışmalara getirdiği kolaylığın daha az deney yaparak optimum ph, konsantrasyon ve elektrolit tamponunun bulunması olduğunu belirtmişlerdir. Bu çalışmaları izleyerek çalışma tamponu olarak 10 mm ph 7,0 olan fosfat tamponu kullanılmıştır. Uygulanan voltaj 15 kv olup bu koşullarda kalibrasyon eğrisinin tanımlayıcılık katsayısı 0,999 dur. Validasyon parametrelerinden gün içi ve günler arası tekrar edilebilirlik değerleriyle teşhis sınırı ile tayin alt sınırı parametreleri tespit edilmiştir. Yöntemde DAD dedektör kullanılmış ve görüntüleme 214 nm de gerçekleşmiştir. Elektroforetik ayrım 25 o C de gerçekleşmiş ve örnekler 10 saniye boyunca 1 psi basınçla yüklenmiştir. Bu koşullar altında analiz süresi 3 dakika sürmüştür. Trandolapril ve verapamil için teşhis sınırları sırasıyla 25 ve 35 ng/ml, tayin alt sınırları ise her ikisi için 90 ng/ml bulunmuştur. GUMIENICZEK ve arkadaşları (2001), çalışmalarında trandolapril ve verapamilin farmasotik dozaj formları için bir ters faz sıvı kromatografik yöntemi geliştirip bu yöntemi valide etmişlerdir. LiChrosorb RP18 kolonun (250 mm x 4,5 mm i.d, 10 µm) kullanıldığı çalışmada hareketli faz bileşimi için optimum koşul olarak (40:40:20; ph 2,7) asetonitril metanol-fosfat tamponu belirlenmiştir. Akış

56 38 hızı 1 ml/dk olup 220 nm de görüntüleme yapılmıştır. İç standart olarak asetazolamit seçilmiştir. Çalışma yapılırken 20 kapsül tartılmış ve ortalama ağırlık tespit edilmiştir. Alıkonma zamanları; trandolapril için 3,65 dakika, verapamil için 5,01 dakika ve iç standart olan asetazolamit için 2,65 dakikadır. Yapılan validasyon çalışmaları sonucu trandolapril için korelasyon katsayısı r: 0,9995, verapamil için 0,9994 bulunmuştur. Geri kazanım çalışmaları sonucunda trandolapril için % 99,94, verapamil için ise %98,13 değerleri bulunmuştur.

57 Kromatografi Kromatografi birbirine fiziksel ve kimyasal özellikleri bakımından benzeyen maddelerin, karışımların, birbirinden ayrılmasını, tanınmasını ve tayinini sağlayan, birçok yöntemi kapsayan yöntemlerin genel adıdır (Skoog, 1998). Yüzlerce maddenin karışımı bile kromatografi yöntemiyle analiz edilebilir. Kromatografi terimi ilk olarak Mikhail Tswett tarafından 1906 yılında kullanılmıştır. Daha sonraları analitik çalışmaların birçoğunda kromatografi yer almıştır. Kromatografik ayırmada örnek, gaz, sıvı veya süper kritik bir akışkan olan hareketli faz ile sistemde taşınır. Hareketli faz, katı bir yüzeyde ya da kolonda sabitleştirilmiş ve hareketli faz ile karışmayan bir sabit faz içerisinden geçirilir. Bu iki fazın seçimi, örnek bileşenlerinin hareketli ve sabit fazlarda farklı oranlarda dağılmasını hedefler. Örnek içerisindeki bileşenler ile sabit faz arasında bazı fiziksel ve kimyasal etkileşimler olur. Örneğin kolon boyunca hareketi sabit faz ve hareketli faz arasındaki kimyasal ve fiziksel dengelerin dağılımına bağlıdır. Bunlar çözünürlük, elektron çifti alıcı-verici etkileşimler, iyonik etkileşimler ve hidrojen bağı oluşumu gibi olaylardır (Hamilton, 1982; Bidlingmeyer, 1992). İyonik etkileşimler, a) İyonlar arasındaki kulomb çekim kuvvetleri b) İyon-indirgenmiş iyon etkileşimleri c) Dipol-dipol etkileşimleri d) Dipol-indirgenmiş dipol etkileşimleri e) Nötral atom ya da moleküller arası kuvvetlerdir (London kuvvetleri). Ayrıca en iyi koşulların sağlanabilmesi için, sabit faz yapısı, hareketli faz bileşimi ve sıcaklığın dağılıma etkisi de ayarlanabilir.

58 40 Hollandalı kimya mühendisi Van Deemter kendi adını taşıyan ve kromatografik kolondaki ayırma olaylarını matematiksel olarak tanımlayan bir eşitlik bulmuştur (Bidlingmeyer, 1992). H=A+B/u+C (1.1) Eşitlik 1.1 de; H: Tabaka yüksekliği (cm) A: Çoklu akış yolları ve Eddy difüzyon B: Boyuna difüzyon C: Fazlar arasındaki kütle aktarımı u: Çizgisel hız Karışımda bulunan maddelerin kolon boyunca ayrılması ve hareketli faz akış hızıyla kolondan geçmesi Şekil 1.5 de gösterilmiştir. Kromatografik sistem iki ana grupta toplanır; hareketli fazın gaz ya da sıvı olmasına bağlı olarak gaz ve sıvı/süperkritik akışkan kromatografisidir. Kromatografik yöntemler hareketli fazın gaz ya da sıvı olmasına, sabit fazın katı ya da sıvı olmasına, kromatografik ayırımın mekanizmasına ve ayırma tekniğine göre isimlendirilirler (Adamovics, 1997) (Şekil 1.6) Karışım Ayrılma Ayrılma bitmiştir, kolona başlar. maddeler dedektöre yüklenir. ayrı olarak gider. Şekil 1.5. Kromatografik ayırımın şematik olarak gösterilmesi

