HİNDİ KIYMALARINDA SALMONELLA LARIN VARLIĞI VE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİKLERİNİN BELİRLENMESİ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİNDİ KIYMALARINDA SALMONELLA LARIN VARLIĞI VE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİKLERİNİN BELİRLENMESİ Özlem İŞERİ BESİN HİJYENİ VE TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. İrfan EROL 2007-ANKARA

2 ii

3 iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler Grafikler Resimler ii iii vi vii ix x xi xii 1. GİRİŞ Tarihçe Salmonella ların Taksonomisi Salmonella ların Morfolojik ve Biyokimyasal Özellikleri Salmonella ların Gelişimini Etkileyen Faktörler Sıcaklık Su Aktivitesi ve Tuz ph Değeri Salmonella ların Bazı Çevresel Koşullar ve Gıdalarda Canlı Kalma 10 Süreleri 1.6. Salmonella ların Antibiyotik Dirençliliği Salmonella ların Virülens Faktörleri Salmonella ların Minimal İnfeksiyon Dozu ve Patogenezi Salmonella İnfeksiyonlarında Semptomlar Enterokolitis Sistemik Hastalık Salmonella ların Gıdalarda Bulunuşu Kanatlı Eti ve Ürünleri Kırmızı Et ve Ürünleri Yumurta 21

4 iv Diğer Bazı Gıdalar Salmonella ların Kontaminasyon Kaynakları Salmonella İnfeksiyonlarının Epidemiyolojisi Salmonella ların Gıdalardan İzolasyon ve İdentifikasyonu Klasik Kültür Tekniği İmmunomanyetik Separasyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu Korunma ve Kontrol GEREÇ VE YÖNTEM Gereç Salmonella spp. nin İzolasyon ve İdentifikasyonunda Kullanılan 33 Besiyerleri ve Diğer Kimyasallar PCR İçin Kullanılan Malzemeler Antibiyotik Dirençlilik Testinde Kullanılan Besiyerleri ve Antibiyotik 39 Diskleri 2.2. Yöntem Klasik Kültür Tekniği Ön Zenginleştirme Selektif Zenginleştirme Katı Besi Yerine Ekim İmmunomanyetik Separasyon Tekniği Salmonella spp. nin İdentifikasyonu Biyokimyasal Testler Aglütinasyon Testi PCR Tekniği Antibiyotik Dirençliliğin Belirlenmesi İstatistiksel Analizler BULGULAR Klasik Kültür ve IMS Teknikleri ile Analiz Sonuçları PCR Sonuçları Antibiyotik Dirençlilik Sonuçları 56

5 v 3.4. Mevsimsel Dağılım TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER 75 ÖZET 76 SUMMARY 77 KAYNAKLAR 78 ÖZGEÇMİŞ 90

6 vi ÖNSÖZ Hindi eti, çocukların yetişkinlerden daha fazla ihtiyaç duyduğu başta lizin olmak üzere alanin, serin, aspartik asit, metiyonin, glutamik asit ve tirozin amino asitlerini yüksek düzeyde içeren önemli bir protein kaynağı olmasının yanısıra, düşük seviyede kolesterol de içermektedir. Ülkemizde kanatlı eti tüketiminde piliç eti önemli bir paya sahip olmasına rağmen, son yıllarda hindi eti ve ürünlerine olan talep artmıştır. Bununla beraber, kanatlı hayvanlarda insanlar için patojen olan bazı mikroorganizmaların yaygın olarak bulunması ve çiftlikten sofraya kadar geçen aşamalarda gerekli hijyenik önlemlerin yeterince alınmaması insanlarda hindi eti tüketimine bağlı infeksiyon ve intoksikasyonların şekillenmesine neden olabilmektedir. Hindi kıyması, uygulanan teknolojik işleme bağlı olarak parçalanıp yüzeyinin genişlemesi sonucu, yalnızca düşük düzeyde Salmonella lar ile kontamine olması halinde bile risk taşımakta ve uygun olmayan koşullarda muhafaza edilmesine bağlı olarak mevcut Salmonella ların hızlı bir şekilde üreyebilmesine ve çapraz kontaminasyonlara neden olabilmektedir. Bu çalışmada, hindi kıymalarında Salmonella ların varlığının klasik kültür ve IMS teknikleri kullanılarak saptanması, elde edilen izolatların oric gen sekansı esas alınarak PCR ile doğrulanması, antibiyotiklere karşı dirençlilik durumlarının saptanması ve mevsimsel dağılımının incelenmesi amaçlanmıştır. Tez çalışmamım seçilmesi ve yürütülmesinde ilgi ve yardımlarını esirgemeyen başta danışmanım Prof. Dr. İrfan EROL olmak üzere Prof. Dr. Sadi AKGÜN, Prof. Dr. T. Halûk ÇELİK, Doç. Dr. U. Tansel ŞİRELİ, Prof. Dr. Nejat AYDIN ve tüm değerli öğretim üyelerine, PCR çalışmasında yardımlarını esirgemeyen Araş. Gör. Dr. Muammer GÖNCÜOĞLU ve Araş.Gör. N. Deniz AYAZ a, laboratuvar çalışmaları boyunca yardımını ve desteğini esirgemeyen Sema BAL a, tüm araştırma görevlisi arkadaşlarıma ve hayatım boyunca her zaman desteklerini hissettiğim annem ve babam Hacer-Ergül İŞERİ ile ablam ve eniştem Gülay-Seyit YILMAZ ve minik Gülsem e sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

7 vii SİMGELER VE KISALTMALAR a w AOAC APHA BGA BHI BPLS BS CDC DİE DNA ELISA FDA FSIS fur GM HACCP HE HPB IMS ICMSF IFN IL inv ISO kob LIA LPS MKTB NAS NCCLS omp oric oxyr pag PBS PCR PhoP PhoQ prg : Activity of water - Su aktivitesi : Association of Official Analytical Chemists : American Public Health Association - Amerikan Halk Sağlığı Örgütü : Brilliant Green Agar : Brain Heart Infusion : Brilliant Green Phenol- red Lactose Sucrose : Bismuth Sulfite : Center for Disease Control and Prevention- Amerikan Hastalık Kontrol ve Korunma Merkezi : Devlet İstatistik Enstitüsü : Deoksiribonükleik asit : Enzyme Linked Immunosorbant Assay : Food and Drug Administration - Gıda ve İlaç Dairesi : Food Safety and Inspection Service - Gıda Güvenliği ve İnspeksiyonu Servisi : Ferrichrome uptake, Regulation of Iron : Granulocyte-monocyte - Granulosit-monosit : Hazard Analysis and Critical Control Points Tehlike Analizi ve Kritik Kontrol Noktaları Sistemi : Hektoen Enteric : Health Protection Branch - Sağlık Koruma Bölümü : Immunomagnetic Separation - İmmuno Manyetik Separasyon : International Commission on Microbiological Specifications for Foods : Interferon : Interleukin : Invasion gene : The International Organization for Standardization - Uluslar arası Standardizasyon Ofisi : Koloni oluşturan birim : Lysine Iron Agar : Lipopolisakkarit : Mueller-Kauffmann Tetrathionate Buyyon : National Academy of Sciences Ulusal Bilim Akademisi : National Committee for Clinical Laboratory Standards - Klinik Laboratuvar Standartları Ulusal Komitesi : Outer membran protein : Origin of replication of chromosome : Oxidative Stres Resistans : PhoP Activated Gene : Phosphate Buffered Saline : Polymerase Chain Reaction - Polimeraz Zincir Reaksiyonu : Phosphate P; Phosphorylated Transcriptional Activator : Membrane sensor kinase : PhoP Repressed Gene

8 viii rck RVB SCB Sip SPI spv stx TNF TPS TSA TSB TSIA TTB USDA via WHO XLD : Resistance to Complement Killing : Rappaport Vassiliadis Buyyon : Selenite Cystine Buyyon : Salmonella invasion protein - Salmonella invazyon proteini : Salmonella Pathogenicity Islands - Salmonella patojenite bölgeleri : Salmonella plasmid virulence : Salmonella toksin : Tumor necrosis factor - Tümör nekroz faktör : Tamponlanmış Peptonlu Su : Tryptone Soya Agar : Tryptone Soya Buyyon : Triple Sugar Iron Agar : Tetrathionate Buyyon : United States Department of Agriculture - Amerikan Tarım Bakanlığı : Vi antigen : World Health Organization - Dünya Sağlık Örgütü : Xylose Lysine Deoxycholate

9 ix ŞEKİLLER Şekil 1.1. Salmonella ların konakçı bağırsak epitel hücrelerine invazyonu 14 Şekil 1.2. Salmonella ların gıdalara bulaşma zinciri 24 Şekil 2.1. Salmonella spp. nin klasik kültür tekniğiyle izolasyon ve 46 identifikasyon şeması Şekil 2.2. Salmonella spp. nin izolasyonunda IMS tekniğinin kullanılması 47 şeması

10 x ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Çeşitli ülkelerde yıllık hindi eti üretim miktarları 2 Çizelge 1.2. Kauffmann-White Salmonella şeması 5 Çizelge 1.3. Salmonella ların biyokimyasal ve serolojik özellikleri 7 Çizelge 1.4. Salmonella ların bazı virülens faktörleri 12 Çizelge 3.1. Hindi kıymalarından klasik kültür ve IMS teknikleriyle saptanan 52 Salmonella spp. pozitif örneklerin dağılımı Çizelge 3.2. Selektif zenginleştirme buyyonlarındaki Salmonella spp. pozitif 52 örneklerin dağılımı Çizelge 3.3. Salmonella ların izolasyonunda kullanılan BPLS ve XLD selektif 54 katı besiyerlerindeki pozitif örnek dağılımı Çizelge 3.4. Klasik kültür tekniğiyle izole edilen Salmonella ların selektif 54 zenginleştirme buyyonları ve katı besiyerlerine göre dağılımları Çizelge 3.5. PCR tekniği ile doğrulanan 113 Salmonella spp. izolatının 56 antibiyotik dirençlilik tablosu Çizelge 3.6. Hindi kıymalarından izole edilen ve PCR ile doğrulanan 57 Salmonella ların mevsimsel dağılımı Çizelge 3.7. Hindi kıymalarından izole edilen ve PCR ile doğrulanan 58 Salmonella ların aylara göre rastlanma sıklığı

11 xi GRAFİKLER Grafik 3.1. Hindi kıymalarından klasik kültür, IMS ve her iki teknikle saptanan 52 toplam Salmonella spp. pozitif örneklerin dağılımı Grafik 3.2. Selektif zenginleştirme buyyonlarındaki Salmonella spp. pozitif 53 örneklerin dağılımı Grafik 3.3. Klasik kültür tekniğiyle izole edilen Salmonella ların selektif 55 zenginleştirme buyyonları ve katı besiyerlerine göre dağılımları Grafik 3.4. Hindi kıymalarından izole edilen ve PCR ile doğrulanan 58 Salmonella ların mevsimsel dağılımı Grafik 3.5. Hindi kıymalarından izole edilen ve PCR ile doğrulanan 59 Salmonella ların aylara göre rastlanma sıklığı

12 xii RESİMLER Resim 2.1. Salmonella spp. kolonilerinin BPLS agardaki tipik görünümü 42 Resim 2.2. Salmonella spp. kolonilerinin XLD agardaki tipik görünümü 42 Resim 2.3. IMS tekniğinde kullanılan DYNAL seti 43 Resim 2.4. TSIA ve LIA da Salmonella spp. nin tipik görünümü 44 Resim 2.5. Üreaz testi 45 Resim 2.6. Mueller Hinton Agar da disk difüzyon tekniğiyle antibiyotik 50 duyarlılık testi Resim 3.1. PCR ile oric geni tespit edilmiş Salmonella spp. izolatlarının 55 elektroforez görüntüsü

13 1 1. GİRİŞ Geleneksel olarak yılbaşı menülerinde yer alan hindi eti, son yıllarda karkas, parça, kıyma veya füme, salam, sosis gibi ileri işlenmiş ürünlere dönüştürülerek tüketime sunulmaktadır (Bremner ve Johnston, 1996). Türkiye de kanatlı eti tüketiminde piliç eti büyük bir paya sahip olmasına rağmen, hindi eti geleneksel tüketimden bağımsız olarak sofralarda yer almaya başlamıştır. Aile tipi üretime ve entegrasyona elverişli olmasının yanı sıra, içerdiği yüksek düzeyde protein, düşük seviyedeki kolesterol ve kalori düzeyi ile alternatif hayvansal gıda olarak kabul edilmesi hindi yetiştiriciliğine olan eğilimi arttırmıştır (Anon, 2001). Dünyada tavuk eti üretimi 2005 yılı verilerine göre yaklaşık ton iken hindi eti üretimi tondur (Çizelge 1.1). Türkiye de kanatlı eti üretimi de dünyadaki artışa paralel olarak artmış ve 2005 yılı Devlet İstatistik Enstitüsü (DİE) verilerine göre ton civarında olan tavuk eti üretimine karşılık hindi eti üretimimiz yaklaşık ton olmuştur (Anon, 2007a; Anon 2007b). Ancak kanatlı etleri, tüm dünyada gıda infeksiyon ve intoksikasyonları içerisinde ilk sıralarda yer alan salmonelloz ve campylobacteriosis olgularının büyük bir bölümünden sorumlu tutulmakta ve bu durumun önemli sağlık sorunları, işgücü kaybı ve yüksek maliyetli tedavi masraflarına yol açtığı bildirilmektedir (Tauxe, 1991). Epidemiyolojik çalışmaların düzenli olarak yapıldığı Amerika Birleşik Devletleri nde (ABD) her yıl yaklaşık 1,4 milyon insanın Salmonella infeksiyonuna yakalandığı ve bunların yaklaşık 500 ünün ölümle sonlandığı bildirilmiştir (Mead ve ark., 1999). Hindi ve tavuk etleri ve sakadatı sıklıkla değişik Salmonella serotipleri ile kontamine olmaktadır. Kontaminasyon özellikle kesim işlemine bağlı olarak, kloakal bölge, ayaklar ve tüylerdeki fekal materyalden çapraz bulaşmadan kaynaklanmaktadır. Kesim işlemi sırasında özellikle tüy yolma ile iç organ çıkarma aşamalarında oluşan çapraz kontaminasyonun, karkas ve iç organların bulaşmasında

14 2 önemli rol oynadığı bildirilmektedir (Barrow ve ark., 1988; Uyttendaele ve ark., 1998). Çizelge 1.1. Çeşitli ülkelerde yıllık hindi eti üretim miktarları (Anon, 2007a; Anon, 2007b) Ülke adı Üretim Miktarı (1000 ton) (a) 2006(t) Avrupa Birliği ABD Brezilya Kanada Türkiye Rusya Meksika Güney Afrika Tayvan Dünya hindi eti üretimi Dünya tavuk eti üretimi : AB verileri 25 üye ülkeyi içermektedir, a: 2005 yılı başına ait veriler, t : Tahmini değerler,. Kıyma; besleyici değerinin yüksek olması ve mutfak tekniğine kolay uygulanması ile tercih edilmesinin yanısıra, uygulanan teknolojik işleme bağlı olarak parçalanması ve yüzeyinin genişlemesi sonucu, saprofit ve patojen mikroorganizmaların gelişimi için ideal bir ortam özelliğine sahip olması nedeniyle risk grubu gıdalar içerisinde yer almaktadır. Kıymadaki patojen mikroorganizmalar içerisinde gıda kaynaklı infeksiyonlarda en sıklıkla rastlanılan etken olan Salmonella ların varlığı ve serotip dağılımı büyük önem taşımaktadır. Kıymanın düşük düzeyde Salmonella lar ile kontamine olması halinde bile, uygun olmayan koşullarda muhafaza edilmesine bağlı olarak mevcut Salmonella lar üreyebilmekte ve çapraz kontaminasyonlara neden olabilmektedir. Ayrıca kıyma ve kıymadan yapılan ürünlerin çiğ olarak veya yeterince pişirilmeden tüketilebildikleri dikkate alındığında, Salmonella ile kontamine kıymaların taşıyacağı sağlık riski önem kazanmaktadır (Erol, 1999).

