T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU

Transkript

1 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Siyah Havuç Suyu Konsantresi Üretimi ve Depolanması Sürecinde Fenolik Maddeler ve Antosiyaninlerdeki Değişimler ve Bu Değişimlerin Antioksidan Aktivite ile İlişkisi Proje Yürütücüsü : Prof. Dr. Mehmet Özkan Proje Numarası : 7B43432 Başlama Tarihi : Bitiş Tarihi : Rapor Tarihi : Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara 29

2 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Siyah havuç suyu konsantresi üretimi ve depolanması sürecinde fenolik maddeler ve antosiyaninlerdeki değişimler ve bu değişimlerin antioksidan aktivite ile ilişkisi Changes in phenolics and anthocyanins of black carrot juice concentrate during production and storage and their relation with antioxidant activity Özet Bu çalışmada; durultma ve pastörizasyon işlemlerinin, siyah havuç suyunun fenolik ve antosiyanin içeriğinde neden olduğu değişimler ve bu değişimlerin antioksidan aktivite ile ilişkisi incelenmiştir. Ayrıca, siyah havuç suyu konsantrelerinin; fenolik içeriğindeki değişim ve bu değişimin antioksidan aktivite ile ilişkisi 23 C, 5 C, 2 ve 3 C de 8 ay depolama süresince ve antosiyanin içeriğindeki değişimler ise, 23 C, 5 C, 2 C de 319 gün, 3 C de 53 gün depolama süresince gözlenmiştir. Siyah havuç sularının durultulmasında, önce depektinizasyon daha sonra da berraklaştırma işlemi uygulanmıştır. Berraklaştırmada, durultma yardımcı maddeleri olarak adlandırılan bentonit, kizelsol ve jelatin kullanılmıştır. Enzim uygulaması sonucu hücre duvarlarından fenolik ve antosiyaninlerin serbest kalması nedeniyle, depektinize edilmiş siyah havuç suyunun fenolik içeriğinde %12, antosiyanin içeriğinde %7 ve antioksidan aktivitesinde ise %1 düzeyinde bir artış belirlenmiştir. Buna karşın, depektinize edilmiş örneğe bentonit uygulaması sonucunda; fenolik içeriğinde %1, antioksidan aktivitede %9 düzeyinde azalış saptanırken; antosiyanin içeriğinde %26 düzeyinde artış saptanmıştır. Ayrıca, jelatin uygulamasından sonra fenolik maddelerde %25, antioksidan aktivitede %15 ve antosiyaninlerde %1 düzeyinde azalış saptanmıştır. Siyah havuç suyu ve konsantresinde 5 temel antosiyanin tanımlanmıştır ve bunlardan 3 tanesinin ferulik asit, kumarik asit ve sinapik asit ile açillenmiş antosiyanin olduğu belirlenmiştir. HPLC-MS analizleri sonucunda, siyah havuç suyunda başat antosiyaninin siyanidin-3-galaktozid-ksilozid-glukozid-ferulik asit (%45) olduğu, bunu sırasıyla siyanidin-3-galaktozid-ksilozid-glukosid-kumarik asit (22%), siyanidin-3- galaktozid-ksilozid-glukosid-sinapik asit (17%), siyanidin-3-galaktozid-ksilozid-glukosid (1%) ve siyanidin-3-galaktozid-ksilozid (6%) un takip ettiği belirlenmiştir. Açillenmiş yapıdaki bu antosiyaninler, siyah havuç suyu ve konsantresinin renk stabilitesinden sorumludurlar. Ayrıca; siyah havuç suyu ve konsantresinde, antosiyanin olmayan 3 temel fenolik madde de saptanmış ve HPLC-MS analizleri sonucunda bunlardan başat fenolik maddenin klorojenik asit olduğu belirlenmiştir. Siyah havuç suyu ve konsantresinin antioksidan aktivitesinin, onun yüksek klorojenik asit içeriğinden kaynaklandığı da saptanmıştır (r=,9849). Siyah havuç suyu konsantrelerinin (68 Bx) depolama süresince; fenoliklerindeki parçalanma sıfırıncı derece kinetik modele, antosiyaninlerindeki parçalanma ise birinci derece kinetik modele uygun olarak 2

3 gerçekleşmiştir. Depolama süresince, siyah havuç suyu konsantrelerinde fenolik ve antioksidan aktivite içeriğinde %4 11 düzeyinde küçük bir değişim saptanmıştır. Beklenildiği gibi; depolama sıcaklığının artışıyla siyah havuç suyu konsantresi antosiyaninlerinin parçalanması hızlanmıştır. Siyah havuç suyu konsantrelerinde antosiyaninlerin parçalanmasına ilişkin yarılanma süreleri 5 C, 2 C ve 3 C sıcaklıklarda sırasıyla 63, 137 ve 29 gün olarak saptanmıştır. Benzer şekilde, polimerik renk oranlarına ilişkin sıfırıncı derecedn reaksiyon hız sabitleri 5 C, 2 C ve 3 C sıcaklıklarda sırasıyla.27,.1435 ve.5581 % gün 1 olarak saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar, siyah havuç suyunun fenolik madde miktarındaki en önemli azalmanın jelatinkizelsol ile durultma sonucunda olduğunu, fakat; siyah havuç suyu konsantresinin fenolik madde miktarında depolama boyunca önemli bir değişimin olmadığını göstermiştir. Ayrıca bu çalışmada, depolama boyunca siyah havuç suyu konsantrelerinin fenolik madde içeriğinde önemli bir değişim olmadığı, ancak 3 C de depolanması durumunda konsantre örneklerinin renklerinin çok hızlı bir şekilde bozunduğu da gösterilmiştir. 3 C de 33 gün depolama süresince, monomerik antosiyanin miktarında %52 azalma saptanmıştır. Siyah havuç suyu konsantrelerinde, antosiyaninlerin parçalanmasına ilişkin aktivasyon enerjisi 5 C 3 C sıcaklık aralığında 84 kj mol 1 bulunmuştur. Depolama boyunca; fenolik maddelerin parçalanmasında sıcaklığın önemli bir etkisinin olmaması nedeniyle, fenolik maddelerin parçalanması için aktivasyon enerjisi hesaplanmamıştır. Siyah havuç suyu antosiyaninlerinin diğer antosiyanin kaynaklarına göre daha stabil olmasına ve fenolik maddelerin depolama sıcaklığından önemli düzeyde etkilenmemesine rağmen, antosiyanin parçalanmasını en aza indirmek için; siyah havuç suyu konsantrelerinin düşük sıcaklıklarda depolanması gerekmektedir. İngilizce Özet (Abstract) This study was conducted to determine the changes in phenolics and anthocyanins of black carrot juice during clarification and pasteurization and their relation with antioxidant activity. Moreover, the changes in phenolics and its relation with antioxidant activity of black carrot juice concentrates were monitored during storage at 23, 5 C, 2 C and 3 C for 8 months and also the changes in anthocyanin contents were monitored during storage at 23, 5 C, 2 C for 319 days and at 3 C for 53 days. Clarification of black carrot juice included depectinization and fining steps. During fining, fining agents including bentonite, kieselsol and gelatin were used. Since enzyme treatment causes to release of anthocyanins from cell walls; phenolic contents, anthocyanin content and antioksidant activity increased (12%, 7% and %1, respectively) in depectinized black carrot juice. While bentonite treatment resulted in decrease in phenolic content (%1) and antioxidant activity (%9), bentonite treatment resulted in %35 increase in monomeric anthocyanin content of black carrot juice. Moreover; phenolic contents, 3

