Akademik Gıda 10(1) (2012) Araştırma Makalesi / Research Paper

Transkript

1 Akademik Gıda / Academic Food Journal ISSN Print: , Online: Akademik Gıda 10(1) (2012) Araştırma Makalesi / Research Paper Siyah Havuç Suyu Konsantresinin Akide Şekerlerinde Renklendirici Olarak Kullanılması ve Monomerik Antosiyaninlerin Depolama Stabilitesinin Belirlenmesi Betül Erkan Koç 1, Meltem Türkyılmaz 2, Mehmet Özkan 1 1 Ankara Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Dışkapı, Ankara 2 Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı Gölbaşı İlçe Müdürlüğü, Gölbaşı, Ankara Geliş Tarihi (Received): , Kabul Tarihi (Accepted): Yazışmalardan Sorumlu Yazar (Corresponding author): mozkan@ankara.edu.tr (M. Özkan) ÖZET Çalışmada akide şekerleri, içerdiği antosiyaninlerin birçok kırmızı meyvedekine (çilek ve nar gibi) göre daha stabil olması nedeniyle sentetik kırmızı gıda boyalarına alternatif olan siyah havuç suyu konsantresi ile renklendirilmiştir. Renklendirilen şekerler 10, 20 ve 30 C olmak üzere üç farklı sıcaklıkta depolanmış ve depolama süresince renk ve monomerik antosiyanin stabiliteleri incelenmiştir. Depolama süresince, şekerlerin monomerik antosiyanin miktarı üzerine depolama sıcaklık ve süresinin önemli bir etkisinin olmadığı görülmüştür. Bunun nedeni olarak, siyah havuç suyu konsantresinin yüksek oranda açillenmiş antosiyanin içeriğinin yanı sıra, örneklerin yüksek sakaroz içeriği, düşük su aktivitesi ve/veya düşük ph sının antosiyaninleri koruyucu etkisinden kaynaklandığı düşünülmektedir. 10, 20 ve 30 C sıcaklıklarda depolanan şekerlerin polimerik renk oranında ise sırasıyla %2.1, 5.3 ve 7.7 artış gözlenmiştir. Bu artışın da; esmer renkli pigment oluşumundan kaynaklandığı düşünülmektedir. Sonuç olarak, sağladığı yüksek renk stabilitesi ve albeni nedeniyle siyah havuç suyu konsantresi akide şekerlerinin renklendirilmesinde kullanılabilir. Anahtar Kelimeler: Doğal gıda boyaları, Siyah havuç, Antosiyanin, Renk, Depolama Use of Black Carrot Juice Concentrate as Colorant in Hard Candies and Storage Stability of Monomeric Anthocyanins ABSTRACT Anthocyanins in black carrot juice concentrate are more stable than those in red fruits like strawberry and pomegranate. In this present study, Akide (hard) candies were colored with black carrot juice concentrate as an alternative to synthetic red food colorants. Colored candies were stored at three different temperatures (10, 20 and 30 C), and color and monomeric anthocyanin stability of the candies were monitored during storage. Storage temperature and time had insignificant effect on monomeric anthocyanin content of candies during storage, which might be attributed to high acylated anthocyanin content of black carrot juice concentrate as well as the preservative effect of high sucrose content, low water activity and/or low ph of candies. Polymeric colors of candies stored at 10, 20 and 30 C increased 2.1, 5.3 and 7.7%, respectively. The formation of brown colored pigments might be responsible from the increase in polymeric color. Results indicated that black carrot juice concentrate can be used in the coloration of akide candies because of its high color stability and appeal. Key Words: Natural food colorants, Black carrot, Anthocyanin, Color, Storage 30

2 GİRİŞ Gıdaların rengi, tüketici beğenisi üzerine etkili en önemli faktörlerden birisidir. Renk, gıdalarda sadece tüketici beğenisi açısından değil aynı zamanda üretimde kullanılan hammaddenin özellikleri, proses koşulları, depolama sıcaklık ve süresi gibi faktörler hakkında fikir verdiği için de önem taşır [1]. Son yıllarda, tüketicilerin gıdalarda kullanılan sentetik renklendiricilerin güvenilirliği hakkındaki kaygılarının yanında yasal düzenlemeler nedeniyle de yaygın olarak kullanılan sentetik boyalara alternatif olabilecek kırmızı renkli doğal gıda boyalarına gösterilen ilgi artmaktadır. Özellikle de, kullanımı yaygın olan sentetik gıda boyası FD&C Red No:40 (allura red) yerine kullanılabilecek nitelikte, doğal kırmızı boyalara olan talep artmaktadır [2]. Gıdalarda doğal renklendirici olarak kullanılmasına izin verilen renk maddelerine; kurkumin, lutein, beta-karoten, betanin, klorofil, karamelize şeker, malt ekstraktı ve antosiyaninler örnek verilebilir [3]. Bu renk maddelerinden antosiyaninler, birçok meyveye parlak pembe-kırmızı-viyole-mor rengini veren en iyi bilinen doğal gıda boyalarıdır. Suda çözünebilir nitelikte olmaları nedeniyle gıda sistemlerine kolaylıkla uygulanabilmelerinin yanı sıra kullanımlarının herhangi bir yan etkiye sebep olmaması ve koroner kalp hastalıkları, kanser gibi sağlık problemlerini önleyici etkileri dolayısıyla da antosiyaninler, sentetik gıda boyalarına iyi bir alternatif olarak değerlendirilmektedir [4, 5]. Ancak antosiyaninlerin, üretim ve depolama koşulları karşısında düşük stabilite göstermeleri doğal renklendirici olarak kullanımlarını sınırlamaktadır. Antosiyaninler özellikle sıcaklık, ph, oksijen, ışık gibi çeşitli faktörlerin etkisiyle parçalanarak kendilerine özgü renklerini kaybettikleri için gıda maddesi, çekiciliğini dolayısı ile ticari değerini kaybetmektedir. Antosiyaninlerin parçalanmasına neden olan en önemli faktör sıcaklık-süre ilişkili etkendir. Bu nedenle uygulanan her ısıl işlem, antosiyaninlerde mutlaka parçalanmaya neden olmaktadır. Bu tahribat depolamada da sıcaklık-süre etkisiyle devam etmektedir. Konkord üzümü, tatlı patates ve kırmızıturp, fazla miktarda ve stabilitesi yüksek monomerik antosiyanin içermeleri nedeniyle gıdaları renklendirmek için kullanılabilen doğal kaynaklardır. Siyah havuç (Daucus carota) da, yoğun miktarda antosiyanin (1750 mg kg 1 taze ağırlık) içermesi nedeniyle gıda boyası olarak kullanılan diğer bir doğal kaynaktır [6]. İçerdiği antosiyaninlerin büyük bir kısmının açillenmiş olması dolayısıyla, siyah havuç antosiyaninleri proses sırasındaki olumsuz koşullar karşısında diğer antosiyaninlere göre daha stabildir. Tüm bu özelliklerinin yanı sıra kolaylıkla okside olabilen antosiyanin olmayan fenolik (non-anthocyanin phenolics) içeriğinin düşük olması, ucuz olması ve kolaylıkla konsantreye işlenebilmesi nedeniyle de siyah havucun, doğal