59 Şekil 1.6. Kromatografik sistemin sınıflandırılması (Sewel, 1987) HPLC: Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi, TLC: İnce tabaka kromatografisi HPTLC: Yüksek basınçlı ince tabaka kromatografisi 41

60 Adsorpsiyon Kromatografisi Adsorpsiyon; çözünmüş maddenin gaz halinde katı faz üzerinde tutunmasıdır. Bu kromatografi çeşidi bir sıvı/gaz-katı kromatografisidir. Adsorpsiyon özelliği gösteren maddelere adsorban denir ve burada tutunma yüzeyseldir. Adsorpsiyon sırasında çözücü içinde maddeler adsorbe ya da desorbe olabilir. Adsorpsiyon ve desorpsiyon hızlarının farkı toplam adsorpsiyon olarak tanımlanır. Adsorpsiyon ve desorpsiyon hızları birbirine eşit ise denge halindedir ve bu durumda madde kolonda sabit hızla ilerler. Sabit faz ile hareketli faz arasındaki bir A çözüneni için kütle aktarımı şu şekilde ifade edilebilir (Skoog, 1998). A hareketli faz A sabit faz (1.2) Çözünen maddenin adsorpsiyon katsayısı veya dağılma katsatısı K; maddenin adsorbandaki molar derişiminin (C 1 ), maddenin hareketli fazdaki derişimine (C 2 ) oranı ile tanımlanır. C K= C 1 2 (1.3) K değerinin büyük olmasının anlamı, karışım içindeki maddenin adsorban tarafından daha iyi tutunduğunu, K değeri daha düşük maddelere göre daha yavaş ilerlediğini gösterir. K değerinin küçük olması ise maddenin hareketli faza daha ilgili olduğunu göstermektedir (Hamilton, 1982).

61 İyon Çifti Kromatografisi Bu yöntemde dağılma kromatografisiyle ayrılamayan moleküllerin ayrılması sağlanır. İyon-çifti oluşturma kromatografisinde iyonlaşabilen ve iyonik moleküller, hareketli faza eklenen uygun bir karşı iyon ile iyon çifti oluşturularak lipofilik karakter kazandırılır ve sabit faza olan ilgi arttırılır. İyon çifti oluşturan maddeler pik kuyruklamasını engellemeyi ve pik keskinliğini arttırmayı, sabit faz üzerindeki artık silanol gruplarını örterek sağlarlar. Genelde iyon çifti madde olarak; tersiyer aminler, kuvaternar aminler, alkil sülfonik asitler, alkil sülfonatlar kullanılır (Sewell, 1987) İyon Değiştirme Kromatografisi İyon değiştirme kromatografisi tıpkı iyon-çifti kromatografisi gibi iyonik ya da iyonlaşabilen maddelerin ayrılmasında yararlanılan bir tekniktir. Bu kromatografide belirli ph değerlerinde iyon veye iyonik yapı verebilen moleküller (organik baz ya da organik asitler) ya da iyonik yapılar (K +, Na +, SO 4 ) ayrılır. Sabit faz ile ayrılacak madde arasında iyonik bağ ne kadar kuvvetli ise o kadar güçlü bir alıkonma sağlanır. Sulu tuz çözeltileri ve az miktarda alkol içeren polar hareketli faz çözeltileri ile asidik ya da bazik gruplar bağlanmış sabit fazlar kullanılmaktadır. Ayırım pk a ya yani analizi yapılacak maddenin iyonik yapısına bağlıdır. Maddenin adsorplanmasından sonra desorpsiyon hareketli fazın ph değerinin ya da hareketli fazdaki tuz çözeltinin bileşiminin değiştirilmesiyle sağlanır. Peptitlerin ve proteinlerin ayrılmasında kullanılan bir yöntemdir. Sıklıkla kullanılan katyon ve anyon değiştiriciler Çizelge 1.3 de verilmiştir (Skoog, 1998; Hamilton, 1982; Sewel, 1987; Bidlingmeyer, 1992; Meyer, 1988; Adamovics, 1997).

62 44 Çizelge 1.3. Katyon ve Anyon Değiştiriciler Anyon Değiştiriciler Katyon Değiştiriciler Polimer Temelli Değiştiriciler Hidrofobik Hidrofilik Sitrat Ba +2 Ag + Sülfat Pb +2 Cs + i. Polisitiren i. Selüloz Oksalat İyodür Nitrat Kromat Sr +2 Ca +2 Ni +2 Cd +2 Rb + K + + NH 4 Na + ii. Polimetilmetakrilat (%20 Çapraz bağlı divinil benzen içermektedir) ii. Dekstran (Ticari adı cephadex) Bromür Cu +2 H + Tiyosiyanat Co +2 Li + Klorür Mg +2 Format UO 2 +2 Asetat Te +2 Hidroksit Florür Eleme Kromatografisi Eleme kromatografisiyle ayırımda molekülün büyüklüğü önem taşır. Molekülün büyüklüğü hakkında da bilgi edinilebilir. Çözücü viskozitesi çalışma sıcaklığında düşük olmalıdır ve seçilen hareketli fazın organik bileşiminin analizi edilecek örneği iyi dağıtması gerekir. Çözücü piki ise karışımdaki maddelerden sonra gelir. Çoğunlukla üç çeşit jel kullanılmaktadır; aerojeller, zerojeller ve zerojel-aerojeller. Eleme kromatografisinde kullanılan çözücüler ve fiziksel özellikleri Çizelge 1.4 de verilmiştir (Hamilton, 1982; Sewel, 1987; Bidlingmeyer, 1992; Meyer, 1988).