4 anthocyanin content and antioksidant activity decreased (25%, 1% and %15, respectively) after gelatine treatment. The five major anthocyanin compounds were identified in black carrot juice and concentrate, three of which were acylated with ferulic acid, coumaric acid and sinapic acid. HPLC-MS analyses of black carrot juice showed that cyanidine-3-galactoside-xyloside-glucoside-ferulic acid (%45) was the major anthocyanin, followed by cyanidine-3-galactoside-xyloside-glucoside-coumaric acid (22%), cyanidine-3- galactoside-xyloside-glucoside-sinapic acid (17%), cyanidine-3-galactoside-xyloside-glucoside (1%) and cyanidine-3-galactoside-xyloside (6%). These acylated anthocyanins are responsible for the stability of color in black carrot juice and concentrate. Moreover, the 3 major non-anthocyanin phenolic compounds were identified in black carrot juice and concentrate and HPLC-MS analyses showed that chlorogenic acid was the major phenolic in black carrot juice. Also, this study showed that the antioxidant activity of black carrot juice and concentrate was mainly attributed to their high chlorogenic acid content (r=,9849). Phenolic degradation was fitted to a zero-order reaction model during the storage of black carrot juice concentrates (68 Bx) but anthocyanin degradation was fitted to a first-order reaction model. During storage, phenolics and antioxidant activity decreased (4-11%) in black carrot juice concentrates. As expected, the degradation of anthocyanins and formation of brown color progressed at a faster rate with increasing storage temperature in black carrot juice concentrates. Half-life period for anthocyanin degradation in black carrot juice concentrates was 63, 137 and 29 days at 5 C, 2 C and 3 C, respectively. Similarly, the zero-order reaction rate constants for polymeric color ratio were.27,.1435 and.5581 % days 1 at 5 C, 2 C and 3 C, respectively. Results of this study showed that gelatin-kiezelsol treatment resulted in the most important decrease in phenolic and anthocyanin contents of black carrot juice during clarification. Also, in this study revealed that there was no important changes in phenolic contents of black carrot juice concentrates during storage, but very fast color deterioration occurred in concentrate samples stored at 3 C. Over 52% loss in monomeric anthocyanin content was observed in concentrates after 33 days of storage at 3 C. Activation energies for the degradation of anthocyanins in black carrot juice concentrates was 84 kj mol 1 at 5 C to 3 C, respectively. Since phenolic contents of black carrot juice concentrates during storage at 5 C to 3 C didn t change significantly activation energies for the degradation of phenolics in black carrot juice concentrates were not calculated. Although anthocyanins from black carrot juice were much more stable than those from other sources and there was no an impotant effect of storage temperature on phenolic contents, black carrot juice concentrates should be kept at refrigeration temperatures to minimize anthocyanin degradation. 4

5 II. Amaç ve Kapsam Bu projenin temel amacı, yoğun olarak fenolik madde ve antosiyanin içeren siyah havuç suyunun durultularak berraklaştırılmasından başlayarak, konsantreye işlenmesi ve üretilen bu konsantrenin farklı sıcaklıklarda depolanması sırasında antosiyanin ve fenoliklerdeki değişimin saptanması ve bu değişimlerin antioksidan aktiviteyle ilişkisinin belirlenmesidir. Yukarıda belirtilen amaç doğrultusunda, siyah havuç suyunun durultulması için yapılan ön denemelerde yeterli bir durultma yöntemi belirlenmiş ve çalışmada kullanılacak olan siyah havuç suyu belirlenen bu yönteme göre durultulmuştur. Daha sonra, durultma işleminin her bir aşamasında alınan örneklerde (depektinizasyondan önce ve sonra, bentonit uygulamasından sonra ve bentonit, jelatin ve kizelsol uygulamalarından sonra); siyah havuç suyunun fenolik madde ve antosiyanin miktarları ile dağılımları ve antioksidan aktivitesi belirlenmiştir. Ayrıca, durultulmuş siyah havuç suyu 68 Bx e kadar konsantre edilmiş ve 23 C, 5 C, 2 C ve 3 C de depolama çalışmaları yürütülmüştür. Depolama süresince; fenolik ve antosiyaninlerin stabilitesi ile antioksidan aktivitedeki değişim incelenmiştir. III. Materyal ve Yöntem 3.1 Materyal Siyah havuçlar, bu ürünün yoğun olarak yetiştirildiği Konya nın Ereğli ilçesinden sağlanmıştır. 3.2 Yöntem Siyah havuç suyu üretimi Bu amaçla önce 6 kg siyah havuç sağlanmış ve bu havuçların suyu çıkarılarak, depektinizasyon ve durultma ön deneyleri yapılmış ve bir miktar havuç suyu da laboratuarda konsantreye işlenmiştir. Ön denemeler tamamlandıktan sonra, bu defa 25 kg siyah havuç temin edilmiştir. Siyah havuçlar, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi "Meyve Suyu Pilot İşletmesi"nde preslenerek suyu çıkarılmıştır. Bu amaçla etkin bir 5

6 şekilde yıkanan siyah havuçlar, işletmede bulunan rendeleme cihazında rendelendikten sonra, paketli preste (Bucher-Guyer, Niederweningen, İsviçre) preslenmiş ve siyah havuç ham suyu elde edilmiştir. Preslemede, pres basıncı kademeli olarak artırılmış ve maksimum pres basıncına 3 dakikada ulaşılmıştır. Preslemede daha önceki çalışmalar dikkate alınarak randımanın %35 4 düzeyinde olması hedeflenmiş (Kırca 24) ve kullanılan bu materyalde %35,9 lık bir randımana ulaşılmıştır. Elde edilen havuç ham suyu tülbentten süzülerek kaba partiküllerinden ayrılmıştır. 25 kg siyah havuç Presleme 73,6 kg siyah havuç ham suyu 73,6 kg siyah havuç ham suyu Randıman (%) = x 1 = %35,9 25 kg siyah havuç Siyah havuç suyunun depektinizasyonu Elde edilen havuç ham suyuna sitrik asit çözeltisi eklenerek (%5 w/v), havuç suyunun ph sı 4.3 e ayarlanmış ve bu işlemi takiben depektinizasyon denemeleri yapılmıştır. Bu amaçla, ticari enzim preparatından Fructozym P (Döhler, Geisenheim, Almanya) farklı miktarlarda eklenerek 5 C de 2 h süreyle bekletilmiştir. Daha sonra alkol testi ile depektinizasyon işleminin tamamlanıp tamamlanmadığı izlenmeye çalışılmıştır. Ancak, tortu oluşumu kontrol örneklerinde bile yoğun renk nedeniyle izlenememiştir. Bu nedenle, örnekler kaba filtrasyona tabi tutulmuş ve bulanıklık düzeyleri türbidimetrede ölçülmüştür. Bu denemelere ilişkin sonuçlar Çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge 3.1 de verilen deney sonuçlarına göre, en düşük NTU değerine; yani, maksimum berraklık düzeyine 1 ml ye.5 ml enzim preparatı uygulamasıyla ulaşılmıştır. Bu enzim dozajı dikkate alınarak, gerekli enzim eklenerek tüm havuç suyu 6

7 kitlesi 5 C de 2 h süreyle bekletilerek depektinize edilmiştir. Bu süre sonunda, üstte oluşan tortu bir süzgeç yardımıyla alınmıştır. Çizelge 3.1 Siyah havuç suyuna uygulanan depektinizasyon deneme sonuçları Dozaj (ml/1 ml) NTU Siyah havuç suyunun durultulması Depektinize edilen havuç suyunda bentonit, jelatin ve kizelsol için uygun dozajısaptama deneyleri yapılmıştır. Bu amaçla, önce uygun bentonit dozajı saptanmıştır. Denemelerde kullanılacak bentonit, kütlesinin 9 katı su ile iyice karıştırılarak süspansiyon haline getirilmiş ve bu süspansiyon 1 gece kendi halinde bırakılarak şişmesi sağlanmıştır (Cemeroğlu ve Karadeniz 24). Depektinize edilmiş havuç suyuna %1 (w/v) konsantrasyonda hazırlanan bentonit çözeltisinden farklı miktarlarda eklendikten sonra 5 C de 3 dak. bekletilmiştir. Bentonit denemelerine ilişkin sonuçlar Çizelge 3.2 de verilmiştir. Çizelge 3.2 Siyah havuç suyuna uygulanan bentonit deneme sonuçları Dozaj (ml/25 ml) NTU * *Bu denemede yapılan ölçüm sırasında çok fazla salınım gözlenmiş ve bu nedenle bu deneme değerlendirmeye alınmamıştır. Bu denemelerden alınan sonuçlara göre, maksimum berraklığa 25 ml depektinize edilmiş havuç suyuna 2 ml bentonit eklenerek ulaşıldığı saptanmıştır. Daha sonra sıcaklığı +4 C ye getirilen depektinize edilmiş ve bentonit uygulanmış havuç 7