pigment kaynağı olarak kullanımı kırmızı sentetik boyalara alternatif olabilir. Bu çalışmamızdaki temel amaç; siyah havuç suyu konsantresi kullanılarak renklendirilen akide şekerlerinde bulunan monomerik antosiyaninlerin, şekerin 10, 20 ve 30 C sıcaklıklarda depolanması süresince stabilitesini belirlemektir. Çalışmamızda ayrıca; şekerlerin renklendirilmesinde kullanılan siyah havuç suyu konsantresindeki monomerik antosiyanin miktarının, üretim sırasında ne kadar azaldığı da belirlenmiştir. Bu çalışma ile elde edilen sonuçların, endüstriye önemli katkılar sağlayacağı umulmaktadır. MATERYAL ve METOT MATERYAL Siyah Havuç Suyu Konsantresi Araştırmada, doğal renklendirici olarak siyah havuç suyu konsantresi kullanılmıştır. Siyah havuç suyu konsantresi, TARGID Meyve Suyu Firması ndan (Mersin) temin edilmiştir. Siyah havuç suyu konsantresi (64.83 Bx), akide şekeri üretiminde kullanılana kadar 20 C sıcaklıktaki derin dondurucuda muhafaza edilmiştir. Akide Şekeri Araştırmada materyal olarak, Hicret Şekerleme nin (Ankara) imalathanesinde üretilen ve yoğun antosiyanin içeriği dolayısıyla doğal renklendirici olarak kullanılan siyah havuç suyu konsantresi ile renklendirilen akide şekerleri kullanılmıştır. Akide şekerlerinin renklendirilmesinde 2.1 kg şekere 5.22 g siyah havuç suyu konsantresi eklenmiştir. Kimyasallar Antosiyaninlerin saflaştırılmasında kullanılan C 18 -Sep- Pak kartuşları Waters firmasından (Milford, MA, ABD) temin edilmiştir. Antosiyaninlerin ekstraksiyonunda, saflaştırılmasında ve HPLC ile analizinde, daima HPLC saflığında (HPLC grade) solventler kullanılmıştır. Diğer analizlerde Merck (Darmstad, Almanya) firmasından temin edilen, ya analitik saflıkta ya da yüksek saflıkta kimyasallar kullanılmıştır. METOT Akide Şekeri Üretimi Bir kaynatma kazanına 30 kg toz şeker, 6 L içme suyu ve 20 ml %10 luk (w/v) sitrik asit çözeltisi konulup içerik, ağzı açık olarak, şurubun sıcaklığı 165 C olana kadar yaklaşık 45 dakika kaynatılmıştır. Süre sonunda istenen renk (bal sarısı) ve kıvama gelen şurup alttan su soğutmalı bir sistemle kombine edilen metal tezgâha dökülmüştür. Tezgaha dökülen şekerden yaklaşık 2 kg kadarı ayrılarak bu kitleye renklendirme amacıyla 5.2 g siyah havuç suyu konsantresi (2.6 g siyah havuç suyu konsantresi/1 kg akide şeker hamuru) eklenmiş ve boya, kitleye homojen şekilde dağıtılmıştır. Şekere eklenecek doğal boya miktarı, üretimi gerçekleştiren ekibin tecrübelerinden faydalanılarak, üretim sonunda elde 31

3 edilecek renk göz önüne alınarak denemeler sonucunda belirlenmiştir. Tezgâha dökülen şeker, soğudukça bir spatula yardımıyla kaldırılarak sıcak kısımların soğuk tepsiyle teması sağlanmış ve bu şekilde şeker, soğuyana kadar adeta bir hamur gibi yoğrulmuştur. Soğudukça yumuşak şeker kıvamına gelen hamur, rulo şekline getirildikten sonra kesim makinesine verilmiştir. Kesilen şekerler soğutma tünelinden geçerek döner bir tezgâha dökülmüş ve tepsinin hemen üzerinde bulunan fan yardımıyla oda sıcaklığına soğutulmuştur (Şekil 1). Hammaddelerin karışımı Karışımın ısıtılması, 165 C Yağlanmış tezgâha karışımın dökülmesi Araştırma için gerekli miktarda şekerin kitleden ayrılması Renklendirici ilavesi Renklendiricinin şekere dağıtılması Karışımın istenilen kıvama getirilmesi Kitleye şekil verilmesi Kesim Soğutma Şekil 1. Akide şekeri üretim akış diyagramı Akide Şekerlerinin Depolanması Her bir akide şekerinde bulunan doğal boya miktarının eşit olmaması olasılığı düşünülmüş, akide şekerleri porselen bir havanda dövülmek suretiyle öğütülerek tüm kitle homojen hale getirilmeye çalışılmıştır. Öğütülen şekerler tek kullanımlık miktarlarda, hava ve nem geçirgenliği olmayan plastik tüplere paylaştırılmış ve antosiyaninler artık parçalanmaya daha duyarlı hale geldiğinden oksijenin etkisini ortadan kaldırmak amacıyla örnekleri içeren tüplere azot gazı doldurularak kapakları sıkıca kapatılmıştır. Hazırlanan örnekler, depolamanın yapılacağı sıcaklık kontrollü inkübatörlere yerleştirilmiştir. 10, 20 ve 30 C'deki depolama deneyleri 253 L'lik inkübatörlerde (Sanyo MIR 253, Gunma, Japonya) yapılmıştır. Ayrıca; söz konusu akide şekerleri öğütülerek ve azot gazı altında muhafaza edildiği, oksijenin etkisi ortadan kaldırıldığı için üretilen aynı partiden bir miktar akide şekeri de kontrol grubu olarak ayrılıp, cam kavanozlarda bütün halde depolanmıştır. Bütün halde depolanan şekerler de analiz edilmeden önce öğütülerek yine boya dağılımı homojen bir kitle oluşturulmaya çalışılmıştır. Bu şekerlerde yapılan analizlerin sonuçlarıyla öğütülen şekerlerden elde edilen sonuçlar arasında herhangi bir fark saptanmamış olduğundan, bu kitleye ait sonuçlara araştırma bulguları bölümünde kısaca değinilmiştir. Şekerler, 275 gün süreyle depolanmıştır. Depolama süresince, her 3 sıcaklıkta depolanan şekerlerden alınan örneklerde aşağıda belirtilen fiziksel ve kimyasal analizler yapılmıştır. Fiziksel Analizler ph tayini ph değeri, potansiyometrik olarak ph-metre (WTW Inolab Level 1, Weilheim, Almanya) ile saptanmıştır. Bu amaçla, porselen havanda dövülerek öğütülmüş akide şekerlerinden 7.5 g tartılıp üzerine 15 ml damıtık su ilave edildikten ve şekerin çözünmesi amacıyla iyice karıştırıldıktan sonra elde edilen homojen sıvıda ph değeri belirlenmiştir. ph ölçümleri, 20 C de yapılmıştır. Reflektans renk tayini Bu amaçla, reflektans spektrofotometresi (Minolta CM- 3600d, Osaka, Japonya) kullanılmıştır. Akide şekerlerinin renklerinin ölçümünde CIE L*a*b* sistemi kullanılarak L*, a* ve b* değerleri belirlenmiştir. Daha sonra a* ve b* değerlerinden, C* (chroma, renk yoğunluğu) ve h (hue, renk tonu) aşağıda verilen 1 ve 2 No'lu eşitlikler yardımıyla hesaplanmıştır: C* = (a* 2 + b* 2 ) 1/2 (1) h = arctan (b*/a*) (2) Spektrofotometre, beyaz seramik plakaya karşı her kullanımdan önce standardize edilmiştir. Renk ölçümünde, 1 cm tabaka kalınlığı olan 10 ml hacimdeki quartz küvet kullanılmıştır. Işık kaynağı olarak CIE tarafından belirlenen C ışıtıcısından (Illuminant C) yararlanılmıştır. Reflektans renk değerleri ile toplam monomerik antosiyanin analizi sonucunda elde edilen verilerin birbiriyle ilişkisini ortaya koymak amacıyla monomerik antosiyanin