63 45 Çizelge 1.4. Eleme kromatografisinde kullanılan çözücüler ve fiziksel özellikleri Çözücü GB Cut-off Viskozite Maks. Akıs Kırılma (nm) (cp) 20 C Hızı ml/dk İndeksi Hegzan Tetrahidrofuran Diklorometan p-dioksan Siklohegzan Dikloroetan Trikloroetan Kloroform Karbon tetraklorür Benzen Toluen Ksilen N,N-Dimetilformamid m-kresol* ,2,4-triklorobenzen* Standart yüksek sıcaklık çözücüleri, GB cut-off: Görünür bölge, bu dalga boyunun altında çözücü kullanılamaz Dağılma Kromatografisi Dağılma kromatografisi sıvı-sıvı kromatografisi olarak da bilinir ve temelinde birbiri ile karışmayan iki sıvı faz arasında maddelerin dağılması ilkesi yatar. Sabit faz katı yüzey üzerinde kolon dolgu maddesi üzerine tutturulmuş ince bir sıvı film tabakasıyken, diğer sıvı hareketli fazdır. Karışımdaki maddelerin sabit faz içerisinde kısmen çözünmesi gerçekleşir (solvofobik etki). Burada maddelerin sabit fazdaki

64 46 çözünürlükleri fazla, hareketli faz içerisindeki çözünürlükleri ise az olmalıdır. Yoksa maddelerin ayrımı gerçekleşmez ve hareketli faz ile beraber atılırlar. Sabit faz ile hareketli faz farklı polariteye sahip olduklarında örnek molekülleri de farklı çözünürlüklere sahip olabilmektedirler. Bu iki fazın polarite farklılığına göre dağılma kromatografisi iki kısımda incelenebilir; bunlar ters-faz sıvı kromatografisi ve normal-faz sıvı kromatografisidir (Hamilton, 1982; Bidlingmeyer, 1992) Ters-faz Sıvı Kromatografisi Ters-faz sıvı kromatografisinde hareketli faz sabit faza göre daha fazla polardır. En çok kullanılan kimyasal olarak bağlanmış fonksiyonel grup taşıyan sabit fazlardan biri ODS (18 karbon atomu zincirinden oluşan oktadesilsilan) dir. Bunun yanı sıra fonksiyonel grup olarak daha kısa zincirli (C 8, C 2 gibi), fenil ve siyano (CN) bağlanan sabit fazlar da kullanılır. Ters-faz sıvı kromatografisinde hareketli faz bileşeni olan tampon çözeltiler önemlidir. Bu çözeltileri hazırlarken suyun oldukça saf olması gerekir. Diğer önemli hareketli faz bileşenleri ise, suyla karışabilen organik çözücülerdir. Hareketli fazlarda kullanılan organik çözücüler ile polariteleri ve elütropik dizilişleri Çizelge 1.5 de verilmiştir. Ters-faz sıvı kromatografisinde genellikle apolar maddelerin ayrımı gerçekleştirilir. Uzun zincirli sabit fazlar (C 18 ) daha apolar maddelerin, kısa zincirli sabit fazlar (C 8, C 2 ) ise polar maddelerin ayrılmasında kullanılır. Buna göre polar maddeler uzun alkil zincirli sabit fazlarda daha az tutunurken, apolar maddeler de kısa zincirli sabit fazlarda daha az tutunurlar (Hamilton, 1982; Sewel, 1987; Bidlingmeyer, 1992; Meyer, 1988).

65 47 Çizelge 1.5. Çözücülerin fiziksel özellikleri Çözücü RI GB (nm) cutoff Viskozite (cp) KN ( C) P n-pentan n-hegzan n-heptan Siklohegzan Karbon disülfit Karbon tetraklorit izopropil eter 2-kloropropan Toluen 1-kloropropan Klorobenzen Benzen Bromoetan Etil eter Kloroform Diklorometan Tetrahidrofuran 1,2-Dikloroetan Metil etil keton Aseton Dioksan Etil asetat Metil asetat Pentan-1-ol Dimetil sülfoksit Anilin

66 48 Nitrometan Asetonitril Piridin Propan-2-ol Etanol Metanol Etilen glikol Asetik asit Su < RI : Kırılma indeksi GB cut-off : Görünür bölge, bu dalga boyunun altında çözücü kullanılamaz Viskozite : Viskozite KN : Kaynama noktası : Hildebrand çözünürlük parametresi P : Polarite indeksi, Rohrschneider s verileriyle hesaplanan Normal-faz Sıvı Kromatografisi Normal-faz sıvı kromatografisinde hareketli faz polaritesi sabit faz polaritesinden daha düşüktür. Polar sabit fazlar kullanılır. Hareketli faz içerisinde genelde metilen klorür, dietil eter, kloroform veya hekzan bulunmaktadır. En çok kullanılan sabit fazlar ise; silika ve alüminadır. Ters ve normal-faz sıvı kromatografilerinin farklılıkları Çizelge 1.6 de verilmiştir (Hamilton, 1982; Sewel, 1987; Bidlingmeyer, 1992; Meyer, 1988; Skoog, 1998).

