T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ MİKROBİYOLOJİK SELÜLAZ ENZİMİNİN ÜRETİMİ ÜZERİNE ÇALIŞMALAR Emre ÖZTÜRK Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Moleküler Biyoloji ve Genetik Programı Danışman Doç. Dr. Ercan ARICAN Haziran, 2015 İSTANBUL

2

3 Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yürütücü Sekreterliğinin numaralı projesi ile desteklenmiştir.

4 ÖNSÖZ Yüksek lisans boyunca bilgilerini ve tecrübelerini benimle paylaşan danışman hocam Doç. Dr. Ercan ARICAN a ve İstanbul Üniversitesi Fen Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik bölüm hocalarıma; Tez çalışmaları sırasında dostluk ve yardımlarından yararlandığım Aylin GAZDAĞLI ve Yunus AKSÜT e; Tüm lisans ve yüksek lisans eğitimim boyunca sabırla benden maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen ANNE, BABA ve AMCAMA sonsuz teşekkür ederim. HAZİRAN, 2015 Emre ÖZTÜRK i

5 İÇİNDEKİLER Sayfa No ÖNSÖZ... i İÇİNDEKİLER... ii ŞEKİL LİSTESİ... iv TABLO LİSTESİ... v SİMGE VE KISALTMA LİSTESİ... vi ÖZET... vii SUMMARY... viii 1. GİRİŞ GENEL KISIMLAR MALZEME VE YÖNTEM Aspergillus niger HÜCRELERİNİN YETİŞTİRİLMESİ A. niger HÜCRELERİNİN ÜRETİMİNDE KULLANILAN BESİYERLERİNİN HAZIRLANMASI A. niger HÜCRELERİNİN ÜRETİMİ İÇİN KÜLTÜR KOŞULLARININ OPTİMİZASYONU A. niger HÜCRELERİNDE BİYOREAKTÖR KULLANILARAK SELÜLAZ ENZİMİ ÜRETİMİ BİYOREAKTÖRDE A. niger HÜCRELERİ İLE ÜRETİLEN FERMENTASYON ÜRÜNÜNDEKİ PROTEİN KONSANTRASYONUNUN BELİRLENMESİ BİYOREAKTÖRDE A. niger HÜCRELERİ İLE ÜRETİLEN FERMENTASYON ÜRÜNÜNDEKİ PROTEİNLERİN ÇÖKTÜRÜLMESİ A. niger HÜCRELERİ TARAFINDAN ÜRETİLEN SELÜLAZ ENZİMİ AKTİVİTE TAYİNİ BULGULAR KÜLTÜR KOŞULLARININ OPTİMİZASYONU A. niger HÜCRELERİYLE BİYOREAKTÖR KULLANILARAK ÜRETİLEN SELÜLAZ ENZİMİ BİYOREAKTÖRDE A. niger HÜCRELERİ İLE ÜRETİLEN FERMENTASYON ÜRÜNÜNDE LOWRY YÖNTEMİYLE PROTEİN MİKTARININ BELİRLENMESİ ii

6 4.4. ENZİM AKTİVİTE TAYİNİ TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR EK 1. TAŞÇILAR ÇAY FABRİKASINDAN ÇAY ÇÖPÜ ALIMINA DAİR İZİN BELGESİ ÖZGEÇMİŞ iii

7 ŞEKİL LİSTESİ Sayfa No Şekil 2.1: Egzoglukonaz (β-1,4-d glukanohidrolaz) enzimi 3 boyutlu görüntüsü Şekil 2.2: Endoglukonaz (1,4-β-D-glukan-4-glukanohidrolaz) enzimi 3 boyutlu görüntüsü Şekil 2.3: β-glukozidaz (Sellobiyohidrolaz) enzimi 3 boyutlu görüntüsü Şekil 3.1: Sartorius Biostat B Plus Fermentör ve Ekipmanları Şekil 4.1: Lowry yöntemine göre protein standart grafiği Şekil 4.2: Lowry yönteminde kuyucuklarda renk oluşumu Şekil 4.3: DNS metodu için glukoz standardı grafiği iv

8 TABLO LİSTESİ Sayfa No Tablo 2.1: Bazı enzimlerin kullanım alanları ve elde edildikleri mikroorganizmalar Tablo 2.2: Aspergillus niger van Tieghem, Anamorph (ATCC ) taksonomisi... 7 Tablo 3.1: Kültür koşullarının optimize edilmesinde kullanılan farklı besiyeri içerikleri Tablo 3.2: İstenen doygunluğa ulaşılması için çözeltiye eklenmesi gereken katı Amonyum Sülfat miktarı hesaplama tablosu Tablo 3.3: DNS yönteminde kullanılan tampon ve bileşikler Tablo 4.1: Kültür koşullarının optimize edilmesinde bulunan enzim aktivite değerleri Tablo 4.2: Enzim çözeltisine yapılan enzim aktivite tayinleri v

9 SİMGE VE KISALTMA LİSTESİ Simgeler Açıklama atm : Atmosfer Basınç Birimi ml : Mililitre C : Santigrat derece, sıcaklık birimi µl : Mikrolitre nm : Nanometre µmol : Mikromol w/v : Ağırlık/hacim β : Beta M : Molar rpm : Revolutions per minute (dakikadaki dönüş sayısı) U (enzim) : Ünite sn : Saniye mg : Miligram mm : Milimolar Kısaltmalar Açıklama NC-IUBMB E.C. CMC dh 2 O SSF SmF PDA PDB MMS ÇÇ DNA : Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology : The Enzyme Commission : Carboxy methyl cellulose : Distile su : Solid-State Fermentation (Katı-hal Fermentasyonu) : Sub-merged Fermentation (Batık Kültür Fermentasyonu) : Patato Dextrose Agar : Patato Dextrose Broth : Mısır Maserasyon Sıvısı : Çay Çöpü : Deoksiriboz Nükleik Asit vi

10 ÖZET YÜKSEK LİSANS TEZİ MİKROBİYOLOJİK SELÜLAZ ENZİMİNİN ÜRETİMİ ÜZERİNE ÇALIŞMALAR Emre ÖZTÜRK İstanbul Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Ercan ARICAN Selülaz (E.C ), temel fonksiyonu lignoselülozik biyokütle içinde mevcut kompleks karbohidratların etkili bir şekilde glukoz monomerleri haline dönüşümünü sağlayan bir enzim kompleksidir. Selülazlar nişasta işleme, yem sanayi, tahıl, alkol fermentasyonu, malt, bira, sebze ve meyve suyu endüstrisi, kağıt hamuru ve kağıt endüstrisi gibi çeşitli endüstriyel süreçlerin yanı sıra tekstil sektöründe kullanılmaktadır. Endüstriyel alanlarda selülazların büyük önemi nedeniyle, bunların üretiminde genelde bakteri ve mantarlar kullanılmakla birlikte özellikle Aspergillus, Trichoderma türleri tercih edilir. Bu çalışmada talaş ve çay fabrikası atığı içeren besiyeri hazırlanarak Aspergillus niger aracılığıyla selülaz enzimi üretimi amaçlanmıştır. Deneyler bu atık maddeler ile 5 lt lik karıştırmalı fermentörde kesikli Batch fermentasyon kullanılarak yürütüldü. Oluşan fermentasyon ürününde enzim aktivite tayini dinitro salisilik asit yöntemi ve protein miktarı tayini için Lowry yöntemi kullanıldı. En iyi enzim aktivitesi 9,6 g talaş ve 3 ml mısır maserasyon sıvısı içeren besiyerinde 6,16 U/ml olarak saptandı. En fazla protein miktarı da 8 g talaş ve 3 g çay çöpü içeren besiyerinde 7 mg/ml olarak saptandı. Haziran 2015, 43 Sayfa. Anahtar kelimeler: Aspergillus niger, selülaz, çay fabrikası atığı, talaş. vii

11 SUMMARY M.Sc. THESIS STUDIES ON PRODUCTION OF MICROBIOLOGICAL CELLULASE ENZYME Emre ÖZTÜRK Istanbul University Institute of Graduate Studies in Science and Engineering Department of Molecular Biology and Genetics Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Ercan ARICAN Cellulase ( E.C ) is an enzyme complex whose basic function is the conversion of complex carbohydrates which are present in lignocellulosic biomass efficiently into glucose monomers. Cellulases are utilized in a variety of industrial processes, such as starch processing, fodder industry, cereal alcohol fermentation, malting, breweries, vegetable and fruit juice extraction, pulp and paper industry as well as in the textile industry. Due to great importance of cellulases in industrial fields, generally bacteria and fungi,especially Trichoderma and Aspergillus species are prefered for producing cellulases. In this study, production of cellulase enzyme using Aspergillus niger on sawdust and tea factory residue is aimed. Batch fermentation were carried out on experiments in a 5 L stirred fermenter using this waste materials. Dinitro salicylic acid method for enzyme activity assay and Lowry method for protein determination were made on fermentation product. The best enzyme activity was found 6.16 U/ml in the medium of containing 9.6 g sawdust and 3 ml corn steep liquor. Maximum protein amount was found in medium of containing 8 g sawdust and 3 g tea factory residue. June 2015, 43 pages. Keywords: Aspergillus niger, cellulase, tea factory residue, sawdust. viii