analizinde belirlenen seyreltme oranı kullanılarak seyreltilmiş örneklerde reflektans renk değerleri belirlenmiştir. Bu amaçla, porselen havanda dövülerek öğütülmüş akide şekerlerinden 10 g tartılıp üzerine 20 ml M potasyum klorür tampon çözeltisi (ph 1.0) eklendikten sonra karışım, içerikteki şekerin çözünmesi amacıyla çalkalayıcıda (Heidolph Unimax 2010, Almanya) 400 rpm devirde 10 dak. süreyle çalkalanmıştır. Tüm depolama süresince, şeker örnekleri aynı miktarda çözelti eklenerek seyreltilmiştir. Potasyum klorür çözeltisi ile belirlenen bu seyreltme oranı, sodyum asetat tampon çözeltisi (ph 4.5) için de uygulanmış ve elde edilen seyreltikler, 30 min süreyle denge oluşması için kendi halinde bırakılmıştır. Renk ölçümlerinde "Minolta CM-S100w SpectraMagic NX" 1.22 versiyonu bilgisayar programı kullanılmıştır. L*, a*, b*, C* ve h değerlerine ilişkin aritmetik ortalama ve standart sapma değerleri bu program kullanılarak hesaplanmıştır. Kimyasal Analizler Titrasyon asitliği Titrasyon asitliği, ph ile izlenerek yürütülen elektrometrik titrasyonla saptanmış olup, analizde IFU [7] tarafından 32

4 meyve suları için önerilen işlemler uygulanmıştır. Bu amaçla, ph tayini için hazırlanmış olan homojen sıvı, ayarlı 0.1 N NaOH çözeltisi ile ve ph metre yardımıyla, ph 8.1'e ulaşıncaya kadar titre edilmiştir. Titrasyon asitliği, tüm örneklerde, susuz sitrik asit cinsinden g/100 g" olarak hesaplanmıştır. Toplam monomerik antosiyanin tayini Bu amaçla, Fuleki ve Francis [8] tarafından önerilen ve Giusti ve Wrolstad [9] tarafından geliştirilen ph diferansiyel metodu kullanılmıştır. Absorbans okumaları siyah havuç suyu antosiyaninlerinin maksimum absorbans verdiği dalga boyunda (λ vis-maks ), pus (haze) halindeki bulanıklığın belirlenmesi için ise; 700 nm de yapılmıştır. Siyah havuç suyu konsantresinde antosiyaninlerin 534 nm de maksimum absorbans verdiği saptanmıştır. Siyah havuç suyu konsantresi, yaklaşık 4 g konsantrenin 25 ml lik bir ölçü balonuna tartılıp, balonun damıtık suyla çizgisine kadar tamamlanmasıyla seyreltilerek analize hazırlanmıştır. Seyreltilmiş örnekler, potasyum klorür tampon çözeltisi (ph 1.0) ile bir kez daha seyreltilerek, havuç suyunda bulunan antosiyaninlerin λ vis-maks dalga boyu olan 534 nm de absorbans değeri arasına getirilmiştir. Daha önce porselen havanda dövülerek öğütülen ve böylece homojen bir kitle haline getirilerek analize hazırlanan akide şekerlerinden ise, 5 g tartılıp üzerine 10 ml potasyum klorür çözeltisi (ph 1.0) eklenen karışım, içerikteki şekerin çözünmesi amacıyla çalkalayıcıda (Heidolph Unimax 2010, Almanya) 400 rpm devirde 10 min süreyle çalkalanmıştır. Depolama süresince, tüm şeker örnekleri aynı miktarda çözelti eklenerek seyreltilmiş ve böylece analizler birçok spektrofotometrenin lineer sınırı olan 1.2 absorbans değerinin altında yürütülmüştür [10]. Potasyum klorür çözeltisi ile belirlenen bu seyreltme oranı, hem potasyum klorür (ph 1.0) hem de sodyum asetat tampon çözeltisi (ph 4.5) ile uygulanmış ve elde edilen seyreltikler, 15 min süreyle denge oluşması için kendi halinde bırakılmışlardır. Bekleme süresi sonunda, seyreltikler 0.45 µm gözenek çapındaki PVDF (polyvinylidene fluoride) filtreden (Sartarious, Minisart RC 25, Goettingen, Almanya) filtre edildikten sonra, örneklerin absorbans değerleri, örnek ve şahidin (damıtık su) aynı anda konulabildiği çift huzmeli (doublebeam) spektrofotometre (ThermoSpectronic Helios-α, Cambridge, İngiltere) kullanılarak belirlenmiştir. Absorbans ölçümleri, damıtık suya karşı, siyah havuç antosiyaninlerinin λ vis-maks dalga boyu olan 534 nm de ve ayrıca düşük düzeydeki bulanıklığın belirlenmesi için 700 nm de 1 cm tabaka kalınlığındaki tek kullanımlık küvetlerde (Brand Gmbh, Postfach, Wertheim, Almanya) yapılmıştır. Monomerik antosiyanin miktarı, sebze ve meyvelerde baskın bulunan siyanidin-3-glukozid cinsinden aşağıda verilen 3 no'lu eşitliğe göre hesaplanmıştır [9]. Bu eşitlikteki A: absorbans farkı (ph 1.0 ve 4.5 değerlerinde ölçülen absorbans farkı), MW: baz olarak alınacak antosiyaninin molekül ağırlığı, S f : seyreltme faktörü, ε: molar absorpsiyon katsayısı, L: spektrofotometre küvetinin tabaka kalınlığıdır (cm). Monomerik antosiyanin miktarı, siyanidin-3-glukozidin molar absorbans değeri ε= L cm 1 mol 1 ve molekül ağırlığı ise, MW=449.2 alınarak hesaplama yapılmıştır [9]. Monomerik antosiyanin miktarı (A)(MW)(S )1000 (mg/kg veya L) = f ( ε )( L) (3) Antosiyanin dağılımının belirlenmesi Akide şekerlerinde antosiyanin kompozisyonu, HPLC (yüksek performanslı sıvı kromatografisi) ile belirlenmiştir. HPLC yöntemi üç aşamadan (ekstraksiyon, saflaştırma ve hesaplama) oluşan bir uygulama olup, bu aşamalar aşağıda açıklanmıştır. Ekstraksiyon Bu amaçla, porselen havanda dövülerek öğütülmüş şeker örnekleri 1:2 (w/v) oranında %0.01 lik (v/v) HCl li suda çözündürülmüştür. Saflaştırma Elde edilen karışımdan, şeker ve organik asit gibi unsurların uzaklaştırılması amacıyla saflaştırma işlemi uygulanmıştır. Bu amaçla Skrede ve ark. [11] tarafından önerilen yöntem uygulanmıştır. Saflaştırma işleminin ilk aşamasında C-18 Sep-Pak kolonlarındaki dolgu maddesinin (sorbentin, 200 mg) antosiyaninlerle reaksiyona girebilmesini sağlamak için şartlandırma (conditioning) işlemi yapılmıştır. Bu işlemde kolondan sırasıyla 5 ml etil asetat, 5 ml metanol (MeOH, %0.01 HCl içeren) ve son olarak da 2 ml asitlendirilmiş su (%0.01 HCl içeren) geçirilmiştir. Ekstraksiyona hazır hale getirilen kolona, saflaştırılacak bileşeni içeren 1 ml karışım yüklenmiş ve daha sonra 5 ml asitlendirilmiş suyla elüe edilmiştir. Böylece bu elüsyon ile organik asitler, şekerler ve suda çözünür nitelikteki diğer bileşikler gibi analizi interfere eden bileşikler uzaklaştırılırken, antosiyaninler ve diğer polifenolik bileşikler kolon üzerinde sorbente bağlanmıştır. Eşdüze bir saflaştırma işlemi için saflaştırma düzeneğinden (manifold) (Waters, Milford, MA, ABD) yararlanılmıştır. C-18 Sep-Pak kolonu, 3 min süresince N 2 gazı akımında tutularak kalıntının kuruması sağlanmıştır. Daha sonra 1 ml asitlendirilmiş MeOH (%0.01 HCl içeren) ile yıkanarak antosiyaninleri içeren ekstrakt elde edilmiştir. Elde edilen antosiyanin fraksiyonu bir evaporasyon tüpüne alınmış ve 35±0.1 C'deki su banyosuna (Memmert WB 14, Schwabach, Almanya) yerleştirilerek, asitlendirilmiş MeOH, N 2 gazı altında kurutulmuştur. Daha sonra evaporasyon tüpündeki kalıntı üzerine 0.5 ml asitlendirilmiş su eklenerek yeniden çözündürülmüştür. Bu işlem bir örnek için 2 kez tekrarlanıp işlem sonunda elde edilen 0.5 er ml lik ekstraktlar birleştirilmiş ve toplam 1 ml ekstrakt elde edilmiştir. Antosiyaninleri içeren bu çözelti 0.45 µm gözenek çaplı PVDF filtreden filtre edilerek, HPLC'nin oto-örnekleme (auto-sampler) ünitesinde kullanılan amber renkli 2 ml'lik cam şişelere (vial) alınmış ve bekletilmeden HPLC'ye enjekte edilmiştir. 33