67 49 Çizelge 1.6. Ters ve Normal-faz sıvı kromatografilerin karşılaştırılması Ters Faz Normal Faz Sabit Faz Polaritesi Düşük Yüksek Hareketli faz polaritesi Ortadan Yükseğe Düşükten Ortaya Elüsyon Sırası En polar önce En az polar önce Hareketli Faz Polarite Artışının Etkisi Elüsyon zamanını arttırır Elüsyon zamanını azaltır İlaçlar genellikle apolar yapıda oldukları için ters-faz sıvı kromatografisi normal-faz sıvı kromatografisine göre daha çok tercih edilir. Bunun yanı sıra kromatografik ayrımda söz konusu olan solvofobik olayların etkisi, herketli faz içerisine konulan çözücülerin ucuz olması, sulu tampon çözeltilerin oranının yüksek tutulması, uygulamanın ve sistem kontrolünün daha kolay olması gibi sebeplerden dolayı tersfaz sıvı kromatografisi tercih edilir. Ters ve normal-faz sıvı kromatografide kullanılan sabit ve hareketli fazlar Çizelge 1.7 de verilmiştir. Çizelge 1.7. Ters ve Normal-faz sıvı kromatografide kullanılan sabit ve hareketli fazlar Sabit faz Hareketli Faz Normal-Faz Sıvı Kromatografisi -oksidipropionitril 1,2,3,-Tris(2-siyanoetoksi)propan (Fraktonitril) Dimetilsülfoksit Su-etilen glikol Pentan, siklopentan, hegzan, izooktan, %10-20(v/v) kloroform, tetra hidro furan, asetonitril, dioksan İzooktan Hegzan, karbontetra klorür

68 50 Etilendiamin Su Nitrometan Hegzan Butanol Hegzan, karbontetra klorür Ters-Faz Sıvı Kromatografisi Hidrokarbonlar Dimetilpolisiloksan ODS CN Fenil C2 NH2 Metanol-su Asetonitril-su Asetonitril/ Metanol/su Asetonitril/ Metanol/su Asetonitril/ Metanol/su Asetonitril/ Metanol/su Asetonitril/ Metanol/su Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (YPSK) Kromatografi, bir karışımda bulunan bileşenlerin birbirinden ayrılmasını gerçekleştiren ve bu sayede kalitatif ve kantitatif analizlerinin yapıldığı yöntemlerin genel adıdır. Bu yöntemlerde çalışma düzeneği temel olarak iki bileşenden oluşur. Bu bileşenlere sabit faz ve hareketli faz adı verilir. Hareketli fazın içerisinde yer alan bileşenler, sabit faza ait dolgu maddesiyle etkileşmeleri sebebiyle, bir miktar tutulurlar. Bu tutulma, örnekteki farklı bileşenler için farklı miktarlarda olur. Böylece bileşenler sabit fazın sonlarına doğru, farklı hızlarda ilerledikleri için, birbirinden ayrılmış vaziyette sabit fazı farklı zamanlarda terk ederler. Bu şekilde sabit fazdan çıkan bileşenlerin derişimleri uygun bir biçimde ölçülür ve zamana karşı y-ekseninde işaretlenerek kromatogram denilen grafikler elde edilir.

69 51 Şekil 1.7. Sıvı-sıvı dağılım (partisyon) kromatografisinde çözünmüş maddenin ayrımı Sıvı kromatografik teknikler içinde ters faz sıvı kromatografisi en yaygın kullanılanıdır. Sabit faz polaritesi, hareketli faz polaritesinden daha düşüktür. Bu kromatografi türü, apolar sabit fazda tutunmaları farklı olan türlerin ayırımında kullanılır. Kimyasal olarak bağlı alkil zincirlerinin sabit faz olarak kullanıldığı ters faz sıvı kromatografisinde, ODS (18 karbon atomu zincirinden oluşan oktadesil silan) en fazla kullanılan sabit fazdır. Ayrıca C8 ve daha kısa alkil zincirleri, siklohekzil ve fenil bağlanmış sabit fazlar da kullanılmaktadır. Ters faz kromatografisinde hareketli fazlar genellikle su veya sulu tampon çözeltileri ile suyla karışabilen organik çözücü karışımlarından oluşmaktadır. YPSK nin diğer kromatografi türlerinden üstünlükleri şunlardır: YPSK kolonu, rejenerasyon olmaksızın pek çok kez kullanılabilir. Bu teknik kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve tekrarlanabilirlik daha yüksektir. Nitel ve nicel analiz amaçları için kullanılabilir. Analiz süresi oldukça kısadır. Duyarlık çok yüksektir. 10 g lık bir örnek bile, floresans veya elektron yakalama dedektörleri kullanılarak tayin edilebilir.