8 suyuna %1 lik (w/v) jelatin çözeltisinden ve %15 lik (v/v) kizelsol çözeltisinden farklı miktarlarda eklenerek, jelatin ve kizelsol için dozaj deneyleri yapılmıştır. Jelatin ve bentonit denemelerine ilişkin sonuçlar Çizelge 3.3 de verilmiştir. Çizelge 3.3 Siyah havuç suyuna (15 ml) uygulanan jelatin ve kizelsol deneme sonuçları Jelatin (%1, w/v) Kizelsol (%15, v/v) NTU Çizelge 3.3 de verilen sonuçlar dikkate alınarak kizelsol dozajını belirlemek için bir deneme daha yapılmıştır. Bu amaçla, 2 ml havuç ham suyuna 1 ml pektolitik enzim eklenerek depektinize edilmiş ve depektinize edilen havuç suyuna 1.64 ml bentonit (%1) ve 3 ml jelatin (%1) eklenmiş ve son olarak da %15 lik kizelsol çözeltisinden farklı miktarlarda eklenerek, kizelsol için dozaj deneyleri yapılmıştır. Bu sonuçlar Çizelge 3.4 te verilmiştir. Çizelge 3.4 Siyah havuç suyuna (2 ml) uygulanan kizelsol deneme sonuçları Kizelsol (%15) NTU

9 Bu denemelerden alınan sonuçlara göre, maksimum berraklığa 2 ml depektinize edilmiş ve bentonit uygulanmış havuç suyuna 3 ml jelatin (%1) ve.53 ml kizelsol (%15) eklenerek ulaşıldığı saptanmıştır. Dozaj deney sonuçları dikkate alınarak tüm kitle önce depektinize edilmiş ve daha sonra da depektinize edilen havuç suyu bentonit, jelatin ve kizelsol ile durultulmuştur. Bu amaçla havuç suyuna 2.85 ml/l enzim preparatından eklenerek 5 C de 2 h bekletildikten sonra üstte oluşan tortu bir süzgeç yardımıyla alınmıştır. Daha sonra, depektinize edilen havuç suyuna 7.15 ml/l (%1) bentonit çözeltisinden eklenerek 5 C de 3 dak. bekletilmiştir. Bu süre sonunda, havuç suyu tülbentten geçirilerek bir gece soğutmalı inkübatöre konularak sıcaklığının +4 C ye gelmesi sağlanmıştır. Daha sonra depektinize edilmiş ve bentonit uygulanmış havuç suyuna 7.5 ml/l jelatin (%2) ve 2.6 ml/l kizelsol (%15) çözeltisinden eklenerek +4 C de 8 h bekletilerek durultma işlemi yapılmıştır. Bu süre sonunda, durultulan havuç suyu kaba filtrasyona tabi tutulmuştur. Havuç suyunun durultma aşamalarında (depektinizasyondan sonra, bentonit uygulamasından sonra ve durultmadan sonra) örnekler alınmıştır. Bu örneklerin bir bölümü pastörize edilerek, bir bölümü de pastörize edilmeden analizlere kadar dondurulmuş olarak 23 C'de muhafaza edilmiştir. Durultulan havuç suları 1.5 L'lik PET şişelere doldurularak, konsantrasyon işlemine kadar dondurulmuş olarak muhafaza edilmiştir Siyah havuç suyu konsantresi üretimi Bentonit + jelatin + kizelsol ile durultulmuş havuç suları, 68 Briks derecesine kadar vakum altında 4 C de döner (rotary) evaporatörde (Heidolph Laborota 43, Schwabach, Almanya) konsantre edilmiştir Siyah havuç suyu konsantrelerinin pastörizasyonu Konsantre örneklerinin muhafaza edileceği kavanozlar boş olarak ve kapakları hafif aralı olarak kapatılarak, otoklavda 121 C de 15 dak. süreyle sterilize edilmiştir. Havuç suyu konsantreleri, steril kavanozlara doldurulmadan önce döner evaporatörde 7 C ye ısıtılmıştır. Daha sonra steril kavanozların kapakları bunzen beki yanında açılıp, 7 C ye ısıtılmış yaklaşık 9 g konsantre örneği hızlı bir şekilde kavanozlara 9

10 doldurulmuş ve kapakları hermetik olarak kapatılmıştır. Bunu izleyerek kavanozlar hızla oda sıcaklığına kadar soğutulmuşlardır. Konsantre örnekleri için yapılan bu işlem tam bir pastörizasyon işlemi olmayıp, örneklerin uzun süre mikrobiyolojik bir bozulma olmadan depolanabilmesi amacıyla yapılmıştır Siyah havuç suyu konsantrelerinin depolanması Konsantre örneklerinin bulunduğu kavanozlar, depolamanın yapılacağı sıcaklık kontrollü inkübatörlere yerleştirilmiştir. 5 C, 2 C ve 3 C'deki depolama deneyleri 253 L'lik inkübatörlerde (Sanyo MIR 253, Gunma, Japonya) yapılmıştır. Bir kısım havuç suyu konsantresi ise, 23 C'de depolanmıştır Fiziksel analizler Suda çözünür kuru madde tayini Örneklerde suda çözünür kuru madde (briks) dijital bir refraktometre (Atago Rx-7α, Tokyo, Japonya) kullanılarak saptanmıştır. Briks ölçümleri, 2 C de yapılmıştır ph tayini ph değeri, potansiyometrik olarak ph-metre (WTW Inolab Level 1, Weilheim, Almanya) ile saptanmıştır. Bu amaçla, bulanık ve berrak siyah havuç suyu örneklerinden bir behere 1 ml alınarak üzerine, 1 ml damıtık su ilave edildikten sonra ph değeri belirlenmiştir. Konsantre örneklerinde ise, 1.5 g konsantre örneği üzerine 2 ml damıtık su ilave edildikten ve iyice karıştırıldıktan sonra elde edilen homojen sıvıda ph değeri belirlenmiştir. Meyve ve sebze suları gibi tampon niteliği yüksek olan gıdalarda sulandırma oranı fazla olsa bile, ph değeri değişmediği için (Cemeroğlu 27), gerek havuç sularına gerekse de konsantre örneklerine ph ölçümlerini kolaylaştırmak için önemli miktarda su eklenebilmiştir. ph ölçümleri, 2ºC de yapılmıştır Bulanıklık düzeyinin ölçülmesi Durultulmuş ve kaba filtreden geçirilmiş havuç suyu örneklerinin bulanıklık düzeyi, bir türbidimetre (HACH Ratio/XR 439, Loveland, A.B.D.) yardımıyla belirlenmiştir. Bulanıklık düzeyi "NTU (Nephelometric Turbidity Unit)" değeri ile ifade edilmiştir. 1

11 Ölçümler, siyah havuç sularında doğrudan, konsantrelerde ise; doğal siyah havuç suyu briksine (1.68 Briks) kadar seyreltildikten sonra yapılmıştır. Bu amaçla, yaklaşık 5 g siyah havuç suyu konsantresine, 3 ml damıtık su ilavesiyle seyreltilerek doğal siyah havuç suyu briksine getirilmiştir. Türbidimetrenin sıfır ayarı, konsantrelerin seyreltilmesinde kullanılan damıtık su ile yapılmıştır Reflektans renk tayini Bu amaçla, reflektans spektrofotometresi (Minolta CM-36d, Osaka, Japonya) kullanılmıştır. Havuç sularının renklerinin ölçümünde CIE L*a*b* sistemi kullanılarak L*, a* ve b* değerleri belirlenmiştir. Daha sonra a* ve b* değerlerinden, C* (chroma, renk yoğunluğu) ve h (hue, renk tonu) değerleri aşağıda verilen 3.1 ve 3.2 No'lu eşitlikler yardımıyla hesaplanmıştır: C* = (a* 2 + b* 2 ) 1/2 (3.1) h = arctan (b*/a*) (3.2) Spektrofotometre, beyaz seramik plakaya karşı her kullanımdan önce standardize edilmiştir. Renk ölçümünde, 1 cm tabaka kalınlığı olan 1 ml hacimdeki quartz küvet kullanılmıştır. Işık kaynağı olarak CIE tarafından belirlenen C ışıtıcısından (Illuminant C) yararlanılmıştır. Siyah havuç sularında renk ölçümü doğrudan, buna karşın konsantrelerin renk ölçümü damıtık su ilavesiyle briksleri doğal siyah havuç suyunun briksine getirildikten sonra yapılmıştır. Renk ölçümlerinde "Minolta CM-S1w SpectraMagic NX" 1.22 versiyonu bilgisayar programı kullanılmıştır. L*, a*, b*, C* ve h değerlerine ilişkin aritmetik ortalama ve standart sapma değerleri bu program kullanılarak hesaplanmıştır Kimyasal analizler Titrasyon asitliği tayini Titrasyon asitliği, ph ile izlenerek yürütülen elektrometrik titrasyonla saptanmış olup, analizde IFU (1968) tarafından önerilen işlemler uygulanmıştır. Bu amaçla, ph tayini için hazırlanmış olan siyah havuç sularından 2 ml alınarak ayarlı.1 N NaOH çözeltisi ile ve ph metre yardımıyla, ph 8.1'e ulaşıncaya kadar titre edilmiştir. Siyah 11