5 Hesaplama Antosiyaninlerin miktarlarının hesaplanmasında yüksek performanslı sıvı kromatografi cihazından (HPLC, Agilent 1200 serisi, Waldbronn, Almanya) yararlanılmıştır. Kullanılan HPLC sistemi; ikili (binary) pompa, foto diyoderey dedektörü (PDA), +4 C'ye inebilen soğutma sistemine sahip oto-örnekleyici (autosampler), gaz giderici (degasser) ve kolon fırınından (thermostatted column compartment) oluşmaktadır. Elde edilen kromatogramlar "ChemStation rev.b.02.01" yazılım programı ile değerlendirilmiştir. Kromatografi koşulları Kolon: Ters faz (reverse phase) C 18 kolonu (250 x 4.6 mm, 5 µm) (Phenomenex Inc., Los Angeles, CA, A.B.D.) Koruyucu kolon: C 18 koruyucu kolonu (4 x 3 mm, 5 µm) (Phenomenex Inc.) Akış hızı: 1 ml min 1 Elüsyon süresi: 30 min Enjeksiyon hacmi: 50 µl Dalga boyu: 520 nm Hareketli faz (mobil faz): Asetonitril (%100) (A) ile O-fosforik asit-asetik asit:asetonitril:su (1:10:5:84; v:v:v:v) (B) karışımı. Gradiyen akış söz konusu olup, Skrede ve ark. [11] tarafından önerilen elüsyon profili tarafımızdan modifiye edilerek uygulanmıştır (Tablo 1). Tablo 1. HPLC ile antosiyaninlerin analizinde kullanılan elüsyon profili* Süre(dakika) %A %B *A ve B için açıklama metin içinde verilmiştir. Antosiyanin parçalanma ölçütlerinin belirlenmesi Giusti ve Wrolstad [9] tarafından önerilen yöntem kullanılarak; antosiyaninlerin parçalanma ölçütleri olarak kabul edilen "renk yoğunluğu," "polimerik renk" ve "polimerik renk yüzdesi" gibi üç nitelik belirlenmiştir [9]. Bu amaçla, şeker örnekleri M potasyum klorür tamponu (ph 1.0) ile seyreltilerek, havuç suyu antosiyaninlerinin maksimum absorbans verdiği dalga boyundaki (λ vis-maks ) absorbans değerinin spektrofotometrenin linear sınırı olan 1.2'nin altına getirilmesi sağlanmıştır. Porselen havanda dövülerek öğütülmüş şeker örnekleri 1:2 (w/v) oranında %0.01 lik HCl li suda çözündürülerek analize hazırlanmıştır. Toplam monomerik antosiyanin miktarı tayininde olduğu gibi, M potasyum klorür tampon çözeltisi (ph 1.0) kullanılarak uygun bir seyreltme oranı saptanmıştır. Bu seyreltme oranına göre, örnekler bu defa asitlendirilmiş suyla çözündürülmüş ve böylece ortamdaki antosiyaninlerin, analiz süresince stabil kalması sağlanmıştır. Ortamdaki bulanıklık yapan unsurları uzaklaştırmak için, örnekler 0.45 µm gözenek çaplı PVDF filtreden (Millipore, Bedford, MA, A.B.D.) filtre edilmiştir. İki ayrı 1 cm tabaka kalınlığındaki tek kullanımlık spektrofotometre küvetinin (Brand Gmbh, Postfach, Wertheim, Almanya) her birine bu seyreltikten 2.8 ml alınıp, küvetlerden birindeki seyreltik üzerine 0.2 ml bisülfit (%20, w/v, K 2 S 2 O 5 ) çözeltisi eklenerek, örnekteki monomerik antosiyaninlerin renksiz "sulfonik asit kompleksi" oluşturması sağlanmıştır. Buna karşın, "polimerik antosiyanin-tanen" kompleksleri ve "melanoidin" pigmentleri ise, bisülfite karşı direnç göstererek renklerini korumuşlardır. Bu esmer renkli pigmentlerin ortamdaki konsantrasyonu arttıkça, 420 nm'de okunan absorbans değerleri yükselmektedir. Diğer küvete ise, bisülfit çözeltisi yerine 0.2 ml damıtık su eklenerek her iki küvet 15 min süreyle denge oluşumu için kendi haline bırakılmışlardır. Bu süre sonunda, her iki küvetteki çözeltilerin absorbans değerleri 420 nm, λ vis-maks (534 nm) ve 700 nm dalga boylarında ölçülmüştür. Ölçümler damıtık suya karşı yapılmıştır. Ölçüm sonuçları aşağıda belirtildiği gibi "renk yoğunluğu," "polimerik renk" ve "polimerik renk oranı" olarak değerlendirilmiştir. Renk yoğunluğu Bu değer, "bisülfit uygulanmamış küvette bulunan örneğin, λ vis-maks ve 420 nm dalga boylarındaki absorbansları toplamı" olarak tanımlanmaktadır. Aşağıda verilen 4 no'lu eşitliğe göre hesaplanmıştır [9]. Burada S f : seyreltme faktörüdür. [( vis -maks A700 nm ) + ( A420nm A700 )] Sf Renk yogunlugu λ (4) Polimerik renk = nm Bu değer, "bisülfit uygulanmış küvette bulunan örneğin, λ vis-maks ve 420 nm dalga boylarındaki absorbansları toplamı" olarak tanımlanmaktadır. Aşağıda verilen 5 no'lu eşitliğe göre hesaplanmıştır [9]: [( maks A700 nm ) + ( A420nm A700 )] Sf Polimerik renk Aλ (5) Polimerik renk oranı = nm Polimerik renk oranı; polimerik rengin, renk yoğunluğuna oranı olarak tanımlanmaktadır. Hiçbir işlem görmemiş taze meyve ve sebze sularında bu oranın genellikle %10'un altında olduğu bildirilmektedir [9]. Bu değer arttıkça, monomerik antosiyaninlerin parçalandığı ve esmer renkli pigmentlerin arttığı, kısaca doğal rengin bozulduğu anlaşılır. Bu değer, aşağıda verilen 6 no'lu eşitliğe göre hesaplanmıştır [9]. Polimerik renk Polimerik renk oranı (%) = 100 (6) Renk yogunlugu İstatistik değerlendirme Siyah havuç suyu konsantresi ile renklendirilmiş akide şekerlerinin farklı sıcaklıklarda depolanmasının ph, 34