70 Sıvı Kromatografi Cihazları Modern sıvı kromatografi sistemlerinde genel olarak kullanılan ve tanecik boyutu 1,7 ile 10 m arasında olan dolgu maddeleri ile uygun sıvı akış hızları elde edebilmek için, yüzlerce atm lik pompa basınçlarına gerek vardır. Bu yüksek basınçların bir sonucu olarak YPSK için gerekli donanım, diğer tip kromatografi sistemleri dikkate alındığında, daha ince işçilik gerektirir ve sonuçta daha pahalıdır. Aşağıda tipik bir yüksek performanslı sıvı kromatografi cihazının çeşitli kısımları fotoğraf (Şekil 1. 8.) ve şematik (Şekil 1. 9.) olarak gösterilmiştir. Şekil 1.8. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi cihazının fotografı

71 53 Şekil 1.9. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi cihazının şematik görünüşü (Perkin- Elmer Corporation, Norwalk, CT) Hareketli Faz Hazneleri ve Çözücü Sistemleri Modern bir YPSK cihazı, bir veya daha çok cam veya paslanmaz çelikten yapılmış hazne içermektedir. Bu hazneler çoğu zaman, bulunabilecek tozların ve kolonda ve detektör sisteminde gaz oluşturarak bozucu etkilere sebep olan çözünmüş gazların (genellikle oksijen ve azot) giderilmesi için bir cihazla donatılmıştır. Bu çözünmüş gazlar kolonda kabarcıklar oluşturarak pik genişlemesine; ayrıca, çoğu zaman gerek gaz kabarcıkları gerekse tozlar, dedektörle girişim yaparak performansında azalmaya sebep olurlar. Çoğunlukla bu sistemler, çözücü içinde bulunabilecek toz ve partikül halindeki maddelerin pompaya veya enjeksiyon sistemine zarar vermemesi veya kolonu tıkamaması için, toz ve partikül maddeleri süzmeye yarayan bir süzme düzeneği de

72 54 içerirler. Çözücüyü hazneye doldurmadan önce uygulanacak diğer bir yol, çözücüyü, vakum altında bir milipor süzgeçten süzmektedir. Bu uygulama, süspansiyon halindeki maddeleri uzaklaştırmanın yanı sıra gazları da giderir. Sabit bileşimdeki tek bir çözücü kullanılarak yapılan bir ayırma izokratik elüsyon olarak adlandırılır. Polarlıkları birbirinden farklı iki (veya bazen daha fazla) çözücü sistemlerinin kullanıldığı tekniğe gradient elüsyon adı verilir. Bu teknikte iki çözücünün oranı önceden programlanmış olarak bazen sürekli bazen de kademeli bir şekilde değiştirilir. Elüsyon başladıktan sonra belli bir programa göre, bazen sürekli olarak, bazen de bir seri basamaklar şeklinde çözücülerin oranı değiştirilir. Modern YPSK cihazları, çözücülerin hacimsel oranı zamanla doğrusal olarak veya üstel olarak değiştirilebilecek şekilde, iki veya daha fazla hazneden aldığı çözücüleri bir karıştırma odasında sürekli olarak değişen oranlarda bir araya getiren sistemlerle donatılmıştır. İzokratik elüsyon ile ayrılamayan maddeler, gradient elüsyonla ayrılabilmekte, farklı kapasite faktörüne sahip madde karışımlarının alıkonma zamanları kısaltılabilmektedir. Hareketli faz su ve/veya sulu tampon içeriyorsa kimyasal bozunmanın yanı sıra mikrobiyolojik üreme sonucunda kolonu tıkayabilir. Bu nedenle, YPSK analizleri sırasında taze hazırlanmış hareketli faz kullanılır Pompa Bir YPSK sisteminde pompanın görevi hareketli fazın kolon boyunca akışını sağlamaktır. Bir YPSK pompalama sistemi için gerekli şartlar şunlardır: i. Üst basınç sınırını 400 atm ( 400bar 6000 lb f /in 2 ) olması gerekmektedir ii. iii. iv. Normal çalışma basıncı atm olmalıdır Pulssuz veya puls giderici ile birlikte kullanılmalıdır Sinyal/gürültü oranı düşük olmalıdır

73 55 v. Analitik uygulamalar için 1-10 ml/dk aralığında akış sağlamalıdır, vi. Kullanılan çözeltilere karşı eylemsiz olmalıdır, vii. Sistem ölü hacmi düşük olmalıdır, viii. Çözelti değiştirmek kolay olmalıdır, ix. Bakımı ve tamiri kolay olmalıdır, x. Conta, halka, valf gibi kolay aşınan parçaların dayanıklı ve yedek parçalarının kolay bulunabilir olması gerekir. Bir YPSK sisteminde kullanılan pompalar sabit hacim pompaları ve sabit basınç pompaları olmak üzere iki ana başlıkta toplanabilir. Çalışma farklılığına bağlı olarak ise; pistonlu pompalar, şırınga pompalar ve pnömatik pompalar olmak üzere üçe ayrılırlar (Skoog, 1998; Hamilton, 1982) Pistonlu Pompalar Pistonlu pompalar, genellikle motor kontrollü bir pistonun ileri ve geri hareketiyle çözücünün pompalandığı küçük bir silindirden meydana gelmiştir. Ticari olarak satılan YPSK sistemlerinin yaklaşık %90 ında pistonlu pompalar kullanılır (Şekil 1.10). Şekil YPSK için bir pistonlu pompa.