12 1 1. GİRİŞ Günümüzde selüloz içeriği yüksek olan tarımsal atıklardan biyodönüşüm, hem çevresel kirliliğin önlenmesi hem de organik gübre ve biyoetanol üretimi için çok önemli bir hale gelmiştir. Bununla beraber organik içeriği çok yüksek olan bu maddelerin, mikroorganizma üremesi için ne kadar elverişli olduğu da ortaya konulmalıdır. Selülozun fermente edilebilir glukoz haline dönüşmesi ve bu sayede üretilen biyoetanol, enerji üretimi konusunda fosil kaynakların dışında yeni alternatifler sunmaktadır (Robati, 2013). Biyoetanol üretiminde en pahalı aşama organik biyokütle içinde bulunan glukozun açığa çıkarılmasıdır. Bu aşama toplam üretim maliyetinin % 40 lık bir dilimini kapsamaktadır. Glukoz türevli bileşiklerden biri olan selülozun parçalanmasında selülaz enzimini üretip hücre dışına salgılayan mantar türlerinin kullanımı ile bu maliyet azaltılmış olacaktır (Ahamed ve Vermette, 2007). Bu selülaz enziminin hücre dışına salgılanan formunun üretimini ticari olarak gerçekleştiren mantar türlerinin başında Trichoderma ve Aspergillus türleri gelmektedir (Weber, 2005). Selüloz içeriği yüksek olan tarımsal atık ürünleri substrat olarak kullanıp mikroorganizma temelli olarak değişik enzimler, kimyasal maddeler, sekonder metabolitler ve gıda katkı maddeleri de üretmek mümkündür. Özellikle hif şeklinde olan küf mantarları kullanılarak ticari değeri yüksek enzimler bu şekilde üretilmektedir (Mrudula ve Murugammal, 2011). Dünya genelinde endüstriyel enzimlerin ticari pazar payının yaklaşık 2 milyar dolar olduğu ve 2020 yılında 10 milyar doların üzerine çıkacağı tahmin edilmektedir (Schallmey ve diğ., 2004). Bu endüstriyel enzimlerin kullanım alanlarına göre dağılımına bakıldığında, % 29 unun gıda endüstrisinde, % 15 inin hayvan yemi sektöründe ve % 56 sının ise genel amaçlı teknik alanlarda yer aldığı görülmektedir (Outtrup ve Jorgensen, 2002). Günümüzde enzimler, gıda sektöründe süt ürünlerinin üretilmesinde, bira üretiminde, etlerin işlenmesinde, meyve sularının berraklaştırılmasında, früktoz şurubu üretiminde kullanılırlar. Deterjan endüstrisinde de protein ve yağ atıklarının parçalanması amacıyla kullanılırlar. Enzimler tekstil sektöründe ise deri ve dokuma ipliklerinin işlenmesinde kullanılırlar. Bununla beraber enzimler tıpta teşhis ve tedavi amacıyla kullanılmaktadırlar. Endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık % 75 ini hidrolitik enzimler oluşturmaktadır. Proteaz grubundaki enzimler

13 2 kullanımda ilk sırayı alırken, karbohidratları parçalayan enzimler ikinci sırada yer almaktadır (Harwood, 1992; Bhat, 2000). Karbohidrat parçalayan enzimlerden amilazlar, enzim piyasasında yaklaşık % 25 lik bir paya sahiptir (Sidhu ve diğ., 1997; Rao ve diğ., 1998). Karbohidratları parçalayan diğer bir enzim ise selülazlardır. Selülazların bitkisel atıkların hidrolizinde kullanılması durumunda Amerika Birleşik Devletleri nde yıllık 400 milyon dolarlık bir ticaret hacmine ulaşacağı tahmin edilmektedir. Bu durum, endüstriyel enzim pazarında karbohidratları parçalayan enzimlerin % 33 lük orana yükselebileceğini göstermektedir (Percival ve diğ., 2006). Endüstrideki bu önemli enzimlerin üretimleri mikroorganizmalar kullanılarak kapalı bir ortamda gerçekleştirilen fermentasyon süreçlerinde yapılmaktadır. Bu fermentasyon süreçleri katı-hal ( solid-state fermentation, SSF) ve daldırmalı kültür ( submerged fermentation, SmF) olmak üzere 2 farklı şekilde gerçekleştirilir. Endüstride ticari enzimleri üreten mantar türleri nem oranı düşük ortamda katı materyal üzerinde daha iyi ürediklerinden SSF fermentasyon tercih edilir (Bansal ve diğ., 2012). Ancak büyük ölçekli üretimde ph ve sıcaklık gibi çevresel faktörlerin kontrolü daha kolay olduğundan SmF fermentasyon daha sık kullanılmaktadır (Mrudula ve Murugammal, 2011).

14 3 2. GENEL KISIMLAR Uygun şartlar altında doğada mikroorganizmalar aracılığıyla gerçekleşen tepkimelerin laboratuvar ortamında kontrollü olarak gerçekleştirilmesi mikrobiyolojik üretimin temelini oluşturur. Ancak üretilmek istenen maddeyi en yüksek miktarda ve en düşük maliyetle ortaya koyan mikroorganizma ve fermentasyon sürecinin seçilmesi mikrobiyolojik üretimin en önemli noktasıdır. Bu amaçla üretici mikroorganizma suşlarının seçimi ve geliştirilmesi, büyük ölçekte üretim için ayarlanan besiyeri, ortam koşulları gibi optimizasyonlar ve üretilen ürünün en uygun şekilde mikroorganizmadan ve besiyeri bileşenlerinden ayrılması işlemleri gerçekleştirilir (Tosun, 2005). Geleneksel olarak bira, yoğurt, peynir gibi ürünlerin mikroorganizmalar aracılığıyla üretimi üretimi yüzyıllardır gerçekleştirilmektedir. Bazı özel uygulamalar için bitkisel ve hayvansal kaynaklı enzimler ve kimyasal maddeler kullanılmaktaydı. Son 30 yıldan beri özellikle rekombinant DNA teknolojisinin gelişmesiyle bu enzim ve kimyasal maddelerin üretimi için mikrobiyal kaynaklar ağırlık kazanmıştır. Böylece günümüzde mikrobiyal biyoteknoloji yöntemleriyle üretilen saf kimyasal maddelerin ve enzimlerin sayısı da giderek artmaktadır. Bu yöntemlerle enzimler, enzim inhibitörleri, biyopolisakkaridler, biyoplastikler, biyoaktif peptidler, bakteriosinler, toksinler, alkaloidler, steroidler, immunomodulatörler, aşılar, antibiyotikler ve lantibiyotikler, biyopestisitler, vitaminler ve diğer büyüme faktörleri, amino asitler, özel şekerler, polioller ve organik asitler, biyomanyetikler, biyopigmentler ve biyolezzetlendiriciler üretilebilmektedir (Pensupa ve diğ., 2013). Enzimlerin mikrobiyolojik yolla üretilmesinde genellikle aerobik karıştırmalı tank tipi biyoreaktörler kullanılır. Ancak bu konuda ilk denemeler ve optimizasyonlar çalkalamalı etüv içinde erlenlerde yapılmalıdır. Çünkü kullanılan besiyerleri çok iyi formüle edildiği için tipik bir kesikli kültürde mikroorganizmanın üremesi, besin sınırlaması, enzim üretimi gibi parametreler çok net gözlemlenir. Ancak büyük ölçekli üretimlerde durum böyle değildir. Özellikle ticari uygulamalarda daha ucuz ve kolay elde edilebilir substratlar kullanılır. Bu substratların içeriği komplekstir. Bu yüzden mikroorganizma üremesi, enzim kapasitesi ve besin elementlerinin etkisini net görmek zordur. Ancak daha sonraki aşamada uygun donanıma sahip ve parametrelerin ölçülebildiği bir karıştırmalı biyoreaktör kullanılabilir (Tosun, 2005).

15 4 Mikroorganizmalar kullanılarak yapılan her üretim başta sıcaklık ve ph olmak üzere ortamdaki oksijen, besiyeri ortamının kimyasal bileşimi gibi parametrelerden etkilenmektedir. Bununla beraber mikroorganizma seçimi çok daha önemli bir konudur. Seçilen mikroorganizma kısa sürede yüksek verimle istenen maddeyi üretebilmeli, toksik madde ve antibiyotik üretmemeli, ucuz besi ortamında rahatlıkla çoğalabilmeli, gerek enzim üretimi sırasında gerekse izolasyon ve saflaştırma işlemleri sırasında problem oluşturacak yan ürünler üretmemelidir. En önemlisi endüstriyel boyutta düşük maliyetli çözümler sunabilmelidirler. Mikroorganizmaların hepsi endüstriyel olarak kullanılmamakla birlikte endüstriyel mikroorganizmalar (Tablo 2.1) ürettikleri bir veya birden fazla spesifik ürüne göre çok dikkatli bir şekilde doğadan seçilmektedirler. Endüstriyel mikroorganizmaların bütün suşlarının tek kaynağı doğadır. Bu organizmalar klasik screening (tarama) teknikleriyle doğadan seçildikten sonra büyük ölçekli endüstriyel üretimlerde kullanılmadan önce laboratuvarda çeşitli yöntemler kullanılarak modifiye edilebilmektedirler. Bunun amacı ise üretilecek ürünün katalitik etkinliğinin artırılması yada bu ürünü daha düşük maliyetli olarak ortaya koyabilmektir (Pensupa ve diğ., 2013). Düşük maliyetli çözümler ortaya koyabilmek endüstriyel boyutta üretim yapabilmenin en önemli şartıdır. Bu sebeple kullanılacak besiyeri seçimi konusunda farklı alternatifler değerlendirilmektedir. Bitkisel maddelerin içeriklerinde bulunan selüloz, hemi-selüloz ve lignin onların yenilenebilir enerji kaynağı olarak kullanımını cazip kılmaktadır (Mandels, 1975). Endüstriyel üretimde atık olarak açığa çıkan ya da tarlada ürün artığı olarak kalan bu bitkisel atıklardan, mikroorganizmalar yardımıyla ticari olarak faydalı kimyasal bileşenler veya biyodizel üretilebilmektedir (Han ve Chen, 2010). Selülozik içeriği bu şekilde mikroorganizmalar için karbon kaynağı olmak üzere besi ortamı olarak kullanılan bitkisel atıklar arasında mısır koçanı, pirinç kepeği, soya küspesi, buğday sapı, talaş, tahıl küspesi, şeker kamışı, melas vb. materyaller yer almaktadır (Mushtaq ve diğ., 2014). Bunların dışında lokal bölgelerde Hindistan cevizi kabuğu ve yeşil çay atığı gibi farklı maddeler de kullanılabilmektedir (Chinedu ve diğ., 2011). Besi ortamında azot kaynağı olarak kullanılan maddelere ise balık unu, jelatin, kazein, kepek, peptonlar ve soya küspesi örnek olarak verilebilir (Tosun, 2005).