6 titrasyon asitliği, toplam monomerik antosiyanin miktarı, polimerik renk oluşumu ve reflektans renk değerleri üzerine etkisini belirlemek için siyah havuç suyu konsantresi ile renklendirilmiş akide şekerlerinin farklı sıcaklıklarda depolanması süresince elde edilen veriler iki tekerrürlü faktöriyel düzende varyans analiz tekniği kullanılarak değerlendirilmiştir. Varyans analizi sonucuna göre, gerekli olduğu durumda, Duncan çoklu karşılaştırma testi kullanılarak faktörlerin hangi seviyeleri arasındaki farklılığın önemli olduğu araştırılmıştır. İstatistik analizler için "Minitab for Windows (ver. 15.1)" ve "MSTAT" paket programları kullanılmıştır. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Antosiyanin Miktarındaki Değişimler Çalışmamızda öncelikle; akide şekerlerinde HPLC ile antosiyanin dağılımı belirlenmiş ve iyi bir pik ayrımı elde edilmiştir (Şekil 2). Siyah havuç suyu konsantresinde antosiyanin kompozisyonunun 5 temel antosiyaninden oluştuğu saptanmış; ancak bu antosiyaninlerin standartlarının ticari olarak üretilmemesi nedeniyle, bu yöntemle antosiyaninlerin tanımlanması mümkün olmamıştır. Laboratuarımızda siyah havuç antosiyaninleri üzerine yürütülen bir çalışmada yüksek basınçlı sıvı kromatografisi-diyoderay dedektör-kütle spektroskopisi (HPLC-DAD-MS) yöntemi uygulanarak söz konusu antosiyaninler tanımlanabilmiştir [12]. Siyah havuç suyunda bulunan antosiyaninlerin her biri için elde edilen piklerin tanımlanmasında, Sadilova ve ark. [13] tarafından daha önce belirlenmiş olan kütle/yük oranları dikkate alınmıştır. Bu çalışmada elde edilen kromatogramla çalışmamızda elde ettiğimiz kromatogramda piklerin geliş sırası karşılaştırılmış ve Şekil 2 deki kromatogramda 1, 2, 3, 4 ve 5 olarak gösterilmiş olan piklerin sırasıyla; siyanidin-3- galaktozid-ksilozid (Cyd-3-gal-xyl), siyanidin-3- galaktozid-ksilozid-glukosid (Cyd-3-gal-xyl-glc), siyanidin-3-galaktozid-ksilozid-glukosid-kumarik asit (Cyd-3-gal-xyl-glc-coum), siyanidin-3-galaktozid-ksilozidglukozid-ferulik asit (Cyd-3-gal-xyl-glc-fer) ve siyanidin- 3- galaktozid-ksilozid-glukosid-sinapik asit (Cyd-3-galxyl-glc-sin) olduğu saptanmıştır. Şekil 2 de de görüldüğü gibi siyah havuç suyunda bulunan 5 antosiyanin de açillenmiş olması, siyah havuç suyu konsantresinin doğal gıda boyası olarak kullanılabileceğinin kanıtı niteliğindedir. Nitekim literatürde depolama sıcaklığına ve ısıl yolla parçalanmaya karşı açillenmiş antosiyaninlerin, açillenmemiş antosiyaninlere göre daha stabil olduğunun ortaya konduğu çalışmalar bulunmaktadır. Sadilova ve ark. [14] tarafından yapılan çalışmada; mürver yemişi, çilek ve açillenmiş antosiyanin içeren siyah havuç antosiyaninlerinin ph 1 ve 95 C de stabiliteleri incelenmiş ve yarı-ömür süresi (t 1/2 ) değerleri sırasıyla 1.9, 3.2 ve 4.1 h olarak belirlenmiştir. Bu çalışmada, siyah havuç suyu antosiyaninlerinin t 1/2 değerlerinin, mürver yemişi antosiyaninlerininkinden 2 kat daha yüksek olduğu saptanmıştır. Bu sonuç, açillenmiş antosiyaninlerin açillenmemiş antosiyaninlere kıyasla t 1/2 değerlerinin yüksek olması ve yüksek derecede hidroksilasyona uğramış B halkasına sahip antosiyaninlerin t 1/2 değerlerinin kısa olması ile açıklanmıştır [13]. Farklı depolama sıcaklıklarının siyah havuç suyu konsantresi ile renklendirilmiş akide şekerlerinin toplam antosiyanin miktarları üzerine etkisini saptamak üzere, akide şekerlerinin antosiyanin miktarları, depolama süresince belirlenmiş ve antosiyanin miktarlarındaki değişime ilişkin veriler Şekil 3 te verilen grafikte gösterilmiştir. Hem öğütülmüş olarak hem de bütün halde 10, 20 ve 30 C de depolanan akide şekerlerinde depolama sıcaklık ve süresinin antosiyanin miktarı üzerine etkisine ilişkin yapılan varyans analizi sonuçlarına göre; depolama süresince antosiyanin miktarı üzerine sıcaklık x süre interaksiyonunun etkisinin istatistik olarak önemli olmadığı görülmüştür (p>0.05). İkili interaksiyon istatistik olarak önemli olmadığı için sıcaklık ve süre faktörlerinin esas etkileri, verilere Duncan çoklu karşılaştırma testi uygulanarak incelenmiştir. İki faktör incelendiğinde sıcaklığın ve sürenin antosiyanin miktarı üzerine istatistik açıdan önemli bir etkisinin olmadığı, yani, şekerlerin antosiyanin miktarları arasındaki farkın tesadüfi olduğu saptanmıştır (p>0.05). mau min Şekil 2. Siyah havuç suyu konsantresi ile renklendirilmiş akide şekerlerinde antosiyaninlerin HPLC kromatogramı Şekil 3. Farklı sıcaklıklarda depolanan öğütülmüş haldeki akide şekerlerinde sıcaklığın antosiyaninler üzerine etkisi Literatürde siyah havuç antosiyaninleri üzerine depolama sıcaklığının etkisinin araştırıldığı birçok çalışmada ise depolama sıcaklık ve süresine bağlı olarak antosiyaninlerde parçalanma meydana geldiği belirtilmiştir. Laboratuvarımızda Kırca ve ark. [14] tarafından yapılan bir çalışmada briksleri 30, 45 ve 64 olan siyah havuç suyu konsantrelerinin 4, 20 ve 37 C sıcaklıklarda depolama stabilitesi belirlenmiştir. Çalışmada, tüm briks değerlerinde, depolama sıcaklığı

7 yükseldikçe, antosiyaninlerin parçalanma hızlarının arttığı ortaya konmuştur. Yine laboratuvarımızda Türkyılmaz [12] tarafından yapılan bir çalışmada da 5, 20 ve 30 C sıcaklıklarda depolanan siyah havuç suyu konsantrelerindeki antosiyaninlerin, depolama sıcaklığı ve süresine bağlı olarak parçalandığı belirlenmiştir. Çalışmada, 5, 20 ve 30 C sıcaklıklarda depolanan siyah havuç suyu konsantresinin antosiyanin miktarında, depolamanın 275. günü itibarı ile sırasıyla yaklaşık %28, %76 ve %93 azalma meydana geldiği belirlenmiştir. Çalışmada bu veriler deneysel yolla elde edilmemiş, deneysel verilerin grafiğe aktarılması sonucu elde edilen denklemden hesaplanmıştır. Bu çalışmanın aksine bizim çalışmamızda akide şekerlerinin içerdiği antosiyaninlerin, şekerlerin 275 gün depolanması süresince korunmasının çalışmamızda kullandığımız materyalin, yüksek sakaroz içeriğinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Nitekim, karanlıkta ve buzdolabında 63 gün boyunca depolanan üzümsü meyvelerin antosiyanin stabilitesi üzerine sakaroz konsantrasyonunun (%20, 40 ve 60) etkisinin araştırıldığı bir çalışmada %20 konsantrasyonundaki sakarozun antosiyaninleri koruyucu etkisinin olduğu, bunun üzerindeki konsantrasyonlarda ise bu etkinin azaldığı ifade edilmiştir [15]. Akide şekeri üretiminde kullanılan toz şeker bilindiği gibi, sakaroz kökenli bir şekerdir. Ancak akide şekeri üretimi sırasında kullanılan asidin ve ısıtmanın etkisiyle sakarozun önemli bir kısmının parçalandığı düşünülmektedir. Buna bağlı olarak da, akide şekerlerinde sakaroz konsantrasyonunun azalmış ve sakarozun antosiyaninleri koruyucu etkisinin artmış olabileceği düşünülmektedir. Benzer şekilde, Wrolstad ve ark. tarafından yapılan bir çalışmada da dondurulmuş çileklerde antosiyanin stabilitesi üzerine sakarozun etkisi araştırılmıştır. Çalışmada %10, 20 ve 40 (w/w) oranında sakarozla muamele