74 Şırınga Pompalar Şırınga pompalar, bir kademeli motordan güç alan vidalı güdüm mekanizması ile kumanda edilen sızdırmaz bir sürgüsü olan, şırınga benzeri silindirik bir kaptan ibarettir. Bu pompalar da viskoziteden ve geri basınçtan bağımsız bir akış üretirler. Ayrıca çıkış akımı pulssuzdur. Dezavantajları; sınırlı çözücü kapasitesi (250 ml) ve çözücü değiştirilme aşamasında karşılaşılan güçlüklerdir Pnömatik Pompalar En basit pnömatik pompalarda sıvı, sıkıştırılmış bir gaz ile basınçlandırılabilen bir kap içine yerleştirilmiş, portatif bir kap içine konur. Bu tip pompalar, pahalı değildir ve pulsuzdur. Ancak, kapasitesi sınırlı olup, çıkış basıncı düşüktür ve çıkış hızı çözücü viskozitesi ile kolon geri basıncına bağlıdır Enjektör YPSK analizlerinde ölçümlerin kesinliğini belirleyen faktör, numunenin kolon dolgu maddesine gönderilmesinin tekrarlanabilirliğidir. Aşırı numune yüklenmiş kolonlarda görülen bant genişlemesi de kesinliği etkiler. Bu yüzden kullanılan hacim çok küçük olmalıdır ve sistemin basıncını düşürmeden numunenin sisteme girişinin sağlanması gereklidir. Temel olarak, el ile (manuel) ve otomatik olmak üzere iki tip enjektör vardır.

75 Manüel Enjeksiyon Valfleri Enjeksiyon valfleri yüksek basınçlı bir ortama numune aktarmak amacıyla kullanılan sistemlerdir. Enjeksiyon valfinin numune yükleme ve enjeksiyon olmak üzere iki konumu vardır. Şekil Rheodyne 7125 model enjeksiyon valfi Yükleme konumunda örnek haznesi (loop) basınçlı ortamdan izole edilir ve bir şırınga yardımı ile istenilen numune miktarı örnek haznesine doldurulur. Enjeksiyon konumunda örnek haznesi tekrar yüksek basınçlı ortama dönerek numuneyi sisteme aktarır Otomatik Enjektör Basit otomatik enjektörlerde, manuel enjeksiyon valfine benzer bir valf kullanılır. Bu sistemde numune şişesine azot basıncı uygulayarak örnek haznesi doldurulur ve valfin dönmesi ile numune enjekte edilir. Enjeksiyon hacmi sabittir ve örnek haznesi hacmi ile sınırlıdır. Programlanabilen otomatik enjeksiyon sistemlerinde, örnek haznesini doldurmak için hassas motor ile hareket ettirilen şırıngalar kullanılır. Enjektörle çekilen hacim kontrol edilerek istenilen miktarda numune örnek haznesine doldurulur. Küçük miktarlardaki numune enjeksiyonları gerçekleştirilebilmekte ve numune kayıpları minimum olmaktadır. Bu sistem ile istenilen sayıda enjeksiyon yapmak mümkündür.

76 Kolon Sıvı kromatografi kolonları bir YPSK cihazının en önemli parçasıdır ve genellikle paslanmaz çelikten imal edilir. Pek çok üretici tarafından üretilen analitik kolonlar 5-30 cm boyundadır. Tanecik çapları ise 2-10 µm arasında değişmektedir. Bu tip kolonların 1 metresinde kadar tabaka bulunur. Son yıllarda uzunluğu 3-7,5 cm ve iç çapı 1-4,6 µm olan yüksek performanslı mikro kolonlar da imal edilmeye başlanmıştır. Bu kolonların dolgu maddelerin parçacık boyutları 3-5 μm ve tabaka sayısı tabaka/m'ye kadar çıkmaktadır. Bu mikrokolonlar ile çok az miktarda çözücü ile hızlı bir şekilde ayırma yapılabilmektedir. Sıvı kromatografisinde kullanılan çözücülerin saflıkları yüksek olmasından dolayı pahalıdır. Çözücüler kullanıldıktan sonra atıldığı için mikrokolon kullanımı çok önemli bir üstünlüktür. 15 saniye gibi çok kısa bir zamanda sekiz farklı madde birbirinden ayrılabilmektedir. Kolon dolgu maddeleri, film dolgular ve gözenekli dolgular olmak üzere iki tiptir. Film dolgular, gözenekli olmayan cam veya polimer tanelerinden oluşur. Gözenekli dolgular, silika, alümina ve iyon değiştirici reçineden yapılır. Sıvı kromatografisinde kullanılan en yaygın kolon dolgu maddeleri silisyum dioksittir. Mikrondan daha küçük boyutlardaki silisyum dioksit parçacıklarının aglomerasyonuyla, daha büyük ve yaklaşık aynı boyutlarda parçacıklar elde edilir. Hazırlanan parçacıkların yüzeyi, genellikle bu yüzeye fiziksel veya kimyasal bağlarla bağlanmış ince bir organik filmle kaplanır. Silika temelli bağlı fazlar, yüzeyde bulunan silanol gruplarının organosilanlarla Şekil 1.12 de gösterilen reaksiyonları sonucu elde edilir. En çok kullanılan, klorodimetilsilanların yüzey silanol grupları ile reaksiyonudur. Ters faz sıvı kromatografisi için kullanılan çeşitli alkil ve substitüe alkil silikalar bu yolla elde edilir. Alümina parçacıkları, gözenekli polimer parçacıkları ve iyon değiştirici reçineler de dolgu maddesi olarak kullanılabilmektedir.

