GAZ KROMATOGRAFİSİ. Örnek uçucu hale geçirilip ısıtılmış bir kromatografik kolona gönderilir.

Transkript

1 GAZ KROMATOGRAFİSİ Bozunmadan uçucu hale geçebilen, ısıya dayanıklı organik ve inorganik bileşiklerin bir kolonda farklı hızlarla ilerleyerek ayrılması ve tayininde kullanılan bir tekniktir. Örnek uçucu hale geçirilip ısıtılmış bir kromatografik kolona gönderilir. Örnek bileşenlerinin (solütlerin) kolondan elüsyonu inert bir taşıyıcı gaz ile sağlanır. 1

2 Gaz-Sıvı Kromatografisi Bileşenlerin hareketli bir gaz fazı ile katı bir destek üzerine tutturulmuş sabit bir sıvı faz arasında bölüşülmeleri ile sağlanır. Gaz-Katı Kromatografisi Sabit faz katı bir adsorbandır ve bileşikleri iki faz arasında adsorpsiyon dengesine göre bölüşülür. Kolondan çıkan bileşikler uygun bir dedektörle belirlenir. 2

3 SOLÜTÜN KOLONDA İLERLEME HIZI Kromatografik bir kolon, örnek bileşenlerinin elüsyonunu ne kadar farklı hızla sağlarsa ayırma da o kadar etkindir. Hareketli ve sabit fazlar ile ayırma için seçilen koşullar değiştirilerek solütlerin kolonda alıkonma süreleri ve dolayısıyla elüsyon hızları değiştirilebilir. A Hareketli faz = A sabit faz Bu dengenin sabitine dağılma sabiti veya dağılma katsayısı, K, denir. 3

4 K= C S / C M C S solütün sabit fazdaki ve C M ise hareketli fazdaki molar derişimdir. İdeal koşullarda alıkonma zamanı madde miktarına bağımlı değildir. ALIKONMA Bir solüt bandını enjeksiyon noktasından kolon boyunca taşıyarak dedektöre ulaştırmak için gerekli olan hareketli faz hacmine alıkonma hacmi (V R ), örneğin enjeksiyonu ile bir analitin dedektöre ulaşması için geçen süreye de alıkonma süresi, t R, denir. 4

5 Bir hareketli faz molekülünün veya kolonda tutulmayan bir analitin kolondan geçmesi için gerekli süreye ölü zaman, t M, hacim cinsinden ise kolonun ölü hacmi veya boş hacmi, V M, denir. Ölü hacmin büyük olması ayırma gücünü azaltır. Düzeltilmiş alıkonma hacmi, V R, veya zamanı, t R ise; V R = V R -V M veya t R = t R t M Bir solütün kolonda ilerleme hızı, v, v = L / t R 5

6 Benzer şekilde taşıyıcı gaz moleküllerinin kolonda ortalama doğrusal ilerleme hızları, u; U = L / t M L; Kolondaki dolgunun boyudur. V R = V M + KV S veya V R -V M = KV S V M : Hareketli faz hacmi V R : Sabit faz hacmi Bu eşitlik gaz-sıvı kromatografisi için geçerli olup gaz-katı kromatografisinde ise V S yerine adsorbanın yüzey alanı A S konur. 6

7 Alıkonma faktörü Dağılma oranı, kapasite oranı, kapasite faktörü veya alıkonma faktörü olarak ifade edilen k, bir solütün sabit ve hareketli fazlarda geçirdiği zamanların ölçüsüdür. Solütün sabit fazdaki mol sayısının heareketli fazdaki mol sayısına oranı olarak tanımlanır. k = KV S /V M Alıkonma faktörü, kolonda tutulmayan bir maddeye göre (k =0) bir solütün ne kadar süre sonra çıkacağının bir ölçüsüdür. k = (t R -t M )/t M = (V R -V M )/V M 7

8 Bir önceki eşitlikle V R ye ulaşmak için kaç ölü hacim taşıyıcı gazın kolondan geçirilmesi gerektiğini gösterir. t R = t M (1+k ) = (L/u)(1+k ) k nın 10 dan büyük olması gereksiz zaman kaybına, birden küçük değeri ise ilk çıkan solüt piklerinin yeterince ayrılamamasına neden olur. 8