edilmiş dondurulmuş çilekleri, 25 C de 3 yıl depolamanın, toplam monomerik antosiyanin miktarı ve polimerik renk oranına etkisi belirlenmiş ve sonuç olarak sakaroz ilavesinin, antosiyaninler üzerine koruyucu etkisi olduğu saptanmıştır. Sakarozun β-glukozidaz ve polifenol oksidaz gibi antosiyaninleri parçalayıcı enzimleri inhibe ederek, antosiyanin-polifenol polimerizasyonu gibi kondenzasyon reaksiyonlarında sterik etki göstererek ve antosiyanin-askorbat interaksiyonu veya kısmi oksijen bariyeri oluşturarak koruyucu etki gösterdiği düşünülmektedir [16]. Bununla birlikte, bu bulguların aksiyle sonuçlanan bir çalışmada ise sakaroz, fruktoz, glukoz ve ksilozun ahududularda antosiyanin parçalanmasını arttırdığı saptanmıştır [17]. Çalışmamızda antosiyaninlerde parçalanma olmadığı yönünde bulgular elde etmemizin bir diğer nedeninin de yine materyalimizin şeker oranının yüksek olması ve dolayısıyla materyalimizin su aktivitesinin meyve suyu konsantresine göre çok daha düşük olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Burada, ortamda bulunan ve parçalanma reaksiyonlarında kullanılabilecek nitelikteki suyun iki fonksiyonu vardır: 1) Ortamda bulunan su, meydana gelebilecek parçalanma reaksiyonlarında rol alan unsurların taşınmasında görev alır. Burada su, bir antosiyanaz olarak davranan β-glukozidazın aktivite gösterebilmesi için uygun ortam sağlar. Hidroliz sonucu antosiyanin molekülünden ayrılan aglukon form, parçalanma sonucunda 2-karbinol veya çalkon gibi renksiz unsurlara dönüşür [18]. 2) Antosiyaninlerin parçalanmasının hidrolitik olarak gerçekleşmesinde su, reaktan olarak rol oynar. Burada su molekülleri antosiyanin molekülünün C halkasında bulunan 2. karbon atomuna nükleofilik bir atak yaparak halkanın açılmasına ve renksiz formun oluşmasına neden olur [18]. Çalışmamızda, akide şekerlerinin depolanması süresince antosiyanin miktarında meydana gelen değişimin yanı sıra üretim sırasında şekere eklenen siyah havuç suyu konsantresinde bulunan antosiyanin miktarının üretimde uygulanan sıcaklık nedeniyle ne kadar azaldığı da saptanmıştır. Konsantrede bulunan antosiyanin miktarındaki azalma Şekil 4 te yer alan histogramda görüldüğü gibi %21 dir. Şekil 4. Şeker üretimi sırasında siyah havuç suyu konsantresinin antosiyanin içeriğinde meydana gelen değişim Polimerik Renk Oranındaki Değişimler Farklı depolama sıcaklıklarında, akide şekerlerinin polimerik renk oranlarına ilişkin verilerin grafiğe aktarılmasıyla elde edilen Şekil 5 te de görüldüğü gibi depolama süresi boyunca polimerik renk oranında çok sınırlı da olsa bir değişim gözlenmiştir. Hem öğütülerek hem de bütün halde 10, 20 ve 30 C de depolanan akide şekerlerinde depolama sıcaklık ve süresinin polimerik renk oranı üzerine etkisine ilişkin yapılan varyans analizi sonuçlarına göre; depolama süresince antosiyanin miktarı üzerine sıcaklık x süre interaksiyonunun etkisinin istatistik olarak önemli olmadığı görülmüştür (p>0.05). İkili interaksiyon istatistik olarak önemli olmadığı için sıcaklık ve süre faktörlerinin esas etkileri, verilere Duncan çoklu karşılaştırma testi uygulanarak incelenmiştir. İki faktör incelendiğinde sıcaklığın ve sürenin polimerik renk oranı üzerine etkisinin istatistik açıdan önemli olduğu, yani şekerlerin polimerik renk oranları arasındaki farkın tesadüfi olmadığı saptanmıştır (p<0.05). Örneğin, 275 gün süreyle öğütülerek 10 C sıcaklıkta depolanan akide şekerlerinde polimerik renk oranının %2.1, 20 C sıcaklıkta depolananlarda %5.3 ve 30 C sıcaklıkta depolananlarda ise %7.7 arttığı ortaya konmuştur. Bunun yanı sıra 284 gün süreyle bütün halde 10 C sıcaklıkta depolanan akide şekerlerinde polimerik renk oranının %6.0, 20 C sıcaklıkta 36

8 depolananlarda %5.9 ve 30 C sıcaklıkta depolananlarda ise %6.2 arttığı ortaya konmuştur. Polimerik renk oranı sadece monomerik antosiyaninlerdeki parçalanmayı değil, aynı zamanda; üründeki esmer renkli pigmentlerin arttığını da gösteren bir kriterdir. Depolama sıcaklık ve süresine bağlı olarak, akide şekerlerinin monomerik antosiyanin miktarlarında önemli bir değişim meydana gelmemesine rağmen polimerik renk oranlarında meydana gelen artışın enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonlarında oluşan esmer renkli pigmentlerden kaynaklandığı düşünülmektedir. Bilindiği gibi, reflektans renk değerlerinin kolaylıkla belirlenmesi nedeniyle, özellikle L* değeri birçok üründe esmerleşme indeksi olarak kullanılmaktadır. Bu amaçla, L* değeri, elma ve armutlarda [19], çekirdeksiz kuru üzümlerde [20] ve greyfurt sularında [21] esmerleşme indeksi olarak kullanılmıştır. Ayrıca, h değerlerinde meydana gelen artış ise; antosiyaninlerin parçalanmasının bir göstergesi olarak kabul edilmektedir [14]. Reflektans renk değerleri dikkate alındığında, akide şekerlerinin 275 gün depolanması süresince, çalışmamızda elde edilen L* değerlerinde meydana gelen %33 40 düzeyindeki azalmaya karşılık, h değerlerinde değişim olmaması da esmer renkli pigment oluşumunu işaret etmektedir (Tablo 2). Sonuç olarak, depolama sıcaklığında meydana gelen artışın enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonunun da hızını artırması nedeniyle depolama sıcaklığı arttıkça akide şekeri örneklerindeki polimerik renk oranının da bir miktar arttığı düşünülmektedir. Şekil 5. Farklı sıcaklıklarda depolanan öğütülmüş haldeki akide şekerlerinde sıcaklığın polimerik renk oranı üzerine etkisi Yapılan birçok çalışmada elde edilen kinetik veriler, sıcaklık yükselmesi ile monomerik antosiyaninlerin parçalandığı ve esmer pigmentlerin oluşumunun hızlandığı, yani doğal rengin bozulduğu görülmektedir. Polimerik renk oranının artışına depolama sıcaklığının neden olduğu, böğürtlen (blackberry) suyu [22] ve nar suyu konsantresinde [23] yapılan çalışmalarda da belirtilmiştir. Işık [24] tarafından yapılan bir çalışmada da, vişne suyu konsantrelerinin (71 Briks) 5 ve 20 C de 130 gün depolanması sonunda polimerik renk 1.94 ten sırasıyla 2.03 ve 4.37 e yükselmiştir. Benzer bir çalışmada da, vişne suyu konsantrelerinde depolama sıcaklık ve süresine bağlı olarak polimerik rengin arttığı saptanmıştır [25]. Turfan [23] tarafından elde edilen bulgular ise, nar