77 59 Şekil Bağlı faz dolgu maddelerinin elde edilmesi. a) Yüzey silanolünün klorodimetilsilanla reaksiyonu, b) Yüzey silanollerinin trifonksiyonel klorosilanla reaksiyonu, c) Yüzey silanollerinin trifonksiyonel alkoksisilanla reaksiyonu. Anyonları ve katyonları tutan iyon değiştirici reçinelerin dolgu maddesi olarak kullanılması halinde, numunede iyon halinde bulunan türler birbirinden ayrılır. İyonların bu reçinelere olan ilgilerine etki eden faktörler, iyonun yükü, iyonun büyüklüğü, ph, iyon şiddeti, kullanılan reçinelerin gözenek büyüklüğü, çözücü cinsi, çözücü derişimi ve çalışma sıcaklığıdır. Kullanılan iyon değiştirici reçineler doğrudan kolona doldurulabilen katı reçineler olabileceği gibi, bir katı yüzeyine kaplanmış sıvı reçineler de olabilir. Katyon değiştirici reçinelerin ortak özelliği, kuvvetli bir asit olan sülfonik asit grupları ile zayıf bir asit olan karboksilik asit gruplarını içermeleridir. Anyon değiştirici reçineler ise, kuvvetli baz olan kuaterner amin grupları ile zayıf baz olan primer amin grupları içerirler. Bağlı faz dolguları, bağlanan katman apolar karakterde olduğu zaman ters faz olarak, bu katman polar fonksiyonlu gruplar içerdiği zaman ise normal faz olarak sınıflandırılırlar. Uzun alkil zincirli sabit fazlar ters faz sıvı kromatografisinde kullanılırlar. Silika yüzeyinde reaksiyona girmeden kalan artık silanoller, yüzeye istenmeyen bir polarlık verirler. Bu durum, özellikle bazik maddelerde kromatografi piklerinde kuyruklanmaya sebep olmaktadır. Bu etkiyi azaltmak için

78 60 klorometilsilanla ek bir reaksiyon yapılarak artık silanoller kapatılır. Bu işleme endcapped denir. Analitik kolonun kullanım ömrünü arttırmak amacıyla, analitik kolondan önce genellikle kısa bir kolon yerleştirilir. Bu kolonun görevi, sadece partikül haldeki maddeleri ve çözücü içindeki yabancı maddeleri tutmak değil, aynı zamanda numune içinde bulunan ve sabit faza tersinmez olarak bağlanan bileşenleri de tutmaktır. Bu suretle kolonun ömrünü uzatırlar. Ek olarak, bu ön kolonlar, hareketli fazı sabit fazla doyurarak analitik kolonda sabit sıvı faz kaybını en aza indirir. Ön kolonun bileşimi ile analitik kolonunki benzer olmalıdır. Ancak basınç düşmelerini azaltmak için ön kolonun dolgu maddesinin parçacık boyutu analitik kolonunkinden genellikle daha büyüktür. Sıvı kromatografisinde kolon sıcaklığının kontrolü önemlidir. Özellikle ters faz ve iyon değiştirme kromatografisinde sıcaklığın alıkonma zamanına ve tekrarlanabilirliğe etkisi anlamlıdır. Bazı durumlarda ise, kolon sıcaklığı derecenin onda biri mertebesinde sabit tutulduğu zaman, daha iyi kromatogramlar elde edilir. Modern cihazların birçoğunda, kolon sıcaklığını oda sıcaklığından 150 C'ye kadar onda bir derece mertebesinde kontrol etmek için, kolon fırını bulunur. Kolonlar, hassas sıcaklık kontrollü sabit sıcaklık banyosundan beslenen su ceketleriyle de donatılabilir. Sıvı kromatografisinde kolon verimliliği, bir bileşiğin kolondan geçişi sırasında meydana gelen bant genişliğinin derecesi tarafından etkilenir. Bant genişlemesi ve dolayısıyla kolon verimliliğinin kaybı, çözünen bileşenlerin kolondan aşağıya göçleri sırasında yer alan çok sayıda kütle-aktarım işlemlerinin sonucudur. Bu hızları etkileyen bazı değişkenler kontrol edilebilir ve ayırmalar için kullanılabilir. Bu değişkenlerin en önemlileri Çizelge 1.8 da verilmektedir.