16 5 Talaş mobilya sektöründe rendeleme işlemi sonucunda ve kereste endüstrisinde tomruklardan kereste elde edilmesinde açığa çıkan bir atıktır. Odun talaşı bir atık madde olmasına rağmen yenilenebilir bir kaynak olarak kullanımında da pek çok avantajı vardır. Örneğin sunta işlenmiş odun artıklarından levha haline getirilerek üretilir (Ozkazanc, 2013). Bununla beraber talaş yüksek selüloz içeriği sebebiyle mikroorganizma üremesi için besiyerinde karbon kaynağı olarak da kullanılabilir. Talaş içeren sulu çözeltinin ph sı 5,0-6,8 arasında değişir, ayrışmanın ilerlediği dönemlerde ph da biraz yükselme görülür. Ayrışması tamamlanmış talaşın katyon değişim kapasitesi yüksektir. İnce ve kaba talaş olarak her ikisi de kullanılabilir. İnce talaş nemi kaba talaştan daha iyi yaydığı için, kaba talaş ise drenaj üstünlüğü nedeniyle tercih edilir. Bu sebeple karışım halinde kullanılmasının daha iyi olacağı düşünülebilir (Acharya ve diğ., 2008). Ülkemizde siyah çay üretimi sırasında çay fabrikalarından çöp, lif ve toz şeklinde fazla miktarda çay atığı elde edilmektedir. Doğu Karadeniz Bölgesinde Çay işletmeleri Genel Müdürlüğü'ne bağlı fabrikalar ile özel sektör çay fabrikalarında yılda 30 bin tona yakın çay atığının elde edildiği tahmin edilmektedir. Organik gübre olarak değerlendirilmesi gereken önemli bir potansiyel olan çay atığı organik madde, toplam azot ve potasyum bakımından varsıl, fosfor bakımından yoksuldur. Tuzluluk oranı düşük olan çay atığının ph'sı asit karakterdedir. Çay atığı kendi ağırlığının 2.6 katı su tutma özelliğine sahiptir (Kacar ve diğ., 1996). Tablo 2.1: Bazı enzimlerin kullanım alanları ve elde edildikleri mikroorganizmalar. Kimyasal Madde Kullanım Alanı Mikroorganizma α-amilaz Katalaz Leke çıkarıcı Glukoz şurubu Maltoz ve Nişastanın yıkımı İçeceklerin bozulmasını önlemek amacıyla Deterjan katkı maddesi Atıkların değerlendirilmesi Bacillus subtilis Aspergillus oryzae Bacillus licheniformis Aspergillus niger Selülaz Aspergillus niger Trichoderma reesei Glukoz oksidaz Biyosensör Aspergillus niger Laktaz Peynir altı suyu üretimi Kluyveromyces laktis Lipaz Deterjan katkı maddesi Aspergillus oryzae Pektinaz Meyve suyu berraklaştırılması Erwinia spp. Sükraz (İnvertaz) Şekerleme endüstrisi Saccharomyces spp.

17 6 Aspergillus niger küf mantarı Ascomycota şubesinden, Trichocomaceae ailesinden bir ipliksi mantar türüdür (Tablo 2.2). Aspergillus, dünyanın her yerine yayılmış ortalama 200 küf mantarı türünden oluşmuş bir cinstir. Yuvarlak hücrelerden oluşmuş mayalardan değişik olarak, Aspergillus türleri hif olarak isimlendirilen hücre zincirlerinden oluşan ipliksi mantar türleridir. Doğada saman ve çürüyen bitki artıklarında yaşarlar. Aspergillus türleri aerobiktirler ve bol oksijenli hemen her ortamda rastlanırlar. Mantarlar genel anlamda bol karbonlu yüzeylerde, glukoz gibi monosakkaritler ile büyümelerine rağmen, Aspergillus amilaz enzimleri salgılamış olduğu için nişasta gibi polisakkaritleri de kullanabilir. Bu yüzden Aspergillus türleri ekmek ve patates gibi nişastalı yiyeceklerin bozulmalarında sık sık görülür, ek olarak çoğu bitki ve ağaç üstünde de büyürler. Glukoz, früktoz, maltoz ve nişasta gibi karbon kaynakları ile büyüyebilmelerinin yanında çoğu Aspergillus türü gıda maddelerinin çok düşük konsantrasyonda olduğu veya diğer organizmaların kullanmamış olduğu besin kaynaklarının olduğu ortamlarda da gelişme yeteneğine sahiptir. Bunun başlıca örneği olan Aspergillus niger nemli duvarlar üstünde büyür, banyolardaki küfü oluşturur (Hu ve diğ ). Aspergillus türleri, hem birincil hem ikincil metabolitlerin üretimi nedeniyle ticari önemi en büyük olan mantar türü sayılabilir. Aspergillus niger in en önemli kullanımı sitrik asit üretimidir; bu organizma dünya çapındaki üretiminin % 99'u olan yılda 4,5 milyon ton sitrik asitten sorumludur. Aspergillus niger ayrıca hem kendisine hem başka organizmalara ait enzimlerin üretimi için kullanılır, bunlara örnek glukoz oksidaz ve tavuk yumurta lizozimidir. Bu kullanımlarda kültür katı yüzey üzerinde değil (ancak Japonya'da bu hâlâ yapılır), sıvı ortam içinde, biyoreaktörde büyütülür. Bu sayede büyümeyle ilgili en önemli parametreler ince bir şekilde kontrol edilebilir. Ayrıca elde edilmek istenen kimyasalı veya enzimi kültür ortamından ayrıştırmak çok daha kolay olduğu için bu yöntem daha ekonomiktir (Kang ve diğ., 2004).

18 7 Tablo 2.2: Aspergillus niger van Tieghem, Anamorph (ATCC ) taksonomisi Alem Fungi Üst şube Dikarya Şube Ascomycota Alt şube Pezizomycotina Sınıf Eurotiomycetes Alt sınıf Eurotiomycetidae Takım Eurotiales Aile Trichocomaceae Cins Aspergillus Tür Aspergillus niger Enzimler reaksiyonların hızını, aktivasyon enerjisini düşürerek artıran ve reaksiyondan değişmeden çıkan protein yapıdaki biyolojik katalizörlerdir. Doğal olarak yalnız canlılar tarafından sentezlenirler. Hücre içerisinde meydana gelen binlerce tepkimenin hızını ve özgüllüğünü düzenlerler Ancak yeterli koşulların sağlanması durumunda hücre dışında da etkinliklerini korurlar. Hücrelerde enerji üretimi, organik maddelerin yapılması ve yıkılması, kas kasılması, sinirsel iletim gibi önemli fizyolojik faaliyetler hücre için hayati önem taşır. Bütün bu reaksiyonların tümünün başlayabilmesi ve devam etmesi için tepkimeye girecek moleküllerin aktivasyon enerjisi denilen enerji engelini aşması gerekir. İşte bu engel enzimler ile düşürülür ve reaksiyonların hızlı bir şekilde gerçekleşmesi sağlanır. Bu nedenle canlılık birçok enzim reaksiyonlarının bir araya gelmesi ile oluşmuş bir sistem olarak nitelendirilebilir. Enzimler, protein yapıdadırlar ve proteinler de hücrede DNA daki kalıtsal bilgiye göre oluşturulur. Enzimlerin proteinden oluşan kısmına Apoenzim denir. Ayrıca bu protein kısım enzimin hangi maddeye etki edeceğini de belirler. Ancak enzimlerin çoğu bu protein yapıyla beraber vitamin ya da mineral gibi protein olmayan prostetik grup olarak adlandırılan bir aktifleştiriciye ihtiyaç duyar. Bu şekilde hem protein hem de prostetik grup içeren enzimlere de Holoenzim denir. Enzimin prostetik grubu eğer vitamin gibi bir organik madde olursa (vitaminler, riboflavin, tiamin ve folik asit gibi) koenzim ismini alır. Eğer mineral gibi organik olmayan bir madde (örneğin metal iyonları ve demir-kükürt elementleri gibi) olursa kofaktör olarak adlandırılır. Bu enzimlerin prostetik grubu enzimin etki edeceği kimyasal reaksiyonu, yani spesifisitesini tayin eder (Dinckaya, 1997). Enzimin etki ettiği madde veya madde

19 8 karışımına ise substrat denir. Apoenzim ise enzimin hangi substrata etki edeceğini, diğer bir deyişle enzimin substrat spesifisitesini tayin eder. Örneğin; koenzimi NAD + olan enzimler dehidrojenasyon reaksiyonlarını kataliz ederler, fakat hidrojenin hangi substrattan ayrılacağını tayin eden enzimin apoenzim kısmıdır. Enzimlerin bir diğer önemli özelliği de katalizledikleri reaksiyon tiplerine ve ürüne dönüştürdükleri substratlara karşı son derece spesifik olmalarıdır. Bu spesifikliği sağlamak ve enzimlerin tam olarak işlevsel özellik kazanması için üç boyutlu yapısını oluşturması gerekmektedir (Karademir ve diğ., 2002). Enzimlerin yapılarının aydınlatılmasında ilk adım protein zincirindeki aminoasit diziliş sırasının belirlenmesidir. Bu yapı enzimin primer yapısıdır. Sekonder yapı ise bir protein zincirindeki aminoasitlerin R grupları dikkate alınmaksızın zincirin uzaydaki şeklini ifade eder. Sekonder yapının oluşumunda amino asitler arasındaki hidrojen bağları önemli yer tutar. Sekonder yapı α-heliks ve β-katlanmış yaprak yapısı olmak üzere 2 şekilde oluşur. Enzimin yapısının gösterilmesinde üçüncü adım, 3 boyutlu yapının oluşumunda son derece etkili olan tersiyer yapıdır. Bir enzimin tersiyer yapısı protein zincirindeki hidrojen köprü bağları, disülfit köprüleri, iyonik ilişkiler ve hidrofobik etkileşimler ile oluşmaktadır. Sonraki aşamada birden fazla alt birimden oluşmuş enzimlerde kuarterner yapı son adımı oluşturur. Bu yapı birden fazla polipeptit zincirinden meydana gelir (Dinckaya, 1997). Enzimler protein yapıda olduğundan ve 3 boyutlu yapılarını alarak katalitik etkinliğe ulaştıklarından dolayı sıcaklık, ph, enzim konsantrasyonu, substrat konsantrasyonu ve reaksiyon ürünlerinden etkilenirler. Enzim reaksiyonunun hızı, diğer faktörler sabit tutulduğunda, enzim konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Substrat konsantrasyonu sabit tutulup enzim konsantrasyonu arttırılırsa substratın tamamı enzim-substrat kompleksi oluşturana kadar reaksiyon hızı artar. Substrat tükendiği anda enzim reaksiyonu durur. Yüksek enzim derişimlerinde reversibl bir inhibitör içeriği varlığında veya enzimin agregatlaşması sonucunda enzim aktivitesi azalır. Sabit enzim konsantrasyonunda, enzim reaksiyonunun hızı belirli bir noktaya kadar substrat konsantrasyonu ile artar. Bundan sonra substrat konsantrasyonunun artması ile reaksiyon hızı enzim miktarında herhangi bir değişiklik olmadığı için sabitlenir. Enzim reaksiyonlarının hızı sıcaklık ile artar. Sıcaklığın her 10 C artması ile reaksiyon hızı ortalama iki kat artar. İn vitro enzim reaksiyonları çoğu zaman C de yapılır. Bu sıcaklıkta reaksiyon hızı oda sıcaklığındakine oranla dört kat daha fazladır. Fakat belirli bir sıcaklık aşıldıktan sonra, enzimler denatüre olurlar ve etkilerini kaybederler. Her enzim için