12 havuç suyu ve konsantre örneklerinin titrasyon asitliği, susuz sitrik asit cinsinden sırasıyla, "g/1 ml veya g/1 g" olarak hesaplanmıştır Toplam monomerik antosiyanin tayini Bu amaçla, Fuleki and Francis (1968) tarafından önerilen, ve Giusti and Wrolstad (21) tarafından geliştirilen ph diferansiyel metodu kullanılmıştır. Bu metodun ilkesi, monomerik antosiyaninlerin ph 1. da renkli oksonium formunun, ph 4.5 de ise, renksiz hemiketal formunun egemen olmasına dayanmaktadır. Buna göre, ortam ph 1. ve 4.5 olduğu zaman ölçülen absorbans değerlerinin farkı, doğrudan antosiyanin konsantrasyonu ile orantılı bulunmaktadır. Bulanık ve berrak siyah havuç suları seyreltilmeden, konsantreler ise, 4 g konsantrenin 25 ml lik bir ölçü balonuna tartılıp, balonun damıtık suyla çizgisine kadar tamamlanmasıyla seyreltilerek analize hazırlanmıştır. Konsantrelerin seyreltilmesiyle hazırlanmış örnekler daha sonra 8 x g de 1 dak. süreyle santrifüj (Sigma 3K 15, Postfach, Almanya) edilip, bulanıklık oluşturacak tortularından ayrılmıştır. Seyreltilmiş örnekler, potasyum klorür tampon çözeltisi (ph 1.) ile bir kez daha seyreltilerek, siyah havuç suyunda bulunan antosiyaninlerin λ vis-maks dalga boyu olan 534 nm de absorbans değeri 1. civarına getirilmiştir. Tüm depolama süresince, konsantre örnekleri aynı seyreltme oranlarına uyularak seyreltilmiş ve böylece analizler birçok spektrofotometrenin linear sınırı olan 1.2 absorbans değerinin (Özkan vd 27) altında yürütülmüştür. Potasyum klorür çözeltisi (ph 1.) ile belirlenen bu seyreltme oranı, hem potasyum klorür hem de sodyum asetat tampon çözeltisi (ph 4.5) ile uygulanmış ve elde edilen seyreltikler, 15 dak. süreyle denge oluşması için kendi halinde bırakılmışlardır. Bekleme süresi sonunda, seyreltikler.45 µm gözenek çapındaki PVDF (polyvinylidene fluoride) filtreden (Millipore, Bedford, MA, A.B.D.) filtre edildikten sonra, örneklerin absorbans değerleri, örnek ve şahidin (damıtık su) aynı anda konulabildiği çift huzmeli (double-beam) spektrofotometre (ThermoSpectronic Helios-α, Cambridge, İngiltere) kullanılarak belirlenmiştir. Absorbans ölçümleri, damıtık suya karşı, siyah havuç antosiyaninlerinin λ vis-maks dalga boyu olan 534 nm de ve ayrıca düşük düzeydeki bulanıklığın belirlenmesi için 7 nm de 1 cm tabaka kalınlığındaki tek kullanımlık küvetlerde (Brand Gmbh, Wertheim, Almanya) 12

13 yapılmıştır. Monomerik antosiyanin miktarı, meyvelerde baskın bulunan siyanidin-3- glukozid cinsinden (Gil et al. 2) aşağıda verilen 3.3 No'lu eşitliğe göre hesaplanmıştır. (A) (MW) (S f ) 1 Monomerik antosiyanin miktarı (mg/kg veya L) = (3.3) (ε) (L) Burada: A : Absorbans farkı (ph 1. ve 4.5 değerlerinde ölçülen absorbans farkı), MW : Baz olarak alınacak antosiyaninin molekül ağırlığı, S f : Seyreltme faktörü, ε : Molar absorpsiyon katsayısı, L : Spektrofotometre küvetinin tabaka kalınlığı (cm). Siyanidin-3-glukozidin molar absorbans değeri ε=26 9 ve molekül ağırlığı ise MW=449.2 (Giusti and Wrolstad 21) alınarak hesaplama yapılmıştır Fenolik ve antosiyanin dağılımlarının belirlenmesi Siyah havuç suyu ve konsantrelerinde fenolik ve antosiyanin kompozisyonu, HPLC (yüksek performanslı sıvı kromatografi) ve HPLC-DAD-MS (kütle spektroskopisi) yöntemleri ile belirlenmiştir HPLC yöntemi HPLC yöntemi üç aşamadan (ekstraksiyon, saflaştırma ve hesaplama) oluşan bir uygulama olup, bu aşamalar aşağıda açıklanmıştır. Ekstraksiyon Gerek fenolik gerekse de antosiyanin dağılımlarının belirlenmesi amacıyla yapılan ekstraksiyon işlemlerinde önemli benzerlikler bulunmaktadır. Bu amaçla, Lee and Wrolstad (24) tarafından ortaya konulan yöntem izlenmiş, ancak örnek hazırlama aşamasında tarafımızdan bazı değişiklikler yapılmıştır. Siyah havuç suyundan 2 ml ekstraksiyon işleminin yapılacağı plastik bir tüpe alınarak, 1 ml %1 lük aseton ile birlikte 1 dak. tüp karıştırıcıda (CAT, VM2, Staufen, Almanya) çalkalanmıştır. Siyah 13