15 3 1.1 Tarihçe Salmonella ilk kez tifoid basili olarak 1880 yılında Alman bakteriyologlar Ebert ve Koch tarafından tanımlanmış ve 1884 yılında Gaffky Salmonella yı kültüre etmeyi başarmıştır yılında Amerikalı mikrobiyolog D.E.Salmon domuz vebasına neden olan domuz kolera basilini karakterize ederek Bacterium suipestifer olarak adlandırmıştır. Söz konusu bakterinin adı daha sonraki yıllarda Salmonella choleraesuis olarak değiştirilmiştir (Bell ve Kyriakides, 2002). Aynı şekilde, klinik olarak benzer semptomlardan sorumlu olan paratifoid basili 1896 yılında Achard ve Bensaud, 1898 yılında ise Gwyn tarafından izole edilmiştir. Salmonella genusu, 1900 yılında Amerikalı veteriner patolog D.E. Salmon a atfen Lignieres tarafından oluşturulmuştur. Tifoid basili ile paratifoid basilinin kültürel ve serolojik olarak ayrımı 1901 yılında Schottmüller tarafından yapılmıştır (Adams ve Moss, 1995). Salmonelloz salgınının ilk defa laboratuvarda doğrulanmasıysa, 1888 yılında Gaertner tarafından sığır eti ve bu eti tüketen bir insanın organlarından Bacterium enteritidis in (S. Enteritidis) izole edilmesiyle gerçekleşmiştir (Bell ve Kyriakides, 2002). Salmonella nın klasifikasyonu için antijenik şema ilk olarak 1926 yılında White tarafından önerilmiş ve 1941 yılında Kauffmann tarafından Kauffmann-White şeması olarak genişletilmiştir (D Aoust, 1997) Salmonella ların Taksonomisi Salmonella nın 2004 yılına kadar belirlenen 2541 serotipi olduğu bildirilmektedir (Popoff ve ark., 2004). Salmonella ların tiplendirilmeleri, Kauffmann tarafından ortaya konulan O (somatik), H (flagellar) ve K (kapsüler) antijenlerinin serolojik

16 4 identifikasyonunu temel almakta ve her serotip ayrı bir tür (S. Paratyphi A, S. Newport, S. Enteritidis vb.) olarak belirtilmektedir (Brenner ve ark., 2000). Salmonella taksonomisindeki gelişmelerin tanımlanması 1973 yılında DNA hibridizasyonuyla yapılmış ve bütün serotipler ve Salmonella nın I, II ve IV alttürleri ve Arizona nın bütün serotipleri türler düzeyinde ilişkilendirilmiştir. Tek istisnanın farklı bir tür olarak tanımlanan ve alttür V olarak bilinen S. bongori olduğu bildirilmiştir (Reeves ve ark., 1989) yılında Le Minor ve Popoff, Salmonella nın 7 alt türünün I, II, IIIa, IIIb, IV, V ve VI olarak ayrılması gerektiğini ve alt tür III ün genomik ilişki ve biyokimyasal özelliklerine bağlı olarak IIIa ve IIIb olarak ayrıldığını bildirmiştir. Amerika Hastalık Kontrol ve Korunma Merkezi (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) tarafından kullanılan Kauffmann-White şemasına göre Salmonella içerisindeki türler ve alt türler Çizelge 1.2 de gösterilmektedir. Bu şemaya göre türlerden birinin, S. enterica, diğerinin eskiden alt tür V olarak isimlendirilen S. bongori olduğu bildirilmektedir (Reeves ve ark., 1989; Popoff ve ark., 2004). Bilinen Salmonella serotiplerinin büyük bir çoğunluğu S. enterica I (S. enterica subsp. enterica) alt türüne aittir. S. enterica subsp. I içerisinde en yaygın O antijen serogrupları A, B, C1, C2, D ve E dir. Bu serogrup içerisindeki türlerin yaklaşık % 99 u insanlarda ve sıcak kanlı hayvanlarda Salmonella infeksiyonlarına neden olmaktadır (Popoff ve Le Minor, 1997; Popoff ve ark., 2004). S. enterica subsp. II (S. enterica subsp. salamae), IIIa (S.enterica subsp. arizonae), IIIb (S. enterica subsp. diarizonae), IV (S. enterica subsp. houtenae), VI (S. enterica subsp. indica) ve S. bongori genellikle soğuk kanlı hayvanlar, çevre ve nadir olarak da insanlardan izole edilmektedir (Farmer ve ark., 1984).

17 5 Çizelge 1.2. Kauffmann-White Salmonella şeması (Popoff ve Le Minor, 1997; Popoff ve ark., 2004). Salmonella tür ve alt türleri Alt tür içerisindeki serotip Konakçıları sayısı S.enterica subsp. enterica (I) 1504 Sıcak kanlı hayvanlar S.enterica subsp.salamae (II) 502 Soğuk kanlı hayvanlar ve çevre S.enterica subsp.arizonae (IIIa) 95 Soğuk kanlı hayvanlar ve çevre S.enterica subsp.diarizonae (IIIb) 333 Soğuk kanlı hayvanlar ve çevre S.enterica subsp.houtenae (IV) 72 Soğuk kanlı hayvanlar ve çevre S.enterica subsp.indica (VI) 13 Soğuk kanlı hayvanlar ve çevre S. bongori (V) 22 Soğuk kanlı hayvanlar ve çevre Toplam Salmonella ların Morfolojik ve Biyokimyasal Özellikleri Salmonella lar Enterobacteriaceae familyası içinde yer alan Gram negatif, çubuk formunda ( x2-5 µm), spor oluşturmayan fakültatif anaerob bakterilerdir. S. Pullorum ve S. Gallinarum hariç tüm Salmonella türleri peritrik flagellaları ile hareket yeteneğine sahiptirler (D Aoust, 1997; ICMSF, 1996). Salmonella lar fermentasyon yoluyla besinleri metabolize edebilme özelliğinden dolayı kemoorganotrofik bakterilerdir. Bu mikroorganizmalar D-glikoz ve diğer karbonhidratları asit ve gaz üretmek için katabolize etmektedirler. Oksidaz, Voges-Proskauer, üreaz ve indol negatif olup katalaz pozitiftir. Nitratı nitrite indirgerler. Tipik Salmonella izolatları Triple Sugar Iron Agar da (TSIA) glikozdan gaz ve asit üretirken TSIA, Brilliant Green Agar (BGA), Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) ve Hektoen Enteric (HE) agarlarda laktoz ve sakkarozu kullanmazlar. Bunlara ilaveten Lysine Iron Agar da (LIA) kadaverin ile lizinin dekarboksilasyonu sonucu alkali reaksiyonların hızlı bir şekilde oluşumunu sağlamaktadırlar. Genellikle, TSIA ve LIA da hidrojen sülfür ve gaz oluştururlar (D Aoust, 1997). Salmonella nın bazı biyokimyasal ve serolojik özellikleri Çizelge 1.3 de gösterilmiştir (Flowers ve ark., 1992).

18 6 S. Typhi, D-ksilozu fermente edebilmekte ve tetratiyonatı indirgeyebilmektedir. S. Gallinarum ve S. Pullorum aynı antijenik yapıya sahip olmalarına rağmen S. Gallinarum dulsitol ve d-tartratı kullanır (D Aoust,1989). Lizin dekarboksilaz reaksiyonu S. Paratyphi A dışında Salmonella ların çoğu için pozitifken, ornitin dekarboksilaz S. Typhi de negatiftir. Fenilalanin ve triptofanı oksidatif olarak deamine edemezler. Sitrat, genellikle Salmonella tarafından tek karbon kaynağı olarak kullanılırken bazı serotipleri, özellikle S. Typhi ve S. Paratyphi A sitratı kullanmaz. Çoğu Salmonella türü malonatı kullanmazken S. arizonae kullanır. Sakkaroz, salisin, inositol ve amigdalin genellikle Salmonella tarafından kullanılmaz. Hem lipaz hem de deoksiribonükleaz üretmezler. Çoğu Salmonella serotipleri aerojenik olup, gaz üretmektedir. Bununla beraber S. Typhi önemli bir istisna olup gaz üretmemektedir. Normalde gaz üreten Salmonella serovarlarının anaerojenik varyantları olabilir, bu özellikle S. Dublin de yaygındır. Uygun besiyerinde gelişen çoğu Salmonella serotipleri tarafından hidrojen sülfür üretilebilir, fakat bazı S. Choleraesuis ve çoğu S. Paratyphi A suşları bu özelliğe sahip değildir. Laktoz, genellikle Salmonella tarafından kullanılmaz, fakat S. arizonae nin bir çok türü ß-galaktozidaz aktivitesine sahiptir (Krieg ve Holt, 1984).

19 7 Çizelge 1.3. Salmonella ların biyokimyasal ve serolojik özellikleri (Flowers ve ark., 1992) Test veya Substrat Pozitif Negatif Salmonella türlerinin reaksiyonu a Glikoz TSIA da dipte sarı renk oluşumu TSIA da dipte kırmızı renk oluşumu + Lizin dekarboksilaz LIA da dipte mor renk oluşumu LIA da dipte sarı renk oluşumu + H 2 S (TSIA ve LIA) Siyahlaşma Siyahlaşma yok + Üreaz Pembe-kırmızı renk Renk değişikliği yok - Lizin dekarboksilaz buyyon Mor renk Sarı renk + Fenol red dulsitol buyyon Sarı renk ve/veya gaz Renk değişikliği ve gaz yok + b KCN buyyon Gelişebilir Gelişemez - Malonat buyyon Mavi renk Renk değişikliği yok - c İndol test Yüzeyde kırmızı renk Yüzeyde sarı renk - Polivalan flagellar test Aglütinasyon Aglütinasyon yok + Polivalan somatik test Aglütinasyon Aglütinasyon yok + Fenol red laktoz buyyon Sarı renk ve/veya gaz Renk değişikliği ve gaz yok - d Fenol red sukroz buyyon Sarı renk ve/veya gaz Renk değişikliği ve gaz yok - Voges-Proskauer test Pembe kırmızı renk Renk değişikliği yok - Metil red test Diffuz kırmızı renk Diffuz sarı renk + Simmons sitrat Gelişir; mavi renk Gelişmez; Renk değişikliği yok v a + : 1-2 gün içinde % 90 veya daha fazlası pozitif - : 1-2 gün içinde % 90 veya daha fazlası negatif b : Salmonella alttürleri 3a, 3b, 4 ve 6 nın büyük bir bölümünde negatif, S. arizonae kültürlerinin çoğunda negatif c : Salmonella alttürleri 2, 3a ve 3b nin büyük bir bölümünde pozitif, S. arizonae kültürlerinin çoğunda pozitif d : Salmonella alttürleri 3b nin büyük bir bölümünde pozitif, S. arizonae kültürlerinin çoğunda pozitif v : değişken

20 Salmonella ların Gelişimini Etkileyen Faktörler Sıcaklık Salmonella lar, genellikle 5-47 o C ler arasında üreyebilmekle beraber optimum üreme sıcaklığı 37 o C olarak bildirilmiştir (Adams ve Moss, 1995). Salmonella lar için D değerinin (decimal reduction time-desimal indirgenme süresi) 60 o C de genellikle 2-6 dakika, 70 o C de ise 1 dakika olduğu belirlenmiştir. S. Senftenberg gibi bazı serotiplerin diğer serotiplere göre ısıya daha dirençli oldukları saptanmıştır (Doyle ve Mazzotta, 2000). Veeramuthu ve ark. (1998) nın, hindi but etinden yapılan kıymalarda S. Senftenberg in ısıya dirençliliğini belirlemek için yaptıkları çalışmada D değeri 55 o C de 227.1, 60 o C de 13.5 ve 65 o C de 3.0 dakika olarak belirlenmiştir. Tavuk kıyması ile yapılan bir çalışmada ise, S. Senftenberg i de içeren serotiplerin D değerleri, 67.5 o C de 2.8 ve 70 o C de 1.7 dakika olarak bulunmuştur (Murphy ve ark., 1999). Juneja ve Eblen, (2000) in çeşitli yağ içeriklerine sahip sığır etinde yaptıkları çalışmada, S. Typhimurium DT104 ün termal inaktivasyonu için gereken sürenin uzunluğunun yağ içeriğiyle orantılı olduğunu bildirmişlerdir. Çalışmada % 7 yağ varlığında 58 o C de lag periyodu 4 dakika, % 24 yağ varlığında ise 28 dakika olarak bulunmuştur Su Aktivitesi (a w değeri) ve Tuz Salmonella ların gelişimleri için gereken optimal a w değeri 0.99 olmasına rağmen Salmonella ların büyük bir bölümünün 0.93 gibi düşük a w değerlerinde canlılıklarını sürdürebildikleri bildirilmiştir (Adams ve Moss, 1995). Etkenin çikolata, karabiber ve jelatin gibi düşük su aktivitesine sahip gıdalarda bir yıl veya daha uzun süre canlılığını koruyabildiği bildirilmektedir (ICMSF, 1996).