20 9 birim zamanda substratını en fazla değişikliğe uğrattığı belirli bir sıcaklık vardır. Bu sıcaklığa o enzimin optimum sıcaklığı denir. Enzimin reaksiyon hızı ortamın ph sına bağlıdır. Belirli bir ph alanında enzimin etkisi en fazladır. Bu ph ya enzimin optimum ph sı denir. Optimum ph nın aşağısında ya da yukarısında reaksiyon hızı daha düşüktür. Belirli bir ph dan sonra da enzim tamamen etkisiz kalır (Pazarlıoğlu, 1997). İn vitro enzim reaksiyonu devam ettikçe reaksiyon ürünleri enzimi inhibe ettikleri için enzim reaksiyonun hızı azalır. Bu inhibisyona sebep, reaksiyon ürünlerinin molekül yapısı bakımından substratı andırmaları ve enzime substrattan daha fazla bağlanmalarıdır. Reaksiyon ürünü, apoenzim ile substratın birleştiği yerin dışında bir yerde birleşebilir. Allosterik yere bağlanan madde, enzimin etkili bölgesinde biçimsel bir değişikliğe yol açabilir. Bunun sonucu olarak, enzim proteininin şeklinin bozulması dolayısıyla enzimin substrat ile birleşmesi substratın yapısına, konsantrasyonuna veya diğer faktörlere bağlı olarak inhibisyona neden olur. Bu etkiye de allosterik etki denir. Yapılan araştırmalar enzimlerin optimum sıcaklıklarının ve optimum ph larının zamana da bağlı olduğunu göstermektedir (Immanuel ve diğ., 2007). Enzimler günümüzde Uluslararası Biyokimya Birliğinin kurduğu bir komite (NC-IUBMB) tarafından yapılan sistematik sınıflandırmaya göre isimlendirilmektedir yılındaki ilk enzim komisyonu raporuna göre enzimler katalizledikleri reaksiyon tipine göre altı ana sınıfa (Oksidoredüktazlar, Transferazlar, Hidrolazlar, Liyazlar, İzomerazlar, Ligazlar) ayrılmışlardır. Bu sınıflandırmada her enzim dört rakamlı bir kod numarası ile ( Enzyme Code, E.C.) tanımlanmıştır. Bu kod numarasının kapsadığı 4 rakamdan ilki enzimin altı ana sınıftan hangisi içinde yer aldığını, ikinci rakam alt sınıfı, üçüncü rakam alt-alt sınıfı ve dördüncü rakam da o enzimin alt-alt sınıftaki seri numarasını ifade eder. Herhangi bir enzimin biri sistematik diğeri önerilen olmak üzere iki ismi bulunur. Önerilen isim geleneksel isim olarak da adlandırılabilir. Önerilen isim yaygın olarak kullanılan ve daha basit olan isimdir (IUBMB, 1992). Bir enzimin aktivitesini çeşitli yollardan ifade etmek mümkündür. Örneğin; 1 mg enzim proteini tarafından birim zamanda meydana getirilen absorbans değişimi (da/dt) bir birim olarak ifade edilebilir. Fakat elde edilen sonuçları karşılaştırabilmek için daha standart bir birim tanımlaması geliştirilmiştir: Uluslararası ünite (IU, International Unit). Buna göre bir ünite enzim, bir dakikada 1 µmol ürünün oluşumunu (veya 1 µmol substratın dönüşümünü) katalizleyen enzim miktarıdır ( U= µmol/dakika).

21 10 Enzimatik reaksiyonda oluşan ürün (veya dönüşen substrat) spektral yöntemle kolaylıkla izlenir ve enzim aktivitesi temelde Lambert-Beer yasasına dayanan aşağıdaki formül ile hesaplanır: Örnekteki Enzim Ünitesi= =U/l veya µmol dakika -1 l -1 Absorbansın (A), zamana bağlı değişimi (da/dt), molar ekstinksiyon katsayısına (ε) bölünürse absorbans değişimi izlenen maddenin, derişimdeki değişim hızı saptanmış olur. Molar ekstinsiyon katsayısının değeri absorbansı veren maddenin değişimi ve absorbansı arasındaki sabit oranın ifadesidir. ε=a/c cm 2 µmol -1 ile formülize edilir. A= absorbans, C= maddenin derişimini ifade eder (cm 2 µmol -1 ) Vt= toplam hacim (ml) Ve= eklenen enzim hacmi (ml) d= Küvetin ışık yolu (genelde 1 cm) da/dt= dakikada gözlenen absorbans değişimi Formülün payında yer alan 1000 rakamı, enzim ünitesindeki miktarı mikromol olarak ifade etmek için gereklidir. Çünkü formülde absorbsiyon katsayısının birimindeki miktar mol, hacim değerleri ise ml olarak verilmiştir. Enzim aktivitesini tanımlamak için kullanılan diğer birim de spesifik aktivitedir. Bir enzimin spesifik aktivitesi, 1 mg protein başına düşen enzim ünitesinin sayısıdır. Spesifik aktivite=u/protein (mg/ml) Enzim ünitesi (U) ve spesifik aktiviteden yola çıkarak enzimin miktarı miligram olarak bulunabilir (Arda ve Temizkan, 2008). Bir çözeltideki total protein miktarının belirlenmesinde farklı yöntemler kullanılabilmektedir. Bu çalışmada hücre dışına salgılanan protein miktarı ölçülmesi hedeflendiğinden Lowry yöntemi kullanıldı. Lowry yöntemi total protein miktarı belirlenmesi konusunda diğer yöntemlere göre daha hassastır.. Lowry Yöntemi fosfomolibdotungstik asit çözeltisinin (Folin- Ciocalteau belirteci) tirozin amino asidi bakiyeleriyle reaksiyona girerek mavi renk oluşturması esasına dayanır. Reaksiyon bakır ile protein arasında kompleks oluşumu ile başlar ve oda

22 11 sıcaklığında tamamlanır. Bakırın varlığı sebebiyle yöntem çok duyarlıdır çünkü bakır ile oluşan bu kompleks, Folin belirtecindeki molibden ve tungsten ile birleşerek yeni bir kompleks ortaya koyar (Lowry ve diğ., 1951). Bir çözeltideki proteinleri çözeltiden ayırmak ve konsantre etmek amacıyla farklı yöntemler kullanılabilir. Protein konsantrasyonunun artırılmasında organik çözücülerle ya da tuzla çöktürme işlemin amacına göre kullanılabilecek yöntemlerdendir. Amonyum sülfat tuzuyla çöktürme, protein çözeltilerinin konsantre edilmesinde ve saflaştırılmasında geniş çapta kullanılan bir yöntemdir. Amonyum sülfat tuzu ortamdaki proteinlerin denatürasyonuna yol açmadan, bir araya gelmelerini sağlayarak çözeltide çökmelerini sağlar. Proteinler farklı tuz konsantrasyonlarında çöktürülerek birbirlerinden ve çözeltideki diğer moleküllerden ayrılabilirler. Her protein farklı tuz konsantrasyonunda çöktürülerek birbirlerinden ve çözeltideki diğer moleküllerden ayrılabilir. Bir çok protein %55 doygunlukta çöker. Genelde %70 doygunlukta da tüm proteinlerin çökelmesi sağlanır. Çöktürmede kullanılan tuzların etkinliği anyonun yükü ile ilgilidir ve en çok sülfat, fosfat, sitrat tuzları kullanılır. Katyonun cinsi daha az etkili ise de bir değerlikli katyonların kullanılması tercih edilir. Etkinlik sırası NH 4 >K + >Na + dır. En çok kullanılan tuz amonyun sülfattır C aralığında çözünürlüğü çok az değişir (Arda ve Temizkan, 2008). Mikroorganizma temelli üretilen enzimler başlıca 2 bölüm altında incelenebilirler. Bunlardan ilki hücre içinde sentezlendikten sonra hücre dışına salgılanarak buradaki gıda moleküllerinin monomerlerine kadar ayrışmalarını ve hücre zarından ve hücre duvarından geçebilecek düzeye inmelerini sağlayan enzimlerdir. Bu tarz aktivite gösteren enzimler genelde hidrolitik enzimlerdir. Mikroorganizma temelli üretilen diğer enzim grubu ise hücre içinde üretildikten sonra hücre dışına salgılanmayarak hücre içinde etkinlik gösteren enzimlerdir. Ticari alanda kullanılan DNA polimeraz ve restriksiyon endonükleaz enzimlerinin üretiminde bu sistem kullanılmaktadır (Tosun, 2005). Doğada en yaygın olarak bulunan madde olan selüloz, glukoz moleküllerinin β-1,4-glikozid bağı ile birbirine bağlanması sonucu oluşan bir polisakkarittir. Bu polimer maddeyi parçalayan enzim olan selülaz doğal olarak geviş getiren hayvanların işkembesinde bakteriler tarafından anaerobik koşullarda üretilir. Ancak bu enzimin endüstriyel boyutta üretiminde genelde Aspergillus ve Trichoderma hifli mantar türleri kullanılır. Selülaz enzimi, gıda endüstrisinde