14 havuç suyu konsantre örneklerinde ise, 4 g konsantre 25 ml lik bir ölçü balonuna tartılmış ve balon damıtık su ile hacmine tamamlanmıştır. Bu kitleden 2 ml alınıp, 1 ml %1 lük aseton ilave edildikten sonra 1 dak. tüp karıştırıcıda karıştırılmıştır. Her iki şekilde elde edilmiş homojenizata aşağıdaki işlemler uygulanmıştır. Homojen sıvı, Buchner hunisinden Whatman 1 No lu filtre kağıdından vakum uygulanmaksızın filtre edilmiştir. Ekstraksiyon işlemlerinin gerçekleştirildiği plastik tüpün çeperlerine yapışan kitledeki antosiyaninleri de ekstrakte etmek için; tüp, 1 ml %7 lik aseton (aseton:damıtık su, 7:3, v/v) ile tüp karıştırıcıda 1 dak. süreyle karıştırılmıştır. Aynı işlem, 1 ml %7 lik aseton ve 1 ml %5 lik aseton (aseton:damıtık su, 5:5, v/v) ile tekrarlanmıştır. Yıkantılar, Buchner hunisine aktarılmış ve vakum uygulanmadan filtre edilmiştir. Son olarak filtre kağıdı üzerinde oluşmuş filtre kekini tamamen renksiz kılmak için; 1 ml %5 lik aseton ile bir kez daha yıkanmıştır. Tüm yıkama işlemi boyunca, başlangıçta vakum pompası çalıştırılmadan, filtre keki yukarıda verilen hacim ve konsantrasyondaki aseton içinde bir süre bekletilmiş ve en son eklenen 1 ml %5 lik aseton ile yıkama sonunda vakum uygulanarak filtre edilmiştir. Filtrat bir ayırma hunisinde bulunan 12 ml kloroform üzerine aktarılmış ve böylece aseton:kloroform oranı, 1:2 (v/v) düzeyine erişmiştir. Emzikli erlenmayerdeki ekstraktın tümünün kayıpsız olarak alınması için erlenmayer 3 5 ml %7 lik aseton ile yıkanmış ve yıkantı kloroformun üzerine aktarılmıştır. Ayırma hunisi dairesel hareketlerle hafifçe karıştırılmış, 5ºC de bir gece bekletilerek faz ayrımı sağlanmıştır. Bu ayrım sağlandıktan sonra, altta bulunan kloroform fazı dikkatle uzaklaştırılmış ve antosiyaninleri içeren üstteki renkli faz, ayırma hunisinin çeperleri 3 5 ml %7 lik asetonla yıkanarak kayıpsız bir şekilde bir rotary evaporatör balonuna alınmıştır. Renkli fazdaki aseton ve az miktardaki kloroform, 4ºC de rotary evaporatörde vakum altında uzaklaştırılmıştır. Kalan sulu ekstrakt, asitlendirilmiş su (%.1 HCl içeren) ile 1 ml lik ölçü balonuna yıkanarak hacmine tamamlanmıştır. Balondaki çözelti.45 µm gözenek çaplı PVDF filtreden filtre edilmiş ve böylece bundan sonra yapılacak saflaştırma işleminin etkinliği artırılmıştır. Işığın bileşenler üzerindeki olumsuz etkisini azaltmak için, ekstraktlar amber renkli şişelere aktarılmıştır. 14

15 Saflaştırma Elde edilen ekstrakttan; şeker ve organik asit gibi unsurların uzaklaştırılması amacıyla saflaştırma işlemi uygulanmıştır. Bu amaçla Skrede et al. (2) tarafından önerilen yöntem uygulanmıştır. Saflaştırma işleminin ilk aşamasında C-18 Sep-Pak kolonlarındaki dolgu maddesinin (sorbentin, 2 mg) antosiyaninlerle reaksiyona girebilmesini sağlamak için şartlandırılma (conditioning) işlemi yapılmıştır. Bu işlemde kolondan sırasıyla; 5 ml etil asetat, 5 ml %.1 HCl içerecek şekilde asitlendirilmiş metanol ve son olarak da 2 ml %.1 HCl içerecek şekilde asitlendirilmiş su geçirilmiştir. Ekstraksiyona hazır hale getirilen kolona, saflaştırılacak bileşeni içeren 1 ml ekstrakt yüklenmiş ve daha sonra 2 ml asitlendirilmiş suyla elüe edilmiştir. Böylece bu elüsyon ile organik asitler, şekerler ve suda çözünür nitelikteki diğer bileşikler gibi analizi interfere eden bileşikler uzaklaştırılırken, antosiyaninler ve diğer polifenolik bileşikler kolon üzerinde sorbente bağlanmıştır. Eşdüze bir saflaştırma işlemi için saflaştırma düzeneğinden (manifold) (Waters, Milford, MA, A.B.D.) yararlanılmıştır. C-18 Sep-Pak kolonu, 3 dak. süresince N 2 gazı akımında tutularak kalıntının kuruması sağlanmıştır. Fenoliklerin saflaştırması Bu amaçla N 2 gazı altında kurutulmuş C-18 Sep-Pak kolonu, 2 ml etil asetat ile yıkanarak fenolikleri içeren ekstrakt elde edilmiştir. Fenolikleri içeren bu ekstrakt bir evaporasyon tüpüne alınıp, 35º±.1 C'deki su banyosunda (Memmert WB 14, Schwabach, Almanya), asitlendirilmiş metanol N 2 gazı altında kurutularak uzaklaştırılmıştır. Daha sonra evaporasyon tüpündeki kalıntı üzerine 2 ml asitlendirilmiş su eklenerek yeniden çözündürülmüştür. Fenolikleri içeren bu çözelti.45 µm gözenek çaplı PVDF filtreden filtre edilerek, HPLC'nin oto-örnekleme (autosampler) ünitesinde kullanılan amber renkli 2 ml'lik cam şişelere (vial) alınmış ve bekletilmeden HPLC'ye enjekte edilmiştir. Antosiyaninlerin saflaştırması Antosiyanin saflaştırma işlemindeki; kolonun şartlandırılması, ekstraksiyona hazır hale getirilmesi ve kolona örneğin yüklenmesi aşamaları fenoliklerin saflaştırmasında verildiği gibi yapılmıştır. Ancak antosiyaninleri içeren ekstraktın elde edilmesinde, C- 15

16 18 Sep-Pak kolonu 4 ml %.1 HCl içerecek şekilde asitlendirilmiş metanol ile yıkanmıştır. Daha sonra fenolik saflaştırma işlemi nde olduğu gibi analize devam edilmiştir. Hesaplama Fenolik ve antosiyaninlerin tanımlanması ve miktarlarının hesaplanmasında yüksek performanslı sıvı kromatografi cihazından (HPLC, Agilent 12 serisi, Waldbronn, Almanya) yararlanılmıştır. Kullanılan HPLC sistemi; ikili (binary) pompa, foto diyoderey dedektörü (PDA, photo dioderay dedector), +4 C'ye inebilen soğutma sistemine sahip oto-örnekleyici (auto-sampler), gaz giderici (degasser) ve kolon fırınından (thermostatted column compartment) oluşmaktadır. Elde edilen kromatogramlar "ChemStation rev.b.2.1" yazılım programı ile değerlendirilmiştir. Fenoliklerin tanımlanması ve miktarının hesaplanması Kromatografi koşulları Kolon : Ters faz (reverse phase) C 18 kolonu (25 x 4.6 mm, 5 µm) (Phenomenex, Los Angeles, CA, A.B.D.) Koruyucu kolon : C 18 koruyucu kolonu (4 x 3 mm, 5 µm) (Phenomenex, Los Angeles, CA, A.B.D.) Akış hızı : 1 ml dak. 1 Elüsyon süresi : 7 dak. Enjeksiyon hacmi : 2 μl Dalga boyu : 32 nm Hareketli faz (mobile phase) : Asetonitril (%1) (A) ile %1 formik asit (B) karışımı. Gradiyent akış söz konusu olup, Chaovanalikit and Wrolstad (24) tarafından önerilen elüsyon profili tarafımızdan modifiye edilerek uygulanmıştır (Çizelge 3.5). 16

17 Çizelge 3.5 HPLC ile fenolikler için uygulanan elüsyon profili Süre (dak.) %A %B HPLC ile toplam fenolik miktarının belirlenmesi, materyaldeki piklerin alanları hesaplandıktan sonra, başat pike ait standart eğri esas alınmak suretiyle yapılması önerilmektedir (Yemiş ve Özkan 27). Bu çalışmada da, siyah havuç suyu ve konsantrelerinde HPLC ile toplam fenoliklerin belirlenmesinde, siyah havuçta baskın bulunan klorojenik asit cinsinden hesaplama yapılmıştır. Antosiyaninlerin tanımlanması ve miktarının hesaplanması Kromatografi koşulları Kolon : Ters faz (reverse phase) C 18 kolonu (25 x 4.6 mm, 5 µm (Phenomenex, Los Angeles, CA, A.B.D.) Koruyucu kolon: C 18 koruyucu kolonu (4 x 3 mm, 5 µm) (Phenomenex, Los Angeles, CA, A.B.D.) Akış hızı : 1 ml dak. 1 Elüsyon süresi : 3 dak. Enjeksiyon hacmi : 5 μl Dalga boyu : 52 nm Hareketli faz (mobile phase) : Asetonitril (%1) (A) ile O-fosforik asitasetik asit:asetonitril:su (1:1:5:84; v/v/v/v) (B) karışımı. Gradiyent akış söz konusu olup, Skrede et al. (2) tarafından önerilen elüsyon profili tarafımızdan modifiye edilerek uygulanmıştır (Çizelge 3.6). 17