21 9 Matches ve Liston (1972) un Salmonella nın tuz toleransına sıcaklığın etkisini araştırdıkları çalışmada, S. Heidelberg, S. Typhimurium ve S. Derby % 0-8 NaCl içeren Nutrient Buyyon içerisinde karıştırılıp sırasıyla 8, 12, 22 ve 37 o C lerde inkübe edilmişlerdir. 8 o C de S. Heidelberg % 1 ve 2, S. Typhimurium ise % 1 NaCl içeren ortamda gelişirken, S. Derby nin % 1 ve 2 NaCl içeren ortamda gelişemediği saptanmıştır. 12 o C de inkübe edildikleri zaman üç serotipin de % 0-4 NaCl lü ortamda geliştiği, 22 o C de NaCl toleransının % 5-8, 37 o C de ise % 7-8 lere çıktığı bildirilmiştir. Mattick ve ark. (2000), S. Enteritidis PT 4 ve S. Typhimurium DT104 ün düşük a w değerlerinde yaşam sürelerini araştırdıkları çalışmada, inkübasyon sıcaklığı ve kullanılan buyyona göre farklılık göstermekle birlikte % 8 NaCl (a w 0.95), % 96 sakkaroz (a w 0.94), ve % 32 gliserol (a w 0.92) konsantrasyonlarının bakterisit etki yaptığı saptanmıştır. S. Enteritidis PT 4 ve S. Typhimurium DT104 ün % 8 NaCl varlığında 37 o C de 43 gün canlılıklarını sürdürebildikleri belirlenmiştir. Aljarallah ve Adams (2006), farklı sıcaklıklar ve düşük a w değerlerinde S. Typhimurium un D değerlerinin araştırıldığı çalışmada, Nutrient Buyyon içerisinde % 10 NaCl (a w 0.94) konsantrasyonunda D değerlerinin 48 ve 50 o C lerde sırasıyla 50.7 ve 42.8 dakika iken 53, 55 ve 60 o C lerde bu değerlerin 13.8, 8.3 ve 1.1 dakikaya düştüğü bildirilmiştir ph değeri Salmonella lar için optimal ph değeri arasında değişmekle birlikte 4.5 ile 9.9 arasındaki ph aralığında üreme yeteneğine sahiptir (D Aoust, 1997). Yapılan bir çalışmada S. Pullorum, S. Oranienburg ve S. Senftenberg in sıvı yumurta albumini içindeki gelişiminin ph değeri 8 e yaklaştıkça ilerleyen bir şekilde azaldığı, ph değeri 9 un üzerinde olduğunda gelişemediği bildirilmiştir. Salmonella ların hidroklorik, sitrik, laktik ve asetik asitle asitlendirilen sıvı besiyerinde gelişimi için

22 10 minumum ph değerleri sırasıyla 4.05, 4.05, 4.40 ve 5.40 olarak tespit edilmiştir (D Aoust, 1989) Salmonella ların Bazı Çevresel Koşullar ve Gıdalarda Canlı Kalma Süreleri Salmonella lar çevresel koşullara yüksek direnç göstererek, bazı gıdalarda uzun süre canlılıklarını koruyabilmektedir. Salmonella ların yaklaşık olarak sığır gübresinde 34 ay, balık yeminde 24 ay, bahçe toprağında 9 ay, kanatlı altlığında 4 ay, kanatlı gübresinde 1 ay ve çeşme suyunda 2 ay süreyle (Murray, 1991; Anon, 2003a), ayrıca taze ette 14 gün, dondurulmuş ette 1500 günden fazla, sütte gün, peynirde gün, tereyağında 105 gün, süttozunda 590 gün, dondurmada 2500 gün, kurutulmuş yumurtada 4700 gün ve balık ununda 360 gün süreyle canlılıklarını koruyabildiği bildirilmektedir (Erol, 2007). Salmonella ların buzdolabı koşulları altında uzun periyotlar boyunca yaşayabileceği bildirilmiştir. Yapılan çalışmalarda Salmonella ların -23 o C depolanan tereyağında 2.5 aydan daha uzun bir süre, buzdolabında muhafaza edilen sebzelerin yüzeyinde 1 aydan daha uzun bir süre, oda sıcaklığında veya buz kutuları içinde depolanan sütlerde ise 6 ay canlılığını koruduğu bildirilmiştir (ICMSF,1996) Salmonella ların Antibiyotik Dirençliliği Çiftlik hayvanlarında tedavi, profilaktik veya büyütme faktörü amacıyla düzenli olarak, düşük konsantrasyonlarda antibiyotik kullanımının antibiyotiklere dirençli bakterilerin ortaya çıkmasında en önemli faktörlerden biri olduğu bildirilmektedir (Tollefson ve ark., 1997). Salmonella ve diğer gıda kaynaklı patojenlerde meydana gelen antibiyotik dirençliliği, plazmidler, transpozonlar ve integronlar vasıtasıyla konak hücre bölünmesi sırasında vertikal olarak geçtiği gibi, aynı veya farklı tür ve soylardaki bakteriler arasında transdüksiyon, konjugasyon ve transformasyon vasıtasıyla horizontal olarak da geçmektedir (Holmberg ve ark., 1984).

23 11 Antimikrobiyellere dirençli Salmonella lar tarafından oluşturulan infeksiyonların çoğu kontamine hayvansal gıdaların tüketilmesiyle meydana gelmektedir (Tollefson ve ark., 1997). Salmonella türleri arasında çoklu direnç gösteren fenotipler dünyada yaygın olarak bulunmaktadır. İspanya da 1993 yılından itibaren Salmonella türleri içinde ampisiline direnç % 8 den % 44 e, tetrasikline direnç % 1 den % 42 ye, kloramfenikole direnç % 1.7 den % 26 ya, nalidiksik aside direnç ise % 0.1 den % 11 e yükselmiştir (Prats ve ark., 2000). İngiltere de 1980 yılından 1990 a kadar ki süreç içerisinde tetrasikline direnç % 9 dan % 24 e, ampisiline direnç ise % 10 dan % 14 e yükselmiştir (Threlfall ve ark., 1993). İngiltere de yapılan bir çalışmada ise S. Typhimurium DT104 izolatlarının trimetoprim ve aminoglikozitlere dirençli olduğu ve florokinonlara duyarlılığının azaldığı bildirilmiştir (Low ve ark., 1997). Salmonella türleri içerisinde çeşitli antimikrobiyel maddelere duyarlılığın azalmasıyla beraber son yıllarda çoklu antibiyotik direnci gösteren S. Typhimurium DT104 den meydana gelen insan infeksiyonlarının insidensinde de artış kaydedilmiştir. Çoğu DT104 izolatının ampisilin, kloramfenikol/florfenikol, streptomisin, sulfonamidler ve tetrasikline (ACSSuT) çoklu antibiyotik dirençliliği gösterdiği bildirilmiştir (Threlfall ve ark., 2000) Salmonella ların Virülens Faktörleri Salmonella kromozom veya plazmidler tarafından kodlanan; konakçıya tutunma ve invazyonu sağlamak (prgh, inv), intrafagositik aktiviteye direnç geliştirmek (phop, phoq), komplementi lize etmek (Vi antijen, LPS, phop/phoq ve rck), porinler aracılığıyla besin ve antibiyotiklerin hücreye alınımını düzenlemek (ompf, ompc, ompd, phoe), konak dokuların derinlerine invazyonu sağlamak (spv), Fe +3 elde edebilmek için yarışmak (siderofor) ve toksin üretimini sağlamak için (enterotoksin,

24 12 sitotoksin) çeşitli virülens determinantlarından yararlanır (Çizelge 1.4) (D Aoust, 1997). Çizelge 1.4. Salmonella ların bazı virülens faktörleri (D Aoust, 1997). Virülens faktörleri Mekanizma Gen Sideroforlar Demir elde edebilmek için konağın transferrin, laktoferrin ve ferritin ligantlarıyla yarışmak fur PhoP/phoQ Toksinler A-B enterotoksin, sitotoksin Vi antijen Enzimler katalaz, superoksit dismutaz, peroksidaz Plazmid (30-60 MDa) Porinler (dış membran proteinleri) Fagositlerle, fagolizozom ve defensinlerin yüksek asiditesinde Salmonella nın yaşayabilmesine imkan vermek Sıvı eksorbsiyonuna sebep olmak Yüzey lipopolisakkaritleri üzerinde C3b konak komplementinin opsonizasyonunu inhibe etmek H 2 O 2 ye karşı korumak Bakterinin hızlı bir şekilde çoğalması ve infeksiyonun yayılımını sağlamak Besin ve antibiyotiklerin hücreye alınımını düzenlemek pag ve prg stx viaa ve viab oxyr spv ompc, ompd, ompe ve ompf Lipopolisakkaritler Konak komplement sistemini litik aktiviteyle uzaklaştırmak - Salmonella infeksiyonlarının patogenez analizlerinde, Salmonella virülens genlerinin bir çoğunun Salmonella patojenite bölgeleri (Salmonella Pathogenicity Islands-SPI) olarak bilinen, kromozomun belirli bölgelerinde lokalize oldukları bildirilmektedir (Groisman ve Ochman, 1996; Marcus ve ark., 2000). Salmonella kromozomu üzerinde şimdiye kadar, SPI-1, SPI-2, SPI-3, SPI-4 ve SPI-5 olmak üzere 5 SPI nın varlığı bildirilmişdir (Marcus ve ark., 2000). SPI-1 in fonksiyonu salmonellozun başlangıç basamağı yani gastrointestinal epitelyuma penetrasyon ve invazyonun gerçekleşmesi amacıyla nonfagositik hücreler içerisine Salmonella nın girmesini sağlamaktır (Hayward ve Koronakis, 2002). SPI-2 lokusu tip III sekresyon sistemini kodlamakta ve epiteliyal hücreler ve makrofajlar içerisinde bakterinin yaşaması ve replikasyonu için gerekli olduğu bildirilmektedir. SPI-3 ise çevrede Mg +2 sınırlı olduğu zaman gelişim için gerekli olup, farelerde Salmonella nın virülensi için indirekt olarak gerekli olduğu bildirilmektedir (Blanc-Potard ve

25 13 Groisman ve Ochman, 1996). SPI-4 makrofajlar içerisinde yaşam için gerekli olmakta ve toksin salınımını da içerisine alan tip I sekresyon sistemini taşımaktadır (Wong ve ark., 1998). SPI-5 in ise, intestinal salgı ve inflamatuar cevabı azalttığı ortaya konmuştur (Wood ve ark., 1998). S. Enteritidis, S. Kapemba ve S. Thompson un Shigella dysenteriae-1 benzeri sitotoksin ürettikleri ve bu sitotoksinin etkisinin Shigella dysenteriae-1 toksinine karşı oluşturulan antiserumlar tarafından nötralize edilebildiği bildirilmektedir (Ketyi ve ark., 1979). Sitotoksinler tripsin ve proteaza karşı duyarlı olup, S. Nchanga ve S. Virchow serotiplerinin papaine karşı kısmen duyarlı olmadıkları bildirilmiştir (Malik ve ark., 1996). Salmonella ların bir diğer toksini ısıya duyarlı enterotoksin (Stn) olup, S. Enteritidis, S. Typhi serotiplerini de içeren S. enterica nın 14 serotipine ilişkin incelenen 84 suşun tamamında bulunmuştur (Prager ve ark., 1995). Stn nin camp nin aktive edilmesini, sentezin artmasını ve prostaglandinlerin serbest bırakılmasını sağladığı, elektrolit ve sıvı sekresyonuna neden olduğu bildirilmektedir (Darwin ve Miller, 1999) Salmonella ların Minimal İnfeksiyon Dozu (MİD) ve Patogenezi Salmonelloz olgularında infektif doz kob/g olarak bildirilmekle birlikte, minimal infeksiyon dozu, serotipin virülensine, bireysel savunma mekanizmasına ve gıdanın kompozisyonuna bağlı olarak büyük farklılıklar göstermektedir (D Aoust, 1989; Adams ve Moss, 1995). Gıda kaynaklı salgınlarda, 1-10 Salmonella nın infeksiyonlara neden olabileceği bildirilmiştir (D Aoust ve ark., 1985). Yeni doğanlarda ve küçük çocuklarda immun sistemin tam olarak gelişmemesi, yaşlılarda immun cevabın gecikmesi veya çok zayıf olması ve küçük çocuklarda gastrik asit üretiminin az olması Salmonella ların intestinal kolonizasyonunu ve sistemik yayılımını kolaylaştırmaktadır (D Aoust, 1997). Antibiyotik tedavisi gören bireylerde

26 14 doğal bağırsak florasının bozulmasına bağlı olarak bakteriyel virülensin arttığı bildirilmektedir (Holmberg ve ark., 1984). Salmonellozun oluşumunda kontamine gıdanın kimyasal kompozisyonunun önemli olduğu ve düşük infeksiyon dozuna ilişkin en büyük payı yüksek yağ içeriğine sahip çikolata, peynir ve etin aldığı belirtilmektedir. Hidrofobik yağ miselleri içerisinde Salmonella gastrik asitten korunmaktadır. Ayrıca sıvı gıdaların boş mideden hızlı bir şekilde pasajının bakterinin gastrik asite maruz kalmasını en alt düzeye indirdiği belirtilmektedir (Blaser ve Newman, 1982). Patojen bakteriler konakçı hücresinde çoğalabilmek ve canlı kalabilmek için farklı stratejiler geliştirmektedirler. Salmonella fakültatif hücre içi bir patojen olup konakçı immun cevabına rağmen yaşamakta ve konakçı hücresinde çoğunlukla da makrofajlar gibi fagositik hücrelerde çoğalabilmektedir (Fields ve ark., 1986). Salmonella Giriş Penetrasyon Lumen Çoğalma Diyare Su ve elektrolitlerin sekresyonu Tutunma ince bağırsakların kolumnar epiteliyal hücreleri Lizozomal sindirim Lamina propriya Sistemik yayılım Makrofajlar ve nötrofiller tarafından fagositoz Derin dokulara invazyon Şekil 1.1. Salmonella ların konakçı bağırsak epitel hücrelerine invazyonu (Anon, 2007c). Çoğu tifoid olmayan Salmonella lar vücuda kontamine gıdalar ile alınmaktadır. Ağız yoluyla alındıktan sonra ileum ve kolonda kolonize olarak intestinal epitelyumu istila etmekte ve hücre içinde çoğalarak mezenterik lenf nodüllerine ve oradan da sistemik dolaşıma katılarak tüm vücuda yayılabilmektedir. Ancak retiküloendoteliyal sistem Salmonella nın yayılmasını kontrol altına almaktadır. Konakçı hücre