23 12 meyve suyu, sebze ve meyve püreleri hazırlanmasında; hayvan yemi endüstrisinde, tekstilde, kağıt endüstrisinde, nişasta endüstrisinde ilaç endüstrisinde, alkol üretiminde sıkça kullanılan ticari bir enzimdir (Ahamed ve Vermette, 2007). Selülaz enzimi, bir kaç bakteri ve mantar türü tarafından üretilen bir grup enzimlerin genel adıdır. Bu enzimler selüloz molekülünün içindeki β-1,4-d-glikozidik bağını hidroliz etmek için ortaklaşa bir etki gösteren endoglukonaz (Şekil 2.1), ekzoglukonaz (Şekil 2.2), ve β-glukozidaz (Şekil 2.3) enzimleridir (Davies ve Henrissat, 1995). Şekil 2.1: Egzoglukonaz (β-1,4-d glukanohidrolaz) enzimi 3 boyutlu görüntüsü Şekil 2.2: Endoglukonaz (1,4-β-D-glukan-4-glukanohidrolaz) enzimi 3 boyutlu görüntüsü

24 13 Şekil 2.3: β-glukozidaz (Sellobiyohidrolaz) enzimi 3 boyutlu görüntüsü Endoglukanazlar, (1,4-β-D-glukan-4-glukanohidrolazlar, E.C ) selülozun iç kısmında bulunan β-1,4-glikozidik bağını rastgele olarak keserler. Statik köprü bağları sayesinde β-glukosidik bağlarını yani, uzun zincirli polimerlerin hidrolizini sağlamaktadır. Bu durumda yeniden parçalanabilir madde olarak enzime yardımcı olan sellooligosakkaritler meydana gelmektedir. Ekzoglukanazlar, (Sellodekstrinazlar veya 1,4-β-D-glukan glukanohidrolazlar) (E.C ) selüloz zincirinin sonunda indirgenmeyen glukoz birimlerinin ayrılmasını sağlamaktadırlar. Sellobiyohidrolazlar (1,4-β-D-glucan sellobiyohidrolazlar, E.C ) selülozun indirgenen ya da indirgenmeyen ucundan parça parça keserler. Selüloz zincirinin indirgenmeyen son kısmından sellobiyozun ayrılmasını sağlamaktadırlar (Duran, 2007). Sellobiyazlar (β-glukozidazlar, yada β-d-glukozid glukohidrolazlar, EC ) sellobiyozun glukoza hidrolizini sağlamaktadırlar (Acharya ve diğ., 2008). Endoglukanazlar, selülozu meydana getiren polisakkarit zincirinin iç bölgelerinde kesim yaparlar ve değişik uzunlukta oligosakkaritler meydana getirirler. Ekzoglukanazlar ise selüloz zincirinin ucundan itibaren sırayla kesim yaparlar ve son ürün olarak glukoz ya da sellobioz açığa çıkarırlar. Selülaz enzim sistemi sadece bu üç enzimden oluşan bir kompleks değil, daha çok selülozun etkin hidrolizi için koordinasyon sağlayan bir ekip gibi düşünülebilir. Bütün bu enzim sistemleri sinerjetik bir etkiyle selülozu parçalamaktadır. Nitekim mikroorganizmalar

25 14 selülozun tam hidrolizi için, doğal olarak substratlar için farklı adaptasyonlar geliştirmişlerdir (Begum ve Absar, 2009). Bu çalışmada, mikrobiyolojik selülaz enzimi, Aspergillus niger aracılığıyla farklı besiyeri içerikleri kullanılara 6 günlük kültürler kurularak 5 lt lik sıcaklık, ph gibi parametreleri kontrol edilebilen karıştırmalı fermentörde üretildi. En iyi enzim aktivitesi 9,6 g talaş ve 3 ml mısır maserasyon sıvısı kullanılarak optimize edilen besiyerinde 6,16 U/ml olarak saptanırken en fazla protein miktarı amonyum sülfat çöktürmesi yapıldıktan sonra 8 g talaş ve 3 g çay çöpü içeren besiyerinde 7 mg/ml olarak bulundu.

26 15 3. MALZEME VE YÖNTEM 3.1. Aspergillus niger HÜCRELERİNİN YETİŞTİRİLMESİ Çalışmada kullanılan ve biyogüvenlik seviyesi 1 olan Aspergillus niger van Tieghem, anamorph (ATCC ) hücreleri ATCC /İngiltere şirketinden temin edildi. A. niger hücreleri 12 saat karanlık/12 saat ışık periyodundaki bitki büyütme kabininde (Daihan Wise Cube) üretildi ve hücreler, Potato Dextrose Agar (PDA) besiyerlerinde 6-8 gün aralıklarla pasajlandı A. niger HÜCRELERİNİN ÜRETİMİNDE KULLANILAN BESİYERLERİNİN HAZIRLANMASI Bu çalışmada besiyerine eklenen ve karbon kaynağı olarak kullanılan talaş, mobilya üretimi yapan atölyelerden temin edildi. Besiyerinde kullanılan talaş, öncelikle 2N NaOH çözeltisi ile 2 saat ön işleme maruz bırakılarak odunsu yapının bozulması ile selüloz ve hemiselüloz moleküllerinin açığa çıkması sağlandı. Kimyasal madde ile ön işlemden geçen bu talaş daha sonra birkaç kez distile su ile yıkanarak bir gece oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı. Buna ek olarak besiyerine azot kaynağı olarak iki farklı bileşen eklendi. Bunlardan ilki mısır Maserasyon sıvısı (Corn Steep Liquor, Sigma-Aldrich) diğeri ise, Rize/Kalkandere Taşçılar çay fabrikasından üretim atığı olarak temin edilen çay çöpüdür. Çay çöpünün içindeki selülozik molekülleri açığa çıkartmak için, bu örnekler 121 C de 1,2 atm basınç altında otoklavlanarak fiziksel ön işlemden geçirildi A. niger HÜCRELERİNİN ÜRETİMİ İÇİN KÜLTÜR KOŞULLARININ OPTİMİZASYONU A. niger hücreleriyle enzim üretimi optimizasyonları 250 ml hacimli erlenlerde yapıldı. Bunun için karbon kaynağı olan talaş 5 g, 8 g ve 9,6 g olmak üzere 3 farklı konsantrasyonda ve azot kaynaklarından mısır maserasyon sıvısı 2 ml, 3ml, 5 ml ve 7 ml konsantrasyonlarda denendi. Diğer bir azot kaynağı çay çöpü ise 3 g, 5 g ve 8 g olarak denendi. Tüm kültürler 100 ml hacimde ph 5 ayarlanarak başlatıldı. A. niger hücrelerinde selülaz enzimini en yüksek miktarda üretmek amacıyla yapılan optimizasyonlar sonucunda en yüksek enzim aktivitesi ölçümü alınan 3 farklı besiyeri seçilerek biyoreaktöre ekim için hazırlandı (Tablo 3.1).

27 16 Hazırlanan tüm örnekler otoklav kullanılarak 121 C ve 1,2 atm basınç altında 15 dakika steril edildi. Tablo 3.1: Kültür koşullarının optimize edilmesinde kullanılan farklı besiyeri içerikleri BESİYERİ KARBON KAYNAĞI AZOT KAYNAĞI 1 9,6 g talaş 7 ml mısır maserasyon sıvısı 2 9,6 g talaş 5 ml mısır maserasyon sıvısı 3 * 9,6 g talaş 3 ml mısır maserasyon sıvısı 4 9,6 g talaş 2 ml mısır maserasyon sıvısı 5 8 g talaş 5 ml mısır maserasyon sıvısı 6 8 g talaş 3 ml mısır maserasyon sıvısı 7 8 g talaş 2 ml mısır maserasyon sıvısı 8 9,6 g talaş 5 g çay çöpü 9 * 9,6 g talaş 3 g çay çöpü 10 9,6 g talaş 2 g çay çöpü 11 5 g talaş 5 g çay çöpü 12 5 g talaş 3 g çay çöpü 13 8 g çay çöpü 2 g talaş 14 * 8 g çay çöpü g talaş - A. niger hücrelerinin hazırlanan bu besiyerlerine ekimlerinin yapılabilmesi için ekimden 4 gün önce hücreler, Potato Dextrose Brorth (PDB) besi yerinde üretildi. 100 ml hazırlanan besiyerlerine 500 µl mikroorganizma eklendi ve kültürler 30 C de ph 5 olacak şekilde başlatıldı ve 6 gün süreyle enzim üretimi amacıyla fermentasyona bırakıldı.

28 A. niger HÜCRELERİNDE BİYOREAKTÖR KULLANILARAK SELÜLAZ ENZİMİ ÜRETİMİ Bu tez çalışmasında A. niger hücrelerinde selülaz enziminin üretimi amacıyla Biostat B plus Twin (SARTORIUS) fermentör cihazı kullanıldı (Şekil 3.1.).