18 Çizelge 3.6 HPLC ile antosiyaninler için uygulanan elüsyon profili Süre (dak.) %A %B HPLC ile toplam antosiyanin miktarının belirlenmesi de, materyaldeki piklerin alanları hesaplandıktan sonra, başat pike ait standart eğri esas alınmak suretiyle yapılmıştır (Yemiş ve Özkan 27). Ancak siyah havuç suyunda tanımlanan antosiyaninlerin hiç birisinin ticari olarak üretilen standardı olmadığı için, meyvelerin yapısında yaygın olarak bulunan "siyanidin 3-O-glukozit" cinsinden hesaplama yapılmıştır. Böylece bir yandan HPLC ile belirlenen her bir antosiyaninin miktarı siyanidin 3-O-glukozit" cinsinden de olsa belirlenmiş, diğer yandan da spektrofotometrik yöntemle "siyanidin 3- O-glukozit" cinsinden belirlenen toplam monomerik antosiyanin miktarı ile yine "siyanidin 3-O-glukozit" cinsinden bu defa HPLC ile belirlenen toplam monomerik antosiyanin miktarlarının karşılaştırma olanağı da bulunmuştur Siyah Havuç Suyu Antosiyaninleri için Recovery (Geri Kazanım) Testi Analiz süresindeki muhtemel kayıpları belirlemek amacıyla recovery testi yürütülmüştür. Bu amaçla Yemiş ve Özkan (27) tarafından önerilen yöntem uygulanmıştır. Bu yöntemin temeli, örneğe belli miktarda eklenen standardın analiz sonunda % kaçının geri kazanıldığının tespitine dayanır. Bunun için 2 ayrı deney yürütülmüştür; 1. Eklenecek standardın örnekteki miktarını belirlemek için örneğin analizi 2. Eklenen standardın, örnekte standarda ait olan pik alanını % ne kadar artırdığını belirlemek amacıyla standart eklenmiş örneğin analizi 18

19 Bu amaçla standart; örneğe analizin başlangıcında, yani ekstraksiyondan önce eklenmiştir. Böylece recovery deneyinin, analizde çok önemli bir aşama olan ekstraksiyon işlemini kapsaması da sağlanmıştır. Siyah havuç antosiyaninlerinin ticari olarak üretilmemesi nedeniyle recovery çalışması; siyah havuçta bulunmayan siyanidin-3,5-diglukozit standardı ile yürütülmüştür. Buna göre; 4 g (±.1g) siyah havuç suyu konsantresi tartılmış ve örnek damıtık suyla 25 ml ye tamamlanmıştır. Böylece konsantrenin briksi siyah havuç suyu briksine getirilerek, analize hazırlanmıştır. Ekstraksiyon için kullanılan 2 ml örnek üzerine, 6 ve 1 mg L 1 düzeyinde siyanidin-3,5-diglukozit standardından eklenip, iyice karıştırılmıştır. Daha sonra Fenolik ve antosiyanin dağılımlarının belirlenmesi bölümünde anlatıldığı şekilde ekstraksiyon ve saflaştırma işlemleri yapılmış ve elde edilen ekstraktlar.22 μm gözenek çapındaki teflon filtrelerden filtre edildikten sonra HPLC ye enjekte edilmiştir. Elde edilen kromatogramlarda oluşan pik alanları integre edilerek hesaplama yapılmıştır. Elde edilen piklerin alanları siyanidin-3,5-diglukozit bileşiğine ait hazırlanmış bulunan standart eğriden (Şekil 3.1), bunların eşdeğeri olan konsantrasyonlar saptanmıştır. Saptanmış standart madde miktarlarından yararlanılarak aşağıda verilen 3.4 ve 3.5 No lu eşitlikler yardımıyla "recovery" ve "tekrarlanabilirlik" (reproducibility, varyasyon katsayısı) değerleri hesaplanmıştır. Burada : A 2 A 1 Recovery (%) = x 1 (3.4) A 3 A 1 : Standart eklenmemiş materyaldeki bileşen miktarı, A 2 : Standart eklenmiş materyaldeki bileşen miktarı, A 3 : Eklenen standart miktarı. Recovery testinin standart sapması Varyasyon katsayısı, CV (%) = x 1 (3.5) Recovery değerlerinin ortalaması 19

20 A la n (m A U * s) y = x R 2 = Konsantrasyon (mg/l) Şekil 3.1 Siyanidin-3,5-diglukozit standart eğrisi Kütle spektroskopisi (HPLC-DAD-MS) yöntemi Fenoliklerin tanımlanması HPLC yöntemiyle; siyah havuç suyu konsantresinin fenolik kompozisyonunun 3 temel fenolikten oluştuğu saptanmıştır. Bu fenoliklerin birinin tanımlanmasında HPLC-DAD sistemi kullanılmıştır. Tanımlanan bu pikin doğrulanması için, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi-diyoderay dedektör-kütle spektroskopisi (High Performance Liquid Chromatography-DiodeArrayDedector-Mass Spectroscopy; HPLC-DAD-MS) yöntemi uygulanmıştır. Bu çalışmada kullanılan HPLC-DAD-MS cihazındaki HPLC-DAD kısmı fenoliklerin belirlenmesinde kullanılan HPLC-DAD cihazı ile aynı konfigürasyona sahiptir. Fenoliklerin tanımlanmasında, Agilent Technologies tarafından üretilen ve Agilent 12 serisi HPLC sistemine uyumlu VL modeli kütle spektroskopisi (Waldbronn, Almanya) kullanılmıştır. Bu analizde kullanılan sistemde, multimode (MM) iyonizasyon sistemi bulunmakta ve bu sistem de ESI (elektron spray ionization ) ile APCI (atmospheric pressure chemical ionization) iyonlaştırma yöntemlerini içermektedir. Daha ılımlı bir iyonizasyon tekniği olması nedeniyle, fenoliklerin 2

21 tanımlanmasında ESI iyonizasyon sitemi kullanılmıştır (Giusti et al. 1999). Kurutucu gaz olarak, bir jeneratörde üretilen azot gazından yararlanılmıştır. HPLC-DAD-MS kromotografi koşulları MS koşulları Mode : Scan Polarite: Pozitif İyonizasyon : MM-ES Kütle aralığı: 1-5 Fragmentor: 5 İyonizasyon (Method Spray Chamber) Koşulları Method Spray Chamber: MM+ES+APCI Azot gazı akış hızı: 5 L dak. 1 Püskürtücü (Nebulizer) basıncı: 6 psig Azot gazı sıcaklığı: 25 C Buharlaşma sıcaklığı: : 25 C Kapiler voltaj: 2 V Yük (Charging) voltajı: 2 V HPLC koşulları Kolon : Ters faz (reverse phase) C 18 kolonu (25 x 4.6 mm, 5 µm) (Phenomenex, Los Angeles, CA, A.B.D.) Koruyucu kolon: C 18 koruyucu kolonu (4 x 3 mm, 5 µm) (Phenomenex, Los Angeles, CA, A.B.D.) Akış hızı : 1 ml dak. 1 Elüsyon süresi : 22 dak. Enjeksiyon hacmi : 1 μl olup, HPLC yöntemi için kullanılan siyah havuç ekstraktları kullanılmıştır. Dalga boyu : 28 nm Hareketli faz (mobile phase) : Asetonitril (%1) (A) ile formik asit (%1) (B). Gradiyent akış söz konusu olup, elüsyon profili Çizelge 3.7 de verilmiştir: 21