27 15 membranında oluşturulan pseudopodlar veya membranda yapılan bazı değişiklikler ile bakterinin fagozomal bölmeler içerisine alınması sağlanmaktadır (Şekil 1.1.). Bununla beraber serotipe ve konağın savunma sistemine bağlı olarak karaciğer, dalak, safra kesesi, kemik ve diğer organları da infekte edebilmektedir (Anon, 2007c). Salmonella larda bağırsak epiteline tutunma ve invazyon kromozom ve plazmidlerdeki çok sayıda genin kontrolü altında şekillenmektedir. Salmonella intestinal epitelyumun apikal yüzeyine tutunmakta ve konak hücre sitozolü içerisine, SPI-1 tarafından kodlanan tip III sekresyon sistemini içeren efektör proteinleri injekte etmektedir. Burada bulunan yerleşmiş makrofajlar, kan damarı ve intravasküler nötrofiller lamina propriya içerisine lokalize olmaktadır. Salmonella efektör proteinlerinden Salmonella invazyon proteinleri (Salmonella invasion proteins-sip ABCD) ve özellikle SipA ve SipC, epiteliyal tabakanın apikal yüzeyinde aktin polimerizasyonuna neden olarak kıvrım oluşumunu sağlamaktadır. Bu olay inokülasyondan sonra en erken 15 dakika içinde M hücreleri ve enterositlerde oluşmaktadır. Bazı Salmonella efektör proteinlerinin nüklear cevaba neden olması interleukin (IL)-1, IL-6, IL-8, Tümör nekroz faktör (Tumor necrosis factor-tnf)-2, interferon (IFN)-U, Granulosit-monosit (Granulocyte-monocyte GM)-CSF yi içeren çeşitli proinflamatuar sitokinlerin serbest bırakılmasına ve sentezine yol açmaktadır. Kemotaktik stimülasyona cevap olarak lamina propriyada nötrofil infiltrasyonu oluşmaktadır. İnflamatuar reaksiyonların oluşumuyla, nötrofillerin transepiteliyal göçü sonucu bazal membrandan epiteller sökülmekte, intestinal lumen içerisine sıvı sekresyonu artmakta ve diyareye ek olarak ateş, terleme, abdominal ağrı, lökositozis gibi semptomlar yaygın olarak görülmektedir. Dışkıda polimorf nüklear lökosit, kan ve mukus bulunabilmektedir (Santos ve ark, 2003; Zhang ve ark., 2003) Salmonella İnfeksiyonlarında Semptomlar Salmonella türleri, enterokolitis ve sistemik hastalık olmak üzere iki farklı klinik sendroma neden olmaktadırlar (D Aoust,1989).

28 Enterokolitis Enterokolitis Salmonella infeksiyonlarının en yaygın belirtisidir. Salmonella nın yaklaşık 2000 serotipi enterokolitis ile ilişkilendirilirken infeksiyonların büyük bir çoğunluğuna S. Typhimurium, S. Enteritidis ve S. Heidelberg in neden olduğu bildirilmektedir (Tauxe, 1996). İnsanlar ve hayvanlarda oluşan gastrointestinal infeksiyonlar asemptomatik olabildiği gibi şiddetli diyareyle de seyredebilmektedir. İnkübasyon periyodu 6-48 saat arasında değişmekte olup temel semptomlar orta derecede ateş, mide bulantısı, kusma, abdominal ağrı ve diyaredir. Diyare birkaç gün sürmekte fakat bazı vakalarda bir hafta veya daha uzun süreli olabilmektedir. Ateş, kırgınlık ve kas ağrıları oldukça yaygındır. Hastalık genellikle kendi kendini sınırlamakta fakat özellikle çok genç, çok yaşlı ve hasta olan duyarlı insanlarda çok daha şiddetli seyredebilmektedir. Semptomlar genellikle bir hafta içerisinde azalmakta, fakat Salmonella 5 yaşın altındaki çocuklar tarafından 20 haftadan uzun, yetişkinler tarafından ise 8 haftadan uzun süreyle dışkıyla atılabilmektedir (Adams ve Moss, 1995). Salmonella infeksiyonlarını, infeksiyondan genellikle 1-3 hafta sonra reaktif artritisin (ReA) yol açtığı post infeksiyöz semptomlar takip edebilmektedir (Keat, 1983) Sistemik Hastalık Sistemik özellikteki tifoid ve paratifoid Salmonella infeksiyonlarında (S. Typhi, Paratyphi A, B, C) tifoid ateşin inkübasyon periyodu 7-28 gün arasında olup klinik semptomlar sulu diyare, konstipasyon, yüksek ateş, bulantı, abdominal kramplar ve baş ağrısı ile ortaya çıkmaktadır (D Aoust, 1997). İntestinal epitelyuma penetre olan invaziv Salmonella lar, lenf sistemi yoluyla mezenterik lenf yumrularına taşınır. Makrofajlarda çoğaldıktan sonra kana karışarak serbest kalır ve bütün vücuda yayılırlar (Santos ve ark., 2003). İlk hafta ateş ve

29 17 bakteriyeminin yanısıra üşüme, baş ağrısı, iştahsızlık, boğaz ağrısı, kas ağrısı, psikoz ve hastaların % 5-10 unda mental konfüzyonlar oluşmaktadır. Tonsillerde ağrı, abdominal duyarlılık, hepatomegali ve splenomegali yaygındır. İkinci hafta içerisinde hastaların % 5-30 unun cildinde gül kırmızısı renkte benekler oluşabilmektedir (Andrade ve Andrade, 2003). Salmonella nın safra kesesine ulaşarak safra içerisinde çoğalması ve infekte safra akışının ince bağırsakları yeniden infekte etmesi inflamasyon ve ülserasyonlara neden olabilmektedir. Diyarenin başlangıcında çok fazla sayıda bakteri dışarı atılmakta ve dışkı az miktarda olmaktadır. Daha ciddi vakalarda ülserlerde kanama şekillenir ve bağırsakların perforasyonu sonucu peritonitis oluşabilir. Semptomların hafiflemesinden sonra taşıyıcılık durumu birkaç ay veya daha uzun süre devam edebilmektedir (Santos ve ark., 2003) Salmonella ların Gıdalarda Bulunuşu Hayvansal gıdalar içerisinde başta kontamine kanatlı hayvan etleri ve yumurta ile bunlardan yapılan ürünler, kırmızı et ve et ürünleri, kontamine süt, pastacılık ürünleri, krema, dondurma ve soslar ile kabuklu deniz ürünleri, çoğu insan infeksiyonlarına neden olan en önemli kaynakları oluştururlar (Erol, 2007) Kanatlı Eti ve Ürünleri Tavuk, hindi, kaz ve ördek etleri, intestinal sistem veya tüy ve ayaklardaki fekal materyallerden dolayı sıklıkla Salmonella ile kontamine olabilmektedir. Çapraz kontaminasyon özellikle tüy yolma, iç organ çıkarma ve soğutma gibi kritik aşamalarda önem taşımaktadır. Ayrıca işçi elleri, alet ve ekipmanlarla da çapraz kontaminasyonun şekillendiği bildirilmektedir (ICMSF, 1996).

30 18 Lammerding ve ark. (1988), Kanada da yılları arasında yaptıkları bir çalışmada 230 hindi karkasının 159 unda (% 69.1) Salmonella saptamışlardır. Bu çalışmada S. Schwarzengrund en çok izole edilen serotip olmuştur. Telo ve ark. (1998), kanatlı etlerinden oluşan 80 örnekte Salmonella varlığının araştırılması amacıyla yaptıkları çalışmada Salmonella yı 7 si tavuk, 2 si hindi eti ve 1 i de hindi karaciğeri olmak üzere toplam 10 örnekten izole etmişlerdir. Bu çalışmada S. Enteritidis in en sıklıkla saptanan serotip olduğu bildirilmiştir. Chang in (2000) tavuk karkaslarında Salmonella spp. nin varlığının belirlenmesi amacıyla yaptığı çalışmada toplam 27 örneğin % 25.9 undan Salmonella spp. izole edilmiş olup, izolatların S. Enteritidis, S.Virchow ve S. Virginia serotipleri olduğu tespit edilmiştir. Beli ve ark. (2001a), Arnavutluk ta yılları arasında hindi etleri üzerine yaptıkları bir çalışmada, 134 hindi eti örneğinin 11 inden (% 8.2) Salmonella spp. izole etmişlerdir. İzolatlardan 4 ü S. Enteritidis, 3 ü S. Agona diğerleri S. Saint- Paul, S. Reading ve S. Blockley olarak serotiplendirilmiş ve bir izolatın da tiplendirilemediği bildirilmiştir. White ve ark. (2001), tavuk, hindi, sığır ve domuz kıymasından oluşan toplam 200 örneğin 41 inin Salmonella ile kontamine olduğunu ve bu etkenin daha çok kanatlılardan izole edildiğini bildirmişlerdir. İncelenen 50 hindi kıyma örneğinin % 24.0 ünden Salmonella izole edilmiş olup, predominant serotipin S. Agona olduğu, bunu S. Orion ve S. Reading in izlediği bildirilmiştir. Zhao ve ark. (2001), ABD de yılları arasında inceledikleri 194 hindi göğüs eti örneğinin 5 inde (% 2.6) Salmonella spp. saptadıklarını bildirmişlerdir.

31 19 Beli ve ark. (2001b), Arnavutluk ta yılları arasında yaptıkları çalışmada, 461 tavuk eti örneğinin 30 undan (% 6.5) Salmonella izole etmişlerdir. Predominant serotip S. Enteritidis olarak bulunurken, S. Senftenberg, S. Newport, S. Agona, S. Banana, S. Brancaster, S. Infantis, S. Oslo, S. Abony tiplendirilen diğer serotipler olmuşlardır. Rose ve ark. (2002), Amerika da yıllarını kapsayan dönemde çeşitli büyüklüğe sahip işletmelerde, kanatlı ürünleri ve çiğ ette Salmonella prevalansını belirlemek amacıyla, aralarında hindi kıymasının da bulunduğu örnek ve 1502 son ürün üzerinde çalışmış ve Salmonella kontaminasyonu hindi kıymasında % 49.9 olarak bulunmuştur. Dominguez ve ark. (2002), süpermarket ve perakende satış yerlerinden topladıkları 198 tavuk eti örneğinin 71 inden (% 35.8) Salmonella spp. izole ederlerken, predominant serotipin % 47.8 ile S. Enteritidis olduğunu saptamışlardır. Capita ve ark. (2003), İspanya da kanatlı eti ve ürünlerinde Salmonella nın insidensini araştırmak amacıyla tavuk karkası, tavuk parçaları ve iç organları (kanat, but, karaciğer ve kalp) ve işlenmiş tavuk ürünleri (sosis ve hamburger) üzerine yaptıkları çalışmada tüm örneklerde ortalama % 49 oranında Salmonella spp. saptamışlardır. İzolatlardan S. Enteritidis % 34.3, S. Poona % 11.4, S. Paratyphi B % 2.8 ve S.Worthington % 1.4 oranında saptanmıştır. Hindi ve sığır kıyması, domuz ve broiler etlerinde Salmonella varlığının belirlenmesi amacıyla yılları arasında HACCP uygulanan bir işletmede yapılan çalışmaya göre 212 hindi kıyma örneğinin % 23.5 i pozitif olarak bulunmuştur. Çalışmada 29 farklı serotip içerisinde sırasıyla S. Hadar, S. Heidelberg, S. Senftenberg, S. Reading, S. Saint-Paul ve S. Schwarzengrund ın en sıklıkla saptanan serotipler olduğu bildirilmiştir (Anon, 2003e).

32 20 Antunes ve ark. (2003) nın 1999 yılında Portekizde satışa sunulan kanatlı karkaslarında yapmış oldukları bir çalışmada 6 hindi karkasından 4 ünün (% 66.6) Salmonella yönünden pozitif olduğunu bildirmişlerdir. Fratamico (2003), ABD de yılları arasında 104 hindi kıyma ve 86 tavuk kıyma örneği üzerinde yaptığı bir çalışmada klasik kültür tekniğiyle sırasıyla % 16.8 ve % 18.0 oranlarında Salmonella spp. izole etmiştir. Erol ve ark. (2004), piliç karkaslarında Salmonella ların varlığını belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada 69 örneğin 61 inden (% 88.4) Salmonella izole etmişlerdir. S. Enteritidis % 67.2 oranıyla en fazla izole edilen serotip olmuştur. Yazıcıoğlu ve ark. (2005), tavuk kesimhanelerinin parçalama ünitelerinden topladıkları 662 boyun ve kanat örneklerinin 58 inden (% 8.7) Salmonella izole ederken en fazla izole edilen serotiplerin S. Enteritidis, S. Virchow ve S. Typhimurium olduğu bildirilmiştir. Fakhr ve ark. (2006), Amerika da satışa sunulan hindi etleri üzerinde yaptıkları çalışmada, 99 hindi etinin 49 unun (% 49.4) Salmonella ile kontamine olduğunu saptamışlardır Kırmızı Et ve Ürünleri Et, kesim işlemi sırasında hayvanların ayak, deri ve kılları üzerindeki fekal içerikle veya intestinal içerikle kontamine olabilmektedir. Kontamine karkaslarda bulunan etken, etin işlenmesi sırasında kullanılan aletler, çalışma yüzeyleri ve işçilerin elleriyle diğer karkaslara da yayılabilmektedir (ICMSF, 1996).