29 Şekil 3.1: Sartorius Biostat B Plus Fermentör ve Ekipmanları 18

30 19 Bu çalışmada daha önce 250 ml lik erlenler kullanılarak yapılan optimizasyonlar sonucunda fermentasyon için en uygun besiyeri içerikleri belirlendi (Tablo 3.1). Besiyeri içeriğini hazırlama ve sterilizasyondan oluşan üst akım işlemlerine başlandı. Daha önce NaOH ile kimyasal ön işleme maruz bırakılan 384 g talaş ve 120 ml Mısır Maserasyon Sıvısı ile fermentörün birinci kültür kabı hazırlandı. Fermentörün ikinci kültür kabına ise NaOH ile kimyasal ön işleme maruz bırakılan 384 g talaş ve buharlı basınç ile fiziksel ön işlem uygulanan 120 g çay çöpü kondu. Her iki kültür kabı da 4 litre distile su eklendikten sonra kapakları vidalar ile kapatıldı. Sıcaklık ve ph algılayıcıları fermentör kabının uygun alanlarına yerleştirilerek asit, baz ve diğer girişleri kapatıldı. Fermentasyon süresi boyunca oluşabilecek ph değişimlerine karşı 0,2 M 500 ml NaOH ve 0,2 M 500 ml HCl tampon çözeltileri hazırlandı. Fermentörün hava girişine ve bu tampon çözeltilerin hava girişlerine sterilizasyon için filtre yerleştirildi. İçerisine farklı besiyerleri konulan fermentör kültür kapları ve hazırlanan tampon çözeltiler 121 C ve 1,2 atm basınçta 30 dakika otoklav edilerek sterilizasyon işlemi gerçekleştirildi. Otoklav ile steril edilen fermentörün kültür kapları fermentör cihazına bağlandı. Fermentörün devir daim deposu distile su ile dolduruldu ve çalışması sağlandı. Fermentör cihazına bağlanan kültür kaplarının dış ceketine fermentörün devir daim deposundan soğuk su girişi sağlandı. Kültür kaplarındaki sıcaklık ve ph algılayıcıları fermentör cihazının uygun yerine bağlanarak fermentör cihazına veri akışı sağlandı. Kültür kabının içindeki karıştırıcının dönüşünü sağlayacak motor kültür kabına bağlanarak besiyerinin karıştırılması sağlandı. Hazırlanan kültür kapları fermentasyon için uygun sıcaklık 30 C ve ph 5 olarak ayarlandıktan sonra A. niger fermentör kültür kabına steril olarak enjekte edildi. Motor dönüş hızı 120 rpm olarak ayarlandı ve 6 gün süreyle kesikli ( Batch ) fermentasyon uygulandı. Kültür kapları içinde 6 günlük (144 saat) fermentasyon süresi sonunda besiyeri kalıntılarını ve mikroorganizmaları reaktör sıvısından uzaklaştırma süreçlerini içeren alt akım işlemlerine geçildi. Bu kapsamda fermentasyon ürünü +4 C de 15 dakika rpm de santrifüj edildi. Çökelti atıldı ve üst sıvı +4 C de buzdolabında saklandı.

31 BİYOREAKTÖRDE A. niger HÜCRELERİ İLE ÜRETİLEN FERMENTASYON ÜRÜNÜNDEKİ PROTEİN KONSANTRASYONUNUN BELİRLENMESİ Bu çalışmada 6 günlük kesikli fermentasyon sonucunda oluşan ürünün içindeki protein konsantrasyonunun belirlenmesi için Lowry yöntemi tercih edildi (Lowry ve diğ., 1951). Lowry yönteminde A ve B çözeltileri hazırlandı. A çözeltisi 4 g NaOH ile 20 g Na 2 CO ml distile suda çözülerek hazırlandı. B çözeltisi ise 1 g K-tartarat ve 0,5 g CuSO 4.5H 2 O 100 ml distile su içinde çözülerek hazırlandı. Fenol belirteci distile su ile 1:1 oranında seyreltirilerek kullanıldı. Bovin serum albümin standartları 10 mg/ml, 5 mg/ml, 2.5 mg/ml, 1 mg/ml ve 500 µg/ml olarak hazırlandı. Hazırlanan A ve B solüsyonlarıyla 50 ml A ve 1 ml B çözeltisi kullanılarak C solüsyonu hazırlandı. Örnekler 3 ayrı ependorf tüpte hazırlandı. Tüm örneklere ve standartlara 1 ml C solüsyonundan eklendi ve 10 dakika oda sıcaklığında beklemeye bırakıldı. Tüm örneklere ve standartlara 100 µl Folin belirteci eklendi ve 30 dakika karanlık ortamda oda sıcaklığında beklemeye bırakıldı. 660 nm de spektrofotometrik ölçümler alındı. Standartlar üzerinden oluşturulan grafiğe göre protein konsantrasyonu hesaplandı BİYOREAKTÖRDE A. niger HÜCRELERİ İLE ÜRETİLEN FERMENTASYON ÜRÜNÜNDEKİ PROTEİNLERİN ÇÖKTÜRÜLMESİ Fermantasyon ürünündeki proteinleri çöktürerek konsantre etmek için amonyum sülfat çöktürmesi yapıldı. Fermentasyon sonucu oluşan reaktör sıvısına eklenecek amonyum sülfat miktarı Tablo 3.2 den yararlanılarak hesaplandı ml fermentasyon ürününde bulunan proteinleri % 55 doygunlukta çöktürmek için gerekli amonyum sülfat miktarı 33 g olarak belirlendi. Enzim çözeltisi buz dolu kap içinde manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirildi. Hesaplanan miktarda amonyum sülfat çözeltiye yavaş bir şekilde eklendi. Tamamen çözünme sağlandıktan sonra +4 C de rpm de 10 dakika santrifüj edildi ve üst sıvı atıldı. Çözelti distile suda çözüldü ve tuz çözeltisinin uzaklaştırılması amacıyla 3 gün süresince saf suya karşı diyalize bırakıldı.

32 21 Tablo 3.2: İstenen doygunluğa ulaşılması için çözeltiye eklenmesi gereken katı Amonyum Sülfat miktarı hesaplama tablosu 3.7. A. niger HÜCRELERİ TARAFINDAN ÜRETİLEN SELÜLAZ ENZİMİ AKTİVİTE TAYİNİ Bu çalışmada selülaz enziminin aktivite tayini için Dinitrosalisilik Asit (DNS) yöntemi kullanıldı (Ghose, 1987). DNS yönteminde ilk olarak DNS belirteci hazırlandı. Bunun için 1416 ml distile su içinde 10,6 g Dinitrosalisilik asit ve 19,8 g NaOH çözüldü. Ardından 306 g K-tartarat, 7,6 ml fenol ve 8,3 g Sodyum metabisülfit eklendi (Tablo 3.3). Glukoz standartları hazırlandı. 5 farklı konsantrasyon (2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,1 mg/ml) 2 mg/ml stok solüsyondan sulandırılarak oluşturuldu. Substrat olarak % 2 lik (w/v) Karboksimetil selüloz (CMC) çözeltisi 0,05 M sitrat tamponuyla hazırlandı. Kör örnek blank için 100 µl enzim 15 ml lik tüpe konuldu. Tüpler 10 dakika kaynayan suyun içine bırakılarak enzim aktivitesi durduruldu. Örnekler 100 µl olacak şekilde hazırlandı ve hem kör örnek hem de enzim örnekleri üzerine 900 µl substrat eklendi. 50 C de 30 dakika su banyosunda bekletildi. Tüm örnekler üzerine 3 ml DNS belirteci eklenerek doğrudan kaynayan suyun içinde 10 dakika bekletildi ve 540 nm de spektrofotomede absorbans ölçümleri alındı.

33 22 Tablo 3.3: DNS yönteminde kullanılan tampon ve bileşikler Tampon Bileşen Miktar Sitrat Tamponu Sitrik Asit Monohidrat 210 g Distile Su 750 ml Distile Su 1416 ml Sodyum metabisülfit 8,3 g DNS Belirteci Dinitrosalisik asit 10,6 g Sodyum Hidroksit 19,8 g Sodyum-Potasyum Tartarat 306 g Fenol 7,6 g Bu çalışmada uygulanan enzim aktivite tayini yöntemi olan DNS metodunda enzim ünitesi hesaplaması hazırlanan glukoz standardı grafiğine göre yapıldı (Şekil 4.3). Bu glukoz standart grafiği 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml ve 0,1 mg/ml konsantrasyonlarında glukoz standartlarıyla hazırlandı. Bu hazırlanan grafik yardımıyla 540 nm de spektrofotometrik analiz sonucu bulunan absorbans değerleriyle enzim örneklerinin ne kadar substratı glukoza çevirdiği belirlendi. Örneklerin 1 ml sindeki enzim ünitesi aşağıdaki formül yardımıyla hesaplandı: Buradan hesaplanan konsantrasyon ile de U/ml olarak enzim miktarı hesaplanır (Ghose, 1987). Bulunan değer protein miktarına bölünürse spesifik aktivite değeri elde edilir.

34 23 4. BULGULAR 4.1. KÜLTÜR KOŞULLARININ OPTİMİZASYONU Bu çalışmada, Aspergillus niger hücreleri ile hücre dışına salgılanan selülaz enzimi üretimi, atık maddeler olan talaş ve çay çöpü üzerinde gerçekleştirildi. Yapılan optimizasyon çalışmalarında (Tablo 3.1) en yüksek enzim aktivitesi veren besiyeri seçildi. Maksimum selülaz enzimi aktivitesi 9,6 g talaş ve 3 ml mısır maserasyon sıvısı içeren besiyerinde elde edildi. Yapılan tüm optimizasyonlar sonucunda çay çöpü içeren besiyeri ortamında ise maksimum enzim aktivitesi 8 g talaş ve 3 g çay çöpü ile elde edildi (Tablo 4.1). Tablo 4.1: Kültür koşullarının optimize edilmesinde bulunan enzim aktivite değerleri BESİYERİ ENZİM AKTİVİTE 1 4,68 U/ml 2 5,04 U/ml 3 * 6,16 U/ml 4 3,96 U/ml 5 4,15 U/ml 6 4,95 U/ml 7 3,53 U/ml 8 4,43 U/ml 9 * 5,28 U/ml ,18 U/ml 12 1,12 U/ml 13 2,14 U/ml 14 * 2,07 U/ml 15 -

35 A. niger HÜCRELERİYLE BİYOREAKTÖR KULLANILARAK ÜRETİLEN SELÜLAZ ENZİMİ Fermentörün kültür kabında 4 litrede 384 g talaş ve 120 ml mısır maserasyon sıvısı koyularak başlatılan kültürde üretim 6 gün devam ettirildi ve kesikli fermentasyon uygulandı. Bu süre sonunda santrifüj işlemi ile besiyeri ve mikroorganizma kalıntıları uzaklaştırılan 2,5 lt reaktör sıvısı elde edildi. Fermentörün diğer kültür kabında ise 320 g talaş ve 120 g çay çöpü ile 4 litre olarak başlatılan kültürden alt akım işlemleri sonunda 2 litre fermentasyon ürünü elde edildi BİYOREAKTÖRDE A. niger HÜCRELERİ İLE ÜRETİLEN FERMENTASYON ÜRÜNÜNDE LOWRY YÖNTEMİYLE PROTEİN MİKTARININ BELİRLENMESİ Fermentasyon süresi sonunda elde edilen fermentasyon ürününe kantitatif protein tayini için Lowry yöntemi kullanıldı. Protein standart grafiği hazırlandı (Şekil 4.1). Bu standart grafiğine göre enzim çözeltisinde 7013, µg/ml protein olduğu saptanmıştır. Amonyum sülfat çöktürmesi yapıldıktan sonra çözeltideki protein miktarının 18,584 mg/ml olduğu saptanmıştır. Lowry yönteminde spektrofotometrede 660 nm de spektrofotometrik analiz yapılan plate görüntüsünde de total protein miktarına bağlı olarak renk farklılığı net olarak görülmektedir (Şekil 4.2).