22 Çizelge 3.7 HPLC-DAD-MS ile fenolikler için uygulanan elüsyon profili Süre (dak.) %A %B Bu sistemde, siyah havuç suyunda bulunan fenoliklerin her biri için elde edilen piklerin tanımlanmasında, Kammerer et al. (24) tarafından daha önce belirlenmiş olan kütle/yük oranları dikkate alınmıştır. Elde edilen kromotogramlar Agilent ChemStation programı ile değerlendirilmiştir. Antosiyaninlerin tanımlanması HPLC-DAD yöntemiyle; siyah havuç suyu konsantresinin antosiyanin kompozisyonunun 5 temel antosiyaninden oluştuğu saptanmıştır. Bu antosiyaninleri tanımlamak için, HPLC-DAD-MS yöntemi uygulanmıştır. Bu çalışmada kullanılan HPLC-DAD ve HPLC-DAD-MS cihazlarının özellikleri Fenoliklerin tanımlanması bölümünde verilmiştir. Antosiyaninler, asidik ortamlarda aromatik oksonyum formunda bulunmalarından dolayı, bunların iyonlaştırılmalarında pozitif iyon modu kullanılmıştır (Wang and Sporns 1999). HPLC-DAD-MS kromotografi koşulları MS koşulları Mode : SIM (Single ion mode) Polarite: Pozitif İyonizasyon : MM-ES Kütle aralığı: 1-5 Fragmentor: 7 İyonizasyon (Method Spray Chamber) Koşulları Method Spray Chamber: MM+ES+APCI Azot gazı akış hızı: 12 L dak. 1 22

23 Püskürtücü (Nebulizer) basıncı: 35 psig Azot gazı sıcaklığı: 25 C Buharlaşma sıcaklığı: : 25 C Kapiler voltaj: 2 V Yük (Charging) voltajı: 2 V HPLC koşulları Kolon : Ters faz (reverse phase) C 18 kolonu (25 x 4.6 mm, 5 µm) (Phenomenex, Los Angeles, CA, A.B.D.) Koruyucu kolon: C 18 koruyucu kolonu (4 x 3 mm, 5 µm) (Phenomenex, Los Angeles, CA, A.B.D.) Akış hızı : 1 ml dak. 1 Elüsyon süresi : 3 dak. Enjeksiyon hacmi : 1 μl olup, HPLC yöntemi için kullanılan siyah havuç ekstraktları kullanılmıştır. Dalga boyu : 52 nm Hareketli faz (mobile phase) : Asetonitril (%1) (A) ile formik asit (%1) (B). Gradiyent akış söz konusu olup, elüsyon profili Çizelge 3.8 de verilmiştir: Piklerin tanımlanmasında tek iyon modu (single ion mode, SIM) kullanılmıştır. Bu sistemde, siyah havuç suyunda bulunan antosiyaninlerin her biri için elde edilen piklerin tanımlanmasında, Sadilova et al. (26) tarafından daha önce belirlenmiş olan kütle/yük oranları dikkate alınmıştır. Elde edilen kromotogramlar Agilent ChemStation programı ile değerlendirilmiştir. Çizelge 3.8 HPLC-DAD-MS ile antosiyaninler için uygulanan elüsyon profili Süre (dak.) %A %B

24 Antosiyanin parçalanma ölçütlerinin belirlenmesi Giusti and Wrolstad (21) tarafından önerilen yöntem kullanılarak; antosiyaninlerin parçalanma ölçütleri olarak kabul edilen "renk yoğunluğu," "polimerik renk" ve "polimerik renk yüzdesi" gibi üç nitelik belirlenmiştir. Bu amaçla, konsantre örnekleri.25 M potasyum klorür tamponu (ph 1.) ile seyreltilerek, siyah havuç suyu antosiyaninlerinin maksimum absorbans verdiği dalga boyundaki (λ vis-maks ) absorbans değerinin spektrofotometrenin doğrusal sınırı olan 1.2'nin altına getirilmesi sağlanmıştır. Bulanık ve berrak siyah havuç suları seyreltilmeden; buna karşın, konsantre örnekleri su ile 1:6 (w/v) oranında seyreltilerek analize hazırlanmıştır. Toplam monomerik antosiyanin miktarı tayininde olduğu gibi,.25 M potasyum klorür tampon çözeltisi (ph 1.) kullanılarak uygun bir seyreltme oranı saptanmıştır. Bu seyreltme oranına göre, örnekler bu defa damıtık suyla seyreltilmiş ve böylece ortamın, materyalin doğal ph derecesinde kalması sağlanmıştır. Ortamdaki bulanıklık yapan unsurları uzaklaştırmak için, örnekler.45 µm gözenek çaplı PVDF filtreden filtre edilmiştir. İki ayrı 1 cm tabaka kalınlığındaki tek kullanımlık spektrofotometre küvetinin her birine bu seyreltikten 2.8 ml alınıp, küvetlerden birindeki seyreltik üzerine.2 ml bisülfit (%2, w/v, K 2 S 2 O 5 ) çözeltisi eklenerek, örnekteki monomerik antosiyaninlerin renksiz "sulfonik asit kompleksi" oluşturması sağlanmıştır. Buna karşın, "polimerik antosiyanin-tanen" kompleksleri ve "melanoidin" pigmentleri ise, bisülfite karşı direnç göstererek renklerini korumuşlardır. Bu esmer renkli pigmentlerin ortamdaki konsantrasyonu arttıkça, 42 nm'de okunan absorbans değerleri yükselmektedir. Diğer küvete ise, bisülfit çözeltisi yerine.2 ml damıtık su eklenerek her iki küvet 15 dak. süreyle denge oluşumu için kendi haline bırakılmışlardır. Bu süre sonunda, her iki küvetteki çözeltilerin absorbans değerleri 42 nm, λ vis-maks (534 nm) ve 7 nm dalga boylarında ölçülmüştür. Ölçümler damıtık suya karşı yapılmıştır. Ölçüm sonuçları aşağıda belirtildiği gibi "renk yoğunluğu," "polimerik renk" ve "polimerik renk oranı" olarak değerlendirilmiştir. 24

25 Renk yoğunluğu Bu değer, "bisülfit uygulanmamış küvette bulunan örneğin, λ vis-maks ve 42 nm dalga boylarındaki absorbansları toplamı" olarak tanımlanmaktadır. Aşağıda verilen 3.6 No'lu eşitliğe göre hesaplanmıştır (Guisti and Wrolstad 21): Renk yoğunluğu = [(λ vis-maks A 7 nm ) + (A 42 nm A 7 nm )] x S f (3.6) Burada: S f : seyreltme faktörü Polimerik renk Bu değer, "bisülfit uygulanmış küvette bulunan örneğin, λ vis-maks ve 42 nm dalga boylarındaki absorbansları toplamı" olarak tanımlanmaktadır. Aşağıda verilen 3.7 No'lu eşitliğe göre hesaplanmıştır (Guisti and Wrolstad 21): Polimerik renk = [(A λ maks A 7 nm ) + (A 42 nm A 7 nm )] x S f (3.7) Polimerik renk oranı Polimerik renk oranı; polimerik rengin, renk yoğunluğuna oranı olarak tanımlanmaktadır. Hiçbir işlem görmemiş taze meyve ve sebze sularında bu oranın genellikle %1'un altında olduğu bildirilmektedir (Guisti and Wrolstad 21). Bu değer arttıkça, monomerik antosiyaninlerin parçalandığı ve esmer renkli pigmentlerin arttığı, kısaca doğal rengin bozulduğu anlaşılır. Bu değer, aşağıda verilen 3.8 No'lu eşitliğe göre hesaplanmıştır (Guisti and Wrolstad 21): Polimerik renk Polimerik renk oranı (%) = x 1 (3.8) Renk yoğunluğu Toplam fenolik madde tayini Singleton and Rossi (1965) tarafından tanımlanmış bulunan Folin-Ciocalteu yöntemine göre yapılmıştır. Bu yöntemin ilkesi, fenolik bileşiklerin alkali ortamda Folin-Ciocalteu ayıracını indirgeyip, kendilerinin oksitlenmiş forma dönüştüğü bir redoks reaksiyonuna 25