33 21 Aabo ve ark. (1995), 48 domuz kıyması örneğinden klasik yöntemle 4`ünde, PCR tekniğiyle ile 7`sinde Salmonella saptarken, yine 48 sığır kıyması örneğinden klasik yöntemle 1`inde (% 2.0), PCR tekniği ile 5`inde (% 10.4) Salmonella saptamışlardır. Erol (1999) un Salmonella ların varlığı ve serotip dağılımı amacıyla yapmış olduğu çalışmada 120 sığır kıyması örneğinin 4 ünden (% 3.3) Salmonella izole edilmiş olup, S. Anatum, S. Typhimurium ve S. Telaviv serotipleri identifiye edilmiştir. S. Typhimurium DT104 ün sığır kıymasındaki varlığını belirlemek amacıyla yapılan bir çalışmada, 404 taze sığır kıymasının 14 ünden (% 3.5) Salmonella spp. izole edilmiştir. Çalışmada 5 S. Typhimurium, 3 S. Lille ve 1 S. Montevideo olmak üzere 8 serotipin belirlendiği ve izole edilen 5 S. Typhimurium izolatının DT104A olduğu bildirilmiştir (Zhao ve ark., 2002). Boughton ve ark. (2004) nın İrlanda da domuz sosislerinde Salmonella nın prevalansını araştırmak amacıyla yaptıkları çalışmada, Ekim-Aralık ayları arasında % 4.4, Temmuz-Ağustos ayları arasında ise % 1.7 oranında Salmonella izole edilmiştir. DT104 S. Typhimurium izolatları arasında predominant faj tipi olarak belirlenmiştir Yumurta Dünya da yumurtadan kaynaklanan Salmonella infeksiyonlarının kaynağı büyük ölçüde S. Enteritidis olarak saptanırken bunu S.Typhimurium ve nadir olarak da S. Heidelberg in izlediği bildirilmiştir (De Buck ve ark., 2004). S. Enteritidis ile kontaminasyon; fekal bulaşma, kontamine çevre ile temas veya üreme sisteminin infeksiyonu sonucu oluşabilmektedir. Üreme organlarının

34 22 infeksiyonu sonucu yumurta sarısı, albumin, yumurta kabuğu membranı ve yumurta kabuğunun direkt kontaminasyonunun da şekillenebileceği bildirilmektedir (Shivaprasad ve ark., 1990). Schutze ve ark. (1996), ticari olarak satışa sunulan 100 düzine kabuklu yumurta üzerinde yaptıkları çalışmada, yumurtaların 1 düzinesinin yüzeysel olarak S. Heidelberg ile kontamine olduğunu, buna karşılık içeriklerinden Salmonella nın izole edilemediğini bildirmişlerdir. Indar ve ark. (1998), yaptıkları çalışmada 10 farklı çiftlikten topladıkları 750 taze yumurta örneğini Salmonella nın varlığı bakımından incelemişler ve 9 yumurtanın kabuğundan (% 1.2), 35 yumurtanın ise içeriğinden Salmonella izole etmişlerdir. İçerikten S. Enteritidis ve S. Typhimurium, kabuktan S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Ohio, S. Cerro, S. Infantis ve S. Heidelberg identifiye edildiği bildirilmiştir Diğer Bazı Gıdalar Salmonella, pastörizasyon işlemiyle yıkımlanabilmesine rağmen süt ve süt ürünleri etkenin taşınmasında önemli rol oynamaktadır. Süt kaynaklı salmonelloz olguları çiğ süt, yetersiz pastörizasyon veya pastörizasyon sonrası kontaminasyonla ilişkilendirilmektedir (El-Gazzar ve Marth, 1992). Kanalizasyon karışmış sular özellikle S. Typhi nin rezervuarı olabilmektedir. Bunun yanısıra balık ve kabuklu deniz ürünlerinin de Salmonella ile kontamine olabildiği bildirilmektedir (ICMSF, 1996). Salmonella nın deniz balıklarında prevalansının düşük olduğu, bununla beraber balıkların, coğrafi bölgeye bağlı olarak Salmonella ile kontamine olabildiği bildirilmektedir (Heinitz ve ark., 2000).

35 23 Deniz ürünlerinde en büyük risk oluşturan ürünlerin pişmiş ıstakoz, midye, dumanlanmış balık, tuzlanmış-kurutulmuş balık ve havyar olduğu belirtilmiş ve ABD de incelenen 2734 tüketime hazır deniz ürününün % 2.6 sından Salmonella izole edildiği bildirilmiştir (Bean ve ark., 1996). Hayvan orijinli olmayan bir çok gıdanın Salmonella nın taşıyıcısı olduğu saptanmıştır. Hindistan cevizi, arpa, pamuk tohumu, çikolatalı şeker, soya sosu, elma suyu, karpuz, karabiber ve karmin boyası bu gıdalar arasındadır. Bu taşıyıcıların muhtemelen hayvan kaynakları tarafından kontamine edildiği ayrıca kesme ve işleme gibi prosesler sırasında da yüzeyden çapraz kontaminasyona bağlı olarak kontaminasyonun şekillendiği bildirilmektedir (D Aoust, 1994) Salmonella ların Kontaminasyon Kaynakları Evcil hayvanların sürüler halinde olması, yemlerin, yem katkı maddelerinin ve meraların kontamine olması, kontamine sular, atık sular, mezbaha atıkları, infekte yabani hayvanlar, kuşlar, fareler, rodentler ve insektlerin hayvanlarda infeksiyon zincirini oluşturdukları bildirilmektedir (Şekil 1.2) (Adams ve Moss, 1995). Kanatlı ürünleri bir çok ülkede Salmonella nın başlıca rezervuarı kabul edilirken, domuz, sığır ve koyun etinin diğer potansiyel kaynaklar olduğu bildirilmektedir. Kanatlı kümeslerinin yapısının rodentler, insektler ve yabani kanatlıların girmesine engel olamayabildiği, bununla beraber kanatlı kümeslerinde sürü bazında yapılan yetiştiriciliğin Salmonella nın horizontal ve vertikal olarak yayılmasına yol açtığı bildirilmektedir. Sığır, koyun ve domuz eti endüstrisinde Salmonella nın varlığının, çiftlik hayvanlarının kontamine çevresel kaynaklara maruz kalmasından, kontamine yemlerden ve infeksiyonun parental geçişinden köken aldığı bildirilmektedir (D Aoust, 1997).

36 24 Kanatlı hayvan kesiminde haşlama, tüy yolma, iç organ çıkarma ve soğutma aşamalarında, sığır, koyun ve keçilerin kesiminde ise derinin yanısıra iç organ çıkarma işlemi sırasında, özellikle rektumun ayrılması veya bağırsaklarda oluşan rupturlara bağlı olarak oluşan çapraz kontaminasyonun et ve yenilebilir organların kontaminasyonuna neden olduğu belirtilmektedir (Anon, 2003a; Erol, 2007). Yabani hayvanlar Kirli atık sular Çevresel kirlenme Akarsu/otlak Mezbahalar Ürünlerin insanlar tarafından tüketimi Hayvan ithalatı Çiftlik hayvanları İnsan İthal gıdalar İnsan gıda İthal hayvansal ve bitkisel protein Ürünlerin hayvanlar tarafından tüketimi Et ve kemik unu, yem olarak kullanılan tavuk atıkları, organ Evcil hayvanlar Şekil.1.2. Salmonella ların gıdalara bulaşma zinciri (Adams ve Moss, 1995) Ham materyalin, ürüne dönüştürülmesi, paketlenmesi, nakli ve muhafazası ile mutfaklarda hazırlanması aşamalarında oluşan personel ve alet-ekipman hijyeni eksikliğinden doğan çapraz kontaminasyonlar, soğuk zincirin korunamaması veya gıdalara yeterli ısı işleminin uygulanmaması ya da ısı işleminden sonra oluşan çapraz kontaminasyonlar infeksiyonların oluşumunda büyük önem taşımaktadır (Bell ve Kyriakides, 2002; Erol, 2007).

37 Salmonella İnfeksiyonlarının Epidemiyolojisi Tüm dünyada gıda infeksiyon ve intoksikasyonları içerisinde ilk sıralarda yer alan salmonelloz olgularının büyük bölümünün, başta kanatlı etleri olmak üzere, kontamine hayvansal gıdaların tüketimi sonucu meydana geldiği ve bu durumun önemli sağlık sorunları, işgücü kaybı ve tedavi masraflarından kaynaklanan ekonomik kayıplara yol açtığı bildirilmektedir (Tauxe, 1991). ABD de yılları arasında gıda kaynaklı infeksiyonların % 15 ine kanatlı etlerinin neden olduğu bildirilmiştir. Bu olaylardan in üzerinde insanın etkilendiği ve 14 ünün öldüğü bildirilmiştir. Bu infeksiyonların % 62 sine hindi etleri, % 37 sine ise tavuk etleri neden olmuştur (Horwitz ve Gangarosa, 1976). Benzer şekilde, yılları arasında bildirilen gıda kaynaklı infeksiyon ve intoksikasyonların % 13,3 ü hindi etinden ve % 6,5 i tavuk etinden meydana gelmiştir (Bryan, 1980). Yine, ABD de yılları arasında gıda tüketimine bağlı şekillenen salgınlarda, kanatlı etlerinin % 10 oranında bir paya sahip olduğu ve bunların % 56 sının hindi etinden, % 44 ünün de tavuk etinden kaynaklandığı belirlenmiştir (Bryan, 1988). CDC tarafından yılları arasında rapor edilen gıda kaynaklı infeksiyon ve intoksikasyonların % 4 lük diliminin hindi eti tüketiminden kaynaklandığı bildirilmiştir (Bean ve ark., 1996). Georgia da, 1985 yılında bir ilkokulda, 351 çocuk ve personelin öğle yemeğinde yediği hindi salatasından dolayı gastroenteritis meydana gelerek, 100 den fazla çocuğun dışkısında, S. Enteritidis saptandığı rapor edilmiştir. Bu olguda hindi salatasının, asemptomatik dört gıda işçisi tarafından gıda hijyenine uygun olmayan bir biçimde hazırlanarak kontamine edildiği bildirilmiştir (Anon, 1985). Connecticut da (ABD) bir hastanede uygun olmayan bir biçimde çözündürülmüş ve pişirilmiş hindi eti tüketimine bağlı olarak iki hasta ve bir gıda servis görevlisinde salmonelloz şekillenmiş ve yapılan dışkı muayenelerinden saptanan izolatlar S. Reading olarak tiplendirilmiştir (Anon, 1991).

38 26 Almanya da ev yapımı mayonez ve sostan kaynaklanan bir salgında sorumlu gıdanın yumurta olduğu saptanmış ve yumurtalardan S.Enteritidis izole edilmiştir. Aynı satış yerinden alınan yumurtaların bakteriyolojik incelemeleri sonucu 5 yumurta sarısı, 3 yumurta beyazı ve yumurta kabuklarından Salmonella tespit edildiği bildirilmiştir (Buchner ve ark., 1991). Kuzey Staffordshire da (İngiltere) 1996 yılında, hindi eti tüketimine bağlı olarak 6 kişinin infeksiyona yakalandığı bildirilmiştir. Hastalardan, etin alındığı marketteki hindi eti örneklerinden ve vakum paketli dondurulmuş örneklerden S. Agona faj tip 15 saptanmıştır. Takip eden araştırma sonucu ilgili gıda imalathanesinde pişirme işleminin yetersiz yapıldığı belirlenmiştir (Synnott ve ark., 1998). İtalya da ördek ve tavuk yumurtasının kullanıldığı ev yapımı bir tatlıdan meydana gelen bir salgında, şüpheli tatlı örneklerinden ve etkilenen 6 kişiden S. Enteritidis PT4 ün izole edildiği bildirilmiştir (Nastasi ve ark., 1998). Güney Dakota da (ABD) 1996 yılında S. Thomson un neden olduğu ve 52 kişinin etkilendiği salgında, restoranda hazırlanan kızartılmış sığır etinin infeksiyonun kaynağı olduğu belirtilmiştir (Shapiro ve ark., 1999). Yakima County de (ABD) S. Typhimurium DT104 ten kaynaklanan ve 54 kişinin etkilendiği salmonelloz olgusunda etkenin taşıyıcısının, pastörize edilmemiş sütten yapılan Meksika tipi yumuşak peynir olduğu bildirilmiştir (Villar ve ark., 1999). İngiltere de S. Enteritis faj tip 4 ten kaynaklanan birbiriyle bağlantılı dört salgında 172 davetliden 47 sinde hastalığın semptomlarının belirlendiği ve 24 hastadan etkenin izole edildiği bildirilmiştir. Gıda içeriğindeki çiğ yumurta etkenin muhtemel taşıyıcısı olarak rapor edilmiştir (Ejidokun ve ark., 2000).

39 27 Almanya da 1998 yılında S. Blockley ile kontamine olmuş dumanlanmış yılanbalığı tüketimine bağlı olarak 14 kişide infeksiyon şekillenmiş ve infeksiyon nedeninin yetersiz sıcak dumanlama uygulanması olduğu bildirilmiştir (Fell ve ark., 2000). İngiltere de Halk Sağlığı Laboratuvar Servisi Bulaşıcı Hastalık Denetim Merkezi ne (Public Health Laboratory Service Communicable Disease Surveillance Center), yılları arasında bildirilen, intestinal sistemin etkilendiği gıda kaynaklı 1426 olguda, toplam 7000 kişi hastalığa yakalanmış ve bunlardan 17 si hayatını kaybetmiştir. Bu olguların % 20 sinin kanatlı eti tüketiminden kaynaklandığı saptanmış, bunların da yaklaşık % 75 inin tavuk eti, % 10 unun da hindi eti tüketiminden köken aldığı belirlenmiştir. Sorumlu tutulan etkenlerin % 30 u Salmonella, % 21 i C. perfringens ve % 6 sı Campylobacter spp. olarak bildirilmiştir (Kessel ve ark., 2001). İngiltere de yılları arasında 1426 gıda kaynaklı salgının rapor edildiği bildirilmiştir in üzerinde insanın etkilendiği bu salgınlarda 9 kişi ölmüştür. Sığır eti (% 34) ve domuz eti (% 32) en sıklıkla rapor edilen et tipleri olurken salgınların % 11 ine kuzu etinin neden olduğu bildirilmiştir. En sık rapor edilen mikroorganizmalar ise C. perfringens (% 43.4) ve Salmonella (% 34.3) olmuştur (Smerdon ve ark., 2001). Danimarka da 2002 yılı içinde Ağustos-Ekim aylarında 41 insanın S. Typhimurium DT120 den kaynaklanan infeksiyona yakalandığı ve bunlar içerisinde ölümle sonuçlanan bir olguya rastlanmadığı bildirilmiştir. İnfeksiyonun kaynağı olarak dumanlanmış hindi eti gösterilmiştir (Anon, 2002a). Danimarka da 2000 yılında meydana gelen salmonelloz olgularının 276 sının ithal kanatlı etinden, 166 sının domuz etinden, 135 inin hindi ve ördek etinden, 99 unun ithal domuz etinden, 71 inin broyler etinden, 49 unun ithal sığır etinden,

40 28 8 inin sığır eti ve 597 sinin sebebi bilinmeyen nedenlerden şekillendiği bildirilmiştir (Anon, 2003b). Fransa da 2001 yılında S. Enteritidis den kaynaklanan iki salgın, çiğ sütten yapılan Cantal peynirinin tüketimi sonucu meydana gelmiştir (Haeghebaert ve ark., 2003). Pennsylvania ve New Jersey de (ABD) S. Typhimurium infeksiyonundan kaynaklanan salgında, pastörize süt, infeksiyonun kaynağı olarak bildirilmiş ve pastörizasyon sonrası sütün kontamine olduğu belirtilmiştir (Olsen ve ark., 2004) Salmonella ların Gıdalardan İzolasyon ve İdentifikasyonu Günümüzde gıdalardan Salmonella ların izolasyon ve identifikasyonu için; klasik kültür tekniği, immunolojik yöntemler, impedans, DNA-DNA hibridizasyon, DNA amplifikasyon, IMS (Immunomagnetic Separation), enzime bağlı antikor-hidrofobik grid membran filtre (Enzyme Linked Antibody Hydrophobic Grid Membrane Filter) gibi farklı analiz metodlarından yararlanılmaktadır (Flowers ve ark., 1992). Ayrıca IMS tekniği; kültür, PCR (Polymerase Chain Reaction) ve ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) teknikleri ile kombine edilerek de kullanılmaktadır (Fluit ve ark., 1993; Molla ve ark., 1994; Coleman ve ark., 1995a,b; Erol ve ark., 1999) Klasik Kültür Tekniği Gıdalardan Salmonella ların izolasyon ve identifikasyonunda kullanılan en eski metot olan klasik kültür tekniği, ön zenginleştirme, selektif zenginleştirme, selektif katı besi yerlerinde izolasyon, biyokimyasal tanımlama ve şüpheli kolonilerin serolojik doğrulanması basamaklarından oluşmaktadır (Flowers ve ark., 1992, Anon, 2002b, 2003c).