36 25 A y = 12,034x - 6,2075 R² = 0, ,5 1 1,5 KONSANTRASYON (mg/ml) Şekil 4.1: Lowry yöntemine göre protein standart grafiği Şekil 4.2: Lowry yönteminde kuyucuklarda renk oluşumu 4.4. ENZİM AKTİVİTE TAYİNİ Fermentasyon süresi sonunda elde edilen ve amonyum sülfat çöktürmesi yöntemi uygulanan çözeltilere enzim miktarının belirlenmesi amacıyla DNS yöntemi uygulandı. DNS yöntemine göre standart glukoz grafiği hazırlandı (Şekil 4.3). Bu glukoz grafiğine göre bulunan glukoz miktarları ile enzimin ne kadar substratı glukoza çevirdiği gösterildi. Ardından enzim ünitesi ve spesifik aktivite hesaplandı (Tablo 4.2).

37 26 A 540 0,7 0,6 0,5 GLİKOZ STANDART GRAFİĞİ y = 0,2299x + 0,1355 R² = 0,9937 0,4 0,3 0,2 0, KONSANTRASYON (mg/ml) Şekil 4.3: DNS metodu için glukoz standardı grafiği Çözelti içeriği Talaş ve Mısır Maserasyon Sıvısı Tablo 4.2: Enzim çözeltisine yapılan enzim aktivite tayinleri. Aktivite (U/ml) Toplam Hacim (ml) Protein miktarı (mg/ml) 8, ,01 1,21 Spesifik Aktivite (U/mg protein) Amonyum sülfat çöktürmesi sonucu 8, ,58 0,46

38 27 5. TARTIŞMA VE SONUÇ Selülaz enzimi Aspergillus niger küf mantarında hücre dışına salınabilen lignoselülozik içeriği yüksek biyolojik atıkları parçalamakta etkili sinerjik olarak çalışan bir enzim kompleksidir (Ahamed ve Vermette, 2007). Bu enzim kompleksinin gen anlatımının selüloz, sellobiyoz, laktoz gibi farklı karbon kaynakları tarafından tetiklendiği Ryu ve Mandels tarafından gösterilmiştir (1980). Bu karbon kaynaklarının hangisinin daha verimli şekilde enzim aktivitesi ortaya koyduğu araştırma konusudur. Bu çalışmada ise talaş ve çay çöpünün yapısında bulunan odunsu yapının oluşumundan sorumlu temel maddelerden olan selüloz ve hemiselüloz kullanılmıştır. Talaş ve çay çöpü kullanılarak A. niger tarafından üretilen enzim çözeltileri sayesinde bu iki atık maddenin karşılaştırmalı olarak ne kadar enzim aktivitesi ortaya konmuştur. Böylece mikroorganizma üremesi için hem talaşın hem de çay çöpünün iyi bir karbon kaynağı olduğu gösterilmiştir. Özellikle atmosfere salınan gazların azaltılması için imzalanan anlaşmadan (Kyoto Protokolü, 1997) sonra biyoetanol üretimi için fermente edilebilir glukoz üretimi önem kazanmıştır. Buğday sapı, pirinç çeltiği, hindistan cevizi kabuğu, mısır koçanı, nohut kabuğu gibi selüloz içeriği yüksek atık maddeler biyoetanol üretimi için hali hazırda kullanılmaktadır. (Kim ve Dale, 2004). Bu tez çalışmasında elde edilen sonuçlar, mikroorganizma üremesi için uygun ortam sağlamasından ve selüloz içeriği yüksek yeni bir atık madde olmasından dolayı çay çöpünün biyoetanol üretimi için kullanılabilir olabileceği sonucunu ortaya koymaktadır. Elde edilen sonuçlar biyoetanol üretimi için kullanılması gereken fermente edilebilir glukoz üretimi aşamasında çay çöpünün substrat olarak kullanılabileceğini desteklemektedir. Literatür araştırmasında çay fabrikası atığı veya çay çöpü kullanılarak enzim üretimi konusunda herhangi çalışmaya rastlanmamıştır. Kim ve diğ. (2010) tarafından yapılan araştırmada, yeşil çay atığı üzerinden farklı polisakkaritlerin, flavonoidlerin ve tanninlerin hidrolizi Aspergillus niger ile yapıldığı rapor edilmiştir. Bu araştırmada yeşil çay yaprağının içeriğinin ortaya konması, A. niger aracılığıyla salgılanan selülaz ve diğer hidrolitik enzimler ile gerçekleştirilmiştir. Çay fabrikası atığı ise yeşil çay yaprağının fabrikada işlenmiş halidir. Bu nedenle, çay çöpünün içindeki fenolik içeriğin ortaya konması ve bu fenolik içeriğin selülaz

39 28 enziminin A. niger tarafından üretilmesi ve aktivitesinin artırılmasına katkısının olması beklenmektedir. Bu çalışmada, fermentörde mikroorganizma üremesi sürecinde oluşabilecek ph değişimlerini önlemek için uygun tamponlar kültür kabına steril olarak eklendi ve fermentasyon süreci ph 5 olarak devam ettirildi. Daha önce Murad ve Azzaz ın (2013) başlangıç ph sını ayarlayarak yaptıkları çalışmada selüloz içeriğinin ph 5 civarında iyi parçalandığını ortaya koymuşlardır. Ayrıca çalışmalarında ph arttıkça enzim aktivitesinin düştüğünü göstermişlerdir. Çoral ve Çolak (2000), Çoral ve diğ. (2002) ortaya koyduğu çalışmalarda selülaz enziminin aktivitesinin ph 3 den 5 e kadar geniş bir aralıkta etkili olduğunu göstermişlerdir. Çorlu da tekstil kumaşları boyaması yapan atölyede (YILKA A.Ş.) selülaz enzim kompleksi ph 5 te 50 C de aktif olarak kullanılmaktadır. Bu tez çalışması da en iyi enzim aktivitesinin ph 5 te olduğunu göstermektedir. Elde edilen sonuçların enzimin endüstriyel boyuttaki çalışmalara uygun olduğu yönündedir. Mikroorganizma temelli üretilen enzim çözeltileri eğer ticari olarak kullanılacaksa saflık değerlerinin yüksek olması gerekmektedir. Bu çalışmada enzim çözeltisi sadece besiyeri ve organizma bileşenlerinden uzaklaştırılmak suretiyle saflaştırılmıştır. Ancak daha ileri saflaştırma teknikleri uygulanamamıştır. Amonyum sülfat çöktürmesi yapılarak elde edilen protein miktarı mililitrede 7,01 mg/ml konsantrasyondan 18,584 mg/ml konsantrasyona kadar artırılmıştır. Ancak ortaya konan enzim aktivitesinde belirgin bir değişim olmamıştır. Bunun sebebinin protein miktarını artırmak için yapılan çöktürmede kullanılan amonyum sülfat tuzunun enzim aktvite tayini için kullanılan DNS yönteminde aktif bileşenle reaksiyon vermesi olduğu düşünülmektedir. Amonyum sülfat tuzunun çöktürme sonrası diyalizle tam olarak uzaklaştırılamaması da başka bir sebep olabilir. Ayrıca Jabasingh ve diğ. (2013) yaptıkları SSF fermentasyonundan sonra ürettikleri selülaz enzimi çözeltisine amonyum sülfat çöktürmesi uygulamışlar ve protein miktarının azaldığını ancak enzim spesifik aktivitesinin arttığını gözlemişlerdir. Bu çalışma uygulanan basit saflaştırma teknikleri ile enzim çözeltisinin protein içeriğinin ve aktivite miktarının arttığı gösterildi. Eğer daha ileri saflaştırma teknikleri kullanılırsa enzim çözeltisin daha saf olarak ortaya konabileceği düşünülmektedir. Böylece üretilen selülaz enziminin sadece tekstil sektörü için değil, gıda ve ilaç sektörleri gibi sektörler için de kullanılabilmesine olanak sağlayacağı düşünülmektedir.