suyu konsantrelerinde polimerik rengin depolama süresince sıcaklığa bağlı olarak arttığını göstermiştir. Toplam monomerik antosiyanin miktarındaki azalma ile polimerik renk oranındaki artış arasında iyi bir korelasyon olduğu birçok çalışmada belirtilmiştir [12, 23, 26]. Çalışmamızda, depolama süresince antosiyaninlerde belirgin bir parçalanma belirlenmemesine karşın, polimerik renk oranında az da olsa bir artış saptanmış ve sonuç olarak iki parametre arasında korelasyon saptanamamıştır. Reflektans Renk Değerlerinde Meydana Gelen Değişimler Siyah havuç antosiyaninlerinin akide şekerindeki stabilitesi, depolama süresince antosiyanin miktarının izlenmesiyle belirlendiği gibi, periyodik olarak alınan şeker örneklerinde renk ölçümleri de yapılmıştır. Renkte meydana gelen değişimler, materyalin renginin reflektans spektrofotometresi ile CIE L*, a*, b*, C* (kroma) ve h (hue) değerlerinin ölçülmesi ile izlenmiştir. Renk ölçümlerine ilişkin sonuçlar, Tablo 2 de verilmiştir. Tablo 2. Farklı sıcaklıklarda depolanan öğütülmüş haldeki şeker örneklerinde renk değişiminin ortam ph sı ile ilişkisi ph Sıcaklık Süre ( C) (gün) L* a* b* C* h ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±1.61 Sonuçlar ortalama±standart sapma olarak verilmiştir. Renk ölçümleri, öğütülmüş şeker örnekleri, KCl ve Naasetat tampon çözeltilerinde (ph 1.0 ve ph 4.5) çözündürüldükten 30 min sonra yapılmıştır. Tablo 2 de görüldüğü gibi, depolama süresince 10 C, 20 C ve 30 C de depolanan örneklerin a* değerlerinde ph 1.0 de sırasıyla %31, %31 ve %41 oranında azalma 37

9 görülürken; ph 4.5 te sırasıyla %35, %34 ve %56 oranında azalma saptanmıştır. Benzer azalmalar L*, b* ve C* değerlerinde de saptanmıştır. Buna karşın 10 ve 20 C sıcaklıklarda depolanan akide şekerlerinin h değerlerinde belirgin bir değişim gözlenmezken, 30 C sıcaklıkta depolanan akide şekerlerinin ph 4.5 teki h değerinde sınırlı da olsa bir değişim gözlenmiştir (p<0.05). Bilindiği gibi h değeri arasında değişmekte, 0 /360 kırmızı-mor, 90 sarı, 180 yeşil ve 270 mavi rengi tanımlamaktadır. h Değerlerindeki artış daha sarımsı rengin yani antosiyaninlerin parçalandığının göstergesidir [14]. Çalışmamızda h değerlerinde genel itibariyle bir değişim meydana gelmemesi antosiyaninlerde bir parçalanma olmadığını göstermektedir. Stintzing ve ark. [27] tarafından yapılan bir çalışmada, bazı siyanidin bazlı antosiyanin pigmentlerinin yapılarındaki değişikliklerin, kimyasal ve fiziksel özellikler üzerine etkisi araştırılmıştır. Çalışmada siyah havuç ekstraktının, ph ları farklı (0.45, 3.50 ve 6.00) 3 tampon çözeltiyle seyreltilmesi sonucu reflektans renk değerleri ölçülmüştür. ph sı 0.45 ve 3.50 olan tampon çözeltilerde ölçülen L*, C* ve h değerleri arasında belirgin bir fark gözlenmemiş olup, ph sı 6.00 olan tampon çözeltiyle seyreltilen ekstraktın L*, C* ve h değerlerinde diğer iki tampon çözeltiye göre sırasıyla yaklaşık %3, %32 ve %9 oranında azalma gözlenmiştir. Kırca [1] tarafından yapılan bir çalışmada da, siyah havuç suyu konsantresi eklenmiş çilek marmelatlarının a* değerleri 37 C de 5, 22 C de 6, 10 C de 7 aylık depolama sonunda sırasıyla %51.1, %24.2 ve %3.6 oranında azaldığı belirlenmiştir. Buna karşın, b* değerlerinin 37 C de %46.2, 22 C de %19.9 ve 10 C de %1.2 oranında arttığı saptanmıştır. Yine aynı çalışmada L* değerinde belirgin bir değişim gözlenmemiştir. ph ve Titrasyon Asitliğinde Meydana Gelen Değişimler Öğütülerek ve bütün halde 10, 20 ve 30 C de depolanan akide şekerlerinde depolama sıcaklık ve süresi ph ve titrasyon asitliği değerlerinde bir miktar değişime yol açmıştır (p<0.05). Varyans analizi sonuçlarına göre depolama süresince ph ve titrasyon asitliği üzerine sıcaklık x süre interaksiyonunun etkisinin istatistik olarak önemli olmadığı görülmüştür. İkili interaksiyon istatistik olarak önemli olmadığı için sıcaklık ve süre faktörlerinin esas etkileri incelenmiş; ph ve titrasyon asitliği üzerine sıcaklığın önemli bir etkisinin olmadığı ancak sürenin etkisinin olduğu saptanmıştır. Verilere uygulanan Duncan testi sonuçlarına göre, depolanan akide şekerlerinin depolama süresine bağlı olarak, ph ve titrasyon asitliği değerleri arasındaki farkların istatistik olarak önemli olduğu saptanmıştır (p<0.05). Başlangıçta 3.84 olan akide şekerlerinin ph sı 10 C de 275 gün depolama sonucunda 3.98, 20 C de 3.97, 30 C de ise 3.98 olarak belirlenmiştir. Titrasyon asitliği değerlerindeki değişim incelendiğinde de, akide şekerlerinin titrasyon asitliği değerleri başlangıçta 0.60 mg 100 g 1 iken 10 C de 275 gün depolama sonunda 0.57 mg 100 g 1, 20 C de 0.58 mg 100 g 1 ve 30 C de 0.59 mg 100 g 1 olarak saptanmıştır. Türkyılmaz [12] tarafından yapılan çalışmada ise siyah havuç suyu konsantresinin (67.98 Bx), 5 C 20 C ve 30 C sıcaklıklarda depolanması süresince, siyah havuç suyu konsantrelerinin ph değerlerinde önemli bir değişim gözlenmemiş, titrasyon asitliğinde ise artış gözlenmiştir. Örneğin, 5 C de 319 gün depolama sonunda, siyah havuç suyu konsantrelerinin titrasyon asitliği değerleri 3.62 mg 100 g 1 den 3.71 e, 20 C de 187 gün depolama sonunda 3.62 mg 100 g 1 den 3.83 e ve 30 C de 53 gün depolama sonunda 3.62 mg 100 g -1 den 3.73 e yükselmiştir. Bilindiği gibi antosiyaninlerin stabilitesi üzerine en önemli faktörlerden biri de ph dır. Antosiyaninler, asidik ortamlarda bazik ortamlarda olduğundan daha stabildir. Buna göre depolanan akide şekerlerinin antosiyanin miktarında bir değişim gözlenmemesinin nedenleri arasında akide şekerlerin asidik ph ya sahip olması da gösterilebilir. Nitekim, Kırca ve ark. [14] sıcaklığı 70 C olan ortamda ph nın 2.5 ten 5 e çıkmasıyla, siyah havuç antosiyaninlerinin t 1/2 değerlerinin 25.1 h ten 16.7 h e düştüğünü saptamışlardır. Yine Fossen ve ark. [28] yaptıkları bir çalışmada; mor patates ve pirinçten izole ettikleri antosiyaninlerin 1 9 arasındaki 13 farklı ph da stabilitesini incelemiş ve ph daki her değişimin antosiyaninlerin renk yoğunluğunu ve stabilitesini etkilediğini ortaya koymuşlardır. Özellikle ph nın 1 den 5 e yükselmesiyle, renk yoğunluğunda belirgin bir azalma gözlenmiştir. SONUÇ Akide şekeri üretimi sırasında uygulanan sıcaklık (165 o