9 Bağıl Alıkonma (Seçimlilik Faktörü) 9

10 Kolon Verimi 10

11 11

12 Ayırım (Rezolusyon), R s Ayırım, komşu iki pikin ayrılma derecesini gösterir. R S = (t R2 t R1 )/0,5(W 1 +W 2 ) R S = 1 ise komşu pik ile çakışma %4 R S = 1,5 ise çakışma % 0,3 olup ayırma pratikçe tamdır. Ayırmayı artırmak için kolon boyu artırılabilir ancak bu sefer de analiz süresi uzar. 12

13 13

14 Alıkonma Süresi ve Seçimlilik Faktörünün Ayırıma Etkisi Alıkonma Zamanı ile Ayırım İlişkisi 14

15 GAZ KROMATOGRAFİ CİHAZI 15

16 1.Taşıyıcı Gaz Kaynağı Hareketli Faz: Azot, Argon, Helyum, CO 2, gibi inert bir gaz veya H 2 gazı. Su ve diğer safsızlıklardan moleküler elek vb. ile arındırılır. O 2 safsızlığının giderilmesi de gerek ayırma gerekse kolondaki sıvı fazın yükseltgenerek bozulmasını önlemek açısından zorunludur. Tekrarlanabilir kromatogramlar elde etmek için taşıyıcı gaz hızının kontrol edilmesi gereklidir. Gaz basıncı genellikle oda basıncının 1-5 atm üzerindedir. Taşıyıcı gaz hızı, dolgulu kolonlar için ml/dak, kapiler kolonlarda ise 1-25 ml/dak dır. 16

17 2.Örnek Enjeksiyon Sistemi Kolonda iyi bir ayırma yapabilmek için örnek kolona gaz fazında ve çok kısa sürede verilmelidir. Bu nedenle enjeksiyon bölümü, örneği hızlı buharlaştırabilmek için C üzerinde tutulmalıdır. Kapiler ve dolgulu kolonlar için enjeksiyon sistemleri farklıdır. Dolgulu kolonlarda kapasite daha büyük olduğu için örneğin tamamı kolona gönderilir. Kapiler kolonlarda ise kapasitenin aşılmaması için bir bölüştürücü yardımıyla kolona nacak küçük bir kısım gönderilir. Örnek vanaları kullanılarak yapılan analizlerin tekrarlanabilirliği %0,5 iken şırınga ile enjeksiyonların tekrarlanabilirliği %2-5 arasındadır. 17

18 3. Kromatografik Fırın 18

19 KROMATOGRAFİK KOLONLAAR Başlangıçta, toz şeklindeki inert katı destek üzerine kaplanmış sıvı fazla doldurulan kolonlar yapılırdı. Daha sonra, dolgusuz boru şeklinde kapiler kolonların daha başarılı ayırma yapabildiği görüldü. Kapiler kolonlar 1950 de bulıunmasına rağmen 1970 de kullanılmaya başlandı. Bu gecikmenin nedenleri; Düşük örnek kapasitesi Kolon kırılganlığı Kolon çeperlerinin kaplanması ve dedektöre bağlanmasındaki teknik zorluklar 19

20 Dolgulu kolonlarla kıyaslandığında kapiler kolonlar; 1. Daha büyük ayırma gücü 2. Daha kısa analiz süresi 3. Daha büyük seçimlik gibi avantajlara sahipler, ancak; Daha düşük örnek kapasitesi gibi dezavantajlara sahiptirler. 20

21 Açık Borusal (Kapiler) Kolonlar Üç türü vardır. Bunlar; 1. Çeper kaplı kolonlar (WCOT): Sabit sıvı faz kapiler kolonun iç çeperlerine ince bir tabaka halinde kaplanır. 2. Destek Kaplı kolonlar (SCOT): Sıvı faz kapiler borunun iç çeperlerine tutturulmuş katı destek üzerine kaplanır. 3. Gözenekli tabaka kaplanmış kolonlar (PLOT): Katı sabit faz kolonun iç çeperlerine kaplanır. 21

22 Kapiler kolonların çoğu erimiş silikadan yapılmakta ve dayanıklılığı artırmak için 350 C ye kadar dayanan poliimid plastik ile kaplanmaktadır. Bu kolonların boyu m ve iç çapları 0,10-0,53 mm arasındadır. Kaplama kalınlığının azalması ile ayırım artar ve alıkonma zamanı azalır. Destek kaplı kolonların yüzey alanı çeper çaplı kolonlara göre daha büyüktür. 22

23 Kolonlarda kullanılan sabit fazlar ayrılacak analitlerin yapısına göre değişir. Apoları ayırmak için apolar, polarları ayırmak için de polar kolonlar seçilir. Taşıyıcı gazda bulunabilen oksijen safsızlığı veya fazla sıcaklık etkisi sonucu sıvı faz parçalanabilir. Açığa çıkan silanol grupların etkisiyle piklerde kuyruk oluşur. Bu tip kolon bozulmalarını önlemek için sabit faz silika yüzeye bağlanabilir ve kendi molekülü içinde çapraz bağlar oluşturulur. 23

24 Dolgulu Kolonlar Kolon; sabit bir katı fazla veya katı destek üzerine kaplanmış sıvı fazla doldurulur. Bu kolonların ayırma güçleri kapiler kolonlar kadar iyi değildir. Daha az karmaşık örneklerin ayrılmalarında ve kapasiteleri daha fazla olduklarından preparatif amaçlı olarak kullanılırlar. Paslanmaz çelik, Nikel, Cam dan imal edilir. Boyları 1-6 m, iç çapları 2-6 mm Katı destekler; Toprak, teflon, Gözenekli polimerler. 24

25 25

26 DEDEKTÖRLER İdeal bir dedektörün özellikler 1. Uygun duyarlık 2. Kararlılık ve tekrarlanabilirlik 3. Doğrusal yanıt aralığı C arasında kullanılabilirlik 5. Akış hızından bağımsız kısa yanıt süresi 6. Yüksek güvenilirlik ve kullanma kolaylığı 7. Tüm solütler için yüksek ve seçimli yanıtlar 8. Örneği bozmaması Mevcut dedektörlerin hiçbiri bu özelliklerin hepsini taşımaz. 26

27 Alev İyonlaşma Dedektörü (FID) Gaz Kromatografisinde en yaygın kullanılan dedektördür. 27

28 Kolondan gelen örnek ve taşıyıcı gaz kolon çıkışında hidrojen ve sonra hava ile karıştırılarak küçük bir bekin ucunda yakılır. Yanan organik bileşikler iyon, elektron ve karbon tanecikleri oluşturur ve alevin iletken hale gelmesi sağlanır. Bek ucu ile alevin üstüne yerleştirilen kollektör elektrot arasına birkaç yüz volt gerilim uygulanır. Oluşan akım birim zamanda aleve ulaşan madde miktarı ile orantılıdır. Karbonil, alkol, halojen ve amin gibi bazı fonksiyonel gruplar FID de çok az iyon oluşturur. Ayrıca H2O, CO, CO2, CS2 gibi gazlara da yanıt vermez. FID nin duyarlılığı yüksek (~10-13 g/s), zemin gürültüsü az ve doğrusal yanıt aralığı geniştir (~10 7 ), ancak örneği bozar. 28

29 Termal İletkenlik Dedektörü (TCD) (Katarometre) Analit moleküllerinin taşıyıcı gazın termal iletkenliğini değiştirmesine dayanır. Elektrikle ısıtılan platin, altın veya tungsten tel veya termistör bulunur. Bu tellerin sıcaklığı ve dolayısıyla direnci üzerlerinden geçen gazın termal iletkenliği ile değişir. 29

30 TCD dedektörlerin avantajları; 1. Basit 2. Çok geniş doğrusal cevap aralığı (~10 5 ) 3. Tüm bileşiklere cevap verebilmesi 4. Örneği parçalamaması Dezavantajı ise; Diğer dedektörlere göre düşük duyarlığıdır (~10-8 g analit/ml taşıyıcı gaz) 30

31 Elektron Yakalama Dedektörü (ECD) Çevre örnekleri analizleri için en çok kullanılan dedektörlerden biridir. Pestisit ve poliklorobifenillerin seçimli olarak yüksek duyarlılıkla tayinlerine elverişlidir. ECD, elektronegatif fonksiyonel gruplar içeren moleküller için yüksek seçimlilik ve duyarlık gösterirler. Örneğin; halojenler, peroksitler, Buna karşılık ECD alkoller, aminler ve hidrokarbonlara karşı duyarsızdırlar. Bu dedektörler örneği bozmaz, çok duyar ve seçimlidir ancak doğrusal çalışma aralığı dar olup yalnızca iki mertebedir. 31

32 Gaz kromatografi, yüksek güvenilirlik ve doğrulukla uçucu bileşiklerin ayrılmasında, nitel ve nicel analizinde kullanılmaktadır. 32

33 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC) 33

34 GİRİŞ Eskiden HPLC Günümüzde HPLC Cihaz tasarımı Evrensel dedektörü bulma Verim Artırmaya Yönelik Çalışmalar Kolon boyunun kısaltılması Tanecik boyutunun küçültülmesi (5-10 um tanecik) Ayırma işlemi (Saniyeler düzeyi) 34