41 29 Gıdalardan Salmonella ların belirlenmesi için ISO (The International Organization for Standardization), AOAC (Association of Official Analytical Chemists), APHA (American Public Health Association), FDA (U.S.Food and Drug Administration), HPB (Health Protection Branch-Canada), ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods), NAS (National Academy of Sciences), USDA (U.S. Department of Agriculture) gibi çeşitli kuruluşlar tarafından hazırlanan standartlar bildirilmekte ve bu amaçla kullanılan zenginleştirme sıvı ve katı besi yerleri de farklılıklar göstermektedir (Tietjen ve Fung, 1995). Bu standartlarda geçen ön zenginleştirme buyyonlarının bazıları Tamponlanmış Peptonlu Su, Tryptone Soya ve Nutrient Buyyon iken, selektif zenginleştirme buyyonları; Rappaport-Vassilladis Buyyon (RVB), Mueller-Kauffmann Tetrathionate Buyyon (MKTB), Selenite Cystine Buyyon (SCB), Tetrathionate Buyyon (TTB), selektif katı besiyerleri; Brilliant Green Agar (BGA), Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) Agar, Hektoen Enteric (HE) Agar ve Bismuth Sulfite (BS) Agardır. Biyokimyasal testlerde Triple Sugar Iron Agar (TSIA) ve Lysine Iron Agar (LIA) ın yanı sıra üreaz ve indol testleri de standart prosedürlerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Serolojik doğrulamada ise lam ve tüp aglütinasyon testi kullanılmaktadır (Flowers ve ark., 1992) Ön zenginleştirme aşaması ısıtma, dondurma, çözündürme, ozmotik şok, düşük nemli gıdaların modifiye atmosferde uzun süre depolanması veya yüksek sıcaklık gibi çevresel faktörler sonucu zarar görmüş Salmonella etkenlerinin yenilenmesi amacıyla uygulanmaktadır. Selektif zenginleştirmede kullanılan besiyerleri, Salmonella dışındaki diğer çoğu bakterinin gelişimini sınırlandıran selektif inhibitör maddelerin yanısıra Salmonella ların gelişimini teşvik edici kimyasal maddeler içermektedir. Zenginleştirme işleminin selektifliği zenginleştirme besiyerindeki inhibitör ajanlarla inkübasyon sıcaklığı arasındaki sinerjizmi temel almaktadır. Selektif katı besiyerlerinde Salmonella ların diğer mikroorganizmalardan ayrılması için çeşitli boyalar, safra tuzları ve diğer bazı selektif maddeler bulunmaktadır (Tietjen ve Fung, 1995).

42 İmmunomanyetik Separasyon (Immunomagnetic Separation-IMS) IMS, bakteri hücrelerinin separasyon ve konsantrasyonunda kullanılan kısa süreli bir selektif zenginleştirme tekniğidir. Bu amaçla kullanılan mikropartiküller (bead) uniform, süperparamanyetik mikropartiküller olup, yüzeylerine mono ve polivalan Salmonella antikorlarının karışımı kovalent olarak bağlanmıştır. Gıdalardan Salmonella ların saptanması amacıyla uygulanan ön zenginleştirme işlemi sonrası zenginleştirme sıvı besi yerinde bulunan Salmonella lar, yüzeylerinde antikorlar bulunan paramanyetik mikropartiküllere bağlanarak manyetik çubuk ile oluşturulan alan etkisi ile ayrılırlar ve tekrarlayan yıkama işlemleriyle de konsantre edilirler (Dynal, 1991). Son yıllarda yapılan çalışmalarda IMS tekniği ile Salmonella ların başta kıyma ve tavuk eti olmak üzere çeşitli hayvansal gıdalardan başarıyla saptandığı ve IMS tekniğinin kültür, ELISA ve PCR teknikleri ile kombine edilerek kullanımının iyi sonuçlar verdiği değişik araştırıcılar tarafından bildirilmektedir (Molla ve ark., 1994; Coleman ve ark., 1995a,b; Erol ve ark., 1999) Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction-PCR) DNA nın belirli bir bölümünün in vitro yöntemle hızlı ve çok sayıda çoğaltılmasına yönelik bir teknik olan PCR; moleküler klonlama, DNA nın in vitro mutagenezi, parmak izi, mikroorganizmaların saptanması, genetik hastalıkların teşhisi ve değişik hayvanlara ait proteinlerin saptanması ile DNA analizlerinde kullanılmaktadır (Jones ve ark., 1993). PCR tekniği, selektif sıvı ve katı besiyerlerine ekim ile biyokimyasal ve serolojik testlere ihtiyaç duyulmadan, primerler aracılığıyla hedef DNA nın amplifikasyonu yapılarak gıdalardan patojenlerin büyük bir çoğunluğunun belirlenmesinde kullanılmaktadır (Jones ve ark., 1993; Candrian, 1995). PCR tekniği ile DNA amplifikasyonunun prensibi; çift sarmallı kalıp DNA nın ısı ile

43 31 denatürasyonu, tek sarmallı DNA lara primerlerin bağlanması ve polimeraz enzimi yardımıyla primer uzatılması aşamalarından oluşmakta ve bu 3 aşama 1 siklusu oluşturmaktadır. Saptama süresi de 1-2 güne indirilmektedir (Candrian, 1995). Gıda üretiminin değişik aşamalarında uygulanan teknolojik bazı işlemlere bağlı olarak şekillenen stres faktörlerinin etkisi ile patojenlerin klasik kültür teknikleri ile gıdalardan izolasyonu her zaman mümkün olamamaktadır. Gıdalarda canlı olarak bulunan ancak klasik yöntemlerle kültürü yapılamayan bakteriler de, in vitro DNA amplifikasyonu ile daha güvenli saptanarak, hatalı negatif sonuçların çıkmasına bağlı olarak şekillenecek potansiyel sağlık riskleri de önlenebilmektedir (Josephson ve ark., 1993; Candrian, 1995) Korunma ve Kontrol Hayvansal gıdalardan kaynaklanan Salmonella infeksiyonlarından korunma ve kontrolde aşağıda belirtilen noktalara önem verilmelidir (Silliker ve ark., 1988; Erol, 2007). * Hayvanların yetiştirilmesi boyunca yemlerin patojenlerle kontaminasyonu önlenmeli ve hijyeni sağlanmalıdır. * Sağlıklı damızlık soylar yetiştirilmeli ve kanatlılardan elde edilen fertil yumurtalara kuluçkahaneye girmeden önce, eksternal kontaminasyon kaynaklarının kontrol edilmesi amacıyla fumigasyon işlemi uygulanmalıdır. * İşletme içerisinde ve çevresinde insekt, rodent ve yabani kanatlılarla mücadele yapılmalıdır. * S. Typhimurium DT104 örneğinde olduğu gibi dirençli suşların gelişmesini önlemek amacıyla koruyucu amaçlı antibiyotik kullanımı yasağına uyulmalı ve bunun kontrolü yapılmalıdır. * Kesimhanelerde hijyenik koşullar HACCP programları çerçevesinde iyileştirilerek, özellikle çapraz kontaminasyon kontrol altına alınmalıdır.

44 32 * Gıdalarla temasa gelecek yüzey, alet ve ekipmanın temizlik ve dezenfeksiyonu etkin bir şekilde yapılmalı ve sonuçlar dezenfeksiyon testleri ile teyit edilmelidir. * Üretim, dağıtım ve satış aşamalarında soğuk zincirin sürekliliği sağlanmalıdır. * Personel hijyenine ilişkin etkin ve titiz uygulamalar yapılmalı ve bu çerçevede ellerin temizlik ve dezenfeksiyonuna, gerektiği yerlerde eldiven, bone ve ağız maskesi kullanımına özen gösterilmelidir. * İşletmelerde çalışan personelin düzenli aralıklarla portör kontrolü yapılmalıdır. * Donmuş etlerin oda sıcaklığında çözündürülmesi önlenmelidir. * Gıdaların pişirme ve soğutma işlemleri tercihen küçük porsiyonlar halinde yapılmalı ve çiğ gıdalarla teması engellenmelidir. Çiğ gıdalar, yeniden ısıtılacak pişmiş gıdalar ve donmuş gıdalardaki vejetatif formların tüketilmeden önce yok edilmesi için hindi etleri merkezi sıcaklığı en az 74 o C olacak şekilde ısıtılmalıdır. * Yemekler oda sıcaklığında uzun süre tutulmamalı, pişmiş yemekler mümkün olduğunca çabuk soğutulmalı, soğuk muhafaza 5 o C nin altında olmalı ve soğutulduktan sonra mümkünse yalnızca bir kez ısıtılmalıdır. Bu çalışmada, hindi kıymalarında Salmonella ların varlığının, klasik kültür ve IMS teknikleri kullanılarak araştırılması, elde edilen izolatların oric gen sekansı esas alınarak PCR ile doğrulanması ve izolatların antibiyotiklere karşı dirençlilik durumlarının belirlenmesi ile mevsimsel dağılımının incelenmesi amaçlanmıştır.

45 33 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Gereç Bu çalışmada, Temmuz 2004-Haziran 2005 tarihleri arasında her ay 20 örnek olmak üzere, Ankara da taze olarak tüketime sunulan, 9 farklı firmaya ait ve her biri yaklaşık g olan paketlenmiş formdaki toplam 240 hindi kıyma örneği materyal olarak kullanıldı Salmonella spp. nin İzolasyon ve İdentifikasyonunda Kullanılan Besiyerleri ve Diğer Kimyasallar Tamponlanmış Peptonlu Su (TPS) (Oxoid CM0509) Klasik kültür ve IMS tekniklerinin ön zenginleştirme aşamasında kullanılmak üzere, hazır besi yerinden 20 g tartılarak 1 litre distile suda çözündürüldü ve ph değeri 7.2± 0.1 e ayarlandıktan sonra 121 o C de 15 dakika otoklav edildi. Rappaport -Vassiliadis (RV) Enrichment Buyyon (Oxoid CM669) Klasik kültür tekniğinin selektif zenginleştirme aşamasında kullanılmak üzere, hazır besi yerinden 30 g tartılarak 1 litre distile suda çözündürüldü ve ph değeri 5.2 ± 0.1 e ayarlandıktan sonra 16 x 150 mm tüplere 10 ar ml paylaştırılarak 115 o C de 15 dakika otoklav edildi.

46 34 Selenite Cystine Buyyon (SCB) (Difco JC) Klasik kültür tekniğinin selektif zenginleştirme aşamasında kullanılmak üzere, hazır besi yerinden 23 g tartılarak 1 litre distile suda çözündürüldü ve ph değeri 7.0 ± 0.2 ye ayarlandıktan sonra su banyosunda 15 dakika tutuldu ve aseptik koşullarda 16 x 150 mm lik steril tüplere 9 ar ml paylaştırıldı. Tetrathionate Buyyon (TTB) (FDA,BAM) Polypeptone Bile salts Calcium carbonate Sodium thiosulfate 5H 2 O Distile su 5 g 1 g 10 g 30 g 1000 g Klasik kültür tekniğinin selektif zenginleştirme aşamasında kullanılmak üzere, hazırlanan karışım distile su ile tamamen çözündürülüp ph değeri 8.4 ± 0.2 ye ayarlandıktan sonra kaynayan su banyosunda sterilize edildi ve 45 o C ye kadar soğutuldu. Kullanılacağı gün 20 ml I 2 -KI ve 10 ml brilliant green ilave edilip aseptik koşullarda 16 x 150 mm lik steril tüplere 10 ar ml paylaştırıldı. Iodine-Potassium Iodide (I 2 -KI) solusyonu Potassium iodide Iodine, resublimed Steril distile su 5 g 6 g 20 ml Potassium iodide 5 ml steril distile su içerisinde çözündürüldükten sonra iodine ilave edildi ve karışım çözündürülerek 20 ml ye tamamlandı.

47 35 Brilliant green solusyonu Brilliant green, kuru, steril Steril distile su 0.1 g 100 ml Brilliant Green Phenol-red Lactose Sucrose (BPLS) Agar (Merck ) Klasik kültür ve IMS tekniklerinde selektif katı besi yeri olarak kullanılmak üzere, hazır besi yerinden 52 g alınıp 1 litre distile suda çözündürülerek ph 6.9±0.2 ye ayarlandıktan sonra sıcak su banyosunda tamamen eritildi. 121 o C de 15 dakika otoklavda sterilize edildikten sonra 50 o C ye kadar soğutuldu ve besi yeri steril petrilere dökülerek hazırlandı. Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) Agar (Merck ) Klasik kültür ve IMS tekniklerinde selektif katı besi yeri olarak kullanılmak üzere, hazır besi yerinden 55 g alınıp 1 litre distile suda çözündürülerek ph 7.4±0.2 ye ayarlandı. Daha sonra su banyosunda tamamen eritilip 50 o C ye kadar soğutuldu ve besi yeri steril petrilere dökülerek hazırlandı. Triple Sugar Iron Agar (TSI) (Oxoid CM0277) Klasik kültür ve IMS tekniklerinin biyokimyasal testlerinde kullanılmak üzere, hazır besi yerinden 65 g tartılarak 1 litre distile suda çözündürüldü ve ph değeri 7.4 ± 0.2 ye ayarlandıktan sonra sıcak su banyosunda iyice eritildi. Daha sonra 16 x 150 mm tüplere paylaştırılarak 121 o C de 15 dakika otoklav edildikten sonra yatık bir pozisyona getirilerek katılaşması sağlanarak yatık agar elde edildi.

48 36 Lysine Iron Agar (LIA) (Oxoid CM0381) Klasik kültür ve IMS tekniklerinin biyokimyasal testlerinde kullanılmak üzere, hazır besi yerinden 34 g tartılarak 1 litre distile suda çözündürüldü ve ph değeri 6.7 ± 0.2 ye ayarlandıktan sonra sıcak su banyosunda iyice eritildi. Daha sonra 16 x 150 mm tüplere paylaştırılarak 121 o C de 15 dakika otoklav edildikten sonra yatık bir pozisyona getirilerek katılaşması sağlandı ve yatık agar elde edildi. Urea Buyyon (Difco JF) Klasik kültür ve IMS tekniklerinin biyokimyasal testlerinde kullanılmak üzere, hazır besi yerinden 38.7 g tartılarak 1 litre distile suda çözündürüldü ve ph değeri 6.8 ± 0.2 ye ayarlandıktan sonra 0.45 µm por çapındaki filtreden membran filtrasyon tekniği ile filtre edildi ve aseptik koşullarda 13 x 100 mm lik steril tüplere er ml paylaştırıldı. Tryptone Soya Agar (TSA)(Oxoid CM0131) Elde edilen izolatları 4 o C de muhafaza etmek için, hazır besi yerinden 40 g tartılarak 1 litre distile suda çözündürüldü ve ph değeri 7.3 ± 0.2 ye ayarlandıktan sonra sıcak su banyosunda iyice eritildi. Daha sonra 16 x 150 mm tüplere paylaştırılarak 121 o C de 15 dakika otoklav edildikten sonra yatık bir pozisyona getirilerek katılaşması sağlandı ve yatık agar elde edildi. Dynabeads M-280 anti-salmonella (Dynal A.S., Oslo, Norway, Prod. No ) IMS tekniğinde kullanılmak üzere, 5 ml ve 250 testlik olarak hazırlanmış ticari kit direkt olarak kullanıldı ve 4 o C de muhafaza edildi.

49 37 Phosphate Buffered Saline (PBS) (Oxoid BR 0014G) IMS tekniğinde kullanılmak üzere, 100 ml distile su içerisine 1 tablet PBS (Oxoid BR 0014G) atılarak tamamen eritildikten sonra içerisine % 0.05 lik Tween 20 (Merck ) konuldu ve hazırlanan karışım 115 o C de 10 dakika otoklavda sterilize edildikten sonra 4 o C de muhafaza edildi. Brain Heart Infusion Buyyon (BHI) (Oxoid CM225) PCR tekniğinde izolatların zenginleştirilmesi amacıyla kullanılmak üzere, hazır besi yerinden 37 g tartılarak 1 litre distile suda çözündürüldü ve ph değeri 7.4 ± 0.2 ye ayarlandıktan sonra 16 x 150 mm lik steril tüplere 10 ar ml paylaştırılarak 121 o C de 15 dakika otoklavda sterilize edildi PCR İçin Kullanılan Malzemeler Taq DNA Polymerase 500 U, 5U/µl, EP0402, 3ml lik 10xPCR Buffer, 3ml lik 10xPCR Buffer (NH 4 ) 2 SO 4 solüsyonuyla birlikte, 3ml 25 mm MgCl 2 solüsyonu içermektedir (Fermentas, Litvanya). dntp Mix 4x0.25 µmol, R0181, 100 mm yoğunlukta datp, dctp, dgtp, dttp içeren kit halinde temin edildi (Fermentas, Litvanya).

50 38 Gene Ruler 100bp DNA Ladder Plus, G210A, Blue/Orange 6x Loading Dye (G190A) içermektedir (Promega, ABD). Primerler Widjojoatmodjo ve ark., (1991), Fluit ve ark., (1993) ve Erol ve ark., (1999) tarafından bildirilen iki primer HPLC saflıkta sentezletilmiştir (Integrated DNA Technologies, IDT). Liyofilize olarak temin edilen primerler üretici firmanın önerdiği miktarlarda steril bidistile su ile sulandırıldı. Primer-I : 5 -TTA TTA GGA TCG CGC CAG GC-3 Primer-II : 5 -AAA GAA TAA CCG TTG TTC AC-3 TBE Solüsyonu 54.5 g Tris-Hydroxymethylaminoethane (Merck, ), 27.8 g Boric Acid (Merck ) ve 2.9 g Titriplex II (Merck, ) 1 litre distile suda çözündürüldü ve stok solüsyon elde edildi. Stok solüsyondan 200 ml alınarak distile su ile 1 litreye tamamlanıp 1xTBE elde edildi. Ethidium Bromide (Merck 11608) 10 µg/ml olarak sağlanan stok solüsyon 1:9 oranında sulandırılarak 1 µg/ml konsantrasyonda kullanıldı.

51 39 Agaroz Jel Agaroz jel (% 1.5) için, 4.5 gram Agarose-Basica LE (Prona) içerisine 300 ml 1xTBE eklenerek mikrodalga fırında eritildi ve donmadan içerisine 300 µl Ethidium Bromide eklendi. Referans suş Çalışmada, Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsünden temin edilen S. Typhimurium (ATTC 14028) referans suş olarak kullanıldı Antibiyotik Dirençlilik Testinde Kullanılan Besiyerleri ve Antibiyotik Diskleri Mueller Hinton Agar (Oxoid CM0337) Hazır besi yerinden 38 g alınıp 1 litre distile suda çözündürülerek ph 7.3±0.2 ye ayarlandıktan sonra sıcak su banyosunda tamamen eritildi. 121 o C de 15 dakika otoklavda sterilize edildikten sonra 50 o C ye kadar soğutuldu ve besi yeri steril petrilere dökülerek hazırlandı. Tryptone Soya Buyyon (TSB)(Oxoid CM0129) Hazır besi yerinden 30 g tartılarak 1 litre distile suda çözündürüldü ve ph değeri 7.3 ± 0.2 ye ayarlandıktan sonra 16 x 150 mm lik steril tüplere 5 er ml paylaştırılarak 121 o C de 15 dakika otoklavda sterilize edildi.

52 40 Antibiyotik diskleri Antibiyotik Konsantrasyon (µg) Firma Tetrasiklin 30 Oxoid CT0054B Trimetoprim/sulfametoksazol 25 Oxoid CT0052B Trimetoprim 5 Oxoid CT0076B Kanamisin 30 Oxoid CT0026B Kloramfenikol 30 Oxoid CT0013B Nalidiksik asit 30 Oxoid CT0031B Siprofloksasin 5 Oxoid CT0425B Gentamisin 10 Oxoid CT0024B Streptomisin 10 Oxoid CT0047B Ampisilin 10 Oxoid CT0003B 2.2.Yöntem Her ay düzenli olarak alınan paketlenmiş formdaki kıyma örnekleri termoslu kaplar içerisinde soğuk zincir altında laboratuvara getirildikten hemen sonra Salmonella spp. varlığı yönünden analize alındı. Bu kapsamda; i) Hindi kıymalarında Salmonella lar klasik kültür ve IMS tekniği ile izole edildi ii) oric gen sekansı esas alınarak izolatlar PCR ile doğrulandı iii) izolatların antibiyotiklere karşı dirençliliği saptandı ve iv) Salmonella ların mevsimsel dağılımı belirlendi. Yöntem gereğince hindi kıyması örneklerinin işlenmesi aşağıda sırasıyla açıklanmıştır Klasik Kültür Tekniği Kıyma örneklerinde Salmonella spp. nin klasik kültür tekniği ile izolasyonunda ISO 6579 (The International Organization for Standardization) (Anon, 2002b), FDA

53 41 (Food and Drug Administration) (Anon, 2003c) ile Flowers ve ark.(1992) tarafından bildirilen yöntemler kullanıldı Ön Zenginleştirme Her bir hindi kıyma örneğinden aseptik koşullarda filtreli steril plastik torbalara 25 er gr tartılıp, üzerine 225 er ml tamponlanmış peptonlu su (TPS, Oxoid CM0509) ilave edildikten sonra karışım stomacherde (Lab blender 400) 2-3 dakika homojenize edildi ve ön zenginleştirme amacıyla 37 o C de aerob koşullarda 24 saat inkübe edildi Selektif Zenginleştirme Ön zenginleştirme işlemini takiben selektif zenginleştirme amacıyla, içlerinde 10 ml Rappaport-Vassiliadis Buyyon (RVB, Oxoid CM669), 9 ml Selenite Cystine Buyyon (SCB, Difco JC) ve 10 ml Tetrathionate Buyyon (TTB, Oxoid CM671) bulunan tüplere sırasıyla 0.1, 1 ve 1 ml ön zenginleştirme homojenatından ilave edilerek yine sırasıyla 43, 37 ve 42 o C de 24 saat inkübe edildi Katı Besi Yerine Ekim Selektif zenginleştirme buyyonlarından bir öze dolusu alınarak Brilliant green Phenol-red Lactose Sucrose Agar (BPLS, Merck 7236) ve Xylose Lysine Deoxycholate Agar a (XLD, Merck ) çizme yöntemi ile ekim yapılarak plaklar 37 o C de saat inkübe edildi. BPLS agarda üreyen pembe kırmızı renkli, kenarları düzgün, XLD agarda üreyen merkezi siyah olan kırmızı renkteki tipik kolonilerden 3-5 i seçilerek biyokimyasal testleri yapıldı.

54 42 Resim Salmonella spp. kolonilerinin BPLS agardaki tipik görünümü Resim 2.2. Salmonella spp. kolonilerinin XLD agardaki tipik görünümü

55 İmmunomanyetik Separasyon (IMS) Tekniği Her bir örnek için steril eppendorf tüplerine, homojenize edilen immunomanyetik mikropartiküllerden (Dynabeads M-280 anti-salmonella, , Norveç) 20 şer µl konularak üzerine TPS de ön zenginleştirmesi yapılan homojenattan 1ml ilave edildi, karışım vorteks ile homojenize edildikten sonra DYNAL portüpüne yerleştirildi ve oda sıcaklığında 10 dakika sürekli karıştırılarak inkübe edildi. Bu aşamada örneklerde bulunabilecek Salmonella ların spesifik antijen antikor reaksiyonu ile mikropartiküllere bağlanması sağlandı. İnkübasyonu takiben manyetik partikül konsantratörü (MPC-M; DYNAL AS, Kat. Nr , Norveç) DYNAL portüpünün arka kısmına yerleştirilerek oluşan manyetik alan etkisiyle, Salmonella lar ile bağlanan mikropartiküllerin eppendorf tüplerinin iç yüzüne hareketi ve burada yoğunlaşarak tutunmaları sağlandı. 3 dakikalık bekleme aşamasından sonra manyetik olarak bağlanmamış olan kısım mikropipet yardımıyla dikkatlice alınarak atıldı. MPC nin ayrılmasından sonra mikropartiküller % 0.05 Tween 20 (Merck ) içeren Phosphate-Buffered Saline (ph:7.5) (PBS, Oxoid BR 0014G) ile yıkama işlemine tabi tutuldu. Bu işlemler 2-3 defa tekrar edildikten sonra mikropartiküller 100 µl steril PBS içerisinde yeniden süspanse edildi ve konsantre edilen bu sıvıdan BPLS ve XLD agar a ekimler yapılarak bu plaklarda üreyen tipik kolonilerden biyokimyasal testler yapıldı (Dynal, 1991). Resim 2.3. IMS tekniğinde kullanılan DYNAL seti

56 Salmonella spp. nin İdentifikasyonu Biyokimyasal Testler Aerob koşullarda 37 o C de saatlik bir inkübasyon sonucunda BPLS agarda üreyen pembe kırmızı renkli, kenarları düzgün, XLD agarda üreyen merkezi siyah olan kırmızı renkte ve x µm çapındaki tipik kolonilerden 3-5 i seçilip biyokimyasal reaksiyonlar için Triple Sugar Iron Agar (TSIA,Oxoid CM0277) ve Lysine Iron Agara (LIA, Oxoid CM0381) ekim yapılarak 37 o C de saat inkübasyona bırakıldı. Ayrıca TSIA ya yapılan ekimler sonucu pozitif olan her tüpten Urea Buyyona (Difco JF) geçilerek, tüpler 37 o C de 6-24 saat inkübasyona bırakıldı. Test sonuçlarına göre TSIA testi pozitif, LIA testi pozitif ve üreaz testi negatif olan koloniler Salmonella şüpheli olarak değerlendirildi. Resim 2.4. TSIA ve LIA da Salmonella spp. nin tipik görünümü

57 Resim 2.5. Üreaz testi Aglütinasyon Testi Biyokimyasal test sonuçları pozitif veya şüpheli olan örneklerden polivalan Salmonella antiserumu (Difco, Kat.Nr. L ) ile yapılan test sonucu aglütinasyon veren koloniler Salmonella olarak değerlendirilerek, antibiyotik dirençliliği ve PCR ile doğrulaması yapılmak amacıyla 4 o C de yatık TSA da (Oxoid CM0129) ve -85 o C de cryobanklarda muhafaza edildi.

58 46 1.gün / Ön Zenginleştirme 25 g numune ml Tamponlanmış peptonlu su 37 o C, 24 saat 2. gün / Selektif Zenginleştirme Selenite Cystine Buyyon Rappaport Vassiliadis Buyyon Tetrathionate Buyyon 37 o C, 24 saat 43 o C, 24 saat 42 o C, 24 saat 3. gün / İzolasyon BPLS Agar XLD Agar 37 o C, saat 37 o C, saat 4. Gün veya 5. Gün Her petriden 5 adet tipik koloni Biyokimyasal testler TSIA LIA Urea Buyyon 37 o C, saat 37 o C, saat 37 o C, 6-24 saat Aglütinasyon Testi Şekil Salmonella spp. nin klasik kültür tekniğiyle izolasyon ve identifikasyon şeması (Flowers ve ark.,1992; Anon, 2002b; Anon, 2003c)

59 47 1.gün / Ön Zenginleştirme 25 g numune ml Tamponlanmış peptonlu su 37 o C, 24 saat 2. gün / IMS BPLS Agar XLD Agar 37 o C, saat 37 o C, saat 3. Gün veya 4. Gün Her petriden 5 adet tipik koloni Biyokimyasal testler TSIA LIA Urea Buyyon 37 o C, saat 37 o C, saat 37 o C, 6-24 saat Aglütinasyon Testi Şekil Salmonella spp. nin izolasyonunda IMS tekniğinin kullanılması şeması (Dynal, 1991) PCR Tekniği PCR koşullarının optimizasyonunu takiben Widjojoatmodjo ve ark., (1991), Fluit ve ark., (1993) ve Erol ve ark., (1999) tarafından önerilen protokol gereği oric gen sekansını oluşturan primer çiftleri (Primer-I : 5 -TTA TTA GGA TCG CGC CAG GC-3 Primer-II : 5 -AAA GAA TAA CCG TTG TTC AC-3 ) kullanılarak PCR işlemi yapıldı.