C) nedeniyle, renklendirici olarak şekere eklenen siyah havuç suyu konsantresi antosiyaninlerinde meydana gelen %21 lik kayba rağmen üretim sonrasında albenisi oldukça yüksek, kırmızımsı mor renkte akide şekerleri elde edilmiştir. Dolayısıyla siyah havuç suyu konsantresi ile renklendirilen şekerlerin görsel açıdan tüketici beğenisine hitap ettiği söylenebilir. Bunun yanı sıra; depolama süresince de, akide şekerinde bulunan antosiyaninlerde parçalanma saptanmamıştır (p>0.05). Literatürdeki verilere göre, bunun sakarozun antosiyaninleri koruyucu etkisinden, akide şekerinin düşük su aktivitesinden veya düşük ph sından kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Sonuç olarak, çalışmamızda doğal renklendirici olarak kullanılan siyah havuç suyu antosiyaninlerinin çalışılan üç depolama sıcaklığında (10, 20, 30 C) da depolama süresince stabil kalması, akide şekerlerinin siyah havuç suyu konsantresi ile renklendirilip sıcaklık kontrolü olmayan koşullarda renk açısından herhangi bir kalite kaybına uğramadan uzun süre depolanabileceğini göstermektedir. Dolayısıyla, uzun yıllardan beri halkımız tarafından sevilerek tüketilen akide şekerinin renklendirilmesinde sentetik kırmızı gıda boyaları yerine doğal kaynaklı bir renklendirici olan siyah havuç suyu konsantresinin kullanımı önerilmektedir. TEŞEKKÜR Bu çalışma, birleştirilmiş yüksek lisans-doktora programı kapsamında doktora çalışmalarını yürüten Betül Erkan Koç un doktora hazırlık çalışmasından düzenlenmiştir. Çalışmamızda materyal olarak kullandığımız akide 38

10 şekerlerinin üretiminde yardımcı olan Hicret Şekerleme ye ve siyah havuç suyu konsantresini sağlayan TARGID Meyve Suyu Firması na teşekkür ederiz. KAYNAKLAR [1] Kırca, A., Siyah havuç antosiyaninlerinin bazı meyve ürünlerinde ısıl stabilitesi. Doktora tezi (basılmamış). Ankara Üniversitesi, 109 s., Ankara. [2] Giusti, M.M. and Wrolstad, R.E., Acylated anthocyanins from edible sources and their applications in food systems. Biochemical Engineering Journal 14: [3] Bridle, P. and Timberlake, C.F., Anthocyanins as natural food colours-selected aspects. Food Chemistry 58: [4] Markasis, P., Stability of anthocyanins in foods. In Anthocyanins as Food Colors, Markasis, P. (ed.), pp , Academic Press Inc., New York. [5] Wrolstad, R.E., Anthocyanin pigments- Bioactivity and coloring properties. Journal of Food Science 69(5): C419 C421. [6] Mazza, G. and Miniati, E., Anthocyanins in Fruits, Vegetables and Grains. CRC Press, Boca Raton, FL, U.S.A. [7] IFU. Nr Analysen. Internationale Fruchtsaft Union Juris Verlag, Zurich. [8] Fuleki, T. and Francis, F.J., Quantitative methods for anthocyanins 2. Determination of total anthocyanin and degradation index for cranberry juice. Journal of Food Science 33: [9] Giusti, M.M. and Wrolstad, R.E., Unit F1.2. Anthocyanins. Characterization and measurement with UV-visible spectroscopy, In Current Protocols in Food Analytical Chemistry, Wrolstad, R.E. and Schwartz, S.J. (eds.), pp. 1 13, John Wiley & Sons, New York. [10] Özkan, M., Kırca, A. ve Cemeroğlu, B., Gıdalara uygulanan bazı özel analiz yöntemleri. Gıda Analizleri, 2. Baskı, Cemeroğlu, B. (ed.), s , Gıda Teknolojisi Derneği Yayınları No: 34, Bizim Grup Basımevi, Ankara. [11] Skrede, G., Wrolstad, R.E. and Durst, R.W., Changes in anthocyanins and polyphenolics during juice processing of highbush blueberries (Vaccinium corymbosum L.). Journal of Food Science, 65(2): [12] Türkyılmaz, M Siyah havuç suyu konsantresi üretimi ve depolama sürecinde renkteki değişimler. Doktora hazırlık çalışması (basılmamış). Ankara Üniversitesi, 119 s., Ankara. [13] Sadilova, E., Stintzing, E.C. and Carle, R., Thermal degradation of acylated and nonacylated anthocyanins. Journal of Food Science, 71: [14] Kırca, A., Özkan, M. and Cemeroğlu, B., Effect of temperature, solid content and ph on the stability of black carrot anthocyanins. Food Chemistry, 101: [15] Nikkhah, E., Khayamy, M., Heidari, R. and Jamee, R Effect of sugar treatment on stability of anthocyanin pigments in Berries. Journal of Biological Sciences, 7: [16] Wrolstad, R.E., Skrede, G., Lea, P. and Enersen, G., Influence of sugar on anthocyanin pigment stability in frozen strawberries. Journal of Food Science, 55: [17] Daravingas, G. and Cain, R.F., Thermal degradation of black raspberry anthocyanin pigments in model systems. Journal of Food Science, 33: [18] Erlandson, J.A. and Wrolstad, R.E., Degradation of anthocyanins at limited water concentration. Journal of Food Science, 37: [19] [19] Sapers, G.M. and Douglas, Jr.F.W Measurement of enzymatic browning at cut surfaces and in juice of raw apple and pear fruits. Journal of Food Science, 52: [20] Aguilera, J.M., Oppermann, K. and Sanchez, F Kinetics of browning of Sultana grapes. Journal of Food Science, 52: [21] Lee, H.S. and Nagy, S Quality changes and nonenzymatic browning intermediates in grapefruit juice during storage. Journal of Food Science, 53: [22] Rommel, A, Wrolstad, R.E. and Heatherbell, D.A., Blackberry juice and wine: processing and storage effects on anthocyanin composition, color and appearance. Journal of Food Science, 57: [23] Turfan, Ö., Nar suyu konsantresi üretim ve depolama sürecinde antosiyaninlerdeki değişimler. Yüksek lisans tezi (basılmamış). Ankara Üniversitesi, 140 s., Ankara. [24] Işık, Ş., Vişne Suyu Konsantratlarının Depolanmalarında Renk Ve Berraklık Stabilitesi Üzerinde Araştırma. Yüksek lisans tezi (basılmamış). Ankara Üniversitesi, 49 s., Ankara. [25] Asefi, N., Meyve Sularında Antosiyaninlerin Parçalanması Üzerine Araştırmalar. Doktora tezi (basılmamış). Ankara Üniversitesi, 92 s., Ankara. [26] Garzon, G.A. and Wrolstad, R.E., Comparison of the stability of pelargonidin-based anthocyanins in strawberry juice and concentrate. Journal of Food Science, 67: [27] Stintzing, F.C., Stintzing, A.S., Carle, R., Frei, B. and Wrolstad, R.E., Color and antioxidant properties of cyanidin-based anthocyanin pigments. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50: [28] Fossen, T., Cabrita, L. and Andersen, O.M., Color and stability of pure anthocyanins influenced by ph including the alkaline region. Food Chemistry, 63: