YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ İÇİN UNİFORM PARTİKÜL BAZLI POLAR KOLON ÜRETİMİ VE KROMATOGRAFİK KARAKTERİZASYONU

Transkript

1 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ İÇİN UNİFORM PARTİKÜL BAZLI POLAR KOLON ÜRETİMİ VE KROMATOGRAFİK KARAKTERİZASYONU E. ÜNSAL, T. ÇAMLI, 2 B. ELMAS 2, T. IRMAK, B. ÇAĞLAYAN, A. TUNCEL Hacettepe Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 06532, ANKARA 2 Hacettepe Üniversitesi, Kimya Bölümü, 06532, ANKARA ÖZET Çalışmada, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) için polar formda uniform ve gözenekli poli(dihidroksipropil metakrilat-etilenglikoldimetakrilat) (DHPM-EGD) kolon dolgu materyalleri geliştirilmiş, Ters Faz Sıvı Kromatografisi (Reversed Phase Chromatography, RPC) ve Büyüklükçe Ayırma Kromatografisi (Size-exclusion Chromatography, SEC) nde test edilmiştir. Sentezlerde, farklı oranlarda glisidilmetakrilat (GMA) içeren GMA-EGD partiküller, çok basamaklı polimerizasyon yöntemi ile sentezlenmiş, ardından hidrolizlenerek DHPM-EGD partiküller elde edilmiştir. RPC modunda yapılan çalışmalar, artan GMA derişimi ile partiküllerin hidroliz sonrasında daha polar bir yapıya sahip olduğunu ortaya koymuştur. Üretilen partiküllerin RPC modunda iyi bir ayırma performansına sahip olduğu, % 20 GMA derişimi ile sentezlenen partiküllerin ise en yüksek performansa sahip olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Etilenglikoldimetakrilat, Glisidilmetakrilat, Polar kolon, Uniformgözenekli partiküller, Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC).. GİRİŞ HPLC için kullanılan polimerik kolon dolgu materyalleri genellikle 5-0 mikron aralığında ortalama boy değerine sahip, gözenekli formda, polidispers (boy dağılımlı) yapıdadır (-3). Araştırmalar HPLC uygulamalarında monodispers formdaki kolon dolgu materyallerinin, polidispers yapıdaki benzerlerine kıyasla kromatografik performanslarının daha iyi olduğunu göstermiştir (4-6). Kolon dolgu materyalinin yüzey polaritesi kromatografik performansı etkileyen diğer önemli bir parametredir. Bunun için farklı yüzey polaritelerine sahip materyallerinin sentezleri çalışılmaktadır (7-). Günümüzde monodispers yapıdaki HPLC kolon dolgu materyalleri sınırlı sayıda araştırma grubu tarafından üretilmekte olup henüz polidispers materyaller gibi yaygın ticari kullanımda değildir. Çalışmamızda çok basamaklı polimerizasyon yöntemle, farklı yüzey polaritelerine sahip eş boyutlu gözenekli formda ve DHPM-EGDM kopolimeri şeklinde üretilen partiküllerin HPLC kolon materyali olarak kullanımı bu materyallerin SEC ve RPC de performansları test edilmiştir. 2. DENEYSEL 2.. Uniform-Gözenekli DHPM-EGD Partiküllerin Üretimi ve Karakterizasyonu 2... Materyal Çıkış lateksinin üretiminde başlatıcı olarak 2-2 azobisizobütironitril (AIBN, BDH Chemicals Ltd., İngiltere), sterik stabilizör olarak polivinilpirolidon K-30 (PVP K-30, Sigma Chemical

2 2 Co., ABD), dağıtma ortamı bileşenleri olarak da mutlak etil alkol (Merc A. G. Almanya) ve 2- metoksietanol (HPLC grade, Aldrich Chem. Co., ABD) kullanılmıştır. Monomer stiren (S, Yarpet, Türkiye) distile edilerek kullanılmıştır. Çok basamaklı mikrosüspansiyon yönteminde ilk basamakta organik ajan olarak dibütilftalat (DBP, HPLC grade, Aldrich Chemical Co., ABD), anyonik emülsiyon yapıcı madde olarak sodyum dodesil sülfat (SDS, Sigma Chemicals. Co., ABD), monomer ve çapraz bağlayıcı olarak da sırasıyla glisidilmetakrilat (GMA, Aldrich Chemicals Co., ABD) ve etilenglikoldimetakrilat (EGDMA, Aldrich Chemicals Co., ABD) kullanılmıştır. Benzoil peroksit (BPO, Aldrich Chemicals Co., ABD) başlatıcı, polivinilalkol de (PVA, %87 hidrolize, Aldrich Chemicals Co., ABD) stabilizör olarak kullanılmıştır Çıkış Lateksinin Üretimi 2.g PVP nin hacimce %70 Etanol ve %30 Metoksietanol içeren 20 ml çözeltide çözülmesi ile elde edilen dağıtma ortamına 20mL stiren ve 0.44g AIBN eklenerek ultrasonikasyona maruz bırakılmaktadır. Ağzı kapatılmış 500 ml lik reaktöre konulan çözelti, çalkalamalı su banyosunda 24 saat süreyle 70 0 C değerinde 00 cpm çalkalama hızı ile polimerizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Polimerizasyon sonunda elde edilen partiküller distile-deiyonize su ile defalarca santrifüjlenerek yıkanmaktadır Çok Basamaklı Mikrosüspansiyon Polimerizasyonu ile GMA-EGD Üretimi Tipik bir yöntem şu şekildedir: 8 ml DBP ağırlıkça % 0.25 SDS içeren 20 ml distile-deiyonize su içerisinde 40 dakika süreyle ultrasonikasyonla dispers edilir. DBP-su emülsiyonuna yaklaşık 0.6g polistiren içeren 5 ml dispersiyon eklenip 24 saat süre ile 400rpm hızda manyetik karıştırıcıda tutulur. 2.6 ml GMA, 0,4 ml EGD ve bu karışımda çözünmüş 0.50g BPO dan oluşan organik faz ağırlıkça 0.25 SDS içeren 20 ml distile-deiyonize su içerisinde 0 dakika süre ile ultrasonikasyon uygulanarak dispers edilmiştir. Elde edilen monomer emülsiyonu bir önceki basamakta elde edilen DBP ile şişmiş partikülleri içeren emülsiyona eklenir ve 300 rpm hızda 24 saat süreyle karıştırılarak monomer fazının çıkış partiküllerine transferi sağlanır. Elde edilen dispersiyon üzerine ağırlıkça %5 PVA içeren sulu çözeltisi eklenerek su banyosuna yerleştirilir. Polimerizasyon işlemi 24 saat süreyle 70 0 C değerinde 20 cpm çalkalama hızında yürütülmüştür Uniform-Gözenekli GMA-EGD Partiküllerin Sülfürik Asit ile Hidrolizi Polimerizasyon sonunda elde edilen monodispers gözenekli GMA-EGD partiküller sırası ile su, etanol ve THF ile defalarca yıkanarak 50 ml 0.5 M %95 lik H 2 SO 4 çözeltisi ile 500 ml lik pyrex bir erlen içinde dispers edilmiştir. 60 C de 2 saat süreyle çalkalayıcılı bir su banyosunda gerçekleştirilen hidroliz işlemi ile GMA yapısında bulunan epoksi halkaları açılarak OH fonksiyonel grubu halini almaktadır. Böylece yapı dihidroksipropilmetakrilata (DHPM) dönüştürülmektedir. Monodispers gözenekli partiküller polimerizasyon sırasında farklı monomer oranları (GMA/EGD oranı, 40/60, 20/80, 0/90, 0/00) kullanılarak sentezlenmiştir. Monomer karışımındaki polar monomerin yani GMA nın derişiminin arttırılması, hidroliz sonucunda yüzeydeki -OH fonksiyonel gruplarının derişiminin de artması demektir Kromatografik Çalışmalar Üretilen partiküller kromatografik analiz için 4.6 mm iç çapa ve 250 mm uzunluğa sahip çelik kolonlara (Shimadzu, Japonya) 200 atm basınç altında doldurulmuştur. Ardından partiküllerin kromatografik testleri yapılmıştır. RPC de gerçekleştirilen deneylerde benzen, toluen, etilbenzen, propilbenzen, bütilbenzen ve pentilbenzeni içeren alkilbenzen karışımı analit olarak kullanılmıştır. Buradaki önemli özellik artan alkil grubu büyüklüğü ile aromatik bileşenin polaritesinin azalmasıdır. Bu karışımın literatürde geliştirilen kolon materyallerinin polaritesinin

3 3 tanımlanması amacıyla yaygın olarak kullanılması bir standart niteliğindedir. Örnek karışımının kolon içinde ayrılması 254 nm dalgaboyunda çalıştırılan bir UV-Vis dedektör yardımıyla gözlenmiştir. RPC de mobil faz asetonitril (AcN)-su karışımıdır. SEC deneylerinde mobil faz olarak THF kullanılmıştır. Molekül ağırlığı ,000 arasında değişen polistiren standartlar analit olarak kullanılmıştır. Elde edilen alıkonma süreleri kullanılarak dolgu materyallerine ait gözenek dağılımı, ortalama gözenek boyutu gözenek hacmi ve porozite değerleri SEC yöntemi (2) ile hesaplanmıştır Kromatografik Parametrelerin Tayin Edilmesi Eşitlik ve 2 den yararlanılarak sırasıyla çözünürlük, teorik tabaka sayısı gibi kolon performansını belirleyici parametreler hesaplanmıştır. Alınan kromatogram için çözünürlük değerleri (R), aşağıdaki ifade yardımıyla hesaplanmıştır. R (i+/i) = 2(t i+ t i ) / ( W i+ + W i ) () Burada: ti+,ti, Ardışık piklerin alıkonma sürelerini; Wi+ ve Wi ise taban genişliklerini göstermektedir. Teorik kademe sayısının (N) tayini için ise aşağıdaki ifade kullanılmıştır. Burada W 0.5, pikin yarı yükseklikteki genişliğini göstermektedir. N =5.54 x (ti / W 0.5 ) 2 (2) Üretilen kolon materyallerinin polaritesinin değerlendirebilmek amacıyla akış hızı, kolon boyutu, partikül boyut ve geometrik özelliklerine bağlı olmayıp sadece analit ile katı matris arasındaki etkileşimi veren alıkonma faktörü (k) eşitlik 3 ile hesaplanmıştır. Burada t analitin alıkonma süresi, t R ise kolonla etkileşmeyen inert bir referans materyalinin alıkonma süresidir. k= (ti- t R ) / t R (3) 3. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 3.. Poli(DHPM-EGD) Partiküllerin Karakterizasyonu Monomer fazında hacimce farklı GMA oranları kullanılarak sentezlenen DHPM-EGD partiküllerin boyut ve gözenek yapısını gösteren taramalı elektron fotoğrafları (Scanning Electron Microscope, SEM) Şekil de yer almaktadır. Bu partiküllere ait sayıca ortalama boy değerleri ve boy dağılımının göstergesi olan değişim katsayısı (coefficient of variation, CV) değerleri Çizelge. de verilmiştir. Gerek Şekil den gerekse Çizelge. den görüldüğü gibi sentezlenen tüm partiküllerin monodispers formda oldukları gözlenmektedir. Hesaplanan değişim katsayısı değerlerinin de değişen GMA oranıyla sentezlenen tüm partiküller için %0 dan az olması bu durumu destekler yöndedir. Bu sonuç HPLC de kolon dolgu materyali olarak kullanılan bu partiküller için kromatografik analiz süresince düzenli bir akış rejimi anlamına gelmektedir. Bu sayede kolon içerisinde kanallaşma oluşma olasılığı azalmaktadır. Monodispers partiküller kolon içine daha düzgün yerleştikleri için mobil faz her partikülle etkileşebilmekte ve daha etkin bir kütle transferi gerçekleşmektedir. Şekil den görüldüğü gibi artan GMA oranı ile birlikte partiküllerin ortalama gözenek boyunun arttığı görülmektedir. Bu sonuç Çizelge de Ferreira tarafından önerilen SEC yöntemi ile elde edilen ortalama gözenek çapı değerleri ile de görülmektedir. Bu tabloda ayrıca bu yöntemle elde edilen yüzey alanı, porozite ve gözenek hacmi gibi parametrelerde verilmiştir. Ayrıca monomer fazında düşük GMA derişimi ile sentezlenen partiküllerde süngerimsi gözenek yapısı hakimken, artan GMA derişimi ile krater tipi gözenek yapısının elde edildiği görülmektedir.

4 A B 4 E C D Şekil. Gözenekli Formdaki poli(dhpm-egd) Partiküllerin Yüzey Yapısını Gösteren SEM Fotoğrafları, Büyütme: 4000X, GMA Derişimi (% hacim): (A) 0, (B) 0, (C) 20, (D) 40, (E) 60. Çizelge. DHPM-EGD Partiküllere Ait Boy ve Gözenek Özellikleri. GMA % Partikül Çapı (µm) CV (%) Ortalama Gözenek Çapı (nm) Gözenek Hacmi (ml/g) Porozite (% v/v) Kromatografik Uygulamalar YüzeyAlanı (m 2 /g) Alkilbenzen analizleri sonucunda farklı AcN içerikli mobil fazlar ile elde edilen ters faz sıvı kromatogramları Şekil 2 de verilmektedir. Monomer içerisinde hacimce %60 GMA içeren DHPM-EGD partiküllere ait kromatogramlar bu partiküllerin ters faz uygulamalarında başarılı olmamasından dolayı yer almamaktadır. Bu kromatogramlara ait çözünürlük değerleri topluca Çizelge 2 de verilmiştir. Şekil 2 ve Çizelge 2 beraber değerlendirildiği zaman tüm partiküller ile tatmin edici bir ayırma performansının sağlandığı ve en iyi ayırıcılığın hacimce %20 GMA içeren partiküller ile sağlandığı görülmektedir (en yüksek çözünürlük değerleri). Partikül polaritesinin artışı ile sabit AcN derişimlerinde daha kısa analizler yapmak mümkün olmuştur. Şekil 3 de ise elde edilen sıvı kromatogramlarındaki alıkonma sürerlerinde elde edilen alıkonma faktörleri (k) mobil faz içerisindeki AcN derişimine karşı grafiğe geçirilmiştir. Burada k değerleri pentilbenzen için hesaplanmıştır. Bu şekilde görüldüğü üzere, aynı AcN derişimi için en yüksek k değerleri saf EGD bazlı kolon ile; en düşük değerler ise % 40 GMA içeren partiküllerden oluşan kolon ile elde edilmiştir. Bu da bize en polar kolonun %40 GMA içeren olduğunu ve bu polaritenin azalan GMA oranı ile düştüğünü göstermiştir.

5 % AcN EGD % 0 GMA % 20 GMA % 40 GMA Dakika Şekil 2. Monomer Fazında Farklı Oranlarda GMA Kullanılarak Elde Edilen Poli(DHPM-EGD) Partiküller İçeren Kolonda Farklı AcN Derişimleri İle Elde Edilen Sıvı Kromatogramları, Analit: Alkil Benzen Karışımı, Kolon Boyutları: 250 x 4,6 mm, UV dedektör, λ = 254 nm, Mobil Faz AcN-su, Akış hızı: ml/dak. Şekil 4 de ise benzen analiti için elde edilen teorik tabaka sayısı değerleri verilmiştir. Burada da en yüksek değerler % 20 GMA içeren partiküller ile elde edilmiştir. %0 GMA içeren partiküllerin performansı da tatmin edicidir. Bu sonuçlarla farklı yüzey polaritelerine sahip DHPM-EGD partiküllerin monodispers formda üretildiği ve bu partiküllerin hem SEC hem de RPC de kullanılabileceği gösterilmiştir.

6 Çizelge 2. Farklı AcN Derişimlerinde Alınan Kromatogramlara Ait Çözünürlük Değerleri. 6 % 0 GMA Çözünürlük Değerleri % AcN R(2/) R(3/2) R(4/3) R(5/4) R(6/5) % 0 GMA % AcN % 20 GMA % AcN % 40 GMA % AcN EGD GMA %0 GMA %20 GMA %40 Alıkonma faktörü, k 0 Pentilbenzen AcN konsantrasyonu(%) Şekil 3. Kromatogramlardan (Şekil3) Pentilbenzen İçin Hesaplanan Alıkonma Faktör Değerleri Benzen 5000 Teorik tabaka sayısı, N/m EGD %0 GMA %20 GMA %40 GMA AcN konsantrasyonu(%) Şekil 4. DHPM-EGD Partiküller İle Benzen İçin Elde Edilen Teorik Tabaka Sayısı Değerleri.

7 SEMBOLLER AIBN :2-2-azobisizobütironitril AcN :Asetonitril BPO :Benzoilperoksit CV :Değişim Katsayısı DBP :Dibütilftalat DHPM :Dihidroksipropilmetakrilat EGD :Etilenglikoldimetakrilat GMA :Glisidilmetakrilat HPLC :Yüksek Performanslı Sıvı Kromato. NPC :Normal Faz Kromatografisi PS :Polistiren PVA :Polivinilalkol PVP-K30:Polivinilpirolidon RPC :Ters Faz Sıvı Kromatografisi S :Stiren SDS :Sodyumdodesilsülfat SEC :Büyüklükçe Ayırma Kromat. SEM :Taramalı Elektron Mikroskobu THF :Tetrahidrofuran M :Molekül Ağırlığı N İ :Molekül Sayısı N :Teorik Tabaka Sayısı R :Çözünürlük Faktörü t :Alıkonma süresi t R :Referans Madde AlıkonmaSüresi W :Pikin Taban Genişliği :Pik Yarı Yüksekliğinin Genişliği W KAYNAKLAR. Ellingsen, T., Aune, O., Ugelstad, J., Hagen, S., J. Chromatogr., 47, Cheng, C. Vanderhoff, W., El-Aasser, M.S., J. Polym. Sci: Polym. Chem., 30, 235, Svec, F., Frechet, J. M. J., Science, 273, 205, Wang, Q. C., Svec, F., Frechet, J. M. J., J. Polym. Sci:. Polym Chem., 32, 2577, Galia, M., Svec, F., Frechet, J. M. J., 994, J. Polym. Sci.: Polym. Chem., 32, Tuncel, A., J. Appl. Polym. Sci., 7, , Smigol, V., Svec, F., Frechet, J. M. J., J. Appl. Polym. Sci., 48, 2033, Suzawa, T., Shirahama, H., Fujimoto, T., J. Coll. Inter. Sci., 86, 44, Tseng, C., El-Aasser, M. S., Vanderhoff, JW., J. Polym. Sci.: Polym. Chem., 24, 2995, Unsal E, Camli ST, Senel S, Tuncel A, Journal of Applied Polymer Science 92:607-68, Camli ST, Unsal E, Senel S, Tuncel A, Journal of Applied Polymer Science 92: , Ferreira A, Bigan M, Blondeau D, Reactive and Functional Polymers 56:23-36,2003