40 29 Endüstriyel boyutta mikroorganizmalardan selülaz enzimi üretimi fermentörler aracılığıyla yapılmaktadır. SSF fermentasyon, SmF fermentasyona göre daha yüksek üretilmek istenen ürün içeriği, daha az atık madde üretimi ve daha basit fermentasyon aletleri kullanımı gibi konularda daha üstündür (Pandey ve diğ., 1999). Bu çalışmada, alt akım işlemlerinin daha kolay olması ve fermentasyon için kullanılacak mikroorganizmanın daha iyi üremesi sebebiyle SmF fermentasyon tercih edilmiştir. Çay fabrikası artığının kendi ağırlığının 2,6 katı su tutma özelliği de bu sistemin tercih edilmesindeki başka bir unsurdur. Çay çöpüyle başlatılan kültürlerden daha az enzim çözeltisi elde edilmesi bunu desteklemiştir. Mikroorganizma aracılığı ile endüstriyel boyutta enzim üretimi yapılırken en önemli konu maliyetin düşük olmasıdır. Maliyeti düşürmek için ucuz ve kolay elde edilebilir substratlar seçmek, üretim yapılacak reaktörü olabildiğince büyük ayarlamak gibi sistemler düşünülebilir. Ancak her aşamada öncelikle enzimin stabilitesi düşünülmelidir (Tosun, 2005). Bu çalışmada araştırma laboratuvarlarında ilk çalışmalar erlen boyutunda yapıldıktan sonra küçük ölçekli sıcaklık, ph ve oksijen gibi farklı parametrelerin ölçülebildiği karıştırıcılı bir fermentörde devam edildi. Laboratuvar ölçeğinde yapılan çalışmada 5 lt hacimli reaktörde çalışma yapıldı. Bu aşamadan sonra endüstriyel üretime geçmeden önce lt reaktörlerde pilot üretim yapılır. Pilot ölçekli çalışmalardan sonra endüstriyel boyutta lt hacimli biyoreaktörlerde üretime geçilir. Endüstriyel boyutta hacmin daha fazla olmasını sınırlayan en önemli faktör oksijen transferidir. Bu çalışmada elde edilen veriler ile enzim üretiminde çay çöpü kullanılarak büyük ölçekte üretim yapılabileceği gösterilmiştir. Bu tez çalışmasında çay çöpü kullanılarak yapılan çalışmaların sonucunda bulunan enzim aktivite değerleri piyasada ticari olarak satılan enzimlerin aktivitesinin çok gerisindedir. Bu değerler enzimin ticari ürün olarak piyasaya sunulmasının önündeki en büyük olumsuzluktur. Ancak kullanılan maddenin atık madde olması ve bu atık maddenin çevreye verdiği etkilerin azaltılması süreçlerine sağlayacağı katkı çay çöpünün enzim üretimi veya kimyasal madde üretimi kullanılması kapsamında en olumlu yönüdür. Talaş atık madde olmasına rağmen halihazırda kağıt, mobilya gibi sektörlerde yeniden kullanılabilmektedir. Ancak çay fabrikası atığı için bu şekilde bir kullanım söz konusu değildir. Sonuç olarak çay fabrikası atığının potansiyel yenilenebilir, çevre dostu bir enerji kaynağı olabileceği çalışmamızda ortaya konmuştur. Bu çalışma ile elde edilen sonuçlarla özellikle çay çöpünün endüstriyel boyutta

41 30 fermentasyon ile enzim ve diğer kimyasal madde üretimi çalışmalarına katkılar sunması beklenmektedir.

42 31 KAYNAKLAR Acharya, P.B., Acharyad, K., Modi, H.A., 2008, Optimization for cellulase production by Aspergillus niger using sawdust as substrate, African Journal of Biotechnology, 7 (22), Ahamed, A., Vermette, P., 2007, Culture-based strategies to enhance cellulase enzyme production from Trichoderma reesei RUT-C30 in bioreactor culture conditions, Biochemical Engineering Journal, 40, Arda, N., Temizkan, G., 2008, Enzim Aktivitesinin Hesaplanması, Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler, Bölüm 8, Nobel Tıp Kitapevleri, İstanbul, Bansal, N., Tewari, R., Soni, R., Soni, S.K., 2012, Production of cellulases from Aspergillus niger NS-2 in solid state fermentation on agricultural and kitchen waste residues. Waste Management, 32, Bhat, M.K., 2000, Cellulase and related enzymes in biotechnology, Biotechnolgy Advances, 18 (5) Begum, F., Absar N., Purification and characterization of ıntracellular cellulase from Aspergillus oryzae ITCC Most., The Korean Society of Mycology, 37 (2), Chinedu, S.N., Okochi, V. I., Omidiji, O., 2011, Cellulase production by wild strains of Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum and Trichoderma harzianum grown on waste cellulosıc materıals, Ife Journal of Science, 13 (1), Coral, G., Colak, Ö., 2000, Bir Aspergillus niger ızolatına ait glikoamilaz enziminin izolasyonu ve karakterizasyonu, Turkish Journal of Biology, 24, Coral, G., Arikan, B., Unaldi, M.N., Guvenmez, H., 2002, Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type strain, Turkish Journal of Biology, 26, Davies, G., Henrissat B., 1995, Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases, Structure, 3 (9), Dinckaya, E., 1997, Enzimolojiye genel bakış, Enzimoloji lisansüstü yaz okulu, Eylül 1997 Aydın, Ege Üniversitesi Baskı Atölyesi, Duran, K., Ekmekci, A., Bahtiyar, I., Perincek, S., 2007, Selülaz enziminin selülozik esaslı kumaşlar üzerine etkisi, Tekstil ve Konfeksiyon 1, Ghose, T.K., 1987, Measurement of cellulase activities, Pure and Applied Chemistry, 59 (2),

43 32 Han, Y, Chen, H., 2010, Biochemical characterization of maize stover β-exoglucanase and its use in lignocellulose conversion, Bioresource Technology, 101, Harwood, C.R., Bacillus subtilis and its relatives: Molecular Biological and Industrial Workhorses. Elsevier Science Publishers Ltd, 10, Hu, W., Liu, J., Chen, J., Wang, S., Lu, D., Wu, Q., Li, W., 2014, A mutation of Aspergillus niger for hyper-production of citric acid from corn meal hydrolysate in a bioreactor, Journal of Zhejiang University-SCIENCE B (Biomedicine & Biotechnology), 15 (11), Immanuel, G., Bhagavath, C., Iyappa, R.P., Esakkiraj, P., Palavesam, A., 2007, production and partial purification of cellulase by Aspergillus niger and Aspergillus fumigatus fermented in coirwaste and sawdust, The Internet Journal of Microbiology, 1 (3), 6. Jabasingh, S.A., Varma, S., Garrec, P., 2013, Production and purification of cellulase from Aspergillus nidulans AJSU04 under solid-state fermentation using coir pith, Chemical and Biochemical Engineering Quarterly, 28 (1), Kacar, B., Kütük, A.C., Taban, S., Samet, S., 1996, Etkinlikleri Yönünden Çay Atığı ile Ahır Gübresi ve Değişik Kimyasal Gübrelerin Karşılaştırılması, Tarım Bilimleri Dergisi, 2 (3), Kang, S. W., Park, Y.S., Lee, J. S., Hong, S. I., Kim, S.W., 2004, Production of cellulases and hemicellulases by Aspergillus niger KK2 from lignocellulosic biomass, Bioresource Technology, 91, Karademir, A., Akgül, M., Tutuş, A., 2002, Kağıt endüstrisinde enzim kullanımına genel bir bakış: enzimlerin kabuk soyma, liflerin modifikasyonu, çözünebilir kağıt hamuru ve selüloz üretiminde kullanımı, KSU Journal of Science and Engineering, 5 (1), Kim, J. H., Pan, J.H., Heo, W., Lee, H., Kwon, E. G., Lee, H.G., Shin, D.H., Liu, R.H., Kim, Y.J., Effects of cellulase from Aspergillus niger and solvent pretreatments on the extractability of organic green tea waste. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, Kim, S., Dale, B.E., 2004, Global potential bioethanol production from wasted crops and crop residues, Biomass Bioenergy, 26, Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J., 1951, Protein measurement with the folin phenol reagent, Journal of Biological Chemistry, 193, Mandels, M., 1975, Cellulose as a chemical and energy resource, Biotechnology Bioengineering Symposium, NY 5, 81. Mrudula, S., Murugammal, R., 2011, Production of cellulose by Aspergillus niger under submerged and solid state fermentation using coir waste as a substrate, Brazilian Journal of Microbiology, 42 (3), Murad, H.A., Azzaz, H., 2013, Cellulase production from rice straw by Aspergillus flavus NRRL 5521, Science International, 1 (4),

44 33 Mushtaq, M., Khatoon, F., Batool, S., 2014, Optimization of culture conditions for the production of endoglucanase from Aspergillus sydowii using corn cobs, Pinnacle Biochemistry Research, 1 (1), Outtrup, H., Jorgensen, S. T., The importance of Bacillus species in the production of industrial enzymes, R.Berkley (ed), Applications and systems of Bacillus and relatives, Blackwell Science Inc., Malden, Mass., Ozkazanc, N.K., Maden, S., 2013, Some important shoot and stem fungi in pine (Pinus spp.) and firs (Abies sp.) in western blacksea region, turkey, Uluslararası Bartın Orman Fakültesi Dergisi, 15 (1), Pandey, A., Selvakumar, P., Soccol, C.R., Nigam, P., 1999, Solid state fermentation for the production of industrial enzymes, Current Science, 77, Pazarlıoğlu, N., 1997, Enzim üretimi ve saflaştırılması, Enzimoloji lisansüstü yaz okulu, Eylül 1997 Aydın, Ege Üniversitesi Baskı Atölyesi, Pensupa, N., Jin, M., Kokolski, M., Archer, D. B., Du, C., 2013, A solid state fungal fermentation-based strategy for the hydrolysis of wheat straw, Bioresource Technology, 149, Percival, Y.H., Himmel, M.E., Mielenz, J.R., 2006, Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies, Biotechnology Advances, 24, Ryu, D.D.Y., Mandels, M., 1980, Cellulases: biosynthesis and applications, Enzyme and Microbial Technology, 2, Rao, M.B., Tanksale, A.M. Gathe, M.S., Deshpande, W., 1998, molecular and biotechnological aspect of microbial proteases, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62 (3), Robati R., 2013, Bio-ethanol production from green onion by yeast in repeated batch, Indian Journal of Microbiology, 53 (3), Schallmey, M., Singh, A., Ward, O.P., Developments in the use of Bacillus species for ındustrial production, Canadian Journal of Microbiology, 50, Sidhu, G.S., Sharma, P., Chakrabarti, T., Gupta, J.K., 1997, Strain improvement for the production of a thermostable -amylase, Enzyme and Microbial Technology, 21, Tosun, H., Gönül, H.A., 2005, The effect of acid adaptation conditions on heat resistance of Escherichia coli O157: H7, Polish Journal of Microbiology, 54 (4), Weber, J., Agblevor, F.A., 2005, Microbubble fermentation of Trichoderma reesei for cellulase production, Process Biochemistry, 40,

45 34 EK 1. TAŞÇILAR ÇAY FABRİKASINDAN ÇAY ÇÖPÜ ALIMINA DAİR İZİN BELGESİ

46 35 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Adı Soyadı Uyruğu Doğum tarihi, Yeri EMRE ÖZTÜRK T.C. 1989, RİZE Telefon Eğitim Derece Kurum/Anabilim Dalı/Programı Yılı Yüksek Lisans İ.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü/Moleküler Biyoloji ve Genetik 2015 Lisans İ.Ü. Fen Fakültesi/Moleküler Biyoloji ve Genetik 2013 Lise Vehbi Koç Lisesi 2008