26 dayanmaktadır. Folin ayıracı ile muamele edildikten sonra oluşan mavi renk, spektrofotometrede 72 nm dalga boyunda şahide karşı okunmuştur. Örnekte ölçülen absorbans değerinin gallik asit cinsinden eşdeğeri olan fenolik bileşik miktarı, gallik asit ile hazırlanmış olan standart kurvenin denkleminden hesaplanmıştır. Örnekteki toplam fenolik bileşik miktarı "mg gallik asit/ L" cinsinden ifade edilmiştir. Siyah havuç suyu ve konsantre örnekleri fazla miktarda fenolik bileşik içermeleri nedeniyle seyreltilerek analize hazırlanmıştır. Bulanık ve berrak siyah havuç suları 1:1 (v/v), bulanık ve berrak siyah havuç suyu konsantreleri ise 1:1 (w/v), oranında seyreltilmiştir. 1 ml lik ölçü balonuna konulan 75 ml damıtık su üzerine 1 ml seyreltilmiş siyah havuç suyu veya konsantresinden eklenmiştir. Daha sonra, balon içeriği üzerine 5 ml Folin-Ciocalteu ayracı eklenerek balon iyice çalkalanmıştır. 3 dak. kendi haline bırakıldıktan sonra, üzerine 1 ml doymuş sodyum karbonat çözeltisi eklenip, balon damıtık su ile işaretine tamamlanmış ve bir kez daha iyice çalkalanmıştır. Balon içeriği kendi halinde 6 dak. bekletildikten sonra spektrofotometrede aynı şekilde hazırlanmış şahide karşı 72 nm de absorbansı saptanmıştır. Siyah havuç suyu ve konsantrelerindeki fenolik madde içeriği gallik asit kullanılarak hazırlanan standart eğriden hesaplanmıştır. Bu amaçla 25 mg gallik asit 5 ml absolü etil alkolde çözündürülerek 5 mg/l konsantrasyonda gallik asit stok çözeltisi hazırlanmıştır. Bu stok çözeltiden 1., 2., 4., 6. ve 8. ml alınarak her biri 1 ml lik ölçü balonlarına aktarılmış, balonlar absolü alkol ile çizgisine tamamlanmıştır. Bu şekilde sırasıyla 5, 1, 2, 3 ve 4 mg gallik asit/l konsantrasyonda çözeltiler hazırlanmıştır. Bu çözeltiler ile 5 mg/l konsantrasyonda hazırlanan stok çözeltiye siyah havuç suyu ve konsantresi örneklerine uygulanan analiz aşamaları uygulanmıştır ve yine 72 nm dalga boyunda bu 6 çözeltinin absorbans değerleri saptanmıştır. Bu absorbans değerleri gallik asit konsantrasyonlarına karşı bir grafiğe aktarılmış ve elde edilen verilere doğrusal regresyon analizi uygulanarak gallik asit standart eğrisi ve bu eğriyi tanımlayan eşitliğe ulaşılmıştır. Örnekler için elde edilen absorbans değerleri gallik asit standart eğrisini tanımlayan regresyon eşitliğinde yerine konularak fenolik bileşik miktarı gallik asit cinsinden 26

27 hesaplanmıştır. Bu değerler, uygulanan seyreltme oranları ile çarpılarak örneklerdeki toplam fenolik madde miktarları saptanmıştır Kondense olabilen fenolik madde tayini Tanner und Brunner (1979) tarafından önerilen yönteme göre yapılmıştır. Bu yöntemin ilkesi, düşük moleküllü monomerik kateşin ve löykoantosiyaninlerin tayin edilmesine dayanmaktadır. Vanilin; kateşinler ve löykoantosiyaninlerin 6. ve 8. pozisyonlarıyla kırmızı bir renk oluşturarak reaksiyona girmekte ve bu renk 5 nm de ölçülmektedir. Önce, bulanık ve berrak siyah havuç suları 1:1 (v/v), bulanık ve berrak siyah havuç suyu konsantreleri ise 1:5 (w/v) oranında seyreltilerek ölçümlerin yapılacağı dalga boyunda abosorbans değerleri.2.6 arasına getirilmiştir. Seyreltmiş örnekten aşağıda verildiği şekilde, A, B ve C tüpü olmak üzere 3 tüp hazırlanmıştır. A tüpü, 2. ml seyreltmiş örnek ve 4. ml vanilin çözeltisi; B tüpü, 2. ml seyreltmiş örnek ve 4. ml sülfürik asit çözeltisi (%7, v/v) ve C tüpü ise, 2. ml damıtık su ve 4. ml vanilin çözeltisi (şahit tüpü) içermiştir. Tüp içeriklerinin sıcaklıkları 35 C yi aşmaması için, %7 lik H 2 SO 4 çözeltisinin veya vanilin çözeltisinin eklenmesi sırasında tüpler, buzlu su banyosunda soğutulmuştur. Hazırlandıktan tam 15 dak. sonra, tüp içeriklerinin 5 nm de damıtık suya karşı absorbansları okunmuştur. Standart eğrinin hazırlanmasında, 25 mg kateşin 5 ml etil alkolde (absolü) çözündürülerek, 5 mg/l kateşin içeren kateşin stok çözeltisi hazırlanmıştır. Daha sonra 1 ml lik balonlara bu stok çözeltiden sıra ile 1., 2., 3., 4. ve 5. ml çözelti aktarılmış ve balonlar damıtık su ile hacme tamamlanmıştır. Böylece sıra ile; 5, 1, 15, 2 ve 25 mg kateşin L 1 konsantrasyonlarda bir seri standart çözelti elde edilmiştir. Bu standart çözeltilerin her birinden doğrudan 2. ml alınarak yukarıda örnek için verildiği gibi A ve B tüpleri hazırlanmıştır. A tüpündeki standartlar için saptanan absorbans değerinden B ve C ye (şahit) ait absorbanslar çıkarılarak bulunan absorbans değerleri, kateşin konsantrasyonlarına karşı bir grafiğe aktarılmış ve böylece sıfır noktasından geçen standart bir eğri elde edilmiştir. 27

28 Örnek kullanılarak yürütülen deneyde, A tüpüne ait absorbans değerinden aynı deneye ait B ve C tüplerinde okunmuş absorbans değerleri çıkarılarak, net absorbans değerleri bulunmuştur. Bu absorbans değerleri standart eğri için hesaplanan doğrusal regresyon denkleminde yerine konularak, seyreltilmiş örnekteki kondense olabilir fenolik bileşiklerin miktarı hesaplanmıştır. Uygulanmış seyreltme oranları dikkate alınarak, gerçek örnekteki kondense olabilir fenolik bileşiklerin miktarı mg kateşin/l birimiyle belirlenmiştir Antioksidan aktivite tayini Bu amaçla, Miller and Rice-Evans (1997) ile Arts et al. (21) tarafından önerilen yöntem kullanılmıştır. Bu yöntemin ayrıntıları Kırca ve Özkan (27) tarafından verilmiştir. Bu yöntem, ABTS + (2,2 -azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonik asit)) radikal katyonu tarafından tutulan antioksidatif maddelerin miktarının, sentetik bir antioksidan olan Troloks'un (suda çözünen E vitamini analoğu) standart miktarlarıyla kıyaslanarak bağıl ölçümünü sağlamaktadır. Ölçümler, mavi/yeşil renkli stabil bir bileşik olan ABTS + radikalinin kayboluşunun spektrofotometrik olarak belirlenmesiyle yapılmıştır. Mavi/yeşil ABTS + kromoforu oluşturmak için ABTS ve potasyum persülfat arasında gerçekleşen reaksiyondan yararlanılmıştır. Antioksidan aktivite tayini analizlerinde öncelikle 2.45 mm potasyum persülfat içeren 7 mm lık ABTS çözeltisi hazırlanmıştır. Bu çözelti, 2 o C ye ayarlı bir inkübatörde (Sanyo MIR 253, Gunma, Japonya) saat arasında bekletilerek, ABTS + radikalinin oluşması sağlanmıştır. Bunun dışında; radikal çözeltisinin, örneklerin ve troloks standardının seyreltilmesinde kullanılacak olan PBS (phosphate buffer saline) çözeltisi hazırlanmıştır. Bu amaçla, hazırlanan.1 M fosfat tamponu üzerine 8.77 g NaCl eklenerek 1 L ye damıtık suyla tamamlanmış ve böylece ph sı 7.4 olan PBS çözeltisi elde edilmiştir. Siyah havuç suyu ve konsantreleri yüksek antioksidan aktivite gösterdiğinden, örnekler analizden önce seyreltilmişlerdir. Bu amaçla 1 ml siyah havuç suyu alınarak 1 ml hacme PBS ile tamamlanmıştır. Siyah havuç suyu konsantreleri ise, kavanoz içeriği karıştırılmadan yüzeye yakın kısımdan yaklaşık 1 g örnek alınarak, 5 ml hacme PBS 28