35 Ters faz taneciklerinin üretilmesi Kimyasal anlamda kararlı taneciklerin üretilmesi Alkil bağlı fazların ortaya çıkması İlk kez polar hareketli fazlar kullanılarak polar maddelerin ayrılması Diğer yöntemlerle ayrılamayan birçok ilacın analizi Ve HPLC birçok ilaç, tarım ilaçları, yiyecek katkı maddeleri, çevre örnekleri analizlerine uyarlandı Diyot serili dedektör ile UV dedektörlerinin gücü arttı LC-MS çalışmaları son yıllarda artmış ve kapiler kolonlar üzerine yoğunlaşmış. 35

36 HPLC NİN SINIFLANDIRILMASI HPLC nin en büyük üstünlüğü, çok değişik modlarda çalışabilmesidir. Normal faz kromatografi Ters faz (Reversed phase) kromatografi Boyut dışlama (Size exclusion) İyon değişim (Ion exchage) kromatografisi Bu yöntemler için aynı cihaz, ayrılacak örnekler için uygun dedektör kullanmak koşuluyla ve kolon maddesi değiştirilerek kullanılabilir. 36

37 Normal Faz Kromatoğrafisi Polar durgun fazla apolar organik yapılı bir hareketli faza dayanır. Durgun faz: Silika, alümina, amino ve siyano bağlı silikadır. Temel ayırma ilkesi örneğin polaritesine bağlıdır. Daha az polar olanlar daha önce elüe edilir. Hareketli faz: Elüsyon gücü elementin polaritesi ile artar. Elüsyon gücü, Hekzan<THF<Asetonitril<Metanol Sulu çözücüler silika yüzeyleri bozduklarından kullanılmazlar. 37

38 Ters Faz Kromatoğrafisi Apolar durgun faz ile polar hareketli faza dayanır. Ayırma mekanizması; Bölüşüm Hidrofobik etkileşmelere dayanır. Örneğin polaritesi ve büyüklüğü çok önemlidir. Büyük apolar moleküller kolonda en faz kalır Bu yöntem, ayrılmaları karbon sayısına bağlı homolog serilerin tayininde önemlidir. Durgun faz olaranalkil ve fenil bağlı silikalar (Oktadesi silan, ODS) kullanılır. Grafit esaslı, polimer esaslı kolonlar. En zayıf elüent su. Metanol, Asetonitril, THF ile elüsyon gücü artar. Susuz ortam çalışmaları da vardır. 38

39 Boyut Dışlama (Size Exclusion, SEC) Kromatografisi Molekül büyüklüğüne göre ayırım söz konusudur. MA >2000 moleküller için uygundur. Küçük moleküller kolon gözeneklerine girerek daha geç elüe edilirler. Bu sırada büyük moleküllerin birçoğu kolondan çıkmış olur. 39

40 İyon Değiştirme Kromatografisi Ayırma, maddenin iyonik yüküne bağlıdır. Ayırma, Kolon maddesinin yüzeyindeki katyonik ve anyonik grupların madde ile eklileşmeleri sonucu oluşur. Kolon maddesi, silika veya PS-DVB den oluşan iskelete sahiptir. Bölüşüme dayalı ayırma görülmez. Değişken grubun yapısına göre anyon ve katyon bulundurmalarına göre sınıflandırılır. 40

41 41

42 KURAMSAL BİLGİ Bir kromatografik pikin çözünürlüğü ve ayrılmasına etkiyen etmenler kullanılmakta olan ayırma modlarından (sıvı-sıvı, jel, iyon değişim) bağımsızdır. Bir kromatogramda 4 temel değişken vardır. Bileşenlerin ayrılabilirliği (piklerin çözünürlüğü): Analizin hızı Duyarlık Tekrarlanabilirlik 42

43 Pik çözünürlüğü ve hız, birbiriyle ilişkilidir ve analizlenen sistemin pratik ve kuramsal konumları ile sınırlıdır. Duyarlık, Pik şekline ve özellikle de dedektöre bağlı bir özelliktir. Tekrarlanabilirlik, kullanıcı deneyimine ve cihazın teknolojisine bağlıdır. Piklerin çözünürlüğü; kolondaki bileşenlerin bağıl alıkonma süreleri ie piklerin keskinliğine bağlıdır. 43

44 44

45 Alıkonma süresi (t R ) Örnek, kolondan geçerken hareketli ve sabit faz arasında dağılır. Fazlar arasında dağılım örneğin toplam derişiminden bağımsız ve sabit olmalıdır. Dağılım doğrusal değilse düzgün olmayan pikler elde edilir. İzoterm doğrusal ise Gaussian piki oluşur. Örneğin dağılma oranı: İle verilir. K = C S /C M 45

46 C S : Örneğin durgun fazdaki derişimi C M : Örneğin hareketli fazdaki derişimi Absorpsiyon izotermi doğrusal ise toplam derişimden bağımsızdır. Deneysel olarak K, alıkonma faktörü (k ) ile bağıntılıdır. K = (t R -t 0 )/(t 0 ) = K (V S /V M ) = KxSabit V S =Ft R t 0 : Kolonda tutunmayan örneğin alıkonma süresi V S : Durgun fazın hacmi V M : Hareketli fazın hacmi 46

47 47

48 Verim Kolon uzunluğu Kuramsal plaka sayısı 48

49 Pik genişlemesi; Enjektörde Bağlantılarda Dedektörde Kolonda oluşabilir. İlk üç etmen tasarıma bağlıdır ve ölü hacim, bağlantıların uzunlukları ve çapları en aza indirilerek bu etkiler azaltılabilir. 49

50 Kolonda bant genişlemesine yol açan etmenler Van Deemter ve Knox eşitliği ile açıklanabilir. H = A + B/U + CU A: Eddy difüzyonu olup elüentin kolon boyunca farklı gidiş yollarında kaynaklanır. B: Boylamasına difüzyon C: Kütle transfer bileşenidir. 50

51 HPLC CİHAZI HPLC sistemi dört ana parçadan oluşur. Bunlar; Çözücü pompalama sistemi Enjektör valfi veya oto enjektör Kolon Dedektör Veri kaydedici 51

52 Pompalar 52

53 Diğer taraftan tüm düşük basınç içeren kesimleri yüksek saflıkta teflondan yapılmıştır. Pompa başlarının kuruması, tampon çözelti kullanıldığında oluşan kristaller conta ve pistonlara kalıcı zarar verir. Bu durum, çözücüler kullanılmadan önce pompanın yıkanması ile giderilebilir. Pompa kullanılmadığında nötral bir çözücü içinde pompa bulundurulmalıdır. 53

54 Metanol su karışımlarında gaz çıkabilir. Bu durumda ultrasonic banyoda degassing yapılmalıdır. (Pompa başlarında oyuk oluşur) Bir diğer yöntem, çözücülerin Helyum ile yıkanması. Vakum filtrasyon Kaynatma. 54

55 Enjektörler 55

56 Dedektörler Bir dedektörün işlevi, örneğin derişimi ile orantılı olacak şekilde elektrik sinyali üretmektir. İdeal bir dedektör, elüentler için ya çok az yada hiç sinyal üretmemelidir. Fakat pratikte böyle bir dedektör yoktur. HPLC de kullanılan dedektörler; UV/GB dedektörleri Kırılma indisi (RI) dedektörleri Floresans dedektörleri Elektrokimyasal dedektörler Radyoaktif dedektörler Işık saçılmasına dayalı dedektörler 56

57 UV/Görünür Bölge Dedektörleri UV veya görünür bölgede soğurum yapan organik bileşiklerin analizlerinde kullanılırlar. Bunlar birkaç gruba ayrılırlar. Sabit dalga boylu dedektörler civa lambasından gelen 154 nm deki çizgisel ışık kaynağını ve bir filtre ile tespit edilmiş tek dalga boyunu kullanarak çalışırlar. Ucu ve duyarlı olup ışık saçılmaya uğrasa bile çok düşük gürültüye sahiptir. Değişebilir dalgaboylu dedektörler istenilen dalgaboyu monokromatörlerle oluşturulur. Dedektör, döteryum lambayı UV için tungsten lambayı da GB için kullanır. 57

58 58

59 Taramalı dedektörler kolondan gelen kimyasal bileşenin ölçüm hücresinde bir an durdurulup spektrumunun alındığı tür dedektörlerdir kez spektrum alınabilir. Fotodiyod dedektörleri daha çok tercih edilir. Fotodiyot ışın demeti dedektörleri lambadan gelen ışın ölçüm hücresine gönderilir. Burada soğurulmayan ışınlar polikromatöre (grating) gönderilir. Oluşan spekrum fotodiyotlar üzerine yansıtılır. Bu işlem sonucu tüm dalgaboylarında bir defada (10 ms) spektrum alınabilir. Spektrumu (kromatogramı) herhangi bir zamanda ve herhangi bir dalgaboyunda oluşturup izlemek mümkündür. Bu iki özellik birleştirilerek üç boyutlu bir kromatogram alınabilir. 59