79 61 Çizelge 1.8. Kolon Verimliliğine Etkiyen Değişkenler Değişken Sembol Genel Birim Hareketli fazın doğrusal hızı u cm.s -1 Hareketli fazda difüzyon katsayısı* DM cm 2.s -1 Durgun fazda difüzyon katsayısı DS cm 2.s -1 Kapasite faktörü k birimsiz Dolgu parçacık çapı dp cm Durgun fazda sıvı kaplamanın kalınlığı df cm *Sıcaklık artışıyla ve vizkozitenin azalmasıyla değişir Dedektörler Dedektör yüksek performanslı sıvı kromatografisinde, cihazın en önemli kısımlarından birini oluşturur. Kolondan çıkan maddelerin derişimi kolon çıkışına yerleştirilen uygun bir dedektör ile ölçülür. Dedektör seçimi doğru ve hassas bir analiz yapabilmek için son derece önemlidir. Genellikle tek dedektör sistemi kullanılmakla beraber, birden fazla dedektör sisteminin yer aldığı cihazlar da mevcuttur (Skoog, 1998; Hamilton, 1982; Bidlinmeyer, 1992; Sewel, 1987; Meyer, 1988). Bir dedektörde bulunması gerekli önemli karakteristikler; a) Duyarlılık, b) Geniş bir doğrusal çalışma aralığı, c) İyi bir kararlılık ve tekrarlanabilirlik, d) Üniversal ve akış hızından bağımsız küçük cevap zamanı, e) Doğru cevap, koşulların değişiminden etkilenmeme, f) Numuneyi tahrip etmeme, g) Bant genişlemesini azaltmak amacıyla, minimum iç hacim, g) Ucuzluk ve kolay kullanımdır.

80 62 Genel olarak dedektörler iki grup altında toplanırlar: a) Maddeye Yönelik Dedektörler b) Çözeltiye Yönelik Dedektörler Maddeye yönelik dedektörler hareketli faz içindeki maddenin özelliklerini tayin ederler ve en yaygın kullanılan türleri aşağıda verilmiştir: 1. Fotometrik dedektörler (UV/GB, Floresans, Dizi diyot, Infrared) 2. Elektrokimyasal dedektörler 3. Ayırım sonrası tepkime dedektörleri 4. Radyoaktivite dedektörleri 5. Kütle spektrometreleri Çözeltiye yönelik dedektörler; örnek özelliklerinin ölçülmesine yönelik dedektörlerdir ve aşağıdaki şekilde sınıflandırılabilir: 1. Refraktif indeks dedektörleri 2. Dielektrik sabiti dedektörleri 3. İletkenlik dedektörleri 4. Yoğunluk dedektörleri Bu çalışmada UV/Görünür Bölge (DAD) dedektörü kullanıldığından, sadece bu detektörden bahsedilecektir.

81 Ultraviyole-Görünür Bölge Dedektörü Absorbans ölçen dedektörler olup YPSK de kullanılan dedektörlerin yaklaşık % 60 ını oluşturmaktadırlar. Lambert-Beer yasası geçerlidir. Spektrum taraması yapmak, farklı dalga boyunda çalışmak veya dalga boyunu zamana karşı programlamak mümkündür. Hareketli faz, UV/VIS fotometre ya da spektrofotometrenin bulunduğu Z şeklindeki küçük bir akış hücresinden geçirilir (Şekil 1.13.). Kolon dışı bant genişlemesini en aza indirmek için, bu gibi hücrelerin hacimleri mümkün olduğunca düşük tutulmaktadır. Hacimler 1-10 µl ve hücre uzunluğu 2-10 mm arasında sınırlandırılmıştır. Bu tip hücreler, yaklaşık 600 psi den büyük basınçlarda çalışmazlar. Bunun sonucu olarak, bir basınç düşürme düzeneği genellikle gereklidir. Şekil YPSK de kullanılan bir UV dedektörü Hücreden geçen analit, bir miktar UV ışınını absorblar ve dedektör tarafından bu absorbsiyona bağlı olarak bir sinyal oluşturulur Bu sinyal, analit derişimi ile orantılıdır. Tek bir dalga boyunda çalışan dedektörler kullanılabildiği gibi bir monokromatör ile çeşitli dalga boylarını seçerek çalışan dedektörler de vardır. Tek dalga boyunda çalışan dedektörlerde ışık kaynağı olarak genellikle 254 nm de ışıma yapan Hg lambası, çeşitli dalga boylarını ölçebilen dedektörlerde ise döteryum lambası kullanılır. Dalga boyunun her bir bileşene göre ayarlanabilmesi nedeni ile seçimli bir dedektör türü olan UV-görünür bölge dedektör sisteminde seçilen çözücülerin UV-ışınlarını absorbladığı dalga boylarına dikkat edilmeli ve seçilen çalışma dalga boyu çözücünün absorbsiyon yaptığı dalga boyu değerinden yüksek

82 64 olmalıdır. Bu durum özellikle düşük dalga boylarında absorpsiyon yapan örnekler için son derece önemlidir (CH 3 OH 205 nm, CH 3 CN 190 nm, v.b.). Ayrıca elue edicinin ph değerinin UV-görünür bölge spektrumunu etkileyeceği de göz önünde bulundurulmalıdır. En güçlü ultraviyole spektrofotometrik dedektörler diyod-dizili cihazlardır. Bu cihazlar, spektrumun tamamı için gerekli olan verileri yaklaşık bir saniyede toplayabilmektedir. Böylece, her bir kromatografik pik için spektral veriler, analit kolondan çıkarken toplanıp saklanabilir. Türlerin teşhisine ve kantitatif tayin için şartların seçimine yardımcı olan bu spektrum şekli, üç boyutlu grafik olarak verilebilmektedir. İdeal UV dedektörün karakteristikleri şunlardır: - Örneklerin UV- görünür bölgede absorbsiyon yapması gerekir. - Hareketli faz akış hızı ve sıcaklık değişimlerinden etkilenmez. - Band genişletme etkisi küçüktür. - Çok güvenilirdir. - Örnek çözeltiyi bozmaz. Şekil Dedektörlerin % kullanımları