60 48 DNA ekstraksiyonu için yatık TSA da 4 o C de muhafaza edilen izolatlar BHI buyyon (Oxoid CM 225) içerisinde 24 saat zenginleştirildi. Kültürden 1 ml eppendorf tüpüne alınarak soğutmalı santrifüjde (Eppendorf Centrifuge 5417R) 10 o C de 5000 g de 15 dakika santrifüj edildi. Üstte kalan kısım atılarak tortuya 1 ml steril bidistile su konulup süspanse edilerek vortekslendi. Süspansiyon 10 o C de 5000 g de 5 dakika santrifüj edildikten sonra üstteki sıvı kısım alınarak 200 µl steril bidistile su ile resüspanse edildi. Hücre süspansiyonu 95 o C lik su banyosuna (Memmert WB/OB 7-45, WBU45) konularak 20 dakika beklenildi ve bu işlemin sonunda hemen buz üzerine alınarak PCR işlemi yapılana kadar -20 o C de örnek DNA olarak muhafaza edildi. Hazırlanan DNA ekstraktından 10 µl alınarak 40 µl olan PCR karışımına (1xPCR solüsyonu (10 mmol l -1 Tris-HCl, ph: 8.8; 50 mmol l -1 KCl, % 0.1 Triton x- 100) (Fermentas, Litvanya), 100 µm dntp karışımı (Fermentas, Litvanya), 2 U Taq DNA Polimeraz (Fermentas, Litvanya), her birinden 0.5 µm Primer (IDT) ve 1.5 mm MgCl 2 (Fermentas, Litvanya) ilave edilerek toplam 50 µl lik karışım homojenize edilip üzeri mineral yağ ile kapatıldı. Amplifikasyon, Thermal Cycler da (Biometra, Personal cycler) 94 o C de 1 dakika denatürasyon, 53 o C de 1 dakika primer bağlanması ve 72 o C de 1 dakika primer ekstensiyonu aşamalarını kapsayan 35 siklus ve sonunda 72 o C de 10 dakika ilave ekstensiyon işlemlerinden oluşmuştur. Bu işlemler sonunda amplifikasyon ürünleri bir sonraki aşamaya kadar 4 o C de tutuldu. Amplifiye edilen DNA ların saptanması amacıyla, her bir örneğe ait 10 µl PCR ürünü 2 µl boya (Loading Dye) (Promega, G190A) ile boyandı. Ethidium bromide (Merck, 11608) ile 1 µl /ml oranında boyanmış olan % 1.5 lik agaroz jel hazırlanarak, üzerine yine 1 µl /ml oranında Ethidium bromide ile boyanmış TBE solüsyonu konularak jel tamamen kaplandı. Pozitif kontrol (S.Typhimurium ATTC 14028), steril distile su ile hazırlanan negatif kontrol ve DNA Marker dan (Promega, G210A) 10 ar µl alınarak jeldeki kuyucuklara yerleştirilip elektroforezde (Biometra, Agagel-Maxi- System B15359) 100 voltda (Biometra Power Pack P25) 1 saat süreyle yürütüldü. Bu işlem sonunda 163 baz çifti (bp) uzunluğunda Salmonella için spesifik amplikonlar pozitif kontrol ve DNA Marker yardımıyla UV-Transilluminator de (Biometra, TI1

61 49 UV ) incelendikten sonra örneklere ilişkin jelin görüntülenmesi ve dökümantasyonu jel görüntüleme sisteminde (Sygene Genius) yapıldı Antibiyotik Dirençliliğin Belirlenmesi İzolatların antimikrobiyel duyarlılık profilleri disk difüzyon yöntemi ile belirlendi. Bu işlem NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) tarafından bildirilen yöntem esas alınarak Mueller-Hinton agarda (Oxoid, CM0337) ve tetrasiklin (30 µg, Oxoid CT0054B), trimetoprim/sulfametoksazol (25 µg, Oxoid CT0052B), trimetoprim (5 µg, Oxoid CT0076B), kanamisin (30 µg, Oxoid CT0026B), kloramfenikol (30 µg, Oxoid CT0013B), nalidiksik asit (30 µg, Oxoid CT0031B), siprofloksasin (5 µg, Oxoid CT0425B), gentamisin (10 µg, Oxoid CT0024B), streptomisin (10 µg, Oxoid CT0047B) ve ampisilin (10 µg, Oxoid CT0003B) diskleri kullanılarak yapıldı (Anon, 2003d). Agar plak üzerinden alınan koloniler, içerisinde 4-5 ml Tryptone Soya Buyyon bulunan tüplere transfer edilerek, buyyon kültürü 35 o C de, turbiditesi 0.5 McFarland standardına gelinceye kadar (genellikle 2-6 saat) inkübe edildi. İnoküle edilen süspansiyonun turbiditesi ayarlandıktan sonra, swab buyyon içerisine daldırılıp, tüp çeperinde süzdürülerek Mueller-Hinton agar yüzeyine swab tekniğiyle yayıldı. 150 mm çapındaki bir petriye 10 disk olacak şekilde ve disklerin merkezleri arasındaki uzaklık 24 mm den yakın olmayacak biçimde Mueller-Hinton agar yüzeyine antibiyotik diskleri yerleştirilerek 15 dakika içerisinde 35 o C de inkübasyona bırakıldı. İnkübasyondan saat sonra diskler etrafında oluşan inhibisyon zonlarının çapı NCCLS ye göre değerlendirildi.

62 50 Resim 2.6. Mueller Hinton Agar da disk difüzyon tekniğiyle antibiyotik duyarlılık testi İstatistiksel Analizler Mikrobiyolojik analiz bulgularının istatistiksel değerlendirmesi için Ki Kare kullanıldı. Bu amaçla SPSS istatistik hazır paket programı ile çalışıldı. İstatistiksel analizler, klasik kültür ve IMS tekniklerini karşılaştırmak, klasik kültür tekniğinde kullanılan selektif sıvı ve katı besiyerlerini karşılaştırmak ve mevsimsel farklılığı ortaya koymak amacıyla yapıldı (SPSS, versiyon 14.01, Ref. No: ).

63 51 3. BULGULAR Bu çalışmada, Temmuz Haziran 2005 tarihlerini kapsayan 1 yıllık süre içerisinde Ankara da taze olarak tüketime sunulan paketlenmiş formdaki 240 hindi kıyma örneğinde Salmonella ların varlığı, klasik kültür ve IMS teknikleri kullanılarak analiz edildi. Bu amaçla klasik kültür tekniğinde 3 farklı selektif zenginleştirme buyyonu (RVB, SCB, TTB) karşılaştırılırken, her iki teknikle 2 farklı katı besiyerinin (BPLS, XLD) karşılaştırılması da yapıldı. İzolatlar oric gen sekansı esas alınıp PCR ile doğrulanarak, izolatların 10 farklı antibiyotiğe karşı dirençliliği belirlendi. Salmonella ların mevsimsel dağılımı saptandı Klasik Kültür ve IMS Teknikleri ile Analiz Sonuçları Klasik kültür ve IMS tekniğiyle toplam 240 hindi kıyma örneği üzerinde yapılan analizler sonucunda her iki yöntemle toplam 113 örneğin (% 47.0) Salmonella spp. yönünden pozitif olduğu saptanmıştır (Çizelge 3.1, Grafik 3.1). Çalışmada kıyma örneklerinden klasik kültür tekniği ile 114 örnekte (% 47.5) Salmonella spp. saptanmış olmasına rağmen, PCR ile bunların 110 u (% 45.8) doğrulanmış ve 4 izolatın klasik kültür tekniğiyle yanlış pozitif sonuç verdiği belirlenmiştir. IMS tekniğiyle 26 örnek (% 10.8) Salmonella spp. yönünden pozitif olarak bulunmuştur. Çalışmada 23 örnek her iki teknikle Salmonella spp. yönünden ortak pozitif olarak bulunurken, aynı örneklerin 87 sinden IMS tekniğiyle, 3 ünden ise klasik kültür tekniğiyle Salmonella spp. izole edilememiştir. İstatistiksel yönden yapılan analizde bu iki teknik arasındaki farklılığın önemli olduğu (P<0.001) saptanmıştır.

64 52 Çizelge 3.1. Hindi kıymalarından klasik kültür ve IMS teknikleriyle saptanan Salmonella spp. pozitif örneklerin dağılımı. Klasik kültür IMS Klasik kültür ve IMS ile toplam n/n 110/240 26/ /240 % n/n (n:pozitif bulunan örnek sayısı; N: analiz edilen örnek sayısı) Toplam Klasik kültür IMS Grafik 3.1. Hindi kıymalarından klasik kültür, IMS ve her iki teknikle saptanan toplam Salmonella spp. pozitif örneklerin dağılımı. Klasik kültür tekniğinin selektif zenginleştirme aşamasında kullanılan RVB, klasik kültürle izole edilen 110 örneğin 104 ünden (% 94.5), SCB 32 sinden (% 29.0), TTB ise 22 sinden (% 20.0) Salmonella spp. nin izole edilmesini sağlamıştır (Çizelge 3.2, Grafik 3.2). Yapılan istatistiksel analizlerde kullanılan selektif zenginleştirmeler arasındaki farklılığın RVB ile TTB ve SCB arasında önemli olduğu (P<0.001), ancak TTB ile SCB arasındaki farkın istatistiksel yönden önemsiz (P>0.05) olduğu bulunmuştur. Çizelge 3.2. Selektif zenginleştirme buyyonlarındaki Salmonella spp. pozitif örneklerin dağılımı RVB SCB TTB n/n 104/110 32/110 22/110 % n/n (n:selektif zenginleştirme buyyonları ile pozitif bulunan örnek sayısı; N: klasik kültür tekniğiyle pozitif bulunan örnek sayısı)

65 RVB SCB TTB Grafik 3.2. Selektif zenginleştirme buyyonlarındaki Salmonella spp. pozitif örneklerin dağılımı Salmonella spp. nin klasik kültür tekniğiyle izolasyonunda kullanılan selektif katı besiyerlerinden XLD agar ile 110 örneğin 102 sinden (% 92.7), BPLS agar ile 100 ünden (% 90.9) Salmonella spp. izole edilmiştir. İstatistiksel analizler sonucu, kullanılan bu iki selektif katı besi yeri arasında farklılığın önemsiz olduğu (P>0.05) saptanmıştır. IMS tekniğiyle Salmonella spp. yönünden pozitif bulunan 26 örneğin 24 ü (% 92.3) XLD agara yapılan ekimler sonucu, 2 si (% 7.6) ise BPLS agara yapılan ekimler sonucu pozitif olarak bulunmuştur. Bu teknikte kullanılan selektif katı besi yerleri arasında farklılığın önemli olduğu (P<0.001) saptanmıştır. Her iki teknikle Salmonella spp. pozitif olarak bulunan toplam 113 örneğin 105 i (% 92.9) XLD agardan, 100 ü (% 88.4) ise BPLS agardan izole edilmiştir (Çizelge 3.3). Her iki teknikle toplam 113 örneğin pozitif çıkmasını sağlayan selektif katı besi yeri karşılaştırmasında ise farklılığın önemli olmadığı (P>0.05) saptanmıştır.

66 54 Çizelge 3.3. Salmonella ların izolasyonunda kullanılan BPLS ve XLD selektif katı besiyerlerindeki pozitif örnek dağılımı Besiyeri tipi Klasik kültür IMS Klasik kültür ve IMS ile toplam BPLS Agar n/n % XLD Agar n/n % 100/ / / / / /113 n/n (n:selektif katı besiyerlerinde pozitif bulunan örnek sayısı; N: tekniğe göre pozitif bulunan örnek sayısı) 92.9 Klasik kültür tekniği ile Salmonella spp. olarak izole edilen 110 örnekten 100 ü (% 90.9) RVB ve BPLS agar kombinasyonu kullanılarak saptanmıştır. Bunu 96 örnekle (% 87.2) RVB ve XLD agar, 32 örnekle (% 29.0) SCB ve XLD agar, 20 örnekle (% 18.1) TTB ve XLD agar, 2 örnekle (% 1.8) SCB ve BPLS agar ve 2 örnekle (% 1.8) TTB ve BPLS agar kombinasyonları izlemiştir (Çizelge 3.4, Grafik 3.3.). Çizelge 3.4. Klasik kültür tekniğiyle izole edilen Salmonella ların selektif zenginleştirme buyyonları ve katı besiyerlerine göre dağılımları RVB n/n % SCB n/n % TTB n/n % BPLS Agar 100/ / XLD Agar 96/ / /110 20/ n/n (n:selektif zenginleştirme buyyonu ve katı besiyeri kombinasyonu ile pozitif bulunan örnek sayısı; N: toplam pozitif örnek sayısı)

67 55 % 1,8 % 29,0 % 1,8 % 87,2 %18,1 % 90,9 RVB+BPLS RVB+XLD SCB+BPLS SCB+XLD TTB+BPLS TTB+XLD Grafik 3.3. Klasik kültür tekniğiyle izole edilen Salmonella ların selektif zenginleştirme buyyonları ve katı besiyerlerine göre dağılımları 3.2. PCR Sonuçları Çalışmada klasik kültür ve IMS teknikleri ile Salmonella spp. olarak belirlenen izolatların, oric gen sekansını oluşturan primer çiftleri kullanılarak yapılan PCR analizinde, incelenen 117 izolatın 113 ünün (% 96.5) Salmonella spp. olduğu saptanmıştır. PCR amplifikasyon ürünlerinin elektroforez işlemini takiben transillümünatörde görünümü Resim 3.1 de gösterilmiştir. 100 bp 163 bp 500 bp Resim 3.1. PCR ile oric geni tespit edilmiş Salmonella spp. izolatlarının elektroforez görüntüsü (1 ve 8: 100 bp DNA marker 2: Pozitif kontrol ( Salmonella Typhimurium ATCC 14028) 3: Negatif kontrol. 4-7: oric pozitif Salmonella spp. izolatları)