60 60

61 61

62 Kırılma indisi dedektörleri (RI): Elüentin kırılma indisindeki değişmelere karşı yanıt verir. UV dedektörlerle tayin edilemeyen şekerler, polimerler ve alkilli asit tuzlarına yanıt vermek üzere tasarlanmıştır. Floresans dedektörler floresans özellik gösteren bileşiğin önce uyarılması ve ardından yayımından elde edilen ışığın ölçümüne dayanır. Çok duyarlı ve yüksek seçimli dedektörlerdir. Aromatik bileşikler, aflatoksinler ve aminoasitlarin analizinde kullanılır. 62

63 Elektrokimyasal dedektörler Sabit bir potansiyel uygulanan iki elektrot arasından geçen bileşiklerin indirgenme ve yükseltgenmelerinin ölçümüne dayanır. Amperometrik dedektörler sabit bir potansiyel uygulandıktan sonra oluşan akımın zamana karşı ölçümü ilkesine dayalı olarak çalışır. Aromatik amin ve fenolik yapılar tayin edilir. Puls amperometrik dedektörler (PAD) de ise akım belirli bir potansiyelde ölçülür. Şekerlerin, alkollerin analizinde kullanılır. 63

64 Radyoaktif dedektörler çözeltinin ölçüm hücresinden geçerken radtoaktivitesini sayan dedektörlerdir. Genelde 14 C, 32 P, 3 H saptarlar. Farmakokinetik çalışmalarda çok kullanılır. Işık saçılmasına dayalı dedektörler maddenin ışık ile etkileşimine dayanır. Işın maddeye çarptığında molekülde geçici bir dipol oluşur ve gelen ışığın frekansı ile titresir. Bu saçılma, örneğin bozunup bozunmadığı ile ilgili bilgi verir. 64

65 KOLONLAR Kromatografi; Bir karışımın içindeki iki veya daha fazla bileşenin ayrılmasını sağlar. Kolon, bu ayırma için tek başına yeterlidir. Kolon seçiminde özellikler şunlar olmalıdır: Paketleme maddesi 1. Kolon destek tanecikleri: Silika veya polimerden oluşur. Dayanımı yüksek ve sıkışmaz olmalıdır. Silika ucuz ama ph>7 olmalı ve bazlar dışındakilerle çalışılabilir Polimer pahalı ancak ph aralığı geniş 65

66 66

67 2. Normal faz Bileşenler, artan polariteye göre elue edilirlerse buna normal faz kromatografi denir. Aynı türden bileşiklerin farklı fomksiyonel grubunu ayırmada çok seçimlidir. En önemli sakınca silikanın suya karşı ilgisidir. Bu amaçla; Pentan, THF gibi çözücüler kullanılır. 3. Ters faz (Reversed phase) Durgun faz hareketli fazdan daha az polar ise örneklerin çoğu azalan polaritede olmak üzere kolondan sıra ile çıkarlar. Buna ters faz ayırma denir. Hareketli faz, genelde organik çözücü ve su karışımı ile hazırlanır. Su, Metanol, Asetonitril, gibi çözücüler kullanılır. 67

68 4.İyon Değişimi Bir molekülün sülfonik asit gibi kuvvetli negatif veya kuaterner amonyum bileşikleri gibi pozitif yüklü bileşiklerle kimyasal olarak bağlanması ile iyon değişimi mümkündür. Zayıf ve kuvvetli iyon değişim kolonları inorganik ve organik iyonların ayrılması ile kullanılır. İyon şiddetinin artması alıkonma süresinin azalmasına neden olur. 68

69 Kolon Yenilenmesi (rejenerasyonu) Frit değiştirilerek kolonda geri basınç oluşumu engellenir. Kuvvetli çözücülerle kolon yıkanarak kirlilikler uzaklaştırılır. Kolonun ters çevrilip yıkanması ile kolon girişindeki kirlilikleri temizlemek mümkündür. Kolonun tepesinde herhangi bir boşluk olmamalıdır. Kolonun girişinde oluşan boşluk, aynı tür paketleme maddesi eklenerek giderilir. Kuyruklanan pikler bu şekilde keskinleştirilir. 69